Artykuł metodologiczny

Izolacja i kwantyfikacja wirusa Epsteina-Barr z linii komórkowej P3HR1

DOI:

10.3791/64279

⸱

28 września 2022

 ,  , 
1Department of Experimental Pathology, Immunology and Microbiology, Faculty of Medicine, American University of Beirut, 2Center for Infectious Diseases Research (CIDR), Faculty of Medicine, American University of Beirut

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół pozwala na izolację cząsteczek wirusa Epsteina-Barr z ludzkiej linii komórkowej P3HR1 po wywołaniu cyklu litycznego wirusa za pomocą 12-mirystynianu 13-octanu forbolu. DNA jest następnie ekstrahowane z preparatu wirusowego i poddawane PCR w czasie rzeczywistym w celu ilościowego określenia stężenia cząstek wirusa.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wirus Epsteina-Barr (EBV), formalnie oznaczony jako ludzki herpeswirus 4 (HHV-4), jest pierwszym wyizolowanym ludzkim wirusem nowotworowym. Prawie 90-95% dorosłej populacji świata jest zakażonych wirusem EBV. Dzięki niedawnym postępom w biologii molekularnej i immunologii, zastosowanie modeli eksperymentalnych zarówno in vitro, jak i in vivo dostarczyło głębokich i znaczących informacji na temat patogenezy EBV w wielu chorobach, a także na temat nowotworzenia związanego z EBV. Celem tego zwizualizowanego artykułu eksperymentalnego jest przedstawienie przeglądu izolacji cząstek wirusa EBV z komórek linii komórkowej P3HR1, a następnie ilościowe określenie preparatu wirusowego. Komórki P3HR1, pierwotnie wyizolowane z ludzkiego chłoniaka Burkitta, mogą wytwarzać wirusa P3HR1, który jest szczepem EBV typu 2. Cykl lityczny EBV może być indukowany w tych komórkach P3HR1 przez traktowanie 12-mirystynianianem 13-octanu forbolu (PMA), w wyniku czego powstają cząsteczki wirusa EBV.

Używając tego protokołu do izolacji cząsteczek EBV, komórki P3HR1 są hodowane przez 5 dni w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w kompletnym pożywce RPMI-1640 zawierającej 35 ng/ml PMA. Następnie pożywkę hodowlaną odwirowuje się z prędkością 120 x g przez 8 minut w celu osadzenia komórek. Supernatant zawierający wirusa jest następnie zbierany i wirowany z prędkością 16 000 x g przez 90 minut w celu osadzenia cząstek EBV. Osad wirusowy jest następnie ponownie zawieszany w kompletnym pożywce RPMI-1640. Następnie przeprowadza się ekstrakcję DNA i ilościowy PCR w czasie rzeczywistym w celu oceny stężenia cząstek EBV w preparacie.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wirus Epsteina-Barr (EBV) jest pierwszym ludzkim wirusem nowotworowym, który został wyizolowany1. EBV, formalnie określany jako ludzki herpeswirus 4 (HHV-4)2, jest częścią podrodziny wirusa opryszczki gamma z rodziny wirusów opryszczki i jest prototypem rodzaju Lymphocryptovirus. Prawie 90-95% dorosłej populacji świata jest zarażona wirusem3. W większości przypadków początkowe zakażenie następuje w ciągu pierwszych 3 lat życia i przebiega bezobjawowo, jednak jeśli infekcja nastąpi później w okresie dojrzewania, może spowodować chorobę określaną jako mononukleoza zakaźna4. EBV jest w stanie zainfekować spoczynkowe limfocyty B, indukując je do proliferacyjnych limfoblastów B, w których wirus ustanawia i utrzymuje stan utajonego zakażenia5. EBV może się reaktywować w dowolnym momencie, prowadząc w ten sposób do nawracających infekcji6.

