Artykuł metodologiczny

Konstruowanie cyklicznych peptydów przy użyciu centrum sulfonowego na uwięzi

DOI:

10.3791/64289

⸱

28 września 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Pingshan Translational Medicine Center, Shenzhen Bay Laboratory, 2Key Laboratory of Chemical Genomics, School of Chemical Biology and Biotechnology, Peking University Shenzhen Graduate School, 3Department of Radiation Oncology, the First Affiliated Hospital, Anhui Medical University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół przedstawia syntezę cyklicznych peptydów poprzez bissalkilację między cysteiną a metioniną oraz łatwą reakcję tiol-yne wywołaną przez centrum propargylu sulfonium.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W ostatnich latach, cykliczne peptydy przyciągają coraz większą uwagę w dziedzinie odkrywania leków ze względu na ich doskonałe działanie biologiczne, a w konsekwencji są obecnie stosowane klinicznie. Dlatego tak ważne jest poszukiwanie skutecznych strategii syntezy cyklicznych peptydów, aby promować ich zastosowanie w dziedzinie odkrywania leków. W artykule przedstawiono szczegółowy protokół efektywnej syntezy cyklicznych peptydów przy użyciu bisalkilacji na żywicy lub wewnątrzcząsteczkowej (międzycząsteczkowej). Korzystając z tego protokołu, zsyntetyzowano peptydy liniowe, wykorzystując syntezę peptydów w fazie stałej z cysteiną (Cys) i metioniną (Met) sprzężonymi jednocześnie na żywicy. Co więcej, cykliczne peptydy zsyntetyzowano poprzez bisalkilację między Met i Cys przy użyciu przestrajalnego tethera i centrum sulfonium on-tether. Całą drogę syntezy można podzielić na trzy główne procesy: deprotekcję Cys na żywicy, sprzężenie łącznika oraz cyklizację między Cys i Met w roztworze rozszczepienia kwasu trifluorooctowego (TFA). Ponadto, zainspirowana reaktywnością centrum sulfonium, grupa propargylowa została przyłączona do Met, aby wywołać addycję tiol-yny i utworzyć cykliczny peptyd. Następnie surowe peptydy wysuszono i rozpuszczono w acetonitrylu, oddzielono, a następnie oczyszczono za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC). Masę cząsteczkową cyklicznego peptydu potwierdzono za pomocą chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas (LC-MS), a stabilność kombinacji cyklicznego peptydu z reduktorem potwierdzono za pomocą HPLC. Ponadto przesunięcie chemiczne w cyklicznym peptydzie analizowano za pomocą widm magnetycznegorezonansu jądrowego 1 H (1H NMR). Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten miał na celu ustanowienie skutecznej strategii syntezy cyklicznych peptydów.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Interakcje białko-białko (PPIs)1 odgrywają kluczową rolę w badaniach i rozwoju leków. Konstruowanie stabilizowanych peptydów o ustalonej konformacji za pomocą środków chemicznych jest jedną z najważniejszych metod opracowywania motywów mimetycznych IPs2. Do tej pory opracowano kilka cyklicznych peptydów, które są ukierunkowane na IPP3. Większość peptydów jest ograniczona do konformacji α-helisy, aby zmniejszyć entropię konformacyjną i poprawić stabilność metaboliczną, powinowactwo do wiązania celu i przepuszczalność komórek4,5. W ciągu ostatnich 2 dekad łańcuchy boczne Cys6,7, lysine8,9, tryptofan10, arginine11 i Met12,13 zostały wprowadzone do nienaturalnych aminokwasów, aby utrwalić peptyd w cyklicznej konformacji. Takie cykliczne peptydy mogą celować w unikalną przestrzeń chemiczną lub specjalne miejsca, wywołując w ten sposób reakcję kowalencyjną w celu utworzenia kowalencyjnego wiązania białko-peptyd 14,15,16,17. W niedawnym raporcie Yu i wsp., chloroacetamid został zakotwiczony w domenie ligandów peptydowych, zapewniając kowalencyjną reakcję koniugacji o doskonałej specyficzności białkowej18. Co więcej, elektrofilowe głowice bojowe, takie jak akryloamid i fluorek arylu sulfonylu (ArSO2F), zostały następnie włączone do peptydów przez Walensky'ego i wsp.19 w celu utworzenia stabilizowanych peptydowych inhibitorów kowalencyjnych i poprawy działania przeciwnowotworowego inhibitorów peptydów. Dlatego bardzo ważne jest wprowadzenie dodatkowej grupy funkcyjnej w celu kowalencyjnej modyfikacji ligandów białkowo-peptydowych20. Grupy te nie tylko reagują z białkami w łańcuchu bocznym, ale także stabilizują drugorzędową strukturę peptydu21. Jednak zastosowanie kowalencyjnie modyfikowanych białek indukowanych przez ligandy peptydowe jest ograniczone ze względu na skomplikowaną drogę syntezy i niespecyficzne wiązanie grup chemicznych22,23. Dlatego pilnie potrzebne są skuteczne strategie syntezy cyklicznych peptydów.

