Artykuł metodologiczny

Automatyczna analiza wewnątrzkomórkowych fenotypów salmonelli za pomocą ImageJ

DOI:

10.3791/64263

⸱

9 sierpnia 2022

 ,  , 
1Risk Analysis and Genomic Epidemiology Unit, Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia e dell'Emilia-Romagna (IZSLER)

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Salmonella atakuje i replikuje się wewnątrz komórek nabłonka jelitowego zarówno w wakuolach specyficznych dla Salmonelli, jak i w wolnych w cytozolu (hiperreplikacja). Opisano tutaj wysokoprzepustowy protokół oparty na mikroskopii fluorescencyjnej w celu ilościowego określenia wewnątrzkomórkowych fenotypów Salmonelli za pomocą dwóch uzupełniających się analiz obrazu za pomocą ImageJ, osiągając rozdzielczość pojedynczej komórki i punktację.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Salmonella jest patogenem jelitowym zdolnym do inwazji nabłonka jelitowego i replikacji w enterocytach, zarówno wewnątrz wakuoli specyficznych dla Salmonelli, jak i wolnych w cytozolu (hiperreplikacja cytozolu). Te różne fenotypy replikacji wewnątrzkomórkowej napędzają różne szlaki patogenezy, tj. hiperreplikacja cytozolowa indukuje śmierć komórek zapalnych i ekstruzję do światła jelita, podczas gdy replikacja wakuolarna prowadzi do penetracji nabłonka i rozprzestrzeniania się ogólnoustrojowego. Podjęto znaczne wysiłki w celu stworzenia narzędzi mikroskopowych do badania zachowania Salmonelli wewnątrz zaatakowanych komórek, takich jak fluorescencyjny plazmid reporterowy pCHAR-Duo, który umożliwia rozróżnienie między bakteriami wakuolarnymi i cytozolowymi poprzez różnicową ekspresję mCherry i GFP. Jednak fenotypy wewnątrzkomórkowe są często oceniane ręcznie, co jest czasochłonną procedurą, która ogranicza analizę do niewielkiej liczby próbek i komórek. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, opracowano dwie uzupełniające się i zautomatyzowane analizy obrazu przy użyciu ImageJ, bezpłatnego oprogramowania do analizy obrazu. W protokole wysokoprzepustowym komórki nabłonkowe zostały zakażone Salmonellą przenoszącą pCHAR-Duo przy użyciu 96-dołkowych płytek. Obrazowanie wykonano przy użyciu automatycznego mikroskopu fluorescencyjnego. Następnie zastosowano dwie metody analizy obrazu w celu zmierzenia wewnątrzkomórkowego zachowania Salmonelli na różnych poziomach szczegółowości. Pierwsza metoda mierzy całkowite wewnątrzkomórkowe obciążenie bakteryjne i zakres hiperreplikacji cytozolowej. Jest szybki i umożliwia ocenianie dużej liczby komórek i próbek, dzięki czemu nadaje się do testów o wysokiej przepustowości, takich jak eksperymenty przesiewowe. Druga metoda przeprowadza analizę pojedynczych komórek w celu określenia procentu zakażonych komórek, średniego obciążenia wakuolarnego Salmonelli i szybkości hiperreplikacji cytozolu, dostarczając więcej szczegółów na temat zachowania Salmonelli w komórkach nabłonkowych. Protokoły mogą być wykonywane przez specjalnie zaprojektowane skrypty ImageJ w celu automatycznego przeprowadzania analiz wsadowych głównych etapów interakcji Salmonella-enterocyty.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Salmonella jest najczęściej zgłaszanym czynnikiem bakteryjnym powodującym wybuchy chorób przenoszonych drogą pokarmową w Unii Europejskiej1. Pierwotnym patologicznym objawem zakażenia Salmonellą jest zapalenie jelit, które jest wynikiem zachowania patogenu w jelitach po spożyciu i wynikającej z tego miejscowej odpowiedzi zapalnej2. Jednak Salmonella może również rozprzestrzeniać się do miejsc pozajelitowych i powodować infekcje ogólnoustrojowe, szczególnie u osób z obniżoną odpornością. Rodzaj interakcji między Salmonellą a nabłonkiem jelitowym warunkuje wynik infekcji. Po dostaniu się do światła jelita Salmonella atakuje i replikuje się w komórkach nabłonka jelitowego. Na poziomie wewnątrzkomórkowym Salmonella może prezentować dwa różne fenotypy replikacji, hiperreplikację cytozolową i powolną replikację wewnątrzwakuolarną w wakuolach zawierających Salmonellę (SCV). Hiperreplikacja cytozolowa indukuje śmierć komórek gospodarza w stanie zapalnym i ekstruzję Salmonelli do światła jelita3; Replikacja wakuolarna prowadzi do penetracji nabłonka i rozprzestrzeniania się ogólnoustrojowego4. W związku z tym zakres inwazji i replikacji wakuolarnej i cytozolowej wpływa na przebieg infekcji.

Rodzaj Salmonella jest bardzo różnorodny, zawiera tysiące serotypów o różnych zakresach żywicieli i zdolnościach do wywoływania chorób. Na przykład S. Typhimurium jest definiowane jako serowar ogólny, ponieważ infekuje wielu niespokrewnionych gospodarzy i stanowi jedną z głównych przyczyn salmonellozy u ludzi. Inaczej, S. Derby jest uważany za serowar przystosowany do świń, ponieważ jest w większości izolowany od świń, ale jest również zgłaszany w pierwszej piątce serowarów odpowiedzialnych za zakażenie ludzi1. Jednak wiedza na temat zachowania bakterii wewnątrz komórek nabłonkowych jest zasadniczo ograniczona do badania kilku szczepów referencyjnych, takich jak S. Typhimurium SL1344, które nie reprezentują ogromnej naturalnej różnorodności patogeniczności Salmonelli. Scharakteryzowanie interakcji różnych szczepów Salmonelli z komórkami nabłonkowymi przyczyniłoby się do zrozumienia ich różnej patogenności. Z tego powodu opracowano wysokoprzepustowy protokół oparty na mikroskopii fluorescencyjnej, aby analizować zachowanie wewnątrzkomórkowe dużej liczby szczepów w szybki i w dużej mierze zautomatyzowany sposób. W tym protokole zakażenie komórek nabłonkowych przeprowadzono na 96-dołkowych płytkach obrazowych, a akwizycji obrazu dokonano za pomocą automatycznego mikroskopu fluorescencyjnego. Plazmid pCHAR-Duo wykorzystano do obserwacji fenotypów inwazji i replikacji Salmonelli wewnątrz komórek nabłonkowych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej5. Plazmid ten przenosi gen kodujący czerwony fluorescencyjny reporter mCherry, konstytutywnie wyrażany przez wszystkie przekształcone komórki bakteryjne, oraz gen kodujący zielony fluorescencyjny reporterowy GFP, którego ekspresja jest aktywowana przez glukozo-6-fosforan obecny wyłącznie w cytozolu komórek eukariotycznych i nieobecny w SCV. Dlatego plazmid umożliwia rozróżnienie między bakteriami wakuolarnymi i cytozolowymi poprzez różnicową ekspresję reporterów mCherry i GFP.

Bakterie wakuolarne i cytozolowe na obrazach mikroskopowych są zwykle oznaczane ilościowo za pomocą ręcznego oceniania6, ale jest to czasochłonna metoda, która ogranicza analizę do niewielkiej liczby próbek. W związku z tym opracowano dwie uzupełniające się i zautomatyzowane analizy obrazów – analizę obszarową i analizę pojedynczych komórek – przy użyciu ImageJ7, ogólnodostępnego oprogramowania do analizy obrazu. Analiza obszaru mierzy całkowite wewnątrzkomórkowe obciążenie bakteryjne i zakres hiperreplikacji cytozolowej przy użyciu danych z obszarów zajmowanych przez komórki nabłonkowe, czerwone i zielone Salmonelle w każdym uzyskanym obrazie mikroskopowym. Metodę tę można zastosować do obrazów uzyskanych w małym powiększeniu; W związku z tym pozwala na uzyskanie dużej liczby komórek nabłonkowych przy użyciu niewielu obrazów, skracając czas akwizycji. Analiza pojedynczych komórek wykorzystuje segmentację komórek do określenia procentu zakażonych komórek, średniego obciążenia wakuolarnego oraz odsetka zakażonych komórek poddawanych hiperreplikacji cytozolowej z rozdzielczością pojedynczej komórki.