W ciągu ostatnich 50 lat, związek między niektórymi wirusami a rozwojem nowotworów złośliwych u ludzi stawał się coraz bardziej widoczny, a dziś szacuje się, że od 15% do 20% wszystkich nowotworów u ludzi jest związanych z infekcjami wirusowymi7. Wirusy opryszczki, w tym EBV, są jednymi z najlepiej przebadanych przykładów tego typu wirusów nowotworowych8. W rzeczywistości EBV może powodować wiele rodzajów nowotworów złośliwych u ludzi, takich jak chłoniak Burkitta (BL), chłoniak Hodgkina (HL), chłoniak rozlany z dużych komórek B i choroby limfoproliferacyjne u gospodarzy z obniżoną odpornością9,10. Wykazano również, że EBV jest związany z rozwojem ogólnoustrojowych chorób autoimmunologicznych. Niektóre przykłady tych zaburzeń autoimmunologicznych to reumatoidalne zapalenie stawów (RZS), zapalenie wielomięśniowe i skórno-mięśniowe (PM-DM), toczeń rumieniowaty układowy (SLE), mieszana choroba tkanki łącznej (MCTD) i zespół Sjögrena (SS)11. EBV jest również związany z rozwojem nieswoistego zapalenia jelit (IBD)12.

Wiele z tych chorób można badać lub modelować za pomocą hodowli komórkowych, myszy lub innych organizmów zainfekowanych EBV. Dlatego cząsteczki EBV są potrzebne do infekowania komórek lub organizmów, zarówno w modelach in vitro, jak i in vivo13,14,15,16, stąd potrzeba opracowania techniki, która pozwoli na izolację cząstek wirusa przy niskich kosztach. Opisany tutaj protokół zawiera wytyczne dotyczące łatwego sposobu niezawodnego izolowania cząstek EBV ze stosunkowo dostępnej linii komórkowej i ilościowego oznaczania cząstek za pomocą PCR w czasie rzeczywistym, który jest opłacalny i łatwo dostępny dla większości laboratoriów. Jest to porównanie z kilkoma innymi metodami, które zostały opisane w celu izolowania EBV z różnych linii komórkowych17,18,19,20.

P3HR-1 to linia komórkowa BL, która rośnie w zawiesinie i jest utajenie zakażona szczepem EBV typu 2. Ta linia komórkowa jest producentem EBV i może być indukowana do produkcji cząstek wirusa. Celem tego manuskryptu jest przedstawienie metody, która pozwala na izolację cząstek EBV z linii komórkowej P3HR-1, a następnie ilościowe określenie materiału wirusowego, które można później wykorzystać zarówno w modelach eksperymentalnych EBV in vitro, jak i in vivo.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: EBV powinien być uważany za materiał potencjalnie niebezpieczny biologicznie, a zatem powinien być traktowany zgodnie z poziomem bezpieczeństwa biologicznego 2 lub wyższym. Należy nosić fartuch laboratoryjny oraz rękawice. Jeśli istnieje możliwość narażenia na zachlapania, należy również rozważyć ochronę oczu. Poniższa procedura powinna być przeprowadzona w Komorze Bezpieczeństwa Biologicznego.