Zainspirowany różnorodnymi strategiami cyklicznych peptydów2,24,25,26, ten protokół próbuje opracować prostą i skuteczną metodę stabilizacji peptydów. Ponadto zauważyliśmy, że grupa łańcucha bocznego stabilnego peptydu może reagować kowalencyjnie z białkiem docelowym, gdy znajduje się przestrzennie blisko ligandów peptydowych. Brak chemicznie modyfikowanego Met został uzupełniony przez grupę Deminga w 2013 roku, poprzez opracowanie nowatorskiej metody wytwarzania selektywnie modyfikowanego peptydu metioniny27. Opierając się na tym tle, Shi i in. skupili się na rozwoju zamykania pierścieni łańcuchów bocznych w celu utworzenia centrum soli sulfonowej. Kiedy ligand peptydowy łączy się z białkiem docelowym, grupa soli sulfonium reaguje kowalencyjnie z przestrzennie bliskim białkiem Cys. W ostatnich latach Shi i in. zaprojektowali nową metodę stabilizacji cyklicznego peptydu28. Sól sulfoniowa na cyklicznym peptydzie została zredukowana przez środek redukujący z grupą sulfhydrylową, która została odwracalnie zredukowana do Met. Reakcja miała jednak niską skuteczność, co było szkodliwe dla późniejszych biologicznych badań aplikacyjnych. W obecnym badaniu zaprojektowano reakcję zamykania pierścienia Met-Cys i bromku propargylu-Cys, w której pojedyncza sól sulfonium pozostaje w łańcuchu bocznym cyklicznego peptydu. Sól sulfonowa działała jak nowa głowica bojowa, która reagowała kowalencyjnie z białkiem Cys w pobliżu przestrzennym. Krótko mówiąc, zmutowany peptyd Cys i Met został poddany cyklizacji przez wewnątrzcząsteczkową alkilację, w wyniku czego powstało centrum sulfonium na uwięzi. W tym procesie utworzenie bocznego mostka łańcuchowego miało kluczowe znaczenie dla cyklicznych peptydów. Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten opisuje szczegółową cyklizację peptydów na bazie sulfonium, którą osiąga się przy użyciu prostych warunków i operacji reakcji. Celem jest opracowanie potencjalnej metody do dalszych szerokich zastosowań biologicznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie sprzętu

UWAGA: Morfolina, N,N-dimetyloformamid (DMF), dichlorometan (DCM), N,N-diizopropyloetyloamina (DIPEA), TFA, morfolina, piperydyna, eter dietylowy i metanol są toksyczne, lotne i. Odczynniki te mogą szkodzić ludzkiemu organizmowi poprzez wdychanie, spożycie lub kontakt ze skórą. Do wszystkich eksperymentów chemicznych należy używać sprzętu ochronnego, w tym rękawiczek jednorazowych, fartuchów eksperymentalnych i okularów ochronnych.

