Połączenie mikroskopii oczyszczającej i fluorescencyjnej w celu wizualizacji zmian w ekspresji genów i reakcjach fizjologicznych na Plasmodiophora brassicae

Summary

Obecny protokół opisuje zoptymalizowaną metodę obserwacji histologicznej galasów indukowanych przez Plasmodiophora brassicae. Skrawki wibratomu hipokotyli są oczyszczane przed obrazowaniem fluorescencyjnym w celu zbadania udziału czynników transkrypcyjnych i fitohormonów podczas progresji choroby. Protokół ten przezwycięża ograniczenia związane z zatapianiem żywicy, umożliwiając wizualizację białek fluorescencyjnych w plantach.

Abstract

Infekcja upraw kapustnych przez protistę Plasmodiophora brassicae prowadzi do powstawania żółci na podziemnych organach. Tworzenie się galasów wymaga przeprogramowania komórkowego i zmian w metabolizmie zakażonej rośliny. Jest to konieczne, aby ustalić fizjologiczny zlew zorientowany na patogen, do którego przekierowywane są składniki odżywcze gospodarza. Aby w pełni zrozumieć tę konkretną interakcję roślina-patogen oraz mechanizmy, za pomocą których wzrost i rozwój gospodarza są zakłócone i przemodelowane, konieczne jest śledzenie i obserwowanie wewnętrznych zmian towarzyszących tworzeniu się żółci z rozdzielczością komórkową. Metody łączące barwniki fluorescencyjne i białka fluorescencyjne są często stosowane do badania reakcji anatomicznych i fizjologicznych u roślin. Niestety, duży rozmiar galasów i ich niska przezroczystość stanowią główną przeszkodę w wykonywaniu obserwacji pod mikroskopem. Co więcej, niska przezroczystość ogranicza zastosowanie mikroskopii fluorescencyjnej do badania progresji choroby maczugowej i tworzenia się żółci. W artykule przedstawiono zoptymalizowaną metodę utrwalania i usuwania galasów w celu ułatwienia epifluorescencji i mikroskopii konfokalnej w celu kontroli galasów zakażonych P. brassicae. Zastosowano protokół oczyszczania tkanek w celu szybkiego usunięcia optycznego, a następnie przecięcie wibratomem w celu wykrycia zmian anatomicznych i zlokalizowania ekspresji genów za pomocą fuzji promotorów i linii reporterowych oznaczonych białkami fluorescencyjnymi. Metoda ta okaże się przydatna do badania reakcji komórkowych i fizjologicznych w innych strukturach wywoływanych przez patogeny u roślin, takich jak syncytia i węzły korzeniowe wywołane przez nicienie, a także galasy liściowe i deformacje spowodowane przez owady.

Introduction

Rośliny dotknięte przez patogeny lub owady mogą rozwijać nieprawidłowe struktury (deformacje organów lub galasy), które pozwalają intruzowi na przyjmowanie składników odżywczych i rozmnażanie się¹. W tym przypadku podjęto skuteczne podejście histopatologiczne w celu zbadania zmian zachodzących w galasach, które rozwijają się na podziemnych częściach roślin zakażonych protistą Plasmodiophora brassicae (Ryc. 1). Drobny wątek związany z tym patogenem wynika z faktu, że zarodniki spoczynkowe P. brassicae mogą zachować zdolność do atakowania roślin przez wiele lat. W przypadku wielkoobszarowych upraw rzepaku (Brassica napus) jest to poważny problem, ponieważ czynniki ekonomiczne ograniczają płodozmian, prowadząc do akumulacji spoczynkowych zarodników w glebie². Odporność rzepaku na chorobę kiłowatych wywołaną przez P. brassicae jest uwarunkowana genetycznie. Niestety, patogen często przewyższa odporność ze względu na swoją biologię i wąską pulę genetyczną, z której pochodzi rzepak. W związku z tym istotne stało się badanie reakcji poinfekcyjnych u roślin żywicielskich i ich zdolności do spowalniania postępu choroby lub zapobiegania rozwojowi niektórych objawów.

