Method Article

Współhodowla i transdukcja mysich tymocytów na komórkach zrębowych z ekspresją 4 podobną do delta w celu badania onkogenów w białaczce z komórek T

DOI:

10.3791/64271

⸱

June 9th, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Cytokines and Immunity Section, Cancer Innovation Laboratory, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 2Comparative Biomedical Scientist Training Program, NIH, 3Department of Pathobiology and Diagnostic Investigation, Veterinary Diagnostic Laboratory, Michigan State University, 4NCI-Frederick Laboratory Animal Sciences Program

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje izolację podwójnie ujemnych tymocytów z grasicy myszy, a następnie transdukcję retrowirusową i kohodowlę w systemie kohodowli linii komórek zrębu szpiku kostnego z ekspresją delta 4 (OP9-DL4) w celu dalszej analizy funkcjonalnej.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transdukowane niedojrzałe mysie tymocyty mogą być różnicowane w limfocyty T in vitro za pomocą systemu kohodowli linii komórek zrębu szpiku kostnego o ekspresji delta-4 (OP9-DL4). Ponieważ transdukcja retrowirusowa wymaga podziału komórek w celu integracji transgenu, OP9-DL4 zapewnia odpowiednie środowisko in vitro do hodowli hematopoetycznych komórek progenitorowych. Jest to szczególnie korzystne podczas badania wpływu ekspresji określonego genu podczas prawidłowego rozwoju limfocytów T i białaczkowania, ponieważ pozwala naukowcom obejść czasochłonny proces generowania myszy transgenicznych. Aby osiągnąć pomyślne wyniki, należy starannie przeprowadzić szereg skoordynowanych kroków obejmujących jednoczesną manipulację różnymi typami komórek. Chociaż są to bardzo dobrze ugruntowane procedury, brak wspólnego źródła w literaturze często oznacza, że wymagany jest szereg optymalizacji, co może być czasochłonne. Wykazano, że protokół ten jest skuteczny w transdukcji pierwotnych tymocytów, a następnie różnicowaniu na komórkach OP9-DL4. Szczegółowo opisano tutaj protokół, który może służyć jako szybki i zoptymalizowany przewodnik po kohodowli retrowirusowo transdukowanych tymocytów na komórkach zrębu OP9-DL4.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Linia komórek zrębu szpiku kostnego OP9 dostarcza użytecznego systemu in vitro do indukcji limfopoezy z kilku źródeł komórek progenitorowych1. Pierwsze badania, w których wykorzystano komórki OP9, wykazały, że brak ekspresji czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów (MCSF) przyczynił się do zdolności linii komórkowej OP9 do wspierania hematopoezy i różnicowania komórek B z hematopoetycznych komórek macierzystych pochodzących ze szpiku kostnego (HSC), jak później wykazano również dla embrionalnych komórek macierzystych (ESC)2,3,4,5. W poprzednich badaniach generacja komórek OP9 z ekspresją delta 1/4 (OP9-DL1/OP9-DL4) umożliwiła indukcję linii limfocytów T commitment6 i wykazała zdolność do skutecznego podsumowania dojrzewania grasicy7,8. Krótko mówiąc, rozwój limfocytów T został opisany przez sekwencyjną ekspresję cząsteczek CD4 i CD8. Niedojrzałe tymocyty są "podwójnie ujemne" (DN, CD4− CD8−) i mogą być dalej dzielone zgodnie z powierzchniową ekspresją CD44 i CD25. Tymocyty DN różnicują się poprzez niedojrzałe stadium pojedynczego dodatniego (ISP), charakteryzujące się ekspresją CD8 u myszy i CD4 u ludzi, następnie etap podwójnie dodatni (DP), charakteryzujący się koekspresją CD4 i CD8, a na końcu dojrzały etap pojedynczy dodatni, charakteryzujący się ekspresją CD4 lub CD89. HSC wyrażają receptor Notch1, który normalnie oddziałuje z delta-podobnym 4 (DL4) wyrażanym na komórkach nabłonka grasicy w celu wywołania różnicowania linii T10. W związku z tym zainteresowanie modelem OP9-DL1/4 stopniowo rosło, co doprowadziło do szerokiego zastosowania tego podejścia w wielu różnych zastosowaniach w ciągu ostatnich dwóch dekad8,11,12,13. Chociaż DL1 i DL4 są w stanie wspierać różnicowanie limfocytów T in vitro, wykazują zróżnicowane wymagania in vivo, a kilka badań sugeruje, że OP9_DL4 jest bardziej skuteczny niż OP9_DL1 w rekapitulacji środowiska grasicy myszy7,14.

Wśród potencjalnych zastosowań systemu OP9-DL1/4, szczególnie interesujące jest połączenie tego systemu z transdukcją komórek DN lub HSC z wektorami retrowirusowymi. Ta kombinacja jest skutecznym sposobem manipulowania ekspresją genów podczas prawidłowego rozwoju limfocytów T i białaczki i wykazano, że jest skuteczną metodą indukowania lub hamowania funkcji interesującego genu15,16,17. Model ten został szczególnie skutecznie wykorzystany do badania współpracy między onkogenami napędzającymi białaczkę15, ponieważ jest elastyczny i umożliwia badanie efektów wielu kombinacji genów w rozsądnym czasie, w przeciwieństwie do generowania myszy transgenicznych. Co więcej, podobne modele były już wcześniej wykorzystywane do oceny skutków wprowadzenia onkogenów do normalnych komórek15,16,17. Dodatkowo, transdukcja retrowirusowa wymaga podziału komórek w celu integracji transgenu18, i chociaż transdukcja lentiwirusowa pokonałaby to ograniczenie, eliminując potrzebę dzielenia komórek w celu integracji transgenu, nie byliśmy w stanie osiągnąć pomyślnej transdukcji tymocytów DN za pomocą wektorów lentiwirusowych. Tak więc OP9-DL1/DL4 jest odpowiednim narzędziem do hodowli hematopoetycznych komórek progenitorowych.