  1. Zbuduj wszystkie substraty peptydowe na żywicy 4-metylobenzhydryloaminy (MBHA) z rinkowidu za pomocą standardowej ręcznej syntezy peptydów w fazie stałej opartej na Fmoc (SPPS)29, jak pokazano w Rysunek 1.
  2. Użyj jednej z dwóch opcji do konstruowania peptydów liniowych: po pierwsze, zsyntetyzuj peptyd przy użyciu czynnika kondensującego 2-(7-azabenzotriazol-1-ylo)-N,N, N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HATU) i odczynnika DIPEA; lub dwóch, zsyntetyzuj z wykorzystaniem 1-hydroksybenzotriazolu (HOBT) i N,N'-diizopropylokarbodimidu (DIC) jako odczynnika do kondensacji amidu. Wybierz odpowiedni protokół syntezy peptydów zgodnie z sekwencją peptydu.
  3. Aby stworzyć ręczne urządzenie do syntezy peptydów, należy ustawić zmodyfikowane urządzenie do próżniowej ekstrakcji fazy stałej w dygestoriach i podłączyć je do trójdrogowego zaworu odcinającego. Następnie umieść polipropylenowy wkład filtracyjny lub szklany reaktor na urządzeniu, gdy jest podłączony do azotu (N2) gazu.
    UWAGA: W celu modyfikacji sprzętu do ekstrakcji próżniowej do fazy stałej należy wyjąć rurkę ekstrakcyjną i pozostawić system zamknięty próżniowo.
  4. Załaduj żywicę MBHA do kolumn wypełnionych żywicą i rozpuść ją w DMF. Wyreguluj przełącznik trójdrogowych zaworów odcinających na bulgotanie N2, a następnie usuń rozpuszczalnik z kolumny za pomocą działającej pompy podłączonej do systemu próżniowego. Obliczyć wymaganą ilość aminokwasu lub środka kondensacyjnego, korzystając z następującego wzoru:
    Aminokwas (g) i czynnik kondensujący (g) = skala żywicy (g) × pojemność żywicy (mM/g) × równoważnik (5 eq) × masa cząsteczkowa (g/M)
    UWAGA: Wybierz ilość załadowanej żywicy w zależności od długości peptydu sprzęgającego. Do pełniejszej reakcji stosuje się wiele odpowiedników (eq) aminokwasów. Ciekłe rozpuszczalniki muszą zostać przekształcone w objętość według gęstości. Korektor 5 pokazuje, że ilość wejściowa obliczonego związku jest wzmacniana pięciokrotnie.

2. Przygotowanie żywicy

UWAGA: Wybierz ilość załadowanej żywicy zgodnie z długością peptydu sprzęgającego.

  1. Odważyć 302 mg żywicy rinkamidowej MBHA (załadowanej 0,331 mM/g) do kolumny (zbiornik o pojemności 20 ml). Dodaj 5-10 ml DCM lub DMF do kolumny, aby spęcznić żywicę podN2, bulgocząc przez 30 minut.
  2. Następnie zamknij przełącznik N2, a następnie włącz przełącznik ssania pompy próżniowej, aby usunąć rozpuszczalnik. Następnie przemyj żywice sekwencyjnie za pomocą DCM (5-10 ml) i DMF (5-10 ml) 5x.

3. Blokada Fmoc na N-terminalu

UWAGA: Deprotekcja przez morfolinę trwa 30 minut, a deprotekcja przez piperydynę trwa 5 minut.

  1. Przygotować N-końcowy roztwór deprotekcyjny 9-fluorenylometylokoksykarbonylu (Fmoc): przygotować wystarczającą ilość (500 ml) 20% (v/v) piperydyny lub 50% (v/v) morfoliny w DMF w szklanym pojemniku do deprotekcji grupy Fmoc.
  2. Dodać 10 ml roztworu odwadniającego do kolumny, wprowadzić bąbelki N2 do roztworu na 30 minut lub 5 minut 2x i powtórzyć procedury deprotekcji 2x.
  3. Odcedź roztwór za pomocą pompy próżniowej i przemyj żywicę sekwencyjnie za pomocą DCM (5-10 ml) i DMF (5-10 ml) 5x.
  4. Wykryj żywicę jako ciemnożółty roztwór o barwie za pomocą 5% ninhydryny (test Kaisera) po każdym odbezpieczaniu, aby potwierdzić brak grupy Fmoc przed etapem sprzęgania. Szczegółowo dodaj 1 ml DMF do niewielkiej ilości żywicy i dodaj 200 μl 5% ninhydryny do szklanej probówki podgrzewanej w temperaturze 130 °C przez 3 minuty, aby ocenić zmiany koloru żywicy.
  5. Odcedź roztwór za pomocą pompy próżniowej i przemyj żywicę sekwencyjnie za pomocą DCM (5-10 ml) i DMF (5-10 ml) 5x.

4. Sprzężenie peptydu liniowego (Rysunek 2)

UWAGA: Gdy sekwencje syntetycznych peptydów zawierają dwie lub więcej powtarzających się jednostek, procedurę łączenia można przeprowadzić bezpośrednio, wybierając typ aminokwasu, taki jak Fmoc-AA-OH lub Fmoc-AAA-OH, i tak dalej. Niektóre specjalne aminokwasy z przeszkodą steryczną i peptydy o dłuższych sekwencjach aminokwasowych są wymagane do prawidłowego wydłużenia czasu reakcji na sprzężenie.