W chorobie maczugowej nasilenie jest zazwyczaj oceniane na podstawie rozwoju galasów i stopnia uszkodzenia systemu korzeniowego. Jest to znane jako Indeks Chorób-DI³. Nie oddaje jednak w pełni prawdziwej oceny tej interakcji roślina-patogen. W szczególności nie odnosi się do tego, w jaki sposób patogen jest rozprowadzany w korzeniach i czy roślina może hamować ruchy P. brassicae w swoich tkankach. Co więcej, nie jest łatwo przewidzieć, w jakim stopniu P. brassicae przeprogramowuje anatomię podziemnych narządów. Badania na roślinie modelowej Arabidopsis thaliana wykazały, że zakażenie P. brassicae prowadzi do zahamowania ksylogenezy (zarówno etapu inicjacji, jak i dojrzewania) oraz zwiększenia różnicowania łyka w obrębie galasów^4,5. Co więcej, w korzeniach i hipokotylach porażonych roślin potomstwo komórek kambium nie opuszcza stanu mitotycznego i rozmnaża się dłużej niż u zdrowych roślin⁶. Proces ten decyduje o ostatecznej wielkości żółci i określa liczbę zarodników spoczynkowych patogenu wytwarzanych w zakażonej roślinie. Rozwojowe, metaboliczne i fizjologiczne przeprogramowanie w organizmie gospodarza wywołane przez P. brassicae jest bardzo złożone⁷; W związku z tym zastosowanie narzędzi pozwalających na inspekcję zmian wewnętrznych w obrębie GALAS jest kluczowe dla prawidłowej oceny tej interakcji. Progresji cyklu życiowego P. brassicae towarzyszy przeprogramowanie metabolizmu komórek gospodarza, które można zaobserwować jako odkładanie skrobi lub lipidów^7,8. Główną przeszkodą w udanej mikroskopii galasów jest ich niska przezroczystość. Z tego powodu większość próbek histologicznych przedstawiających zmiany wywołane przez korzeń kijałkowy w galasach pochodzi z technik utrwalania (wosk lub żywica), po których następuje cięcie mikrotomem. Takie podejścia zostały z powodzeniem wykorzystane do zlokalizowania aktywności promotora dla wielu genów aktywnych w galasach maczugowych^4,5 lub różnych technik barwienia ułatwiających obserwację progresji cyklu życiowego P. brassicae⁹. Należy jednak zauważyć, że etapy utrwalania i zatapiania są czasochłonne i powodują częściowe lub całkowite wypłukanie ważnych biomolekuł (np. lipidów), co znacznie utrudnia niektóre obserwacje. Ostatnio zwizualizowano progresję cyklu życiowego P. brassicae w żywicielu za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH), w której użyto sondy specyficznej dla genu metylotransferazy typu SABATH (PbBSMT) do oznaczania tworzenia się spoczynkowych zarodników¹⁰. Dobrą alternatywą jest zastosowanie innych metod opartych na fluorescencji, w których można zaobserwować autofluorescencję niektórych składników komórkowych, aktywność 5'- regionów regulatorowych genów połączonych z fluorescencyjnymi markerami białkowymi oraz akumulację określonych białek znakowanych fluorescencyjnie. Jednak oprócz niskiej przezroczystości próbek, główną wadą związaną z takimi obiektami jest praca z nieustalonymi próbkami, co znacznie skraca czas, w którym można udokumentować dobrej jakości obrazy. W 2015 roku Kurihara i in.¹¹ opracowali odczynnik czyszczący, który pozwala na zachowanie białek fluorescencyjnych i zwiększa przezroczystość próbek tkanek roślinnych. Dodatkowo jest kompatybilny z licznymi plamami histologicznymi. Ostatnio ta sama technika została z powodzeniem zastosowana do wizualizacji różnych składników ściany komórkowej w tkankach roślinnych^12,13. W tym przypadku protokół ten został wykorzystany do analizy różnych aspektów rozwoju żółci klubowej. Przepływ pracy rozpoczyna się od utrwalenia galasów, przekroju wibratomowego, oczyszczenia tkanek, barwienia i obrazowania fluorescencyjnego. W zależności od potrzeb, bezpośrednio lub po konkretnym barwieniu, powstałe skrawki mogą być poddane oględzinom pod mikroskopem epifluorescencyjnym lub konfokalnym. Metoda ta stanowi skuteczne rozwiązanie do badania lokalnych zmian w ekspresji genów i reakcjach fizjologicznych, w tym równowadze fitohormonów i sygnalizacji. Postęp choroby można śledzić, przyglądając się wzorcowi dystrybucji spoczynkowych zarodników i dynamice dojrzewania. Co więcej, protokół może być łatwo zastosowany do obrazowania charakterystycznych zmian w roślinach zakażonych P. brassicae, w tym hamowania ksylogenezy lub reakcji obronnych roślin żywicielskich widocznych jako miejscowe zdrewnienie w odpornych genotypach. Przykłady w tym protokole pochodzą z obrazowania przeprowadzonego na modelu Arabidopsis thaliana; Protokół może być jednak również stosowany do innych gatunków roślin uprawnych należących do rodziny kapustowatych (Brassicaceae). Opisana poniżej metoda ułatwi w przyszłości szczegółowe badania struktur komórkowych i zmian molekularnych towarzyszących powstawaniu żółci u roślin zakażonych P. brassicae.