Standardowy protokół dla limfopoezy transdukowanych tymocytów na OP9-DL4 obejmuje szereg skoordynowanych kroków, które muszą być starannie wykonane, aby osiągnąć pomyślny wynik. Chociaż są to techniki, które dobrze służą społeczności od wielu lat, często protokoły dostępne w literaturze są fragmentaryczne. W efekcie każde laboratorium jest zmuszone do adaptacji i optymalizacji różnych etapów procedury, co może być czasochłonne. W tym przypadku protokół ten opisuje izolację tymocytów DN z grasicy myszy, a następnie transdukcję retrowirusową i kohodowlę na komórkach zrębu OP9-DL4 w celu dalszej analizy funkcjonalnej. Wykazano, że ten ustalony protokół jest skuteczny i powtarzalny w transdukcji pierwotnych tymocytów, a następnie różnicowaniu na komórkach OP9-DL4 lub indukcji ostrej białaczki limfoblastycznej komórek T15.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie opisane eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez NIH Institutional Biosafety Committee (IBC) oraz Animal Care and Use Committee (ACUC). Szczegółowe informacje na temat wszystkich odczynników i materiałów użytych w niniejszym protokole można znaleźć w Tabeli Materiałów. Zapoznaj się z opublikowanymi wytycznymi19, aby uzyskać więcej informacji na temat hodowli komórkowej i procedur konserwacji w wyniku produkcji retrowirusów. Zobacz Rysunek 1, aby zapoznać się z przeglądem protokołu.

1. Rozpoczęcie hodowli komórek OP9-DL4 (Dzień 1)

  1. Szybko rozmrozić komórki OP9-DL4, trzymając fiolkę i delikatnie wstrząsając w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Natychmiast przenieść komórki do probówki wirówkowej zawierającej 5 ml pożywki OP9 (pożywka MEM-alfa, 10% FBS, 50 U/ml penicyliny/streptomycyny, 55 μM 2-merkaptoetanolu, 2 mM L-glutamina) w celu usunięcia środków krioprotekcyjnych.
  2. Wirować przy 300 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1 ml pożywki OP9.
  3. Umieścić 5 ml pożywki OP9 w kolbie T25 i dodać zawieszone komórki do tej kolby. Hodowla w temperaturze 37 °C i 5 % CO2 .
  4. Po 2-3 dniach przeprowadź subkulturę komórek, stosując podział 1:3 (przechodź komórki w każdy poniedziałek, środę i piątek).
    UWAGA: Podziel komórki OP9-DL4, zanim osiągną zbieg. Kolba OP9-DL4 musi być zlewana w 80%-90% w dniach 6-7 i w dniach 8-9+ w przypadku kohodowli z tymocytami. Dlatego ważne jest, aby zaplanować, ile ogniw OP9-DL4 będzie potrzebnych w tych dniach podczas dzielenia ogniw OP9-DL4.
    1. Wyrzucić pożywkę z kolby i przemyć monowarstwę 1x PBS. Odrzucić PBS, dodać 1 ml 0,25% trypsyny i inkubować przez 1–5 minut w temperaturze 37 °C lub do momentu, gdy komórki usuną się z kolby. Uderz w kolbę, aby usunąć komórki.
      UWAGA: (Opcjonalnie) Postęp dysocjacji komórek można sprawdzić za pomocą mikroskopii.
    2. Dodać 5 ml pożywki OP9 w celu dezaktywacji trypsyny i ponownie zawiesić komórki, przepłukując pokrytą komórkami powierzchnię kolby podczas ponownego wymieszania.
    3. Odwirować zawiesinę komórek o stężeniu 300 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i ponownie zawiesić w 3 ml pożywki OP9 (w celu podziału 1:3).
    4. Umieścić 1 ml zawiesiny komórek w kolbie T25, która zawiera już 5 ml świeżej pożywki OP9. Zamroź/wyrzuć pozostałe komórki.
      1. Aby zamrozić komórki OP9-DL4, należy ponownie zawiesić komórki w 90% FBS/10% DMSO w proporcji 1 ml pożywki do zamrażania na jedną fiolkę komórek.
      2. Zamrażać w kriowiałach o pojemności 1 ml w temperaturze -80 °C lub w ciekłym azocie, w zależności od przyszłych wymagań. Przechowywać w ciekłym azocie do dłuższego przechowywania.

2. Rozpoczęcie hodowli linii komórkowej producenta retrowirusa (Dzień 1)

  1. Szybko rozmrozić linię komórkową wytwarzającą retrowirusa, trzymając fiolkę i delikatnie wstrząsając w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Natychmiast przenieść komórki do probówki wirówkowej zawierającej 5 ml pożywki komórkowej wytwarzającej retrowirusy (RPC: DMEM, 10% FBS) w celu usunięcia środka krioprotekcyjnego.
  2. Wirować przy 300 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1 ml pożywki RPC.
  3. Umieścić 5 ml pożywki RPC w kolbie T25 i dodać zawieszone komórki do tej kolby. Hodowla w temperaturze 37 °C i 5 % CO2 .
  4. Przenikaj komórki co 2-3 dni w podziale 1:5 do 1:8.
    1. Uderz w kolbę, aby usunąć komórki, a następnie ponownie zawiesić komórki, agresywnie pipetując.
      UWAGA: Komórki te można usunąć z powierzchni kolby przez agresywne pipetowanie bez trypsyny. Alternatywnie, trypsynizuj (0,05% trypsyny/0,53 mM EDTA), aż komórki łatwo się odłączą i będzie można je łatwo odpipetować do zawiesiny jednokomórkowej.
  5. Odwirować zawiesinę komórek o sile 300 × g przez 5 minut i ponownie zawiesić w 5 ml pożywki RPC (w celu podziału 1:5).
  6. Umieścić 1 ml zawiesiny komórek w kolbie T25, która zawiera już 5 ml świeżej pożywki RPC. Zamroź/wyrzuć pozostałe komórki. Zamrozić komórki wytwarzające retrowirusa w taki sam sposób, jak opisano dla komórek OP9-DL4 (kroki 1.4.4.1–1.4.4.2).