1. Zliczanie komórek P3HR1

  1. Komory do wirowania i ponownego zawieszania
    1. Przenieść zawiesinę komórkową z płytki hodowlanej o średnicy 100 mm (lub kolby T-25) trwającej hodowli komórkowej P3HR1 przy 80% zbiegu do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Gęstość wysiewu komórek P3HR-1 wynosi 1 x 106 komórek/ml. Utrzymywać w pełnej pożywce RPMI (79% pożywki hodowlanej RPMI, 20% płodowej surowicy bydlęcej, 1% antybiotyku Pen-Strep) w temperaturze 37 °C i 5% CO2 i pasaż co 3-4 dni.
    2. Wirować przez 8 minut przy 120 x g. Po odwirowaniu wyrzucić supernatant, ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml kompletnej pożywki hodowlanej RPMI i dobrze wymieszać (roztwór ten będzie określany jako zawiesina A).
  2. Przygotowanie zawiesiny komórek do zliczania
    1. Przygotować rozcieńczoną zawiesinę komórkową B, mieszając 2 μl zawiesiny komórek A z 8 μl pożywki hodowlanej. Dodać 10 μl 0,4% błękitu trypanowego do zawiesiny B w celu uzyskania zawiesiny C. Dobrze wymieszać preparat przez delikatne pipetowanie.
  3. Liczenie komórek za pomocą hemocytometru
    1. Umieść szklane szkiełko nakrywkowe na hemocytometrze i załaduj 10 μl zawiesiny C. Umieść hemocytometr pod mikroskopem świetlnym i policz liczbę komórek, które nie są zabarwione na niebiesko w każdym z czterech kwadrantów komory hemocytometru za pomocą obiektywu mikroskopu 40x (Rysunek 1).
    2. Błękit trypanowy barwi martwe komórki na niebiesko; nie licz tych komórek, ani komórek, które stykają się z którąkolwiek z górnych, dolnych, prawych lub lewych granic każdego kwadrantu hemocytometru.
    3. Obliczyć stężenie komórek na ml, korzystając z następującego wzoru:
      figure-protocol-1
      UWAGA: Liczba zliczanych kwadrantów wynosi cztery, a 10-4 ml to objętość kwadratów na hemocytometrze. Cztery ćwiartki, które powinny zostać policzone, są zaznaczone na zielono w Rysunek 1. Łączna liczba komórek zliczonych w formule to suma liczb komórek w kwadrantach 1, 2, 3 i 4. Komórki reprezentowane na niebiesko w Rysunek 1 powinien być policzony, podczas gdy komórki w kolorze czerwonym nie powinny być liczone, ponieważ dotykają górnej, prawej, dolnej lub lewej krawędzi kwadrantu.

figure-protocol-2
Rysunek 1: Liczenie komórek za pomocą komory hemocytometru. Cztery ćwiartki są liczone za pomocą mikroskopu świetlnego; Te ćwiartki są reprezentowane na zielono. Łączna liczba komórek Zliczona we wzorze wskazanym w kroku 1.3.3 opisanego tutaj protokołu jest sumą liczby komórek w kwadrantach 1, 2, 3 i 4. Komórki oznaczone kolorem niebieskim powinny być policzone, natomiast komórki oznaczone kolorem czerwonym nie powinny być liczone, ponieważ dotykają górnej, prawej, dolnej lub lewej krawędzi kwadrantu Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

2. Przygotowanie talerza do hodowli

  1. Umieścić objętość zawiesiny komórek A w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Wymagana wolumin zależy od liczby komórek. Dostosuj objętość tak, aby liczba komórek wynosiła około 2,2 x 106 komórek dla płytki hodowlanej o średnicy 100 mm.
  2. Dodać 5 ml kompletnej pożywki hodowlanej do probówki, a następnie przenieść zawartość probówki na płytkę hodowlaną o średnicy 100 mm. Dodać 80 μl dimetylosulfotlenku (DMSO) do płytki hodowlanej.
    UWAGA: DMSO jest wrażliwy na światło, dlatego powinien być przechowywany w pojemniku odpornym na światło lub pokryty nieprzezroczystym materiałem, takim jak folia aluminiowa.
  3. Dodać 350 μl 1 mg/ml 12-mirystynianu 13-octanu forbolu (PMA) do probówki. Końcowe stężenie PMA powinno wynosić 35 ng / ml, a DMSO 0,08%.
    UWAGA: PMA jest toksyczny, i rakotwórczy, dlatego należy obchodzić się z nim z najwyższą ostrożnością. PMA jest światłoczuły, dlatego powinien być przechowywany w pojemniku odpornym na światło lub przykryty nieprzezroczystym materiałem, takim jak folia aluminiowa.
  4. Dodać 4,27 ml pożywki hodowlanej, tak aby całkowita objętość wynosiła 10 ml. Wymieszać zawartość probówki, przechylając ją, a następnie przenieść zawartość na płytkę hodowlaną o średnicy 100 mm. Pozostawić płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych na 5 dni w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .

3. Indukcja i izolacja cząsteczek wirusa Epsteina-Barr

  1. Po 5 dniach w inkubatorze odwirować zawartość płytki o masie 120 x g przez 8 minut, aby osadzać komórki. Zebrać bezkomórkowy, zawierający wirusy supernatant i wyrzucić osad komórkowy.
  2. Odwirować supernatant przy 16 000 x g przez 90 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia cząstek wirusa. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad wirusa w 5 ml pożywki hodowlanej.
    UWAGA: Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) może być użyta do ponownego zawieszenia osadu wirusa zamiast pożywki hodowlanej.
  3. Podwielokrotność zawiesiny wirusa otrzymanej do 20 probówek, z których każda zawiera 250 μl zawiesiny wirusa. Przechowywać zawiesinę w temperaturze -80 °C.

4. Ekstrakcja DNA z cząsteczek wirusa

UWAGA: Należy zachować szczególną ostrożność podczas obchodzenia się z fenolem, ponieważ jest on toksyczny i oraz może powodować poważne oparzenia. Fenol jest wrażliwy na światło i utlenia się w kontakcie ze światłem lub powietrzem. Przechowuj go w pojemniku odpornym na światło lub alternatywnie przykryj rurkę fenolową nieprzezroczystym materiałem, takim jak folia aluminiowa.

  1. Oddzielenie białek od DNA
    1. Dodaj 500 μl fenolu nasyconego TrisCl do jednej z probówek o pojemności 250 μl. Dodać 100 μl wody (w celu zwiększenia objętości fazy wodnej) i dobrze przemieszać, aby uzyskać różową emulsję. Wirować przez 15 minut przy 9650 x g.
  2. Wytrącanie DNA
    1. Zebrać supernatant (przezroczystą fazę wodną) i przenieść go do nowej probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.
    2. Dodać równowartość 1/10 objętości zimnego octanu sodu w supernatantze (3 M, pH 5,2) i mieszać, pipetując w górę i w dół. Dodać 1 μl glikogenu o stężeniu 20 mg/ml i wymieszać pipetując.
      UWAGA: Ten krok jest opcjonalny, ale dodanie glikogenu zwiększa wytrącanie DNA, a także ułatwia wizualizację osadu DNA.
    3. Dodać trzykrotność objętości zimnego 100% etanolu do supernatantu. Przechowywać w temperaturze -80 °C przez noc.
      UWAGA: W tym miejscu procedurę można zatrzymać, aby wznowić ją w późniejszym czasie. Próbka może być przechowywana w temperaturze -80 °C przez 1 godzinę lub alternatywnie przez noc. Przechowywanie przez noc zwiększa wytrącanie DNA i dlatego jest zalecane.
  3. Izolowanie DNA wirusa
    1. Następnego dnia odwirować przy 9650 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant w celu uzyskania osadu DNA.
    2. Przemyć osad trzykrotnie 1 ml zimnego 70% etanolu, odwirować przy 9650 x g przez 15 minut i wyrzucić supernatant.
    3. Suszyć osad na powietrzu przez około 10 minut. Zawiesić osad w 10-50 μl wody destylowanej bez nukleaz (w zależności od wielkości osadu DNA).
    4. Próbki należy przechowywać w temperaturze -20 °C do późniejszego przetwarzania lub w temperaturze 4 °C przez noc, aby zapewnić maksymalne rozpuszczenie DNA, a następnie przechowywać w temperaturze -20 °C. Alternatywnie można bezpośrednio przejść do kroku 5.