W tym protokole wszystkie etapy analizy obrazu są szczegółowo opisane do wykonania ręcznie, ale ta sama analiza może być zautomatyzowana przez nasze specjalnie zaprojektowane skrypty ImageJ. Skrypty te pozwalają również na uruchamianie analiz wsadowych w celu automatycznej analizy wielu obrazów, a tym samym przyspieszenia wykonania metody.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Zakażenie komórek nabłonkowych plazmidem reporterowym Salmonelli przenoszącym pCHAR-Duo

UWAGA: Zalecana jest pipeta wielokanałowa.

  1. 96-dołkowe płytki obrazowe z czarnymi ściankami i płaskim szklanym dnem pokryj kolagenem tuż przed użyciem.
    1. Rozcieńczyć lodowaty kwas octowy (17,4 M) w sterylnej wodzie demineralizowanej pod kapturem chemicznym, aby otrzymać 20 mM roztwór kwasu octowego. W sterylnych warunkach przefiltrować roztwór przez filtr strzykawkowy o wielkości porów 0,2 μm. Pozostawić roztwór w stojaku o temperaturze 0-4 °C na 5 minut.
    2. Rozcieńczyć 3 mg/ml kolagenu do 50 μg/ml we wstępnie schłodzonym roztworze kwasu octowego o stężeniu 20 mM. Wymieszaj przez odwrócenie 10 razy, a następnie dozuj 30 μl roztworu kolagenu na dołek (5 μg kolagenu/cm2), trzymając roztwór w stojaku o temperaturze 0-4 °C, aby uniknąć żelowania kolagenu.
    3. Upewnij się, że dno studzienki jest całkowicie pokryte kolagenem, a następnie pozostaw płytkę pod laminarnym przepływem na 1 godzinę w temperaturze pokojowej (RT).
    4. Delikatnie usunąć roztwór i wykonać trzy płukania 30 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Użyj wielokanałowej pipety o pojemności 100 μl lub 50 μl, aby uniknąć odklejenia kolagenu.
  2. Hodowla komórek nabłonka INT407 na płytkach obrazowych pokrytych kolagenem 20-24 godziny przed zakażeniem.
    1. Rutynowo hodować komórki INT407 w kolbach o długości 2 cm w minimalnej pożywce niezbędnej z 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), dalej zdefiniowanej pożywki hodowlanej (CM), uzupełnionej penicyliną 100 U/ml i streptomycyną 100 μg/ml (Pen/Strep).
    2. Przemyć dwukrotnie kolby INT407 5 ml PBS, a następnie odłączyć komórki 1 ml roztworu trypsyny-EDTA na 3-5 minut w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze 5% CO2 20-24 h przed zakażeniem. Policz komórki i przygotuj zawiesinę 3 x 105 komórek/ml w CM.
    3. Dozuj 100 μl zawiesiny komórek/studzienki na płytkach obrazowych pokrytych kolagenem, aby uzyskać 100% zbieżność. Inkubować w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze 5% CO2 przez 1 godzinę w celu ułatwienia adhezji komórek. Następnie dodać 100 μl CM i inkubować w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze 5% CO2 przez 20-24 godziny aż do zakażenia (krok 1.4).
      UWAGA: W celu zobrazowania bakterii wewnątrzkomórkowych szczepy Salmonelli są przekształcane za pomocą plazmidu reporterowego pCHAR-Duo, który został uprzejmie dostarczony przez dr Olivię Steele-Mortimer. Badane szczepy zostały wybrane tak, aby reprezentowały różnorodność fenotypową objętą protokołem i walidowały analizy obrazowe w sekcji 4. Zobacz reprezentatywne wyniki, aby uzyskać więcej informacji na temat szczepów użytych w tym badaniu.
  3. Przygotować kultury w fazie stacjonarnej szczepów Salmonelli zawierających plazmid reporterowy pCHAR-Duo.
    1. Pobrać próbkę bulionu glicerolowego Salmonella za pomocą końcówki pipety o pojemności 10 μl i zaszczepić go w 1 ml bulionu Luria Bertani (10 g tryptonu, 5 g ekstraktu drożdżowego i 10 g chlorku sodu na litr) uzupełnionego ampicyliną 100 μg/ml.
    2. Inkubować inokulum statycznie w temperaturze 37 °C przez 20 godzin przed zakażeniem, aby osiągnąć stacjonarną fazę wzrostu, odpowiadającą ~1 x 109 9 jednostek tworzących kolonie (CFU)/mL8.
  4. Zakażenie komórek nabłonka INT407 Salmonellą.
    UWAGA: Infekcje wykonuje się w trzech egzemplarzach.
    1. Delikatnie umyj komórki INT407 200 μl PBS/studzienkę.
    2. Przygotować inokulum Salmonella poprzez rozcieńczenie bakterii przez noc w CM w celu uzyskania pożądanej liczby CFU na komórkę nabłonka, zdefiniowanej jako mnogość infekcji (MOI). Tutaj użyto MOI 100.
    3. Zaszczepić 200 μl/basenik, a następnie przykryć płytkę oddychającą membraną uszczelniającą i inkubować w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze 5% CO2 przez 1 godzinę. Inokulację uważa się za czas zerowy infekcji.
    4. Usunąć inokulum i delikatnie przemyć 200 μl PBS/studzienkę, a następnie dodać 200 μl CM z gentamycyną 100 μg/ml na studzienkę. Przykryć płytkę oddychającą membraną uszczelniającą, a następnie inkubować w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze 5% CO2 przez 1 godzinę.
    5. Usunąć CM za pomocą gentamycyny 100 μg/ml i delikatnie przemyć 200 μl PBS/studzienkę. Dodać 200 μl CM z gentamycyną w ilości 10 μg/ml na studzienkę, przykryć płytkę oddychającą membraną uszczelniającą, a następnie inkubować w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze 5% CO2 przez 8 godzin.

2. Utrwalanie próbki i barwienie komórek nabłonkowych

UWAGA: Utrzymuj próbki chronione przed bezpośrednim działaniem światła. Objętości są wskazane dla studzienek z płytką 96-dołkową. Optymalizacja objętości jest wymagana dla różnych płytek lub podpór do hodowli komórkowych.

  1. Po 8 godzinach od zakażenia usunąć CM i delikatnie przemyć trzy razy 200 μl/studzienkę PBS. Usuń PBS, odwracając płytkę na chłonnym papierze; Unikaj zasysania.
  2. Utrwalić zainfekowane monowarstwy za pomocą 100 μl/studzienkę paraformaldehydu (PFA) 4% w PBS przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć PFA 4% i przemyć trzykrotnie 200 μl/studzienkę PBS. Płytkę można przechowywać maksymalnie przez 16-24 godzin w temperaturze 4 °C. Przejdź do następnego kroku.
  3. Barwienie komórek nabłonka.
    UWAGA: Barwienie DNA DAPI (4′,6-diamidino-2-fenyloindol) (krok 2.3.1) stosuje się do analizy obszaru tylko w celu barwienia jąder, a barwienie przesiewowe o wysokiej zawartości (HCS) (krok 2.3.2) stosuje się do analizy pojedynczej komórki w celu zabarwienia całej komórki nabłonkowej. Można stosować inne barwniki komórkowe, ale wymagana jest optymalizacja akwizycji i analizy obrazu.
    1. Analiza obszaru: dozować 100 μl/studzienkę DAPI (roztwór 300 nM w PBS) i inkubować przez 5 minut w temperaturze RT, chroniąc przed światłem.
    2. Analiza jednokomórkowa: przepuścić 100 μl/studzienkę trytonu 0,1x w PBS przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Przemyć trzykrotnie PBS i dozować 100 μl/studzienkę barwnika HCS rozcieńczonego w stosunku 1:2000 w PBS. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej, chronić przed światłem.
  4. Usunąć roztwór barwiący i przemyć trzykrotnie 200 μl/studzienkę PBS. Dodaj 50 μl/studzienkę PBS w celu automatycznego pozyskiwania obrazu.