3. Rozpoczęcie hodowli komórek wytwarzających retrowirusa na płytkach 6-dołkowych (dni 4–5)

  1. Wysiewaj komórki wytwarzające retrowirusa 18–24 godziny przed transfekcją przy 70%-90% zbiegu w każdym dołku 6-dołkowej płytki do hodowli tkankowej w 2 ml pożywki RPC i inkubuj w temperaturze 37 °C i 5% CO2,
    UWAGA: Transfekować dwie studzienki komórek wytwarzających retrowirusa na każde 2-5 × 105 do 1 × 106 tymocytów, które zostaną przetransdukowane.

4. Transfekcja komórek wytwarzających retrowirusa w celu wytworzenia retrowirusa zawierającego interesujące nas geny (dni 5–6)

  1. Zastąp pożywkę świeżą pożywką RPC na 1 godzinę przed transfekcją.
  2. Przygotuj mieszaniny lipofekcji (dla każdego dołka na płytce 6-dołkowej - w razie potrzeby zwiększaj): Rozcieńczyć 4 μg DNA (2 μg plazmidu pomocniczego (pCL-Eco) i 2 μg plazmidu transferowego (pMIG) w 250 μl pożywki o obniżonej surowicy. Delikatnie wymieszaj.
  3. Zmieszać 10 μl odczynnika do transfekcji z 250 μl pożywki o zredukowanej surowicy z kroku 4.2. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Po 5 minutach inkubacji połączyć rozcieńczone DNA z rozcieńczonym odczynnikiem do transfekcji (objętość całkowita = 500 μl). Delikatnie wymieszaj i inkubuj przez 20–25 minut w temperaturze pokojowej.
  5. Delikatnie dodać 500 μl mieszanin DNA/odczynnika do transfekcji do studzienki zawierającej komórki wytwarzające retrowirusa, upuszczając na komórki ruchem okrężnym. Delikatnie wymieszać, kołysząc płytką w przód i w tył, a następnie inkubować płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 16–24 godz.
    UWAGA: Komórki subkonfluentne (80%–90%) najlepiej nadają się do transfekcji i potencjalnie generują najwyższe miano wirusa. Ponieważ komórki wytwarzające retrowirusa bardzo łatwo usuwają się z kolby, należy unikać gwałtownych ruchów podczas obchodzenia się z tymi komórkami.

5. Zmiana pożywki komórkowej producenta retrowirusa (Dni 6–7)

  1. Zastąp starą pożywkę po około 16 godzinach od transfekcji 2 ml świeżej pożywki RPC. Kontynuować inkubację komórek w temperaturze 37 °C przez 20–24 godziny.
  2. Oceń skuteczność transfekcji pod mikroskopem fluorescencyjnym (opcjonalnie).
    UWAGA: W tym protokole komórkami GFP-dodatnimi są komórki będące przedmiotem zainteresowania (patrz Rysunek 2). Ten krok zależy od wektora retrowirusa wybranego do użycia w tym protokole (czy gen reporterowy jest obecny w szkielecie).

