Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Analiza autofagii wywołanej głodem w ciele tłuszczowym larw Drosophila melanogaster

2.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64282

⸱

4 sierpnia 2022

 , 
1Ministry of Education Key Laboratory of Biosystems Homeostasis and Protection and Innovation Center for Cell Signaling Network, Life Sciences Institute, Zhejiang University

W tym artykule

Podsumowanie

Obecny protokół opisuje indukcję autofagii w ciele tłuszczowym larw Drosophila melanogaster poprzez wyczerpanie składników odżywczych i analizuje zmiany w autofagii za pomocą transgenicznych szczepów much.

Streszczenie

Autofagia to proces samotrawienia komórkowego. Dostarcza ładunek do lizosomów w celu degradacji w odpowiedzi na różne stresy, w tym głód. Nieprawidłowe działanie autofagii wiąże się ze starzeniem się i wieloma chorobami ludzkimi. Maszyneria autofagii jest wysoce konserwatywna - od drożdży po ludzi. Larwalne ciało tłuszczowe Drosophila melanogaster, analog wątroby kręgowców i tkanki tłuszczowej, stanowi unikalny model monitorowania autofagii in vivo. Autofagia może być łatwo wywołana przez głód składników odżywczych w ciele tłuszczowym larw. Większość genów związanych z autofagią jest konserwatywna u Drosophila. Opracowano wiele transgenicznych szczepów much wykazujących ekspresję znakowanych markerów autofagii, co ułatwia monitorowanie różnych etapów procesu autofagii. Analiza klonalna umożliwia dokładne porównanie markerów autofagii w komórkach o różnych genotypach w tym samym fragmencie tkanki. Obecny protokół szczegółowo opisuje procedury (1) generowania klonów somatycznych w ciele tłuszczowym larw, (2) indukowania autofagii poprzez głód aminokwasów oraz (3) preparowania ciała tłuszczowego larw, mając na celu stworzenie modelu do analizy różnic w autofagii przy użyciu markera autofagosomów (GFP-Atg8a) i analizy klonalnej.

Wprowadzenie

Autofagia to proces "samozjadający" wywołany różnymi stresami, w tym głodem aminokwasów1. Makroautofagia (zwana dalej autofagią) jest najlepiej zbadanym typem autofagii i odgrywa niezastąpioną rolę w utrzymaniu homeostazy komórkowej2. Nieprawidłowe działanie autofagii jest związane z kilkoma chorobami ludzkimi3. Ponadto niektóre geny związane z autofagią są potencjalnymi celami w leczeniu różnych chorób4.

Autofagia jest regulowana w bardzo wyrafinowany sposób5. Po wygłodzeniu błony izolacyjne sekwestrują materiały cytoplazmatyczne, tworząc autofagosomy o podwójnej błonie6. Autofagosomy następnie łączą się z endosomami i lizosomami, tworząc amfisomy i autolizosomy. Za pomocą lizosomalnych enzymów hydrolitycznych pochłonięta zawartość cytoplazmatyczna ulega degradacji, a składniki odżywcze są poddawane recyklingowi7.

Autofagia to ewolucyjnie zachowany proces8. Drosophila melanogaster jest doskonałym modelem do badania procesu autofagii in vivo. Głód aminokwasów łatwo indukuje autofagię w tkance tłuszczowej muchy, analogu ludzkiej wątroby i tkanki tłuszczowej9. Defekty autofagii zakłócają wyraźne wzorce puncta kilku białek związanych z autofagią, takich jak między innymi Atg8, Atg9, Atg18, Syx17, Rab7, LAMP1 i p6210. Dlatego analiza wzorców tych markerów autofagii pomoże dostrzec występowanie wad autofagii i wadliwego etapu autofagii. Na przykład białko podobne do ubikwityny Atg8 jest najczęściej stosowanym markerem autofagii11. U Drosophila melanogaster udało się opracować transgeniczne szczepy z zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) oznaczonym zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) Atg8a12. GFP-Atg8a jest dyfundowany w cytozolu i jądrach w karmionych komórkach. Po zagłodzeniu, GFP-Atg8a jest przetwarzany i modyfikowany przez fosfatydyloetanoloaminę (PE) i tworzy puncta, które oznaczają błony izolacyjne i w pełni rozwinięte autofagosomy13,14. Dzięki bezpośredniej mikroskopii fluorescencyjnej indukcję autofagii można łatwo zaobserwować jako wzrost tworzenia się punktów GFP-Atg815. Atg8a puncta nie powstawałaby w odpowiedzi na głód w obecności defektu inicjacji autofagii. Ponieważ GFP-Atg8a może być gaszony i trawiony przez niskie pH w autolizosomach, GFP-Atg8a puncta może zwiększyć swoją liczbę, jeśli autofagia zostanie zablokowana w późnych stadiach16.