  1. Dla pojedynczego etapu sprzęgania, weźmy jako przykład sprzężenie reszty Cys (zsyntetyzuj skale żywicy 300 mg). Przygotować roztwór mieszaniny zawierający Fmoc-Cys(Trt)-OH (5 eq, 292 mg) i HATU (5 eq, 206 mg) lub Fmoc-Cys(Trt)-OH (5 eq, 292 mg) i HOBT (5 eq, 106 mg) w probówce polipropylenowej i rozpuścić go w 3 ml DMF.
  2. Dodać 173 μl DIPEA (10 eq) lub 154 μl DIC (10 eq) do roztworu Cys, aby aktywować aminokwas. Pozwól mieszaninie wstępnie aktywować się przez 1 minutę. Dodaj mieszaninę do kolumny z żywicą i bąbelkuj ją z N2 przez 2 godziny
    UWAGA: Konkretny wymagany czas reakcji powinien być ustandaryzowany, aby wykryć 5% ninhydryny.
  3. Po sprzężeniu dodaj 1 ml DMF do niewielkiej ilości żywicy i dodaj 200 μl 5% ninhydryny do szklanej rurki podgrzewanej w temperaturze 130 °C przez 3 minuty. Obserwuj, jak żywica zmienia się na bezbarwną, aby potwierdzić brak wolnej grupy aminowej przed etapem deprotekcji.
  4. Odcedź roztwór za pomocą pompy próżniowej i przemyj żywicę sekwencyjnie za pomocą DCM (5-10 ml) i DMF (5-10 ml) 5x.
  5. Dodać 10 ml roztworu deprotektora do kolumny, bańkować N2 przez 30 minut lub 5 minut 2x, dodać świeży roztwór i powtórzyć procedury deprotekcji 2x.
  6. Powtórz następujące kroki: deprotekcja grupy Fmoc; wykrywanie deprotekcji żywicy; mycie żywicy; sprzęganie aminokwasu; wykrywanie reakcji sprzęgania. Powtarzaj krok sprzęgania, aż wszystkie peptydy zostaną zsyntetyzowane.
    UWAGA: Użyj testu Kaisera, aby monitorować, czy każdy etap deprotekcji jest zakończony lub czy każdy etap sprzężenia aminokwasów jest dokładny. Alternatywnie, niewielka ilość peptydu może zostać odcięta od żywicy i sprawdzona przez LC-MS pod kątem pomyślnego sprzężenia.

5. Bissalkilacja między Met i Cys (Rysunek 3)

  1. Skonstruuj peptyd liniowy z Met i Cys, powtarzając kroki 4.1-4.6. Dodać 10 ml bezwodnego metanolu do kolumny z żywicą w celu odwodnienia i wysuszyć za pomocą N2 do następnego użycia (powtórzyć 2x) po liniowym sprzężeniu peptydów.
  2. Odważyć 100 mg żywicy otrzymanej w poprzednim etapie do kolumny (zbiornik o pojemności 20 ml) i przepłukać żywicę DCM (5-10 ml) i DMF (5-10 ml) przed etapem łączenia.
  3. Przygotować roztwór do usunięcia grupy ochronnej Cys trt(trytyl). Przygotować wystarczającą objętość (100 ml) mieszaniny TFA/TIS/DCM (3:5:92) w szklanym pojemniku w celu usunięcia grupy ochronnej.
  4. Dodać 5-10 ml roztworu TFA/TIS/DCM (3:5:92) do kolumny, aby usunąć grupę ochronną na 10 minut. Powtórz sześć razy z bulgotaniem N2, aż żółty kolor całkowicie zniknie.
  5. Odcedź roztwór za pomocą pompy próżniowej i przemyj żywicę sekwencyjnie za pomocą DCM (5-10 ml) i DMF (5-10 ml) 5x.
  6. Przygotuj roztwór do reakcji z odchronionym Cysem. Przygotować wystarczającą objętość (50 ml) roztworu mieszaniny (DMF) zawierającego di-halogenowany łącznik (2 eq) i DIPEA (4 eq) do reakcji z odchronionym Cys.
  7. Dodać 5-10 ml roztworu reakcyjnego do kolumny, aby reagować z odchronionym Cys przez co najmniej 3 godziny z bulgotaniem N2. Odwodnić bezwodnym metanolem i wysuszyćN2 do następnego użycia.
  8. Odcedź roztwór za pomocą pompy próżniowej i przemyj żywicę sekwencyjnie za pomocą DCM (5-10 ml) i DMF (5-10 ml) 5x.
  9. Przygotować roztwór do cyklizacji peptydów: przygotować wystarczającą objętość (20 ml) mieszaniny TUTW (TFA:TF:H 2O = 95:2,5:2,5) w szklanym pojemniku w dygestorium do cyklizacji peptydów.
  10. Dodaj 5-10 ml roztworu mieszaniny TFA do probówki polipropylenowej i rozłup żywicę pod koktajlem TFA przez 3 godziny
    UWAGA: TFA jest silnie i drażniący; Proces rozszczepiania peptydów powinien odbywać się w dygestorium.
  11. Wykonać kroki 7.1-7.5 w celu otrzymania liniowego roztworu peptydu przez oczyszczanie w fazie odwróconej fazy ciekłej (HPLC). Liofilizuj roztwór do następnego użycia.