6. Przygotowanie tymocytów i wyczerpanie komórek CD4+ i CD8+ (dni 6-7)

  1. Zbierz grasicę od 4–6 tygodniowej myszy C57BL/6. Aby uzyskać więcej informacji na temat zbioru grasicy, zapoznaj się z Xing i Hogquist20.
    UWAGA: Myszy zostały poddane eutanazji przez wdychanie CO2 , a następnie zwichnięcie szyjki macicy.
  2. Przygotować zawiesinę jednokomórkową tymocytu, umieszczając grasicę w 5 ml PBS na szalce Petriego. Używając sterylnych szkiełek podstawowych, umieść grasicę między matowymi powierzchniami szkiełek i delikatnie pocieraj szkiełka o siebie, tocząc grasicę między dwoma szkiełkami. Przepłucz szkiełka szklane, aby zebrać komórki i wyrzuć resztki tkanki zrębu grasicy.
    UWAGA: Szacowana wydajność z jednej grasicy wynosi 90 × 106–100 × 106 komórek, a około 1% komórek pozostanie po wyczerpaniu CD4 i CD8. Użyj tkanki grasicy od młodszych myszy, aby uzyskać lepszą wydajność komórek, ponieważ komórkowość grasicy myszy w pierwszych tygodniach po urodzeniu szybko rośnie, osiąga plateau w wieku 4–6 tygodni, a następnie stopniowo ewolutuje21. Policz komórki za pomocą automatycznego licznika krwinek lub innej metody.
  3. Przefiltrować zawiesinę grasicy przez filtr 30 μm lub 40 μm, pipetując 5 ml zawiesiny grasicy przez sitko do komórek. Odwirować komórki o masie 300 × g przez 10 minut.
  4. Usunąć supernatant i poddać lizie czerwone krwinki za pomocą buforu do lizy ACK, dodając (w zależności od wielkości próbki) 1 ml buforu na probówkę przez 1 minutę. Dodać 5 ml buforu zubożającego komórki (500 ml PBS [pH 7,2], 0,5% BSA, 2 mM 0,5M EDTA, pH 8,0) w celu dezaktywacji buforu do lizy ACK, Odwirować przy 300 × g przez 10 minut i ponownie zawiesić w 1–5 ml buforu zubożającego komórki do liczenia.
    UWAGA: Odłóż na lód następujące elementy przed wyczerpaniem (przed wyczerpaniem): 70 μl zawiesiny komórek do policzenia (różnią się w zależności od wybranej metody liczenia komórek) i 200 μl zawiesiny komórkowej w celu określenia efektywności zubożenia przez barwienie dla CD4 i CD8 i analizę za pomocą cytometrii przepływowej22,23.
  5. Policz komórki i odwiruj przy 300 × g przez 10 minut. Ponownie zawiesić komórki w 1 × 107/80 μl buforu zubożającego komórki. Dodaj po 10 μl mikrogranulek CD4 i CD8 na 1 × 107 komórek. Dobrze wymieszać i inkubować przez 15 minut w ciemności w lodówce (2–8 °C).
  6. Przygotować kolumnę zubożającą, przepłukując ją 2 ml buforu zubożającego i odrzucając przepływ.
  7. Przepłukać komórki z kroku 6.6, dodając 1–2 ml buforu zubożającego na 1 × 107 komórek i odwirować przy 300 × g przez 10 minut. Usunąć i wyrzucić supernatant.
  8. Ponownie zawiesić do 1,25 × 108 komórek w 500 μl buforu zubożającego. Nałóż zawiesinę komórek na kolumnę i zbierz przepływ (nieoznakowane komórki). Przemyć kolumnę 2x 1 ml buforu i zebrać przepływ.
    UWAGA: Nowy bufor należy dodawać tylko wtedy, gdy zbiornik kolumny jest pusty. Odłóż na lód następujące składniki po wyczerpaniu (kontrola po wyczerpaniu): 70 μl zawiesiny komórek do policzenia (różnią się w zależności od wybranej metody liczenia komórek) i 1,000 μl zawiesiny komórkowej w celu określenia skuteczności zubożenia przez barwienie dla CD4 i CD8 i analizę za pomocą cytometrii przepływowej22,23.
  9. Wybarwić kontrolę skuteczności zubożenia, dzieląc 200 μl komórek zebranych przed wyczerpaniem na cztery probówki FACS: niebarwione, CD4 barwione pojedynczo, CD8 barwione pojedynczo i podwójnie barwione CD4/CD8 (użyj próbek niebarwionych i pojedynczo barwionych do ustawienia parametrów cytometrii przepływowej). Użyj 1,000 μl komórek zebranych po wyczerpaniu do barwienia CD4 i CD8 i porównaj z podwójnie wybarwioną próbką pobraną przed wyczerpaniem (zobacz typowe wyniki zubożenia w Rysunek 3).
    UWAGA: Dostosuj objętości do barwienia cytometrią przepływową zgodnie z zaleceniami producenta przeciwciała (np. 1 μl anty-CD4-FITC + 0,5 μl anty-CD8-PE na 1 x 106 komórek w 50 μl buforu).

7. Hodowla tymocytów na komórkach OP9-DL4 (Dni 6-7)

  1. Umieść 2-5 × 105 do 1 × 106 pouszczuplonych tymocytów w kolbie T25 zawierającej 80%-90% zlewających się komórek OP9-DL4 w pożywce OP9 zawierającej cytokiny (10 ng / ml rekombinowanego IL-7 i rekombinowanego hFLT-3). Hodowla w temperaturze 37 °C i 5 % CO2 . Rośnie przez około 24 godziny na komórkach OP9-DL4.
    UWAGA: Ten czas trwania jest wymagany, aby limfocyty T były transdukowalne (patrz typowy wynik w Rysunek 4). Zarezerwować jedną kolbę T25 z kokulturą tymocytów i komórek OP9-DL4 do użycia jako kontrola (nietransdukowana). Nietransdukowane tymocyty zostaną wybarwione razem z transdukowanymi tymocytami (krok 9.1) jako kontrola negatywna w celu oceny wydajności transdukcji. Nietransdukowane tymocyty można również wykorzystać do pomiaru wpływu ekspresji transgenu na różnicowanie komórek. Wyrzuć pożywkę zawierającą cytokiny po 1 miesiącu.

8. Pobieranie retrowirusa z supernatantu i używanie go do transdukcji tymocytów (dni 8-9)

  1. Zebrać supernatant zawierający retrowirusy z transfekowanych komórek, przechylając płytkę 6-dołkową i umieszczając strzykawkę o pojemności 3–5 ml na dnie płytki, jednocześnie pociągając za tłok w celu zassania supernatantu. Zastąp pożywkę 2 ml świeżego podłoża RPC. Kontynuować inkubację komórek w temperaturze 37 °C przez 20–24 godziny w celu przeprowadzenia drugiej transdukcji w kroku 8.9.
  2. Przefiltrować supernatant retrowirusa przez filtr strzykawkowy 0,45 μm i zebrać filtrat w probówce o pojemności 50 ml.
    UWAGA: Nie zamrażać retronatywnego supernatantu. Użyj świeżo przygotowanego preparatu wirusowego do transdukcji.
  3. Zebrać tymocyty z hodowli OP9-DL4 przez agresywne pipetowanie w celu usunięcia tymocytów i komórek OP9-DL4 z powierzchni kolby. Przefiltruj zawiesinę komórek przez sitko o wielkości 40 μm, aby usunąć większość komórek OP9-DL4 i zbierz filtrat w probówce o pojemności 50 ml.
    UWAGA: Ogniwa OP9 są bardzo przylegające. Chociaż agresywne pipetowanie może usunąć niektóre komórki OP9-DL4 z kolby, przerwanie monowarstwy OP9-DL4 podczas tego procesu jest minimalne, a komórki OP9-DL4, które odpadną, zostaną odfiltrowane za pomocą sitka komórkowego 40 μm, ponieważ komórki OP9-DL4 są znacznie większe niż pierwotne tymocyty. Jeśli komórki OP9-DL4 są nadal zlewające się w 80%-90%, usuń tymocyty i ponownie pokryj je w tej samej kolbie OP9-DL4. Alternatywnie należy przygotować nową kolbę OP9-DL4.
  4. Odwirować tymocyty w filtracie z etapu 8.3 przy stężeniu 300 × g przez 5 minut. Odrzucić supernatant.
  5. W probówce o pojemności 50 ml ponownie zawieś tymocyty w 0,5–1 ml pożywki OP9 + cytokin (patrz krok 7.1). Dodać 1–2 ml pożywki RPC zawierającej wirusa (dwa razy więcej pożywki RPC niż pożywki tymocytowej). Dodać bromek heksametryny (stężenie podstawowe 10 μg/μl), aby otrzymać 8 μg bromku heksametryny/ml całkowitej zawiesiny komórek.
  6. Spinokkulować przez odwirowanie komórek w stężeniu 850 × g przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  7. Ponownie zawiesić komórki w 6 ml pożywki OP9 + cytokin na kolbę (patrz krok 7.1) i dodać zawiesinę z powrotem do monowarstwy komórek OP9-DL4.
    UWAGA: Alternatywnie, przygotuj nowe kolby OP9-DL4 na przyjęcie transdukowanych tymocytów. Jeśli tymocyty mają zostać umieszczone z powrotem w używanej kolbie OP9-DL4, należy dodać świeżą pożywkę OP9 do komórek OP9-DL4 podczas 1 godziny spinokulacji tymocytów, aby utrzymać komórki w zdrowiu i zapewnić 80%-90% konfluencji.
  8. Inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.
  9. Powtórz kroki 8.2–8.7, używając nowego dołka supernatantu komórkowego zawierającego retrowirusa.