3. Akwizycja obrazu za pomocą automatycznego mikroskopu fluorescencyjnego

UWAGA: Tutaj w protokole akwizycji używane jest małe powiększenie (10x/0,3 NA, 1 μm/piksel) w kroku 3.1.1 dla analizy obszaru, a wysokie powiększenie (40x/0,75 NA, 0,255 μm/piksel) w kroku 3.1.2 dla analizy pojedynczej komórki. Można stosować inne powiększenia, ale wymagana jest optymalizacja akwizycji i analizy obrazu. Jeśli pozwala na to dostępny mikroskop, uzyskaj obrazy jako obszary kafelków (TR), "mozaikę" ciągłych pól zwanych kafelkami, aby zarejestrować duże obszary próbki. Ustaw autofokus na środku TR zamiast ustawiać po jednym dla każdej płytki, aby zmniejszyć ekspozycję próbki podczas procedury autofokusa.

  1. Użyj programowego autofokusa w kanale barwienia komórek (niebieski kanał dla barwienia HCS i barwienia jądrowego DAPI) jako referencyjnej pozycji z. Pozyskiwanie obrazów w kanale barwienia komórek (465 nm, komórki lub jądra) oraz w kanałach reporterowych pCHAR-Duo mCherry (610 nm, wewnątrzkomórkowe Salmonellae) i GFP (509 nm, cytozolowe hiperreplikujące Salmonellae).
    1. Analiza obszaru: Obraz ≥104 komórki/kontrpróba techniczna (tj. zalecane są co najmniej trzy TR po cztery płytki/studzienka odpowiadająca powtórzeniu technicznemu) przy 10-krotnym powiększeniu.
      UWAGA: Pojedyncza płaszczyzna z jest wystarczająca do zobrazowania zarówno komórek zawierających wakuolarne, jak i komórek zawierających cytozolowe hiperreplikujące się Salmonelle przy 10-krotnym powiększeniu.
    2. Analiza pojedynczej komórki: Obraz ≥1,000 komórek/kontrpróbę techniczną (tj. zalecane są co najmniej dwa TR po 16 płytek/studzienkę odpowiadające powtórzeniu technicznemu) przy 40-krotnym powiększeniu. Do obrazowania zarówno komórek zawierających wakuolarne, jak i komórek zawierających cytozolowe hiperreplikujące się Salmonelle, wymaganych jest wiele płaszczyzn z. Zdefiniuj optymalny stos z (wskazany jest stos z 3,85 μm z odstępem 0,55 μm w celu uzyskania ośmiu płaszczyzn z do obrazowania komórek INT407 zakażonych cytozolowymi hiperreplikującymi się Salmonellami przy 40x). Każda płaszczyzna z jest dalej identyfikowana jako n/8, gdzie n mieści się między 1 (odpowiadającą dolnej płaszczyźnie z) a 8 (odpowiadającą górnej płaszczyźnie z).
  2. Wynikiem każdej akwizycji jest plik o nazwie Acquisition.czi, który zawiera obrazy wszystkich pól, kanałów i płaszczyzn z. Jeśli TR zostały uzyskane, połącz kafelki ze sobą, aby uzyskać ogólny obraz każdego TR, używając pojedynczego pliku Acquisition.czi jako danych wejściowych dla metody Stitching.

4. Analiza obrazu za pomocą ImageJ

UWAGA: Krok 4.1 i Krok 4.2 są specjalnie zaprojektowane do eksperymentu i akwizycji opisanego powyżej. Inne ustawienia eksperymentalne mogą wymagać optymalizacji analizy. Opisana jest analiza pojedynczego pliku Acquisition.czi. W przypadku analizy wsadowej znajdź skrypt analizy jednokomórkowej i skrypt analizy obszarowej jako pliki uzupełniające (Plik uzupełniający 1 i Plik uzupełniający 2). Etykiety używane w skryptach i poleceniach ImageJ są pogrubione w poniższych sekcjach.