6. Cyklizacja soli propargylosulfoniowej (Rysunek 4)

  1. Skonstruuj peptyd liniowy z Met i Cys, powtarzając kroki 4.1-4.6. Dodać 10 ml bezwodnego metanolu do kolumny z żywicą do odwodnienia i wysuszyć za pomocą N2 do następnego użycia (powtórzyć dwukrotnie) po liniowym sprzężeniu peptydów.
  2. Odważyć 100 mg żywicy otrzymanej w poprzednim etapie do kolumny (zbiornik o pojemności 20 ml) i przepłukać żywicę DCM (5-10 ml) i DMF (5-10 ml) przed etapem łączenia.
  3. Wykonać kroki 7.1-7.5 w celu uzyskania liniowego roztworu peptydu metodą HPLC i liofilizować próbkę, jak wspomniano, do następnego użycia.
  4. Przygotować 1% roztwór wodny HCOOH (objętościowo) i 1,0 mM bromku propargylu (5 eq) i dodać do roztworu peptydu Met (0,2 mM, 1 eq; 0,2 ml MeCN/H2O [1:1, v/v]).
  5. Następnie wstrząsać reakcją sprzęgania Met i bromku propargylu w temperaturze pokojowej przez 12 godzin.
  6. Po reakcji rozpuścić produkt w probówce polipropylenowej w acetonitrylu i przefiltrować przez membranę filtracyjną 0,22 μm. Następnie należy natychmiast oczyścić roztwór za pomocą HPLC z odwróconymi fazami i wyliofilizować go na proszek do następnego użycia.
  7. W ostatnim etapie dodać peptyd z bromkiem propargylu do probówki polipropylenowej, utrzymać pH roztworu reakcyjnego na poziomie 8,0 przez dodanie roztworu (NH4)2CO3 i wstrząsać mieszaniną reakcyjną w temperaturze 37 °C przez 12 godzin. Na tym etapie uzyskuje się cykliczny peptyd soli propargylosulfoniowej.
  8. Zebrać ostatnią mieszaninę reakcyjną: rozpuścić ją w probówce polipropylenowej w acetonitrylu i przefiltrować przez membranę filtracyjną 0,22 μm. Następnie należy natychmiast oczyścić roztwór za pomocą HPLC z odwróconymi fazami i wyliofilizować go na proszek do następnego użycia.