Ponieważ autofagia jest bardzo wrażliwa na dostępność składników odżywczych17, niewielkie różnice w warunkach hodowli często prowadzą do różnic w fenotypach. Dlatego analiza klonalna, metoda analizująca zmutowane komórki w porównaniu z komórkami kontrolnymi typu dzikiego w tej samej tkance, ma główną przewagę w analizowaniu defektów autofagii18. Korzystając z rekombinacji specyficznej dla miejsca między chromosomami za pośrednictwem flp/FRT, w której pośredniczy reflukaza/refpasa rozpoznawanie celu, łatwo powstają muchy przenoszące tkanki mozaiki19,20. Dzikie komórki otaczające zmutowane komórki tworzą doskonałą kontrolę wewnętrzną, aby uniknąć różnic indywidualnych21.

Niniejsze badanie opisuje, jak wywołać autofagię poprzez głód aminokwasów i wygenerować mozaikę tkanek tłuszczowych wyrażających GFP-Atg8a. Protokoły te mogą być wykorzystywane do analizy różnic w autofagii wśród zmutowanych klonów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Krzyżowanie się Drosophila i składanie jaj

  1. Wprowadzić 3 samce (genotyp hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a) i 15 samic (genotyp y' w* Mu FRT19A/ FM7, Kr GFP) dorosłe muchy (patrz tabela materiałów) do fiolki hodowlanej (ze standardową pożywką z mąki kukurydzianej/melasy/agaru Drosophila w temperaturze 25 °C) w celu krycia.
    UWAGA: Należy ustawić wiele fiolek z kulturami tej samej krzyżówki, aby zapewnić wystarczającą ilość larw do dalszych eksperymentów. Samce muchy o genotypie hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a są nosicielami miejsca FRT na chromosomie X w pobliżu centromeru (FRT19A). Wyraża również FLP po szoku cieplnym w temperaturze 37 °C. Transgen z wszechobecną ekspresją RFP jest wstawiany do chromosomu X. GFP-Atg8a ulega ekspresji pod kontrolą cgGal4 w ciele tłuszczowym larw22. Samica szczepu muchy o genotypie y' w* Mu FRT19A/ FM7, Kr GFP jest nosicielem śmiertelnej mutacji (Mu) i FRT19A na chromosomie X. Szczegółowy schemat skrzyżowania jest pokazany w Rysunek 1.
  2. W celu złożenia jaj przenieś muchy do nowej fiolki z kulturą. Po 48 godzinach od wprowadzenia, stukać w fiolkę "matującą", aż muchy zostaną ogłuszone i upuść na pożywkę u podstawy fiolki.
    1. Odłączyć "łączącą" fiolkę i przykryć jej usta odłączoną odwróconą fiolką ze świeżą pożywką (fiolka ze świeżymi kulturami). Następnie przenieś muchy do świeżej fiolki z kulturą, odwracając i stukając w fiolki.
    2. Zatkać świeżą fiolkę z kulturą (z przeniesionymi muchami) i wyrzucić starą fiolkę z kulturą. Umieścić tę fiolkę ze świeżymi kulturami w inkubatorze o temperaturze 25 °C do składania jaj na świeżej pożywce.
      UWAGA: Wstępne podgrzanie świeżych fiolek z kulturami do temperatury 25 °C przez 15 minut przed procesem przenoszenia much pomoże muchom szybko przystosować się do nowego środowiska i przyspieszyć składanie jaj.
  3. Muchy usuwamy po 6 godzinach od złożenia jaj. Jeśli eksperymenty muszą zostać powtórzone, przenieś te muszki do innej fiolki z kulturą (jak opisano w kroku 1.2). W przeciwnym razie wyrzuć muchy, wrzucając je do kolby zawierającej 75% etanolu).
    1. Inkubować fiolkę z zarodkami w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 1 godzinę w celu wywołania ekspresji FLP. Następnie umieścić je w inkubatorze w temperaturze 25 °C i pozwolić zarodkom na dalszy rozwój.
      UWAGA: Pomyślne formowanie się zmutowanych klonów może być następnie potwierdzone za pomocą obrazowania. Brak sygnałów RFP oznacza zmutowane klony.