  1. Analiza obszaru
    1. Otwórz plik Acquisition.czi w ImageJ, nazwany jako AcquisitionTitle w skrypcie: File > Open > AcquisitionTitle.czi. Otworzy się okno pokazujące wszystkie kanały. Kanały są oznaczone jako c: 1-3/3 w zależności od kolejności przejęcia. Tutaj c: 1/3 odpowiada niebieskiemu (DAPI), c: 2/3 mCherry (wewnątrzkomórkowe Salmonella), a c: 3/3 GFP (cytozolowe hiperreplikujące się Salmonella).
    2. Zredukuj losowy szum, aby przygotować obrazy do pomiaru obszaru w krokach 4.1.6 i 4.1.7.
      1. Zduplikuj okno AcquisitionTitle za pomocą polecenia Image > Duplicate > OK, aby uzyskać okno AcquisitionTitle1.
      2. Zastosuj rozmycie gaussowskie do AcquisitionTitle1 za pomocą filtru > procesu > rozmycia gaussowskiego. Pozostaw domyślną wartość Sigma jako 2 i kliknij OK. Otworzy się okno Stos procesów?, kliknij Tak, aby przetworzyć wszystkie kanały.
      3. Odejmij filtrowany przez Gaussa AcquisitionTitle1 od oryginalnego pliku AcquisitionTitle by Process > Image Calculator: wybierz AcquisitionTitle jako Image1, wybierz operację Subtract z listy rozwijanej, a następnie wybierz AcquisitionTitle1 jako Image2. Kliknij OK. Otworzy się okno Stos procesów. Kliknij Tak, aby przetworzyć wszystkie trzy obrazy (kanały) w celu uzyskania okna ResultsOfAcquisitionTitle.
    3. Podziel kanały za pomocą opcji Obraz > Kolor > Podziel kanały. Każdy obraz kanału jest teraz wyświetlany w osobnym oknie, automatycznie nazwanym przez ImageJ jako C-ResultsOfAcquisitionTitle. Tutaj C1-ResultsOfAcquisitionTitle odpowiada DAPI, C2-ResultsOfAcquisitionTitle mCherry (wewnątrzkomórkowe Salmonellae), a C3-ResultsOfAcquisitionTitle GFP (cytozolowe hiperreplikujące Salmonelle).
    4. Przetwarzaj obraz C1-ResultsOfAcquisitionTitle, aby zmierzyć obszar zajmowany przez jądra komórek nabłonka.
      1. Przejdź do Process > Smooth, aby homogenizować jąderko, które pojawia się jako w obszarze jąder.
      2. Próg obrazu C1-ResultsOfAcquisitionTitle, aby wykluczyć tło za pomocą opcji Obraz > Dostosuj próg >: zaznacz opcję Ciemne tło i wybierz opcję Czerwony z listy rozwijanej. Ustaw automatyczny próg trójkąta, a następnie użyj górnego suwaka, aby ustawić minimalną wartość progu, gdy jądra są czerwone, a tło czarne (Próg = 100, stosowany w tym protokole).
        UWAGA: Automatyczne progi opisane w krokach 4.1.4.2, 4.1.7, 4.2.3.6.1 i 4.2.4.3 są sugerowane jako wskazówka dla użytkownika w celu ręcznego zdefiniowania najlepiej dopasowanego progu dla jąder/komórek nabłonka i bakterii. Wartość progu automatycznego zostanie zastąpiona w skrypcie przez zdefiniowany próg ręczny. Zdefiniowany próg ręczny zostanie zastosowany do całej analizy wsadowej.
    5. Wybierz interesujące nas miary, korzystając z opcji Analizuj > Ustaw pomiar: Zaznacz opcję Ogranicz do progu, aby ograniczyć pomiar do pikseli progowych. Obszar kontrolny, odpowiadający całkowitemu obszarowi zajmowanemu przez piksele progowe (tj. jądra w C1-ResultsOfAcquisitionTitle, wewnątrzkomórkowe Salmonelle w C2-ResultsOfAcquisitionTitle, cytozolowe hiperreplikujące się Salmonelle w C3- ResultsOfAcquisitionTitle). Zaznacz opcję Wyświetl etykietę, aby zarejestrować tytuł i kanał pobierania dla każdego obrazu w tabeli wyników.
    6. Zmierz obszar zajmowany przez jądra za pomocą funkcji Analizuj > Mierz. Pomiary są rejestrowane w tabeli wyników, która otwiera się automatycznie.
    7. Proces C2-ResultsOfAcquisitionTitle i C3-ResultsOfAcquisitionTitle w celu zmierzenia obszaru zajmowanego odpowiednio przez ogólne wewnątrzkomórkowe Salmonelle i cytozolowe hiperreplikujące się Salmonelle. Postępuj zgodnie z krokami 4.1.4-4.1.6 z pewnymi modyfikacjami: pomiń krok wygładzania w kroku 4.1.4.1 i użyj automatycznego progu Otsu zamiast trójkąta w kroku 4.1.4.2 jako przewodnika, aby ustawić minimalną wartość progową (górny suwak), gdy salmonelle wydają się czerwone, a tło wydaje się czarne (sugerowany próg = 200).
    8. Zapisz tabelę wyników za pomocą polecenia Plik > Zapisz jako > wszystkich plików.
    9. Otwórz tabelę wyników w arkuszu kalkulacyjnym, aby obliczyć współczynniki powierzchni dla każdego analizowanego pliku AcquisitionTitle:
      1. Oblicz współczynnik infekcji: podziel obszar zajmowany przez całkowite wewnątrzkomórkowe Salmonelle (tutaj czerwony kanał, C2-) przez obszar zajmowany przez jądra komórek nabłonkowych (tutaj DAPI, C1-).
      2. Oblicz współczynnik hiperreplikacji: podziel obszar zajmowany przez cytozolowe hiperreplikujące się Salmonelle (zielony kanał, C3-) przez obszar zajmowany przez całkowite wewnątrzkomórkowe Salmonelle (kanał czerwony, C2-).
  2. Analiza jednokomórkowa
    1. Otwórz plik Acquisition.czi w ImageJ, nazwany jako AcquisitionTitle w skrypcie: File Menu > Open > Acquisition.czi. Otworzy się okno pokazujące obrazy wszystkich kanałów i wszystkich płaszczyzn z.
    2. Podziel kanały według opcji Obraz > Kolor > Podziel kanały. Kanały są teraz wyświetlane w oddzielnych oknach, automatycznie nazwanych przez ImageJ jako C-AcquisitionTitle. W tym przypadku okno C1-AcquisitionTitle odpowiada komórkom nabłonkowym (niebieskim), okno C2-AcquisitionTitle wewnątrzkomórkowym Salmonellom (mCherry), a okno C3-AcquisitionTitle cytozolowemu hiperreplikującemu kanałowi Salmonelli (GFP). Każde okno C-AcquisitionTitle zawiera wszystkie uzyskane płaszczyzny z.
    3. Przetwórz okno C1-AcquisitionTitle, odpowiadające komórkom nabłonkowym, w celu segmentacji komórek.
      1. Wybierz obraz płaszczyzny z, który ma być używany do segmentacji komórek. Wybierz okno C1-AcquisitionTitle i użyj opcji Image > Duplicate: wpisz numer wybranej płaszczyzny z (tj. 1, aby wybrać z 1/8), wpisz C1Zplane w polu Tytuł, odznacz Duplicate Stack, a następnie kliknij OK, aby zduplikować tylko wybrany obraz z-plane. Otworzy się okno o nazwie C1Zplane pokazujące wybrany obraz płaszczyzny z.
      2. Przetwórz uzyskany obraz C1Zplane, aby zwiększyć kontrast obrazu. Otwórz Proces > Zwiększ kontrast: dostosuj nasycone piksele (tj. tutaj używany jest 1%) i zaznacz Normalizuj. Następnie kliknij OK, aby zastosować technikę poprawy kontrastu w celu uzyskania obrazu C1Zplane ze znormalizowanym kontrastem.
      3. Przetwarzaj obraz C1Zplane ze znormalizowanym kontrastem, aby podzielić komórki nabłonka na segmenty. Użyj opcji Process > Find Maxima, aby otworzyć menu FindMaxima: najpierw oznacz opcję Podgląd wyboru punktu, aby ustawić Tolerancję szumu, aby przypisać tylko jeden punkt maksimum do każdej pojedynczej komórki nabłonka. Oznacz flagę Wyklucz maksima krawędzi. Wybierz typ wyjścia Segmented Particles i kliknij OK, aby uzyskać C1ZplaneSegmented, nowy binarny obraz przypominający maskę, pokazujący każdą segmentowaną cząstkę na maksymalny punkt oznaczony.
        UWAGA: Algorytm Find Maxima ImageJ służy do segmentacji komórek. Punkty maksimum (szczyty intensywności pikseli) są wykrywane na całym obrazie, potencjalnie odpowiadając komórkom. Ustawiany jest próg szumu (tolerancja szumu), a ciągły obszar wokół punktów maksimów jest analizowany w celu utworzenia binarnego obrazu przypominającego maskę, definiującego każdą cząstkę podzieloną na segmenty na punkt maksimum, a więc każdą komórkę.
      4. Przetwarzaj obraz C1ZplaneSegmented, aby utworzyć maskę komórek podzielonych na segmenty. Użyj opcji Analizuj > Analizuj cząstki: wybierz opcję Pokaż maski i Wyklucz na krawędziach. Dostosuj zakres obszaru cząstki podzielonych na segmenty, które mają zostać uwzględnione w masce, odpowiadający parametrowi Rozmiar, aby wykluczyć nieprawidłowo podzielone na segmenty obiekty, takie jak klastry komórek i frakcje komórek. Aby ocenić obszar błędnie podzielonych na segmenty obiektów, użyj narzędzia Różdżka na pasku narzędzi: wybierz cząstkę za pomocą różdżki, a następnie otwórz Analizuj > Zmierz, aby zmierzyć obszar błędnych obiektów. Ustaw przedział rozmiaru (sugerowany zakres 250-1700 pikseli2) i kliknij OK, aby uzyskać maskę binarną MaskofC1ZplaneSegmented.
      5. Domyślnie maska binarna MaskOfC1ZplaneSegmented ma odwracającą tablicę LUT. Użyj LUT > Odwróć LUT na pasku narzędzi.
      6. Przetwórz maskę binarną MaskOfC1ZplaneSegmented, aby poprawić segmentację komórek:
        1. Próg obrazu C1Zplane ze znormalizowanym kontrastem uzyskany w kroku 4.2.3.2. Użyj obrazu > Dostosuj próg >: zaznacz Ciemne tło. Ustaw domyślne ustawienie automatycznego progu. Wybierz opcję Czerwony i dostosuj minimalną wartość odcięcia (górny pasek), aż komórki staną się całkowicie czerwone, pozostawiając ciemne tło (próg = 8 000 zastosowany w tym protokole). Następnie kliknij Zastosuj, aby przekonwertować obraz C1Zplane ze znormalizowanym kontrastem na obraz binarny z komórkami w kolorze białym i tłem w kolorze czarnym.
        2. Poprawna segmentacja komórek w masce binarnej MaskOfC1ZplaneSegmented. Użyj kalkulatora obrazu > procesu: wybierz MaskOfC1ZplaneSegmented jako Image1, wybierz operację AND z listy rozwijanej, a następnie wybierz progową płaszczyznę C1Zplane ze znormalizowanym kontrastem jako Image2. Kliknij OK. Obraz wyjściowy jest automatycznie nazywany przez ImageJ jako Wyniki maski C1Zplane segmentowany.
      7. Wyniki procesu maski C1Zplane Segmentowane, aby oznaczyć każdą pojedynczą komórkę segmentowaną jako obszar zainteresowania (ROI). Użyj funkcji Analizuj > Analizuj cząstki. Dostosuj rozmiar jak w kroku 4.2.3.4, a następnie wybierz opcję Nic nie pokazuj. Zaznacz opcję Dodaj do Menedżera, aby dodać wszystkie cząstki (segmentowane komórki) do narzędzia Menedżer ROI. Zaznacz także opcję Wyklucz na krawędziach. Kliknij OK. Menu Menedżera ROI pokaże listę wszystkich cząstek (komórek podzielonych na segmenty), zdefiniowanych jako ROI, jednoznacznie oznaczonych odpowiednimi współrzędnymi y i x.
      8. Zapisz dane ROI w ROI-cells-AcquisitionTitle.zip za pomocą menu Menedżera ROI, klikając Więcej > Zapisz. ROI-cells-AcquisitionTitle.zip zostanie otwarty w kroku 4.2.4.6 dla analizy pojedynczej komórki.
    4. Przetwarzaj okno C2-AcquisitionTitle (tutaj czerwony kanał), odpowiadające wewnątrzkomórkowym Salmonellom, aby zmierzyć liczbę zakażonych komórek i wewnątrzkomórkowe obciążenie wakuolarne.
      1. Odejmij kanał zielony (C3-) od kanału czerwonego (C2-), aby usunąć nieostre piksele hiperreplikujących się cytozolowych Salmonelli.
        1. Użyj kalkulatora obrazów > procesowych. Wybierz pozycję C2-Acquisitiontitle jako Image1, wybierz operację Subtract z listy rozwijanej, a następnie wybierz pozycję C3-Acquisitiontitle jako Image2. Zaznacz Utwórz nowe okno i kliknij OK.
        2. Zastosuj odejmowanie do całego stosu z, klikając Tak w stosie procesów? okno. Okno danych wyjściowych nosi nazwę ResultsOfC2AcquisitionTitle w skrypcie.
      2. Process ResultsOfC2AcquisitionTitle w celu zmniejszenia przypadkowego szumu.
        1. Zduplikuj okno ResultsOfC2AcquisitionTitle, klikając menu Obraz > Duplikuj. Zaznacz opcję Duplicate Stack (Zduplikowany stos) i naciśnij przycisk OK, aby wyświetlić okno ResultsOfC2AcquisitionTitle1.
        2. Zastosuj rozmycie gaussowskie do okna ResultsOfC2AcquisitionTitle1 za pomocą opcji Process > Filter > Gaussian Blur. Pozostaw wartość Sigma jako 2 lub dostosuj ją (np. tutaj użyto Sigma: 4). Kliknij OK i zastosuj rozmycie gaussowskie do całego stosu z, klikając Tak w oknie Process Stack?.
        3. Odejmij przefiltrowane przez Gaussa ResultsOfC2AcquisitionTitle1 do ResultsOfC2AcquisitionTitle, klikając Process > Image Calculator. Wybierz pozycję ResultsOfC2AcquisitionTitle jako Image1, wybierz pozycję Operation Subtract (Odejmij) z listy rozwijanej, a następnie wybierz pozycję ResultsOfC2AcquisitionTitle1 jako Image2. Kliknij OK. Zastosuj odejmowanie do całego stosu z, klikając Tak w oknie Stos procesów?, aby uzyskać okno automatycznie nazwane przez ImageJ jako Wyniki wyników C2-AcquisitionTitle.
      3. Przetwarzaj wyniki C2-AcquisitionTitle, aby oddzielić Salmonelle od tła. Użyj obrazu > Dostosuj próg >: zaznacz Ciemne tło i ustaw automatyczny próg Otsu. Dostosuj minimalną wartość odcięcia (górny pasek), aż Salmonella stanie się całkowicie czerwona, pozostawiając ciemne tło (próg = 100 zastosowany w tym protokole). Kliknij Zastosuj, a otworzy się okno Konwertuj na binarne: zaznacz Czarne tło, a następnie kliknij OK. Pełny stos z jest teraz konwertowany na obrazy binarne.
      4. Wybierz środkową płaszczyznę Z, odpowiadającą wakuolarnej płaszczyźnie ostrości Salmonellae, w wynikach okna binarnego Wyniki C2-AcquisitionTitle z kroku 4.2.4.3: Image > Stacks > Set Slice i wpisz numer wybranej płaszczyzny Z (np. tutaj z: 4/8 jest używany). Kliknij OK.
      5. Ustaw pomiary do zarejestrowania dla każdego ROI (komórki). Użyj opcji Analizuj > ustaw pomiar: sprawdź obszar, odpowiadający całkowitemu obszarowi każdego zwrotu z inwestycji. Sprawdź Frakcja obszaru i Ogranicz do progu, aby zarejestrować tylko część obszaru zajętą przez piksele progowe (wewnątrzkomórkowe Salmonelle) dla każdego ROI. Zaznacz opcję Wyświetlaj etykietę, aby oznaczyć każdy pojedynczy zwrot z inwestycji tytułem obrazu, kanałem, płaszczyzną z i współrzędnymi x-y w tabeli wyników.
      6. Przetwarzaj wybraną płaszczyznę Z wewnątrzkomórkowych Salmonelli na etykiety zapisów, Obszar i %Obszar zajmowany przez Salmonelle dla każdej pojedynczej komórki (ROI): otwórz plik ROI-cells-AcquisitionTitle.zip, zapisany w kroku 4.2.3.8, przez File > Open i kliknij Zmierz w menu Menedżer ROI. Wynikiem jest tabela przedstawiająca wybrane pomiary.
      7. Zapisz tabelę wyników za pomocą polecenia Plik > Zapisz jako w oknie wyników.
      8. Otwórz ResultTable w arkuszu kalkulacyjnym: etykieta Obszar i %Obszar zajmowany przez wewnątrzkomórkowe Salmonelle są wskazane dla każdego ROI, odpowiadając konturowej komórce jednoznacznie zidentyfikowanej za pomocą współrzędnych x i y.
      9. Zmierz liczbę zainfekowanych komórek odpowiadającą ROI wykazującą %Obszar > 0 zajęty przez piksele progowe, odpowiadające Salmonellom (tj. w tym przypadku uważa się, że %Obszar > 0,2% jest uważany za identyfikację zakażonych komórek). Następnie oblicz procent zainfekowanych komórek w wszystkich komórkach.
      10. Zmierzyć obciążenie wakuolarne Salmonelli/komórki, obliczając średni % Obszar zajmowany przez wakuolarne Salmonelle dla wszystkich zakażonych komórek.
    5. Przetwarzaj zielony kanał (C3-AcquisitionTitle) w celu zmierzenia liczby komórek wykazujących cytozolowe hiperreplikujące się Salmonellae. Postępuj zgodnie z krokami od 4.2.4.2 do 4.2.4.9, ale z pewnymi modyfikacjami.
      1. Pracuj nad górnymi płaszczyznami z (tutaj z:7/8), ponieważ komórki wykazujące cytozolowe hiperreplikujące się Salmonelle wystają z monowarstwy; dlatego są one skupione na innej płaszczyźnie w porównaniu z komórkami bez hiperreplikujących Salmonelli.
      2. Zmierz liczbę komórek zawierających cytozolowe hiperreplikujące się Salmonelle (kolor zielony), oceniając komórki (ROI) wykazujące wysoki %Obszar zajmowany przez Salmonelle (np. Obszar %> 20% jest uważany za identyfikację komórek zawierających cytozolowe hiperreplikujące Salmonelle). Następnie oblicz odsetek komórek zawierających cytozolowe hiperreplikujące się Salmonelle w całkowitej liczbie zakażonych komórek ocenionych w kroku 4.2.4.9.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zakażenie komórek nabłonka szczepami Salmonella
Protokół ten został opracowany w celu analizy inwazji komórkowej i replikacji cytozolowej (Figura 1A) w porównaniu z obciążeniem wakuolarnym (Figura 1B) Salmonelli wewnątrz komórek nabłonkowych. Protokół został zweryfikowany przy użyciu trzech następujących szczepów Salmonella: S. Szczep referencyjny Typhimurium SL1344 (S. Tm), s. Derby ER1175 typu dzikiego (S. Derby wt) i izogeniczny mutant S. Derby ER1175 bez genu sipA (S. Derby ΔsipA). Szczep S. Derby ER1175 został wyizolowany ze świń i należy do kolekcji IZSLER izolatów Salmonelli. Szczepy zostały wybrane w taki sposób, aby reprezentowały różnorodność fenotypową objętą protokołem. W szczególności szczepy te zostały wybrane, ponieważ ich zachowanie wewnątrz komórek nabłonkowych było już znane z tego, że różni się pod względem inwazji lub replikacji9; w związku z tym były one cennymi kontrolami w celu sprawdzenia, czy protokół pozwala na ilościowe rozróżnienie różnic w wewnątrzkomórkowych fenotypach Salmonelli. W szczególności S. Tm i S. Derby wt zostały uwzględnione, ponieważ wcześniej wykazaliśmy, że S. Tm ma wyższą wydajność inwazji i replikacji wewnątrzkomórkowej niż S. Derby wt9 while S. Derby ΔsipA został dodany jako szczep z upośledzoną hiperreplikacją, ponieważ efektor wirulencji SipA odgrywa kluczową rolę w rozpoczęciu hiperreplikacji10,11. Wcześniej informowano o tym dla S. Tm, że replikacja cytozolowa rozpoczyna się 4 godziny po inwazji, a następnie populacja cytozolowa szybko hiperreplikuje, aby wypełnić komórkę nabłonkową przez 8 h11,12. Konsekwentnie, trwająca 8 godzin infekcja była odpowiednia do obserwacji i ilościowego określenia fenotypu hiperreplikacji cytozolu również w S. Derby wt i S. Derby ΔsipA.