5. Sprawdzanie stężenia i czystości DNA

  1. Po oczyszczeniu cokołu mikrospektrofotometru delikatną wycieraczką zadaniową, należy załadować 1 μl preparatu DNA.
  2. Zwróć uwagę na stężenie DNA w próbce. Sprawdź proporcje absorbancji zarówno w figure-protocol-3 i figure-protocol-4. DNA będzie absorbować przy 260 nm, białka przy 280 nm, a substancje organiczne, takie jak fenol, będą absorbować przy 230 nm. Stosunek 1,8-2 jest uważany za wystarczający do PCR w czasie rzeczywistym.

6. Kwantyfikacja za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym

  1. Przygotowanie mieszanin reakcyjnych PCR
    1. Umieść 5 μl zielonej mieszanki SYBR do PCR w czasie rzeczywistym w probówkach PCR o pojemności 0,2 ml. Dodać do każdej probówki 1 μl 7,5 pmol/μL startera do przodu i 1 μl 7,5 pmol/μL startera wstecznego. Sekwencja startera do przodu: 5'-CCCTAGTGGTTTCGGACACA-3'; odwrotna sekwencja startera: 5'-ACTTGCAAATGCTCTAGGCG-3'. Gen amplifikowany w celu określenia liczby kopii genomu EBV to gen małego RNA 2 wirusa Epsteina-Barr (EBER-2).
    2. Do jednej z probówek dodaj 2 μl wody wolnej od nukleaz i 1 μl wirusowego DNA z kroku 4. Całkowita objętość mieszaniny reakcyjnej wynosi 10 μL,
      UWAGA: W zależności od stężenia DNA w próbce może być konieczny etap rozcieńczania. Należy zanotować współczynnik rozcieńczenia F, który zostanie włączony do wzoru w kroku 6.3.
    3. Przygotuj inne probówki, które będą używane jako wzorce ze znanymi numerami kopii genomu EBV (1000, 2000, 5000, 10 000 i 54 000 kopii).
  2. Uruchomić mieszaniny PCR, zaczynając od początkowego etapu aktywacji w temperaturze 95 °C przez 5 minut, a następnie 40 cykli w temperaturze 95 °C i 58 °C (wyżarzanie) odpowiednio przez 15 s i 30 s.
  3. Wygeneruj krzywą wzorcową qPCR, wykreślając wartości Ct wzorców w stosunku do logarytmu liczby kopii genomu EBV na probówkę wzorcową. Wykorzystując równanie wykresu krzywej standardowej, wyprowadź liczbę kopii genomu EBV w probówce PCR zawierającej indukowane wirusowe DNA. Następnie użyj następującego wzoru, aby obliczyć stężenie indukowanego preparatu wirusowego:
    figure-protocol-5
    Gdzie X jest liczbą kopii genomu EBV pochodzących z krzywej wzorcowej, a F jest współczynnikiem rozcieńczenia używanym do tworzenia DNA wykorzystywanego w reakcji PCR.