9. Utrzymywanie transdukowanych tymocytów na kulturze OP9-DL4 przez 2-5 dni lub zamrażanie w razie potrzeby (Dzień 9+)

  1. Oceń różnicowanie tymocytów za pomocą cytometrii przepływowej, barwiąc tymocyty pod kątem markerów rozwoju limfocytów T, takich jak CD4, CD8, CD25 i CD4423. Zobacz typowe wyniki różnicowania tymocytów w Rysunek 5.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Efektywność wyczerpywania się można ocenić metodą cytometryczną przepływu, oznaczając magnetycznie nieznakowaną frakcję komórkową dla CD4 i CD8 po immunomagnetycznej separacji komórek (MACS) i analizując to na dwuwymiarowym dwuwymiarowym wykresie kropkowym (Rysunek 3). Dobra wydajność komórek podwójnie ujemnych (CD4−, CD8−) wynosi 95% lub więcej, jak przedstawiono w Rysunek 3. Dwie z najczęstszych przyczyn niższej wydajności to błędne obliczenia mikrokulek na podstawie liczby komórek oraz liczba znakowanych komórek przekraczająca pojemność kolumny. Zaleca się wybór odpowiedniej liczby kolumn MACS w zależności od liczby oznaczonych komórek. Podczas pracy z tymocytami liczba znakowanych komórek (komórek DP i SP) jest prawie równa liczbie wszystkich komórek (ponad 96%). Liczenie komórek można przeprowadzić w automatycznym liczniku komórek, komorze Neubauera lub za pomocą dowolnej alternatywnej metody. W związku z tym może być konieczne dostosowanie objętości przydzielonych do zliczania komórek w zależności od konkretnej maszyny i wybranej metody liczenia.

Ważne jest, aby określić liczbę komórek obecnych przed i po wyczerpaniu. Ta liczba komórek jest potrzebna do obliczenia liczby potrzebnych kolumn zubożających LD i do równomiernego rozprowadzenia tymocytów DN w odpowiedniej liczbie kolb OP9-DL4. Kontrole cytometrii przepływowej (komórki nieznakowane, komórki znakowane jako CD4 i komórki znakowane jako CD8) można wykonywać z zarezerwowaną próbką przed wyczerpaniem, ponieważ zawiera ona więcej komórek. Ponieważ jednak oczekuje się, że większość komórek zostanie zachowana w kolumnie, próbka po wyczerpaniu, która ma być oznaczona, będzie wymagała większej objętości. W związku z tym może być konieczne dokonanie korekt zgodnie z wybranym protokołem etykietowania.

Podczas korzystania z wektorów, które wyrażają markery przesiewowe, takich jak gen fluorescencji, transfekcja i transdukcja mogą być z grubsza i empirycznie ocenione za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej (Rysunek 2). Wydajność transdukcji można przeanalizować, zbierając tymocyt z monowarstwy OP9-DL4, jak opisano w kroku 8.3, i przyglądając się ekspresji genu fluorescencji za pomocą cytometrii przepływowej. Skuteczność transdukcji przy użyciu pustego wektora retrowirusowego z GFP jako genem reporterowym wynosiła 84,2% (Ryc. 4).

na komórkach OP9-DL4 można zaobserwować 4 dni po transdukcji. Cytometria przepływowa jest zwykle wykonywana w celu oceny różnicowania komórek indukowanego przez kokulturę na komórkach OP9-DL4 i / lub ekspresję transgenu, jak przedstawiono w Rysunek 5, gdzie komórki zostały oznaczone dla CD4, CD8, CD44 i CD25. Istnieje kilka możliwych kombinacji znakowania cząsteczek na powierzchni komórki, które okazały się przydatne do badania molekularnych i komórkowych mechanizmów rozwoju komórek T u myszy24,25,26,27. W związku z tym panele przeciwciał fluorescencyjnych mogą się różnić w zależności od poruszanej kwestii. Transdukcja tymocytów DN z pustym wektorem retrowirusowym pMIG, pokazana w panelu B, wykazała w przybliżeniu takie same proporcje pojedynczych dodatnich (CD4+ lub CD8+), podwójnie dodatnich (CD4+/CD8+), podwójnie ujemnych (CD4−/CD8−) i jego podetapów podwójnie ujemnych 1–4 (DN1–DN4) jak nietransdukowane tymocyty, pokazane w panelu A, co wskazuje, że proces transdukcji nie miał wpływu na rozwój limfocytów T.