Analiza obszaru
Analiza obszaru w kroku 4.1 zapewnia pomiar ogólnej kolonizacji komórek nabłonka przez Salmonellę (współczynnik infekcji) wraz z pomiarem hiperreplikacji (współczynnik hiperreplikacji). W procesie analizy obszaru opisanym w Rysunek 2, losowy szum jest redukowany, a następnie kanały są dzielone i przetwarzane niezależnie. Dla każdego kanału ustawiany jest próg, aby wykluczyć tło z pomiaru powierzchni. Następnie mierzony jest obszar zajmowany przez piksele progowe dla każdego kanału. Wynikiem analizy obszaru jest tabela przedstawiająca, dla każdego pliku akwizycji, rozszerzenie obszarów zajmowanych przez jądra komórek nabłonkowych (kanał niebieski), wewnątrzkomórkowe Salmonelle eksprymujące mCherry (kanał czerwony) i cytozolowe hiperreplikujące Salmonelle, które wyrażają GFP (zielony kanał) wraz z mCherry. Współczynnik infekcji oblicza się, dzieląc obszar zajmowany przez Salmonelle wykazujące ekspresję mCherry przez obszar zajmowany przez jądra komórek gospodarza. Wyniki badanych szczepów wykazały, że S. Tm wykazuje znacznie wyższy współczynnik infekcji w porównaniu z obydwoma S. Szczepy Derby, zgodnie z oczekiwaniami (Rysunek 3A). Dlatego wyniki te pokazują skuteczność analizy obszaru w wykrywaniu różnic w zdolności szczepów Salmonelli do kolonizacji komórek nabłonkowych. Współczynnik hiperreplikacji salmonelli mierzy się, dzieląc obszar zajmowany przez Salmonelle wykazujące ekspresję GFP przez obszar zajmowany przez wewnątrzkomórkowe Salmonelle wykazujące ekspresję mCherry. Zgodnie z rolą SipA w określaniu hiperreplikacji, znacznie zmniejszony współczynnik hiperreplikacji dla S. Szczep Derby ΔsipA zmierzono w porównaniu z S. Derby wt, (Rysunek 3B). Nie zaobserwowano różnicy w hiperreplikacji między S. Tm i S. Derby wt. Ogólnie rzecz biorąc, analiza obszaru skutecznie ujawniła różne poziomy hiperreplikacji wśród badanych szczepów.