7. Oczyszczanie cyklicznych peptydów

  1. Skonstruuj liniowe substraty peptydowe na żywicy Rink-amide MBHA, powtarzając kroki 4.1-4.6. Dodać 10 ml bezwodnego metanolu do kolumny z żywicą w celu odwodnienia i wysuszyć za pomocą N2 do następnego użycia (powtórzyć dwukrotnie) po liniowym sprzężeniu peptydów.
  2. Przygotować odpowiednią ilość koktajlu rozszczepiającego (TFA/H2O/TIS, v/v/v, 95:2.5:2.5) w dygestorium. Dodaj 1-5 ml roztworu mieszaniny TFA do probówki polipropylenowej i rozłupuj żywicę pod koktajlem TFA przez 3 godziny.
  3. Następnie kolejno wysusz żywicę pod parąN2 w kolumnie. Alternatywnie użyj urządzenia filtrującego, aby przefiltrować żywicę i zebrać roztwór peptydu. Następnie dodać 20 ml eteru do roztworu peptydu w celu wytrącenia peptydu, odwirować przy 3,500 x g przez 5 minut i powtórzyć dwukrotnie. Zebrać surowy osad peptydowy i wysuszyć go pod strumieniem N2 do następnego kroku.
  4. Rozpuścić 200 mg surowego peptydu w probówce polipropylenowej w 4 ml roztworu acetonitrylu i przefiltrować przez filtr 0,22 μm. Przenieść peptyd do wkładki do fiolki HPLC. Umieścić wkładkę w podajniku próbek półpreparatywnego systemu HPLC z odwróconymi fazami, wyposażonego w kolumnę C18 5 μm, 4,6 mm x 250 mm i pętlę iniekcyjną o pojemności 1 ml.
  5. Oczyść i wyizoluj peptyd za pomocą programu gradientu 5% -95% acetonitrylu w wodzie z 0,1% TFA przez 30 minut, monitorując widma HPLC za pomocą UV przy 254 nm. Potwierdź masę cząsteczkową peptydu za pomocą LC-MS, zbierz roztwór peptydu i liofilizuj go na proszek do następnego użycia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie peptydy liniowe zostały zsyntetyzowane na żywicy MBHA Rink-amide za pomocą standardowej ręcznej syntezy fazy stałej Fmoc. Model cyklicznego heksapeptydu (Ac (cyclo-I)-WMAAAC-NH2) został skonstruowany zgodnie z opisem w Rysunek 5A. Warto zauważyć, że nowe centrum chiralne na uwięzi zostało wygenerowane przez alkilację Met, z dwoma epimerami cyklicznego peptydu (Ia, Ib) potwierdzonymi przez HPLC z odwróconą fazą. Ponadto określono konwersję i stosunek epimerów za pomocą in...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podejście syntetyczne opisane w tym artykule zapewnia metodę syntezy peptydów cyklicznych przy użyciu Cys i Met w sekwencji peptydowej, w której podstawowe peptydy liniowe są konstruowane za pomocą powszechnych technik syntezy peptydów w fazie stałej. W przypadku bissalkilacji cyklicznych peptydów między Cys i Met, całą drogę syntezy można podzielić na trzy główne procesy: deprotekcję Cys na żywicy, sprzężenie łącznika i cyklizację między Cys i Met w roztworze rozszczepienia kwasu trifluorooctowego. Warto zauważyć, że us...