figure-results-1
Rysunek 1: Diagram etapów izolacji, transdukcji i kohodowli tymocytu. Skrót: DN = podwójnie ujemny. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Mikroskopia fluorescencyjna ko-hodowlana tymocytów transdukowanych GFP lub nietransdukowanych tymocytów i komórek OP9-DL4. (A) Nietransdukowane tymocyty i (B) stabilne mysie tymocyty eksprymujące GFP na OP9-DL4 w dniu 3 po drugiej transdukcji. Użyto mikroskopu fluorescencyjnego Olympus-IX71 z obiektywem 40x i filtrem 480/30 odpowiednim do wykrywania GFP. Podziałka = 40 μm. Skróty: GFP = zielone białko fluorescencyjne; DN = podwójnie ujemny. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Cytometria przepływowa wyczerpania tymocytów. Reprezentatywne wykresy cytometrii przepływowej analizujące ekspresję CD4 i CD8 na tymocytach uzyskanych od 7-8 tygodniowych samic myszy C57BL/6J (A) przed zubożeniem i (B) po wyczerpaniu CD4+ i CD8+ przy użyciu mikrogranulek i kolumn LD zgodnie z instrukcjami producenta. Wykresy kropkowe po lewej stronie pokazują bramki w zależności od rozmiaru i złożoności zdarzenia (odpowiednio FCS-A i SSC-A). Środkowy panel pokazuje FSC-H i FSC-A, aby bramkować pojedyncze komórki i wykluczać dublety. Na wykresach po prawej stronie komórki zdefiniowano jako CD4 i CD8 z bramki jednokomórkowej. Skróty: FSC-A = forward scatter-peak area; SSC-A = obszar piku bocznego rozproszenia; FSC-H = wysokość piku rozproszenia do przodu; FITC = izotiocyjanian fluoresceiny; PE = fikoerytryna. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Cytometria przepływowa skuteczności transdukcji retrowirusowej tymocytu. (A) Nietransdukowane tymocyty współhodowane na OP9-DL4; (B) retrowirusowo transdukowane tymocyty na OP9-DL4 w 3 dniu po transdukcji. Skróty: FSC-A = forward scatter-peak area; SSC-A = obszar piku bocznego rozproszenia; FSC-H = wysokość piku rozproszenia do przodu; FITC = izotiocyjanian fluoresceiny; PE = fikoerytryna; DN = podwójnie ujemny. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Cytometria przepływowa transdukowanych tymocytów po 4 dniach kohodowli OP9-DL4. (A) nietransdukowany i (B) transdukowany retrowirusem pMIG. Komórki najpierw bramkowano na żywych komórkach, a następnie bramkowano na podstawie rozmiaru i złożoności (odpowiednio FCS-A i SSC-A), a następnie wykreślono FSC-H w porównaniu z FSC-A w celu bramki na pojedynczych komórkach i wykluczenia dubletów. W przypadku komórek nietransdukowanych zastosowaliśmy następującą strategię bramki. Z bramki jednokomórkowej komórki zdefiniowano jako pojedyncze dodatnie (CD4 + lub CD8 +), podwójnie dodatnie (CD4 + / CD8 +) i podwójnie ujemne (CD4− / CD8−). Następnie, z podwójnej bramki ujemnej (CD4−/CD8−), komórki zdefiniowano jako CD44 +, CD25 +, CD44 + / CD25 + i CD44− / CD25−, jak pokazano w panelu A. W przypadku komórek transdukowanych pMIG, pokazanych w panelu B, z bramki jednokomórkowej, komórki najpierw zdefiniowano jako GFP+ / GFP−, a następnie z komórek GFP+ rozkład populacji komórek na główne etapy rozwoju limfocytów T, zdefiniowany przez ekspresję CD4, CD8, CD44 i CD25, określono przy użyciu tej samej strategii bramki, co w przypadku komórek nietradukowanych. Skróty: FSC-A = forward scatter-peak area; SSC-A = obszar piku bocznego rozproszenia; FSC-H = wysokość piku rozproszenia do przodu; FITC = izotiocyjanian fluoresceiny; GFP = zielone białko fluorescencyjne. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany tutaj protokół został opracowany specjalnie dla badań limfocytów T DN (CD4−/CD8−) pochodzących z grasicy z transfekcją retrowirusową, a następnie modelem różnicowania OP9-DL4. Jest jednak prawdopodobne, że komórki docelowe, które zostaną poddane temu protokołowi transdukcji, a następnie różnicowania komórek, będą miały szersze zastosowanie interdyscyplinarne. Tak więc, oprócz niedojrzałych tymocytów, hematopoetyczne komórki macierzyste, takie jak komórki pochodzące z wątroby płodu lub szpiku kostnego, mogą być potencjalnie wykorzystane w tym protokole.