2. Głód aminokwasów indukuje autofagię

  1. Za pomocą szpatułki laboratoryjnej zgarnij pożywkę zawierającą rozwijające się larwy na szalkę Petriego 75 godzin po złożeniu jaj. Dodaj 3 ml 1x PBS do naczynia i delikatnie oddziel pożywkę hodowlaną i larwy za pomocą długich kleszczy. Wybierz od 10 do 15 larw we wczesnym stadium rozwoju.
    UWAGA: Larwy wczesnego stadium rozwoju muszą być starannie wybierane. Etap rozwoju larw ma kluczowe znaczenie dla powodzenia tego protokołu. Ze względu na ograniczony czas składania jaj oczekuje się, że większość larw w fiolce hodowlanej będzie we wczesnym trzecim stadium rozwojowym po 75 godzinach inkubacji. Jednak różne receptury pożywek hodowlanych mogą prowadzić do różnic w czasie rozwoju larw. Kryteriami rozróżniania larw wczesnego trzeciego stadium rozwojowego są długość ciała, obecność przetchlinków przednich i tylnych, a także haki żuchwy aparatu gębowego23.
  2. Napełnij studzienki 9-dołkowej szklanej płytki punktowej z wgłębieniem (patrz Tabela materiałów) 1x PBS. Umieść oddzielone larwy trzeciego stadium w studzienkach za pomocą długich kleszczy i dokładnie umyj larwy, aby usunąć wszystkie pozostałości pożywki.
  3. Weź 5 ml 20% roztworu sacharozy (w 1x PBS) do pustej fiolki i umieść czyste larwy trzeciego stadium w tym roztworze za pomocą długich kleszczy. Inkubować tę fiolkę w inkubatorze w temperaturze 25 °C przez 6 godzin przed pobraniem ich do sekcji.
    UWAGA: 20% roztwór sacharozy (w 1x PBS) służy jako pożywka głodowa z niedoborem aminokwasów.