Analiza pojedynczej komórki
Analiza pojedynczych komórek pozwala na ilościowe określenie inwazji Salmonelli i obciążenia wakuolarnego w porównaniu z replikacją cytozolową wewnątrz komórek nabłonkowych z rozdzielczością pojedynczej komórki. Jak opisano w kroku 4.2, dla każdego pliku akwizycji kanały niebieski, czerwony i zielony były przetwarzane niezależnie (Rysunek 4). W szczególności niebieski kanał, odpowiadający komórkom nabłonkowym, został przetworzony w kroku 4.2.3 w celu uzyskania segmentacji komórek. Następnie segmentowane komórki zostały dodane do Menedżera obszaru zainteresowania (ROI) w celu uzyskania listy ROI, odpowiadającej wszystkim segmentowanym komórkom jednoznacznie oznaczonym współrzędnymi y-x. W celu usunięcia nieostrych pikseli hiperreplikujących się Salmonelli z ekspresją GFP, piksele kanału zielonego zostały odjęte od pikseli kanału czerwonego. Tabela wyników analizy pojedynczej komórki podaje, dla każdego ROI, obszar i procent obszaru ROI zajmowany przez Salmonelle wyrażające tylko konstytutywny reporter mCherry lub reporter reagujący na cytozol GFP. Procent powierzchni komórki zajmowany przez mCherry eksprymujące tylko Salmonelle został przetworzony w kroku 4.2.4 w celu obliczenia procentu zakażonych komórek i średniego obciążenia wakuolarnego (Rysunek 5A). Analiza obciążenia wakuolarnego wykazała, że S. Szczepy Derby generują średnie obciążenie wakuolarne znacznie niższe niż S. Tm (Rysunek 5B). Z kolei w S zaobserwowano jedynie nieznaczne i nieistotne zmniejszenie odsetka zakażonych komórek. Szczepy Derby w porównaniu do S. Tm (Rysunek 5A). Procent powierzchni komórki zajmowany przez Salmonelle wykazujące ekspresję GFP został przetworzony w kroku 4.2.5 w celu uzyskania szybkości hiperreplikacji. Nie zaobserwowano różnicy między S. Tm i S. Derby wt, podczas gdy S. Derby ΔsipA wykazywał znaczny spadek hiperreplikacji, zgodny z wynikiem analizy obszaru (Rysunek 5C) i rolą SipA w indukowaniu hiperreplikacji.