System OP9-DL4 okazał się skutecznym modelem do badania funkcji genów w różnych aspektach, w tym różnicowania komórek17 i onkogenezy15. Podczas gdy retrowirusowa modyfikacja hematopoetycznych komórek progenitorowych jest dobrze ugruntowaną techniką, która umożliwia stabilną modyfikację genetyczną, połączenie indukcji różnicowania komórek w systemie OP9-DL4 i transdukcji retrowirusowej wymaga ostrożności i umiejętności. Kluczowym aspektem osiągnięcia sukcesu w tym protokole jest zapewnienie, że wszystkie kroki są dobrze skoordynowane, ponieważ protokół obejmuje użycie trzech różnych typów komórek, które muszą być utrzymywane w dobrym stanie i w idealnym zbiegu wymaganym dla każdego konkretnego etapu. Mając to na uwadze, ważne jest, aby wykonać wszystkie analizy punktów kontrolnych kontroli jakości po wykonaniu każdego kroku przed przejściem do następnego kroku. Zapewni to, że wszystkie kroki działają. W związku z tym sprawdzenie wydajności zubożenia, transfekcji i transdukcji jest ważne dla pomyślnego wykonania tego protokołu (patrz typowy wynik dla wydajności transdukcji na rysunku 4). Dobra wydajność pierwotnej transdukcji komórkowej jest związana z wysokim mianem wirusa. Zazwyczaj większe wstawki skutkują niższymi mianami wirusa18. Do celów szkoleniowych używamy pustego wektora do reprezentowania wyników, które można uzyskać za pomocą tego protokołu. Z naszego doświadczenia wynika, że skuteczność transdukcji i transfekcji różni się w zależności od wielkości wkładki, zwłaszcza biorąc pod uwagę geny reporterowe wykazujące ekspresję szkieletu wirusa, takie jak GFP. Jedną ze strategii, którą można zastosować podczas badania interakcji więcej niż jednego genu, jest sklonowanie każdego genu do innego wektora transferowego, po którym następuje indywidualna produkcja wirusa, a na końcu kotransdukcja komórki docelowej. W takim przypadku można zastosować etap selekcji w celu wyeliminowania komórek transdukowanych pojedynczo i zachowania tylko komórek transdukowanych.

Warto zauważyć, że większość linii komórkowych warstwy zasilającej zrębu OP9-DL1 / DL4 została genetycznie zmodyfikowana do ekspresji GFP w ramach konstruktów DL1 lub DL47. W tym protokole użyliśmy wektora retrowirusowego, który również wyraża GFP; jednak jest jaśniejszy niż białko GFP wyrażane przez komórki OP9-DL4 i nie zakłóca kontroli transdukcji podczas wizualizacji kokultury pod mikroskopem fluorescencyjnym.

Komórki OP9 różnicują się w adipocyty po wielu pasażach, długich okresach w hodowli lub w warunkach nadmiernej konfluencji19. Świadczy o tym rozwój dużych wakuoli. W związku z tym ogniwa OP9 o tych cechach nie powinny być używane w tym protokole. Transfekcja nadmiernie zlewających się komórek wytwarzających retrowirusa spowoduje niskie miano wirusa. Rzeczywiście, etap subkonfluencji ma miejsce, gdy komórki są najbardziej transfekcyjne. Co więcej, transfekcja komórek wytwarzających retrowirusy o niskiej konfluencji zmniejszy stres komórkowy w procesie transfekcji i zapewni najwyższe miano wirusa.

Chociaż w tym protokole nie miareczkujemy supernatantu wirusa, miareczkowanie supernatantu wirusa musi być brane pod uwagę w niektórych przypadkach, takich jak brak genu reporterowego w wektorze retrowirusowym, co uniemożliwiłoby pośrednie określenie produkcji wirusa, lub w przypadkach, gdy projekt eksperymentalny wymaga dokładniejszej liczby kopii transgenu, które mają zostać zintegrowane z genomem komórki docelowej. Należy jednak zauważyć, że miano supernatantu wektora retrowirusowego ulega znacznemu zmniejszeniu, gdy jest przechowywane w temperaturze -80 °C lub 4 °C do momentu uzyskania wyników miareczkowania. Dlatego użycie świeżo przygotowanego supernatantu wirusa do transdukcji zapewni lepszą wydajność transdukcji.

Grasica zawiera dużą liczbę podwójnie dodatnich (DP) tymocytów (ponad 85%) i około 10% jedno-dodatnich15 komórek (CD4 lub CD8), które są tymocytami po fazie DN. Komórki DP nie mogą przetrwać in vitro w przypadku manipulacji retrowirusowej, podczas gdy komórki SP są nietransdukowalne. Dlatego protokół ten można zastosować do generowania transdukowalnych tymocytów DN transdukowalnych przez wektory retrowirusowe.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia konfliktu interesów

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez program stacjonarny National Cancer Institute, projekt ZIABC009287. OP9-DL4 uzyskano od dr Juana Carlosa Zúñiga-Pflückera (Sunnybrook Health Sciences Centre, Toronto, ON, Kanada). Autorzy dziękują NCI-Frederick Laboratory Animal Sciences Program za ciągłą pomoc techniczną oraz porady i wkłady eksperymentalne, a także Jeffowi Carrelowi, Megan Karwan i Kimberly Klarmann za pomoc w cytometrii przepływowej. Jesteśmy wdzięczni Howardowi Youngowi za krytyczne rady i wkład.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2-merkaptoetanolSigmaM3148
ACK Bufor do lizyLonza10-548E
BSA Cell Signaling Technology9998S
CD4 MicrobeadsMiltenyi130-049-201
CD8 MicrobeadsMiltenyi130-049-401
Wirówka 5910Reppendorf5942IP802353
DMEMCorning10-013-CV
EDTAInvitrogen15575-038
Surowica dla płodu cielęcego HyClone FBSThermoScientific  SH30910.03
Kolumny LDMiltenyi130-042-901
L-glutaminaSigmaG7513Zamroź glutaminę w podwielokrotnościach i użyj świeżo rozmrożonej glutaminy
Lipofectamine 2000InvitrogenP/N 52887
MEM-alpha MediumGibco12561-072
OPTI-MEM I Serum redukujące MediumInvitrogen31985-062
PBS pH 7,2Corning21-040-CV
pcL-Eco PlasmidAddgene12371
penicylina/streptomycynaGibco15140-122
pMIG PlazmidAddgene6492
PolybreneChemiconTR-1003-G
Filtry do wstępnejseparacji Miltenyi130-041-407
rekombinowany hFLT-3LPeproTech300-19
rekombinowany IL-7Peprotech217-17
Retrovialna linia komórkowa do pakowania Phoenix-EcoOrbigenRVC-10002
Filtr strzykawkowy (0,45 &mikro; m)MiliporySLHV033RS