7. Sprawdzanie aktywności biologicznej/zakaźności cząsteczek wirusa

  1. Przenieść komórki BC-3 z płytki hodowlanej o średnicy 100 mm przy 80% zbiegu do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Gęstość wysiewu komórek P3HR-1 wynosi 1 x 106 komórek/ml. Utrzymywać w pełnej pożywce RPMI (79% pożywki hodowlanej RPMI, 20% płodowej surowicy bydlęcej, 1% antybiotyku Pen-Strep) w temperaturze 37 °C i 5% CO2 i pasaż co 3-4 dni.
  2. Policz komórki BC-3 w taki sam sposób, w jaki komórki P3HR-1 zostały policzone, wykonując krok 1. Do 96-dołkowej płytki dodaj 105 komórek BC-3 do każdej studzienki. Użyj trzech, sześciu, dziewięciu lub 12 dołków, aby zapewnić znaczenie wyników i zminimalizować błędy.
  3. Dodać objętość wywaru wirusowego do każdej studzienki, w zależności od stężenia preparatu wirusowego określonego w kroku 6.3. MOI może się różnić, a optymalizacja tego protokołu ujawni najlepszy MOI dla infekcji (zalecany jest zakres MOI 2-50). Upewnij się, że całkowita objętość mieszaniny obecnej w każdym studzience wynosi 250 μl.
    1. Aby określić wymaganą objętość, należy znać stężenie wirusa i wybrać MOI. Na przykład, jeśli MOI wynosi 2, to liczba dodanych cząstek wirusa powinna być dwukrotnie większa niż liczba komórek. Oblicz objętość V wymaganego szczepu wirusa, korzystając ze wzoru: figure-protocol-6, gdzie n oznacza liczbę potrzebnych cząstek wirusa, a C znane stężenie wirusa
  4. Inkubować zawartość płytki 96-dołkowej przez 5 dni. Po 5 dniach przenieś zawartość każdej studzienki do probówki o pojemności 1,5 ml.
  5. Odwirować probówki o sile 120 x g przez 8 minut w celu oddzielenia komórek od pożywki hodowlanej zawierającej wirusa. Poddaj granulki komórek, a także supernatanty ekstrakcji DNA, a następnie kwantyfikacji PCR w czasie rzeczywistym, aby sprawdzić obecność genomów wirusa w każdej frakcji, oceniając w ten sposób zakaźność cząstek wirusa.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem tej procedury jest wyizolowanie cząsteczek EBV w zawiesinie o znanym mianie wirusa, które następnie mogłyby być wykorzystane do modelowania infekcji EBV. Dlatego niezwykle ważne jest stosowanie optymalnych stężeń różnych odczynników, aby uzyskać najwyższą wydajność EBV po zakończeniu procedury.

Przeprowadzono próbę optymalizacji w celu określenia stężeń PMA i DMSO, które dałyby największą liczbę cząstek EBV (Rysunek 2). Stężenie DMSO wynoszące 0,8% i stężenie PMA wyno...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Produkcja cząsteczek EBV jest niezbędna do zrozumienia biologii tego wirusa, a także związanych z nim chorób. Tutaj opisaliśmy produkcję tych cząstek z linii komórkowej P3HR-1. Ta linia komórkowa nie jest jedyną linią produkującą EBV; w rzeczywistości cząsteczki EBV zostały również wyizolowane z komórek B95-8 21,22, a także z linii komórkowej Raji18,19. Cykl lityczny EBV został indukowany w tych komórkach...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Finansowanie tej pracy było wspierane przez granty dla ER z Asmar Research Fund, Libańskiej Narodowej Rady Badań Naukowych (L-CNRS) oraz Planu Praktyki Medycznej (MPP) na Amerykańskim Uniwersytecie w Bejrucie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Cienkościenne probówki PCR 0,2 mlThermo ScientificAB0620Przed użyciem należy je sterylizować w autoklawie
0,2-10 i mikro; L Końcówki filtrów mikroobjętościowychCorning4807Przed użyciem należy je sterylizować w autoklawie
0,5-10 i mikro; L PipetaBrandTech704770
10 ml Jednorazowa pipeta serologicznaCorning4488
1000 µ L Filtrowane końcówki do pipetQSPTF-112-1000-Q
100-1000 µ L PipetaEppendorf3123000063
100x20 mm Płytki do krojeniaSarstedt83.1802
10-100 µ L PipetaBrandTech704774
15 ml Probówki stożkoweCorning430791
200 µ L Końcówki do pipet z filtremQSPTF-108-200-Q
20-200 µ L PipetaEppendorf3123000055
50 ml Probówki stożkoweCorning430828
CFX96 Termocykler C-1000 w czasie rzeczywistymBio-Rad184-1000
DMSOAmresco0231
Woda wolna od DNaz / RNazZymo ResearchW1001-1
Podkłady EBERMacrogenN/APodkłady na zamówienie
Kontrola DNA EBV (standardy)VircellMBC065
Etanol (klasa odczynnika laboratoryjnego)Fischer ChemicalE/0600DF/17
Płodowa surowica bydlęcaSigmaF9665
Fresco 21 MikrowirówkaThermo Scientific10651805
Roztwór glikogenuQiagen158930
HemocytometrBOECOBOE 01
Mikroskop światła odwróconegoZeissAxiovert 25
iTaq Uniwersalny SYBR Green SupermixBio-Rad172-5121
Probówka do mikrowirówekCostar (Corning)3621Przed użyciem należy poddać autoklawowaniu
P3HR-1 Linia komórkowaATCCHTB-62
Penicylina-Streptomycyna RozwiązanieBiowestL0022
FenolVWR20599.297
12-mirystynian 13-octanu (PMA) Phorbol 12-mirystynian 13-octan (PMA)Sigma-AldrichP8139
Napełniacz do pipetThermo Scientific9501
Chusteczki precyzyjneKimtech7552
RPMI-1640 Pożywkahodowlana SigmaR7388
SL 16R WirówkaThermo Scientific75004030
Octan soduRiedel-de Haë n (Honeywell)25022
SpektrofotomerDeNovixDS-11
Tris-HClSigmaT-3253
Trypan Blue SolutionSigmaT8154
Inkubator CO2 z płaszczem wodnymThermo Scientific4121