Ogólny przebieg protokołu jest dość prosty, a wszystkie etapy rozwoju żółci można łatwo zobrazować i scharakteryzować (Rysunek 2). Ponieważ P. brassicae jest patogenem przenoszonym przez glebę, wszystkie eksperymenty muszą być przeprowadzane w systemach glebowych. Patogen preferuje warunki kwaśne; Dlatego należy stosować podłoża glebowe nieimpregnowane wapnem. Chociaż P. brassicae nie stanowi zagrożenia dla ludzi, jest wyłącznie patogenem roślinnym, który może rozprzestrzeniać się przez glebę i wodę. Dlatego wszystkie części zainfekowanej rośliny, a także gleba, muszą zostać zniszczone po eksperymencie przez autoklawowanie lub traktowanie wybielaczem.

Protocol

1. Warunki wzrostu roślin

1. Rośliny Arabidopsis thaliana uprawiać w warunkach światła dnia krótkiego z 9 godzinami światła w temperaturze 22 °C i 15 godzinami ciemności w temperaturze 20 °C i natężeniem promieniowania 120 μmol·m⁻²s⁻¹ (mierzonym jako promieniowanie fotosyntetycznie czynne, PAR na poziomie korony drzewa, patrz tabela materiałów).

2. Przygotowanie inokulum zarodników

UWAGA: Aby uzyskać szczegółowe informacje, zobacz Fuchs et al.¹⁴.

1. Homogenizować dwa do trzech zamrożonych galasów z kapusty pekińskiej (Brassica rapa var. pekinensis, odmiana "Granaat") w blenderze zawierającym 300 ml autoklawowanej wody destylowanej i przefiltrować przez cztery warstwy sterylnej gazy.
2. Odwirować filtrat (w stężeniu 6 000 x g przez 5 minut, w temperaturze 4 °C) i mechanicznie usunąć warstwę skrobi z osadu zarodników za pomocą szpatułki. Powtarzaj ten proces, aż większość skrobi zostanie usunięta.
3. Określ stężenie zarodników za pomocą hemocytometru¹³, licząc liczbę zarodników w 20 różnych obszarach pola.
4. Upewnij się, że końcowe stężenie zawiesiny zarodników używanej do inokulacji wynosi 1 x 10⁶ zarodników·mL⁻¹ dla Arabidopsis thaliana. Zaszczepić każdą roślinę 20 dni po wykiełkowaniu 2 ml skalibrowanej zawiesiny zarodników.