3. Sekcja larw w trzecim stadium rozwojowym i przetwarzanie próbek tkanek

  1. Naostrz dwie pary kleszczy #5 (patrz Tabela materiałów) równomiernie po obu stronach za pomocą kamienia do ostrzenia.
  2. Dodaj 400 μl 1x PBS do każdej studzienki 9-dołkowej szklanej płytki punktowej i przenieś larwy do studzienek za pomocą długich kleszczy. Umieść jedną larwę w studzience stroną grzbietową (stroną z tchawicą) skierowaną do góry.
    1. Chwyć naskórek larwy dwoma kleszczami #5 na środku pnia larwy i delikatnie rozerwij skórki. Odsłonięte ciała tłuszczowe, wraz z innymi wewnętrznymi tkankami larw, będą nadal przyczepione do tuszy larwy. Pociągnij na tyle, aby jak najbardziej odsłonić narządy wewnętrzne. Powtórz ten krok dla wszystkich larw.
      UWAGA: Każda larwa ma dwa duże kawałki ciała tłuszczowego wzdłuż tułowia ciała. Tkanka tłuszczowa jest białą, nieprzezroczystą i płaską monowarstwą, którą można łatwo odróżnić pod mikroskopem preparacyjnym24.
  3. Przenieść tuszę larwalną do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml zawierającej 500 μl 4% paraformaldehydu (PFA). Inkubować przez 30 minut w temperaturze 25 °C bez wytrząsania probówek.
    UWAGA: 4% PFA jest toksyczne. Nosić rękawiczki i maski dla ochrony.
    UWAGA: Zaleca się przygotowanie 4% PFA w buforze 1x PBS. Proszek PFA nie rozpuszcza się natychmiast w 1x PBS. W związku z tym mieszaninę należy inkubować w temperaturze 65 °C w inkubatorze przez noc lub wstrząsać z przerwami przez 45 minut w temperaturze 25 °C.
  4. Po 30 minutach inkubacji tuszy z 4% PFA, odpipetować roztwór PFA, dodać 500 μL 1x PBS do probówki i delikatnie potrząsać probówką na płaskim rotatorze przez 10 minut przed odrzuceniem 1x roztworu PBS (powtórzyć 3x).
  5. Za pomocą długich kleszczy przenieś utrwaloną i umytą tuszę larwalną do studzienki w 9-wklęsłej płytce punktowej wypełnionej 1x PBS. Za pomocą kleszczy #5 usuń wszystkie beztłuszczowe tkanki ciała.
  6. Użyj kleszczyków #5, aby zamontować kawałki ciała tłuszczowego na szkiełku mikroskopowym, używając 80% glicerolu jako medium montażowego i połóż szkiełko nakrywkowe na wierzchu.
    UWAGA: Przed montażem sprawdź pH 80% glicerolu (przy użyciu bibułek do pomiaru pH, pH = 7 jest optymalne), aby chronić sygnał GFP. Podłoże montażowe (patrz Tabela Materiałów) z DAPI w 80% glicerolu pomoże w obrazowaniu jąder komórek tłuszczowych. Szkiełka te są stabilne przez 1 tydzień, jeśli są przechowywane w ciemności w temperaturze 4 °C.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W warunkach sytości białko podobne do ubikwityny oznakowane GFP, GFP-Atg8a, jest rozproszone wewnątrz komórek. W przypadku głodzenia tworzy ono zielone punkty i znakuje autofagosomy. Po połączeniu się autofagosomów z lizosomami sygnał GFP zostaje wygaszony w kwaśnych autolizosomach, a zielone punkty zanikają. Jeśli autofagia nie zostanie indukowana lub dojrzewanie autofagosomów zostanie przyspieszone, oczekuje się, że liczba punktów GFP będzie niska. Jeżeli jednak fuzja autofagosomów z lizosomami zostanie zablokowana lub...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Niniejszy protokół opisuje metody (1) generowania muszek przenoszących zmutowane klony w ciałach tłuszczowych larw, (2) indukowania autofagii poprzez głód aminokwasów, oraz (3) preparowania ciał tłuszczowych larw. Aby pomyślnie wytworzyć klony w larwalnych ciałach tłuszczowych, należy starannie przeprowadzić następujące krytyczne kroki. (1) Dokładny czas szoku cieplnego ma kluczowe znaczenie, ponieważ rekombinacja mitotyczna zachodzi tylko wtedy, gdy tkanka przechodzi mitozę, oraz (2) zarówno temperatura, jak i czas trwa...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Jesteśmy wdzięczni THFC i BDSC za dostarczenie szczepów much. Dr Tong Chao jest wspierany przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (32030027, 91754103, 92157201) oraz fundusze na badania podstawowe dla uniwersytetów centralnych. Dziękujemy podstawowej placówce Instytutu Nauk Przyrodniczych (LSI) za świadczenie usług.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówka do mikrowirówek 1,5 mlAxygenMCT-150-C
#5 KleszczeDumontRS-5015
9 Opatrunki Płytka punktowaPYREX7220-85
Mikroskop fluorescencyjnyNikonSMZ1500
GlycerolSangon BiotechA100854-0100
KClSangon BiotechA610440-0500Skład 1x roztwór PBS
KH2PO4Sangon BiotechA600445-0500Skład 1x roztwór PBS
Szpatułka laboratoryjnaFisher14-375-10
Kleszcze długieR' DEERRST-14
Szkło osłonowe mikroskopuCITOTEST80340-1130
Szkiełka mikroskopoweCITOTEST80302-2104
Na2HPO4Sangon BiotechA501727-0500Skład 1x roztwór PBS
NaClSangon BiotechA610476-0005Skład 1x roztwór PBS
ParaformaldehydSigma-Aldrich158127
szalka PetriegoCorning430166
mąki kukurydzianej / melasy / agaruTong Laboratoryjny
mikroskop stereoskopowyNikonSMZ745
SacharozaSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.
Medium montażowe przeciw blaknięciu Vectashield z DAPIVectorlabratoryH-1200-10Zalecane medium
Muchy kolby
yw* Iso FRT19ATong Lab
stocksy'w* Mu1FRT19A/ FM7,Kr GFPMuchy Tong Lab
yw* Mu2 FRT19A/ FM7,Kr GFPTong Lab's fly stocks
hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8aTong Lab
Standardowy pokarm z 10021418 montażowe Fly