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zuniga-Pflucker, J. C. T-cell development made simple. Nature Reviews Immunology. 4 (1), 67(2004).
  2. Kodama, H., Nose, M., Niida, S., Nishikawa, S., Nishikawa, S. Involvement of the c-kit receptor in the adhesion of hematopoietic stem cells to stromal cells. Experimental Hematology. 22 (10), 979-984 (1994).
  3. Nakano, T., Kodama, H., Honjo, T. Generation of lymphohematopoietic cells from embryonic stem cells in culture. Science. 265 (5175), 1098-1101 (1994).
  4. Nakano, T., Kodama, H., Honjo, T. In vitro development of primitive and definitive erythrocytes from different precursors. Science. 272 (5262), 722-724 (1996).
  5. Ueno, H., et al. A stromal cell-derived membrane protein that supports hematopoietic stem cells. Nature Immunology. 4 (5), 457-463 (2003).
  6. Jaleco, A. C., et al. Differential effects of Notch ligands Delta-1 and Jagged-1 in human lymphoid differentiation. Journal of Experimental Medicine. 194 (7), 991-1002 (2001).
  7. Mohtashami, M., et al. Direct comparison of Dll1- and Dll4-mediated Notch activation levels shows differential lymphomyeloid lineage commitment outcomes. Journal of Immunology. 185 (2), 867-876 (2010).
  8. Schmitt, T. M., Zuniga-Pflucker, J. C. Induction of T cell development from hematopoietic progenitor cells by delta-like-1 in vitro. Immunity. 17 (6), 749-756 (2002).
  9. Mazzucchelli, R., Durum, S. K. Interleukin-7 receptor expression: Intelligent design. Nature Reviews Immunology. 7 (2), 144-154 (2007).
  10. Robey, E. A., Bluestone, J. A. Notch signaling in lymphocyte development and function. Current Opinion in Immunology. 16 (3), 360-366 (2004).
  11. Lavaert, M., et al. Integrated scRNA-Seq identifies human postnatal thymus seeding progenitors and regulatory dynamics of differentiating immature thymocytes. Immunity. 52 (6), 1088-1104 (2020).
  12. Roh, K. H., Roy, K. Engineering approaches for regeneration of T lymphopoiesis. Biomaterials Research. 20 (20), (2016).
  13. Zlotoff, D. A., et al. CCR7 and CCR9 together recruit hematopoietic progenitors to the adult thymus. Blood. 115 (10), 1897-1905 (2010).
  14. Holmes, R., Zuniga-Pflucker, J. C. The OP9-DL1 system: Generation of T-lymphocytes from embryonic or hematopoietic stem cells in vitro. Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (2), (2009).
  15. Cramer, S. D., et al. Mutant IL-7Ralpha and mutant NRas are sufficient to induce murine T cell acute lymphoblastic leukemia. Leukemia. 32 (8), 1795-1882 (2018).
  16. Treanor, L. M., et al. Interleukin-7 receptor mutants initiate early T cell precursor leukemia in murine thymocyte progenitors with multipotent potential. Journal of Experimental Medicine. 211 (4), 701-713 (2014).
  17. Yokoyama, K., et al. In vivo leukemogenic potential of an interleukin 7 receptor alpha chain mutant in hematopoietic stem and progenitor cells. Blood. 122 (26), 4259-4263 (2013).
  18. Simmons, A., Alberola-Ila, J. Retroviral transduction of T cells and T cell precursors. Methods in Molecular Biology. 1323, 99-108 (2016).
  19. Retroviral systems. , Nolan Lab. Available from: https://web.stanford.edu/group/nolan/_OldWebsite/retroviral_systems/retsys.html (2022).
  20. Xing, Y., Hogquist, K. A. Isolation, identification, and purification of murine thymic epithelial cells. Journal of Visualized Experiments. (90), e51780(2014).
  21. Gray, D. H., et al. Developmental kinetics, turnover, and stimulatory capacity of thymic epithelial cells. Blood. 108 (12), 3777-3785 (2006).
  22. Godfrey, D. I., Kennedy, J., Suda, T., Zlotnik, A. A developmental pathway involving four phenotypically and functionally distinct subsets of CD3-CD4-CD8- triple-negative adult mouse thymocytes defined by CD44 and CD25 expression. Journal of Immunology. 150 (10), 4244-4252 (1993).
  23. Wang, Y. B., Edinger, M., Mittar, D., McIntyre, C. Studying mouse thymocyte development using multiparametric flow cytometry: An efficient method to improve an 8-color panel on the BD FACSVerse™ system. BD Biosciences–Application Note. , (2012).
  24. Sakaguchi, N., et al. Altered thymic T-cell selection due to a mutation of the ZAP-70 gene causes autoimmune arthritis in mice. Nature. 426 (6965), 454-460 (2003).
  25. He, X., Park, K., Kappes, D. J. The role of ThPOK in control of CD4/CD8 lineage commitment. Annual Review of Immunology. 28, 295-320 (2010).
  26. Wang, Y., et al. A conserved CXXC motif in CD3epsilon is critical for T cell development and TCR signaling. PLoS Biology. 7 (12), e1000253(2009).
  27. Aliahmad, P., Kadavallore, A., de la Torre, B., Kappes, D., Kaye, J. TOX is required for development of the CD4 T cell lineage gene program. Journal of Immunology. 187 (11), 5931-5940 (2011).

Reprints and Permissions

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

T cell LeukemiaThymocytesRetroviral VectorsOP9 DL4 Stromal CellsGene TransductionPost doctoral FellowGenetic ModificationsCell CultureTransfection ProtocolLipofection MixturesRetrovirus Producer CellsTransfection ReagentThymocyte SuspensionCancer Research