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Epstein, M. A., Achong, B. G., Barr, Y. M. Virus particles in cultured lymphoblasts from Burkitt's lymphoma. Lancet. 1 (7335), 702-703 (1964).
  2. Sample, J., et al. Epstein-Barr virus types 1 and 2 differ in their EBNA-3A, EBNA-3B, and EBNA-3C genes. Journal of Virology. 64 (9), 4084-4092 (1990).
  3. Chang, M. S., Kim, W. H. Epstein-Barr virus in human malignancy: a special reference to Epstein-Barr virus associated gastric carcinoma. Cancer Research and Treatment. 37 (5), 257-267 (2005).
  4. Manet, E. Encyclopedia of Cancer. Schwab, M. , Springer. Berlin Heidelberg. 1602-1607 (2017).
  5. Babcock, G. J., Decker, L. L., Volk, M., Thorley-Lawson, D. A. EBV persistence in memory B cells in vivo. Immunity. 9 (3), 395-404 (1998).
  6. Khan, G., Miyashita, E. M., Yang, B., Babcock, G. J., Thorley-Lawson, D. A. Is EBV persistence in vivo a model for B cell homeostasis. Immunity. 5 (2), 173-179 (1996).
  7. Jha, H. C., Banerjee, S., Robertson, E. S. The role of gammaherpesviruses in cancer pathogenesis. Pathogens. 5 (1), 18(2016).
  8. El-Sharkawy, A., Al Zaidan, L., Malki, A. Epstein-Barr virus-associated malignancies: roles of viral oncoproteins in carcinogenesis. Frontiers in Oncology. 8, 265(2018).
  9. Vereide, D., Sugden, B. Insights into the evolution of lymphomas induced by Epstein-Barr virus. Advances in Cancer Research. 108, 1-19 (2010).
  10. Vereide, D. T., Sugden, B. Lymphomas differ in their dependence on Epstein-Barr virus. Blood. 117 (6), 1977-1985 (2011).
  11. Houen, G., Trier, N. H. Epstein-Barr virus and systemic autoimmune diseases. Frontiers in Immunology. 11, 587380(2020).
  12. Ortiz, A. N., et al. Impact of Epstein-Barr virus infection on inflammatory bowel disease (IBD) clinical outcomes. Revista Espanola de Enfermedades Digestivas. 114 (5), 259-265 (2021).
  13. Caplazi, P., et al. Mouse models of rheumatoid arthritis. Veterinary Pathology. 52 (5), 819-826 (2015).
  14. Kiesler, P., Fuss, I. J., Strober, W. Experimental models of inflammatory bowel diseases. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 1 (2), 154-170 (2015).
  15. Warde, N. Experimental arthritis: EBV induces arthritis in mice. Nature Reviews Rheumatology. 7 (12), 683(2011).
  16. Jog, N. R., James, J. A. Epstein Barr virus and autoimmune responses in systemic lupus erythematosus. Frontiers in Immunology. 11, 623944(2020).
  17. Shimizu, N., Yoshiyama, H., Takada, K. Clonal propagation of Epstein-Barr virus (EBV) recombinants in EBV-negative Akata cells. Journal of Virology. 70 (10), 7260-7263 (1996).