figure-results-1
Rysunek 1: Hiperreplikacja cytozolowa Salmonelli i obciążenie wakuolarne. Pokazano reprezentatywne obrazy (A) hiperreplikacji Salmonelli i (B) obciążenia wakuolarnego uzyskanego przy dużym powiększeniu (40x). Panel B pokazuje różne płaszczyzny ostrości komórek zawierających hiperreplikujące się Salmonelle (z:7/8) w porównaniu z niehiperreplikującymi się Salmonellami (z:4/8). Białe paski skali mają rozmiar 10 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Przebieg analizy obszaru. Przebieg analizy obszaru przedstawiono dla reprezentatywnej akwizycji w małym powiększeniu (10x) komórek INT407 zakażonych przez 8 godzin Salmonellą przenoszącą plazmid pCHAR-Duo (MOI 100). Najpierw redukowany jest losowy szum, a następnie kanały są dzielone na C1, C2 i C3 i przetwarzane niezależnie. Dla każdego kanału ustawiany jest próg, aby wykluczyć tło z obszaru pomiaru. Następnie dla każdego kanału mierzy się obszar zajmowany tylko przez piksele progowe - odpowiadające jądrom komórkowym w C1, wszystkim wewnątrzkomórkowym Salmonellom w C2 i cytozolowym Salmonellom w C3. Analizowane tutaj obrazy są wynikami czterech płytek uzyskanych w 10-krotnym powiększeniu, połączonych ze sobą przez zszycie. Białe paski skali to 100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Wyniki analizy obszaru. Zostaną wyświetlone wyniki analizy obszaru. (A) Współczynnik infekcji oblicza się, dzieląc obszar zajmowany przez Salmonelle wykazujące ekspresję mCherry (kanał C2), reprezentujący wszystkie bakterie wewnątrzkomórkowe, przez obszar zajmowany przez jądra komórek gospodarza (kanał C1). (B) Współczynnik hiperreplikacji mierzono, dzieląc obszar zajmowany przez Salmonelle eksprymujące GFP (kanał C3), reprezentujący tylko cytozolowe bakterie hiperreplikujące, przez obszar zajmowany przez wszystkie wewnątrzkomórkowe Salmonelle wykazujące ekspresję mCherry. Każda kropka reprezentuje replikę. Analizę przeprowadzono na trzech kontrpróbach biologicznych, z których każdy testowano w trzech egzemplarzach. Czarne linie wskazują wartości średnie. Istotność została obliczona za pomocą dwustronnego testu t, a wartości p są podawane. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Przebieg analizy pojedynczej komórki. Przebieg analizy pojedynczych komórek przedstawiono dla reprezentatywnej akwizycji w dużym powiększeniu (40x) komórek INT407 zakażonych przez 8 godzin Salmonellą przenoszącą plazmid pCHAR-Duo (MOI 100). Po pierwsze, kanały są dzielone na C1, C2 i C3 i przetwarzane niezależnie. Kanał niebieski (C1), odpowiadający komórkom nabłonkowym, jest przetwarzany w celu uzyskania segmentacji komórek, a następnie każda segmentowana komórka jest definiowana jako region zainteresowania (ROI) jednoznacznie oznaczony współrzędnymi y-x. Kanał czerwony (C2) jest przetwarzany przez odjęcie kanału zielonego (C3) w celu usunięcia nieostrych, cytozolowych hiperreplikujących się Salmonelli, pozostawiając wszystkie wakuolarne Salmonelle z ekspresją tylko mCherry, a następnie losowy szum został zredukowany, a próg jest ustawiony tak, aby wykluczyć tło z pomiarów. Na koniec mierzy się obszar zajmowany przez wakuolarne Salmonelle dla każdego ROI. Zielony kanał (C3), odpowiadający całkowitej cytozolowej ekspresji GFP Salmonellae, jest przetwarzany podobnie. Analizowane tutaj obrazy są wynikiem 16 płytek połączonych ze sobą za pomocą zszywania. Białe paski skali to 100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Wyniki analizy pojedynczej komórki. Przedstawiono wyniki analizy pojedynczej komórki. (A) Odsetek zakażonych komórek uzyskuje się przez podzielenie liczby komórek o procentowej powierzchni zajmowanej przez Salmonelle wykazujące ekspresję tylko mCherry> 0,2 przez całkowitą liczbę komórek. (B) Średnie obciążenie wakuolarne uzyskano przez obliczenie średniego procentu powierzchni zajmowanej przez Salmonelle wykazujące ekspresję mCherry w zakażonych komórkach. (C) Szybkość hiperreplikacji obliczono, dzieląc liczbę komórek o procentowym odsetku powierzchni zajmowanej przez Salmonelle wykazujące ekspresję GFP ≥20% przez całkowitą liczbę zakażonych komórek. Podano dane z trzech do czterech powtórzeń biologicznych badanych w trzech egzemplarzach. Słupki wskazują standardowy błąd pomiaru. Istotność została obliczona za pomocą dwustronnego testu t, a wartości p są podawane. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Plik uzupełniający 1: Skrypt analizy obszaru. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 2: Skrypt analizy pojedynczej komórki. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sposób, w jaki Salmonella kolonizuje komórki nabłonka jelitowego, wpływa na wynik infekcji. Po inwazji hiperreplikacja cytozolowa indukuje stan zapalny jelit3, podczas gdy replikacja wakuolarna może prowadzić do rozprzestrzeniania się ogólnoustrojowego4. Szczepy Salmonelli mogą różnić się pod względem zdolności do inwazji i replikacji wewnątrz komórek nabłonka jelitowego9. Rzeczywiście, Salmonella jest niezwykle różnorodnym rodzajem obejmującym ponad 2500 serowarów, które mają różne zdolności do wywoływania chorób. Ponadto salmonella jest najczęściej zgłaszaną przyczyną epidemii przenoszonych przez żywność w Unii Europejskiej, co wskazuje na duże rozprzestrzenianie się w populacji ludzkiej1. W związku z tym dostępność wiarygodnych, wysokoprzepustowych metod ilościowego oznaczania wewnątrzkomórkowych fenotypów Salmonelli ma ogromne znaczenie dla oceny różnic w zjadliwości wśród dużej liczby szczepów Salmonelli i ostatecznie umożliwia dokładną i specyficzną dla szczepu ocenę ryzyka tego patogenu.

Opisany tutaj protokół mierzy zachowanie Salmonelli w komórkach nabłonka w szybki i zautomatyzowany sposób. Infekcja komórek nabłonka odbywa się w 96-dołkowych mikropłytkach obrazowych, a do akwizycji obrazu wykorzystuje się automatyczny mikroskop fluorescencyjny, dzięki czemu protokół nadaje się do zastosowań o wysokiej przepustowości. Protokół ten wykorzystuje plazmid pCHAR-Duo, który umożliwia odróżnienie salmonelli wakuolarnych od cytozolowych poprzez różnicową ekspresję dwóch reporterów fluorescencyjnych5. Wewnątrzkomórkowe fenotypy Salmonelli są często analizowane za pomocą ręcznej oceny, co jest czasochłonną procedurą, która nie nadaje się do analizy dużej liczby szczepów i kultur komórkowych na szczep oraz jest podatna na błędy operatora i zmienność międzyoperatorską. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, opracowano dwie uzupełniające się i zautomatyzowane analizy obrazu: analizę obszaru i analizę pojedynczych komórek. Do opracowania obu analiz wykorzystano ogólnodostępne oprogramowanie ImageJ. W celu przyspieszenia wykonywania protokołu, skrypty ImageJ do analizy wsadowej wielu plików akwizycji bez interwencji operatora są dostarczane jako pliki uzupełniające.

Analiza obszaru została zaprojektowana w celu ilościowego określenia, w kilku krokach, ogólnej kolonizacji komórek nabłonkowych (współczynnik infekcji) i poziomu hiperreplikacji (współczynnik hiperreplikacji) poprzez pomiar obszarów specyficznie zajmowanych przez jądra komórek nabłonkowych i przez Salmonelle wykazujące ekspresję mCherry lub mCherry wraz z GFP. Analiza obszaru jest stosowana do obrazów uzyskanych w małym powiększeniu, gdzie zarówno wakuolne, jak i hiperreplikujące się Salmonelle są ostre w tej samej płaszczyźnie z, a w polu mikroskopowym wyświetlana jest duża liczba komórek nabłonkowych, co zmniejsza rozmiar i liczbę plików akwizycji. Analiza obszaru pozwala na zautomatyzowaną, szybką i lekką obliczeniowo analizę dużej liczby próbek, dzięki czemu nadaje się do testów o wysokiej przepustowości, takich jak eksperymenty przesiewowe.