Bibliografia

  1. Yorimitsu, T., Klionsky, D. J. Autophagy: Molecular machinery for self-eating. Cell Death & Differentiation. 12 (2), 1542-1552 (2005).
  2. Jin, S., White, E. Role of autophagy in cancer: Management of metabolic stress. Autophagy. 3 (1), 28-31 (2007).
  3. Mizushima, N., Levine, B. Autophagy in human diseases. New England Journal of Medicine. 383 (16), 1564-1576 (2020).
  4. Mizushima, N., et al. Autophagy fights disease through cellular self-digestion. Nature. 451 (7182), 1069-1075 (2008).
  5. Yang, Z., Klionsky, D. J. Eaten alive: A history of macroautophagy. Nature Cell Biology. 12 (9), 814-822 (2010).
  6. Lamb, C. A., Yoshimori, T., Tooze, S. A. The autophagosome: Origins unknown, biogenesis complex. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 759-774 (2013).
  7. Klionsky, D. J., Eskelinen, E. L., Deretic, V. Autophagosomes, phagosomes, autolysosomes, phagolysosomes, autophagolysosomes...Wait,I'mconfused. Autophagy. 10 (4), 549-551 (2014).
  8. Zhang, S., Hama, Y., Mizushima, N. The evolution of autophagy proteins-Diversification in eukaryotes and potential ancestors in prokaryotes. Journal of Cell Science. 134 (13), (2021).
  9. Scott, R. C., Schuldiner, O., Neufeld, T. P. Role and regulation of starvation-induced autophagy in the Drosophila fat body. Developmental Cell. 7 (2), 167-178 (2004).
  10. Liu, W., et al. Mitochondrial protein import regulates cytosolic protein homeostasis and neuronal integrity. Autophagy. 14 (8), 1293-1309 (2018).
  11. Ichimura, Y., et al. A ubiquitin-like system mediates protein lipidation. Nature. 408 (6811), 488-492 (2000).
  12. Rusten, T. E., et al. Programmed autophagy in the Drosophila fat body is induced by ecdysone through regulation of the PI3K pathway. Developmental Cell. 7 (2), 179-192 (2004).
  13. Nishida, Y., et al. Discovery of Atg5/Atg7-independent alternative macroautophagy. Nature. 461 (7264), 654-658 (2009).
  14. Ravikumar, B., et al. Regulation of mammalian autophagy in physiology and pathophysiology. Physiological Reviews. 90 (4), 1383-1435 (2010).
  15. Xie, Z., Nair, U., Klionsky, D. J. Atg8 controls phagophore expansion during autophagosome formation. Molecular Biology of the Cell. 19 (8), 3290-3298 (2008).
  16. Shintani, T., Klionsky, D. J. Cargo proteins facilitate the formation of transport vesicles in the cytoplasm to vacuole targeting pathway. Journal of Biological Chemistry. 279 (29), 29889-29894 (2004).
  17. Russell, R. C., Yuan, H. X., Guan, K. L. Autophagy regulation by nutrient signaling. Cell Research. 24 (1), 42-57 (2014).
  18. Nagy, P., et al. How and why to study autophagy in Drosophila: It's more than just a garbage chute. Methods. 75, 151-161 (2015).
  19. Golic, K. G., Lindquist, S. The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the Drosophila genome. Cell. 59 (3), 499-509 (1989).
  20. Senecoff, J. F., Cox, M. M. Directionality in FLP protein-promoted site-specific recombination is mediated by DNA-DNA pairing. Journal of Biological Chemistry. 261 (16), 7380-7386 (1986).
  21. Germani, F., Bergantinos, C., Johnston, L. A. Mosaic analysis in Drosophila. Genetics. 208 (2), 473-490 (2018).
  22. Zappia, M. P., et al. E2F/Dp inactivation in fat body cells triggers systemic metabolic changes. eLife. 10, 67753(2021).
  23. Demerec, M. Biology of Drosophila. , Hafner Pub. Co. New York, NJ. (1965).
  24. Rizki, R. M., et al. Drosophila larval fat body surfaces. Wilhelm Roux's Archives of Developmental Biology. 192 (1), 1-7 (1983).
  25. Szeto, J., et al. ALIS are stress-induced protein storage compartments for substrates of the proteasome and autophagy. Autophagy. 2 (3), 189-199 (2006).
  26. Renna, M., et al. Chemical inducers of autophagy that enhance the clearance of mutant proteins in neurodegenerative diseases. Journal of Biological Chemistry. 285 (15), 11061-11067 (2010).
  27. Guo, S., et al. A large-scale RNA interference screen identifies genes that regulate autophagy at different stages. Scientific Reports. 8, 1-15 (2018).
  28. Tian, W., et al. An antibody for analysis of autophagy induction. Nature Methods. 17 (2), 232-239 (2020).
  29. Nezis, I. P. Selective autophagy in Drosophila. International Journal of Cell Biology. 2012, 146767(2012).
  30. Chu, Y., et al. Fluorescent materials for monitoring mitochondrial biology. Materials. 14 (15), 4180(2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Ciało tłuste larw Drosophilaanaliza klonalnagłodzenie aminokwasowemarker GFP-Atg8agenerowanie klonów somatycznychmarkery autofagiianaliza mozaikowaautofagia selektywnamonitorowanie mitofagii
Analiza autofagii wywołanej głodem w ciele tłuszczowym larw Drosophila melanogaster
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.