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Doceniamy wsparcie finansowe ze strony Narodowego Kluczowego Programu Badawczo-Rozwojowego Chin (2021YFC2103900); granty Chińskiej Fundacji Nauk Przyrodniczych (21778009 i 21977010); Fundacja Nauk Przyrodniczych Prowincji Guangdong (2022A1515010996 i 2020A1515010521): Komitet Innowacji Naukowych i Technologicznych Shenzhen (RCJC20200714114433053, JCYJ201805081522131455 i JCYJ20200109140406047); oraz Shenzhen-Hong Kong Institute of Brain Science-Shenzhen Fundamental Grant dla instytucji badawczych (2019SHIBS0004). Autorzy dziękują za wsparcie czasopisma Chemical Science, The Royal Society of Chemistry (numer 30) oraz The Journal of Organic Chemistry (American Chemical Society) (numer 31).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1,3-bis(bromometylo)-benzenEnergyD0215
Kwas 1,3-dimetylobarbiturowyEnergyA46873
1H NMR i HSQCBruker  AVANCE-III 400
1-hydroksybenzotriazol hydratEnergyE020543
2-(7-azabenzotriazol-1-ylo)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HATU)EnergyA1797
2-merkaptopyrydynaEnergyY31130
Kwas 6-aminokapronowyEnergyA010678
BezwodnikoctowyEnergiaA01021454
AcetonitrylAldrich9758
Węglan amonuEnergia12980
Dichlorometan (DCM)EnergiaW330229
Cyfrowe ogrzewanie Chłodzenie Sucha kąpiel  Thermo Scientific88880029
Diizopropyloetyloamina (DIPEA)EnergiaW320014
Dimetyloformamid (DMF)EnergiaB020051
DitiotreitolEnergyA10027
Masa jonizacyjna do elektrorozpylaniaSHIMADZU2020  LC-MS2020
Fmoc-Ala-OHPeptide Nanjing Biotech LtdR30101
Fmoc-Arg(Pbf)-OHPeptide Nanjing Biotech LtdR30201
Fmoc-Cys(Trt)-OHPeptide Nanjing Biotech LtdR30501
Fmoc-Gln(Trt)-OHNanjing Peptide Biotech LtdR30601
Fmoc-Glu(OtBu)-OHPeptide Nanjing Biotech LtdR30701
Fmoc-His(Boc)-OHPeptide Nanjing Biotech LtdR30902
Fmoc-Ile-OHPeptide Nanjing Biotech LtdR31001
Fmoc-Lys(Boc)-OHNanjing Peptide Biotech LtdR31201
Fmoc-Met-OHPeptide Nanjing Biotech LtdR31301
Fmoc-Pro-OHPeptyd Nanjing Biotech LtdR31501
Fmoc-Ser(tBu)-OHPeptide Nanjing Biotech LtdR31601
Fmoc-Thr(tBu)-OHPeptide Nanjing Biotech LtdR31701
Fmoc-Trp(Boc)-OHPeptide Nanjing Biotech LtdR31801
Fmoc-Tyr(tBu)-OHNanjing Peptide Biotech LtdR31901
Fmoc-Val-OHPeptide Nanjing Biotech LtdR32001
Kwas mrówkowyEnergiaW810042
Wysokowydajna chromatografia cieczowa
SHIMADZULC-2030
MetanolAldrich9758
MorpholineAldrichM109062
Odczynnik N,N'-DiizopropylokarbodimiduEnergyB010023
NinhydrynaEnergyN7285
Bromek propargyluEnergyW320293
Żywica MBHA Rink AmideNanjing Peptide Ltd.
Płytki do ekstrakcji próbek do ekstrakcji do fazy stałej (SPE)  Thermo Scientific60300-403
Tetrakis(trifenylofosfina) palladEnergyT1350
Zawory trójdrogoweBio-Rad7328107
TrietyloaminaEnergyB010737
Kwas trifluorooctowy (TFA)J& K101398
Triizopropylosilan (TIS)EnergiaT1533