Analiza pojedynczych komórek została zaprojektowana w celu ilościowego określenia fenotypów Salmonelli wewnątrz komórek nabłonkowych z rozdzielczością pojedynczej komórki, uzyskaną poprzez segmentację komórek i pomiar obszaru komórkowego oraz procentu obszaru zajmowanego przez wakuolarne i cytozolowe hiperreplikujące się Salmonelle. Ogólna kolonizacja komórek nabłonkowych scharakteryzowana za pomocą analizy obszaru jest tutaj podzielona na trzy parametry ilościowe: procent zakażonych komórek, średnie obciążenie wakuolarne i szybkość hiperreplikacji, co pozwala ocenić i określić ilościowo wkład każdego fenotypu w ogólną kolonizację, uzupełniając w ten sposób wyniki analizy obszarowej. Większa szczegółowość oferowana przez analizę pojedynczych komórek odbywa się kosztem wolniejszego pozyskiwania i analizy obrazu. W rzeczywistości, aby osiągnąć rozdzielczość pojedynczej komórki, akwizycja obrazu odbywa się przy dużym powiększeniu. Oznacza to, że do obserwacji zarówno wakuolarnych, jak i cytozolowych Salmonelli w centrum uwagi potrzebnych jest wiele płaszczyzn z oraz że do uzyskania dużej liczby komórek nabłonkowych potrzebne jest uzyskanie dużej liczby pól na próbkę, wydłużając w ten sposób czas akwizycji w porównaniu z analizą obszaru. Ponadto analiza kilku dużych plików akwizycji jest wymagająca obliczeniowo, a co za tym idzie wymaga odpowiedniej stacji roboczej (zastosowano 6-rdzeniową stację roboczą o pojemności 32 GB RAM). W związku z tym analiza pojedynczych komórek może być stosowana jako samodzielna metoda w warunkach ograniczonej przepustowości lub jako metoda drugiego poziomu sprzężona z analizą obszaru w celu lepszego zrozumienia fenotypów Salmonelli wewnątrz komórek nabłonkowych.

Dwie uzupełniające się analizy zostały zweryfikowane przy użyciu S. Tm, S. Derby wt i S. Derby ΔsipA, wybrane, ponieważ ich zachowanie wewnątrz komórek nabłonkowych było już znane z tego, że różni się pod względem inwazji lub replikacji 9,10. Wyniki analiz obszarowych i jednokomórkowych wskazują, że protokół pozwolił na ilościowe rozróżnienie różnic w wewnątrzkomórkowych fenotypach Salmonelli zgodnie z charakterystyką badanych szczepów. Co więcej, wyniki te pokazują, że analiza pojedynczej komórki pozwala na ilościowe określenie udziału każdego fenotypu wewnątrzkomórkowego (inwazja, obciążenie wakuolarne i replikacja cytozolowa) w ogólnej kolonizacji uzyskanej za pomocą analizy obszaru.

Protokół ten został zastosowany do badania patogenności in vitro różnych szczepów Salmonelli, ale może mieć inne zastosowania, takie jak badanie losowych mutantów w celu identyfikacji genów zaangażowanych w inwazję i/lub replikację wewnątrz komórek nabłonkowych. Ponadto protokół można dostosować do analizy zachowania Salmonelli w innych liniach komórkowych niż komórki INT407. Może być również wykorzystany jako punkt wyjścia do opracowania podobnych metod badania interakcji komórka-patogen innych mikroorganizmów wewnątrzkomórkowych.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają sprzecznych interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować dr Olivii Steele-Mortimer za udostępnienie plazmidu pCHAR-Duo. Prace te zostały sfinansowane przez włoskie Ministerstwo Zdrowia, granty PRC2019014 i PRC2021004.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
96-dołkowa mikropłytka obrazowaEppendorf30741030Hodowla komórkowa i infekcja
AmpicylinaSigma-Aldrich59349Hodowla bakterii
Mikroskop odwrócony obserwatora AxioZEISSAutomatyczny mikroskop fluorescencyjny
Axiocam 305 MonoKamera mikroskopowaZEISS
Oddychająca membranauszczelniającaSigma-AldrichZ380059Test infekcji
Colibrì 5/7ZEISSŹródło światła LED
Kolagen I ogon szczuraTechnologiesA1048301Powłoka kolagenowa
DAPIInvitrogenD3571Barwienie komórek
Surowica bydlęcapłodu Gibco10099-141Hodowla komórkowa i zakażenie
GentamycynaSigma-AldrichG12664Test infekcji
Lodowaty kwas octowyCarlo Erba401391Powłoka kolagenowa
HCS CellMask BlueInvitrogenH32720Barwienie komórek
ImageJNational Institutes of Health i Laboratorium Oprzyrządowania Optycznego i Obliczeniowego (LOCI, University of Wisconsin)Oprogramowanie do przetwarzania obrazu
Minimum Niezbędne Eagle's MediumSigma-AldrichM5650-500MLHodowla komórkowa i infekcja
Paraformaldehyd 4%InvitrogenFB002Utrwalanie komórek
Chlorek potasuPanReac AppliChem131494.1211Preparat PBS
Fosforan potasu jednozasadowySigma-Aldrich60220PBS
Chlorek soduPanReac AppliChem131659.1214Hodowla bakterii i preparat PBS
Fosforan sodu dwuzasadowySigma-Aldrich71640Preparat PBS
Kolba do hodowli tkankowych 25 cm2 korek uszczelka nakrętkaEurocloneET7025Hodowla komórkowa
Triton X-100Biorad1610407Barwienie komórek
Trypsyna-EDTA (0,25%)Gibco25200056Hodowla komórkowa i infekcja
TryptonOxoidLP0042BKultura bakterii
Ekstrakt drożdżowyBiolife4122202Kultura bakterii
Life

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. European Food Safety Authority & European Centre for Disease Prevention and Control. The European Union One Health 2020 Zoonoses Report. EFSA Journal. 19 (12), 6971(2021).
  2. Fattinger, S. A., Sellin, M. E., Hardt, W. D. Salmonella effector driven invasion of the gut epithelium: breaking in and setting the house on fire. Current Opinion in Microbiology. 64, 9-18 (2021).
  3. Knodler, L. A., et al. Dissemination of invasive Salmonella via bacterial-induced extrusion of mucosal epithelia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (41), 17733-17738 (2010).
  4. Fulde, M., et al. Salmonella SPI2 T3SS mediates transcytosis in polarized enterocytes in vivo. Cell Host & Microbe. , (2019).
  5. Cooper, K. G., Chong, A., Starr, T., Finn, C. E., Steele-Mortimer, O. Predictable, tunable protein production in Salmonella for studying host-pathogen interactions. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 475(2017).
  6. Klein, J. A., Grenz, J. R., Slauch, J. M., Knodler, L. A. Controlled activity of the Salmonella invasion-associated injectisome reveals its intracellular role in the cytosolic population. mBio. 8 (6), 01931(2017).
  7. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  8. Ibarra, J. A., et al. Induction of Salmonella pathogenicity island 1 under different growth conditions can affect Salmonella-host cell interactions in vitro. Microbiology. 156 (4), 1120-1133 (2010).
  9. Tambassi, M., et al. Mutation of hilD in a Salmonella Derby lineage linked to swine adaptation and reduced risk to human health. Scientific Reports. 10 (1), 21539(2020).
  10. Finn, C. E., Chong, A., Cooper, K. G., Starr, T., Steele-Mortimer, O. A second wave of Salmonella T3SS1 activity prolongs the lifespan of infected epithelial cells. PLoS Pathogens. 13 (4), 1006354(2017).
  11. Knodler, L. A., Nair, V., Steele-Mortimer, O. Quantitative assessment of cytosolic Salmonella in epithelial cells. PLoS One. 9 (1), 84681(2014).
  12. Chong, A., Starr, T., Finn, C. E., Steele-Mortimer, O. A role for the Salmonella Type III Secretion System 1 in bacterial adaptation to the cytosol of epithelial cells. Molecular Microbiology. 112 (4), 1270-1283 (2019).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Salmonella PhenotypesIntracellular SalmonellaImageJ AnalysisFluorescence MicroscopyEpithelial CellsCytosolic Hyper ReplicationVacuolar ReplicationSingle Cell AnalysisHigh Throughput ScreeningCell Segmentation

Powiązane artykuły