  18. Hsu, C. H., et al. Induction of Epstein-Barr virus (EBV) reactivation in Raji cells by doxorubicin and cisplatin. Anticancer Research. 22, 4065-4071 (2002).
  19. Nutter, L. M., Grill, S. P., Li, J. S., Tan, R. S., Cheng, Y. C. Induction of virus enzymes by phorbol esters and n-butyrate in Epstein-Barr virus genome-carrying Raji cells. Cancer Research. 47 (16), 4407-4412 (1987).
  20. Fresen, K. O., Cho, M. S., zur Hausen, H. Recovery of transforming EBV from non-producer cells after superinfection with non-transforming P3HR-1 EBV. International Journal of Cancer. 22 (4), 378-383 (1978).
  21. Glaser, R., Tarr, K. L., Dangel, A. W. The transforming prototype of Epstein-Barr virus (B95-8) is also a lytic virus. International Journal of Cancer. 44 (1), 95-100 (1989).
  22. Sairenji, T., et al. Inhibition of Epstein-Barr virus (EBV) release from P3HR-1 and B95-8 cell lines by monoclonal antibodies to EBV membrane antigen gp350/220. Journal of Virology. 62 (8), 2614-2621 (1988).
  23. Savage, A., et al. An assessment of the population of cotton-top tamarins (Saguinus oedipus) and their habitat in Colombia. PLoS one. 11 (12), 0168324(2016).
  24. Kallin, B., Klein, G. Epstein-Barr virus carried by raji cells: a mutant in early functions. Intervirology. 19 (1), 47-51 (1983).
  25. Fresen, K. O., Cho, M. S., Hausen, H. Z. Recovery of transforming EBV from non-producer cells after superinfection with non-transforming P3HR-1 EBV. International Journal of Cancer. 22 (4), 378-383 (1978).
  26. Bounaadja, L., Piret, J., Goyette, N., Boivin, G. Evaluation of Epstein-Barr virus, human herpesvirus 6 (HHV-6), and HHV-8 antiviral drug susceptibilities by use of real-time-PCR-based assays. Journal of Clinical Microbiology. 51 (4), 1244-1246 (2013).
  27. Buelow, D., et al. Comparative evaluation of four real-time PCR methods for the quantitative detection of Epstein-Barr virus from whole blood specimens. Journal of Molecular Diagnostics. 18 (4), 527-534 (2016).
  28. Wu, D. Y., Kalpana, G. V., Goff, S. P., Schubach, W. H. Epstein-Barr virus nuclear protein 2 (EBNA2) binds to a component of the human SNF-SWI complex, hSNF5/Ini1. Journal of Virology. 70 (9), 6020-6028 (1996).
  29. Li, C., et al. EBNA2-deleted Epstein-Barr virus (EBV) isolate, P3HR1, causes Hodgkin-like lymphomas and diffuse large B cell lymphomas with type II and Wp-restricted latency types in humanized mice. PLoS Pathogens. 16 (6), 1008590(2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Epstein Barr VirusP3HR1 Cell LineVirus IsolationVirus QuantificationViral DNA ExtractionReal Time PCREBV Genome CopyCell CulturePMA InductionHemocytometer Counting

Powiązane artykuły