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Arkin, M. R., Tang, Y. Y., Wells, J. A. Small-molecule inhibitors of protein-protein interactions: Progressing toward the reality. Chemistry Biology. 21 (9), 1102-1114 (2014).
  2. Shi, X. D., et al. Reversible stapling of unprotected peptides via chemoselective methionine bis-alkylation/dealkylation. Chemical Science. 9 (12), 3227-3232 (2018).
  3. Muttenthaler, M., King, G. F., Adams, D. J., Alewood, P. F. Trends in peptide drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 20 (4), 309-325 (2021).
  4. White, C. J., Yudin, A. K. Contemporary strategies for peptide macrocyclization. Nature Chemistry. 3 (7), 509-524 (2011).
  5. Victoria, G. G., Reddy, S. R. Recent advances in the synthesis of organic chloramines and their insights into health care. New Journal of Chemistry. 45, 8386-8408 (2021).
  6. Kim, J. I., et al. Conformation and stereoselective reduction of hapten side chains in the antibody combining site. Journal of the American Chemical Society. 113 (24), 9392-9394 (1991).
  7. Waddington, M. A., et al. An organometallic strategy for cysteine borylation. Journal of the American Chemical Society. 143 (23), 8661-8668 (2021).
  8. Luong, H. X., Bui, H. T. P., Tung, T. T. Application of the all-hydrocarbon stapling technique in the design of membrane-active peptides. Journal of Medicinal Chemistry. 65 (4), 3026-3045 (2022).
  9. Góngora-Benítez, M., Tulla-Puche, J., Albericio, F. Multifaceted roles of disulfide bonds. peptides as therapeutics. Chemical Reviews. 114 (2), 901-926 (2014).
  10. Li, B., et al. Cooperative stapling of native peptides at lysine and tyrosine or arginine with formaldehyde. Angewandte Chemie International Edition. 60 (12), 6646-6652 (2021).
  11. Blaum, B. S., et al. Lysine and arginine side chains in glycosaminoglycan-protein complexes investigated by NMR, cross-Linking, and mass spectrometry: a case study of the factor h-heparin Interaction. Journal of the American Chemical Society. 132 (18), 6374-6381 (2010).
  12. Petitdemange, R., et al. Selective tuning of elastin-like polypeptide properties via methionine oxidation. Biomacromolecules. 18 (2), 544-550 (2016).
  13. Kadlcik, V., et al. Reductive modification of a methionine residue in the amyloid-beta peptide. Angewandte Chemie International Edition. 45 (16), 259(2006).
  14. Reguera, L., Rivera, D. G. Multicomponent reaction toolbox for peptide macrocyclization and stapling. Chemical Reviews. 119 (17), 9836-9860 (2019).
  15. Reddy, C. B. R., et al. Antiviral activity of 3-(1-chloropiperidin-4-yl)-6-fluoro benzisoxazole 2 against white spot syndrome virus in freshwater crab, Paratelphusa hydrodomous. Aquaculture Research. 47 (8), 2677-2681 (2015).
  16. Embaby, A. M., Schoffelen, S., Kofoed, C., Meldal, M., Diness, F. Rational tuning of fluorobenzene probes for cysteine-selective protein modification. Angewandte Chemie International Edition. 57 (27), 8022-8026 (2018).
  17. Jiang, H. F., Chen, W. J., Wang, J., Zhang, R. S. Selective N-terminal modification of peptides and proteins: recent progresses and applications. Chinese Chemical Letters. 33 (1), 80-88 (2022).
  18. Yu, Y., et al. PDZ-reactive peptide activates ephrin-B reverse signaling and inhibits neuronal chemotaxis. ACS Chemical Biology. 11 (1), 149-158 (2016).
  19. Huhn, A. J., Guerra, R. M., Harvey, E. P., Bird, G. H., Walensky, L. D. Selective covalent targeting of anti-apoptotic BFL-1 by cysteine-reactive stapled peptide inhibitors. Cell Chemical Biology. 23 (9), 1123-1134 (2016).
  20. Chow, H. Y., Zhang, Y., Matheson, E., Li, X. C. Ligation technologies for the synthesis of cyclic peptides. Chemical Reviews. 119 (17), 9971-10001 (2019).
  21. Zhang, H. Y., Chen, S. Y. Cyclic peptide drugs approved in the last two decades (2001-2021). RSC Chemical Biology. 3 (1), 18-31 (2021).
  22. Lee, Y. J., Han, S. H., Lim, Y. B. Simultaneous stabilization and multimerization of a peptide alpha-helix by stapling polymerization. Macromolecular Rapid Communications. 37 (13), 1021-1026 (2016).
  23. Karthikeyan, K., et al. Anti-viral activity of methyl 1-chloro-7-methyl-2-propyl-1h-benzo[d] imidazole-5-carboxylate against white spot syndrome virus in freshwater crab (Paratelphusa hydrodromous). Aquaculture International. 30, 989-998 (2022).
  24. Zhao, H., et al. Crosslinked aspartic acids as helix-nucleating templates. Angewandte Chemie International Edition. 55 (39), 12088-12093 (2016).
  25. Hu, K., et al. An in-tether chiral center modulates the helicity, cell permeability, and target binding affinity of a peptide. Angewandte Chemie International Edition. 55 (28), 8013-8017 (2016).
  26. Hu, K., Sun, C., Li, Z. Reversible and versatile on-tether modification of chiral-center-induced helical peptides. Bioconjugate Chemistry. 28 (7), 2001-2007 (2017).
  27. Kramer, J. R., Deming, T. J. Reversible chemoselective tagging and functionalization of methionine containing peptides. Chemical Communications. 49 (45), 5144-5146 (2013).
  28. Shi, X. D., et al. Reversible stapling of unprotected peptides via chemoselective methionine bisalkylation/dealkylation. Chemical Science. 9 (12), 3227-3232 (2018).
  29. Merrifield, B. Solid phase synthesis. Nobel lecture, 8 December 1984. Bioscience Reports. 5 (5), 353-376 (1985).
  30. Wang, D. Y., et al. A sulfonium tethered peptide ligand rapidly and selectively modifies protein cysteine in vicinity. Chemical Science. 10 (19), 4966-4972 (2019).
  31. Hou, Z. F., et al. A sulfonium triggered thiol-yne reaction for cysteine modification. The Journal of Organic Chemistry. 85 (3), 1698-1705 (2020).
  32. Reguera, L., Rivera, D. G. Multicomponent reaction toolbox for peptide macrocyclization and stapling. Chemical Reviews. 119 (17), 9836-9860 (2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Cyclic Peptide SynthesisOn Tether SulfoniumSolid Phase PeptideBisalkylation CyclizationCysteine Methionine CouplingPeptide CyclizationTrifluoroacetic Acid CleavageHigh Performance Liquid ChromatographyLiquid Chromatography Mass SpectrometryProton NMR Analysis

Powiązane artykuły