3. Przygotowanie i utrwalenie tkanek

1. Przygotuj tkankę roślinną.
   1. Ostrożnie usuń glebę z systemów korzeniowych roślin zakażonych i niezainfekowanych. Dokładnie oczyść wodą i zbierz hipokotyle i galasy (o długości od 0,5 do 2 cm) do probówek do mikrowirówek.
2. Wykonaj utrwalanie PFA (4% paraformaldehydu, PFA w 1x PBS + 0,01% Triton X-100) postępując zgodnie z poniższymi krokami.
   1. Dodać 4 g proszku PFA (patrz tabela materiałów) do 100 ml PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami, pH 7,4, tabela 1) mieszając w temperaturze 65 °C (nie gotować). Użyj KOH (10 M i 1M) kroplami, aby uzyskać klarowny roztwór o pH około 11.
   2. Dostosuj pH za pomocą_H2SO4, aby obniżyć je do 6,9 i dodaj 0,01% (v/v) Triton X-100, aby poprawić utrwalenie. Podwielokrotność roztworu przechowywać w temperaturze -20 °C (nie zamrażać ponownie) lub przechowywać w temperaturze 4 °C.
3. Wykonaj utrwalenie tkanki.
   1. Utrwalić próbki w 200-500 μl utrwalacza PFA przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, stosując stałą próżnię (700 mbar) za pomocą pompy próżniowej. Upewnij się, że obiekt jest całkowicie zanurzony w roztworze PFA.
      UWAGA: Próbki można przechowywać przez kilka tygodni w temperaturze 4 °C (lodówka) i wykorzystać później do podziału.

4. Osadzanie i dzielenie tkanek na sekcje

1. Użyj 4% w/v agarozy do osadzania agarozy w niezakażonych hipokotylach i zakażonych galasach. Zagotuj roztwór, aby rozpuścić agarozę i wlej go, gdy ostygnie, gdy jest jeszcze lepki.
2. Lekko osusz przedmiot na chusteczce przez kilka sekund, aby usunąć nadmiar PFA.
3. Użyj wykałaczek/kleszczy, aby ostrożnie osadzić i zorientować obiekt roślinny w agarozie. Aby zapobiec ukośnym przekrojom, upewnij się, że obiekt jest prawidłowo zorientowany i uformowany, tak aby jego oś była prostopadła do płaszczyzny ostrza wibratomu (w przypadku sekcji promieniowych).
4. Aby przyspieszyć krzepnięcie agarozy, umieścić szalkę Petriego lub wielokulturową płytkę w temperaturze 4 °C na 10 minut
   UWAGA: Jeśli obiekt jest zbyt duży (jak w przypadku większych galasów Arabidopsis po 21 dniach od inokulacji [DPI]), obiekt można podzielić na sekcje nawet bez zatapiania w agarozie.

5. Sekcja wibratomu

UWAGA: Wibratom jest wyposażony w wibrującą żyletkę do przecinania organów roślinnych/tkanek. Prędkość drgań, amplituda, kąt ostrza i grubość przekroju to parametry, które można regulować (patrz Tabela materiałów).

1. Za pomocą ostrza ostrożnie wytnij i uformuj przedmiot w bloku agarozy, zwracając uwagę na preferowaną orientację do cięcia.
2. Przyklej blok agarozy/dużą żółć, aby prawidłowo zamontować go na uchwycie próbki za pomocą cyjanoakrylanu/kleju błyskawicznego i taśmy maskującej (patrz Tabela materiałów).
3. W przypadku hipokotyli i galasów Arabidopsis (wczesne stadia) należy zachować grubość przekrojów między 30-40 μm, aby uzyskać obrazy dobrej jakości.
   UWAGA: Do analizy późniejszych etapów progresji żółci grubość odcinków może wynosić od 50 do 80 μm.
4. Powstrzymaj się od cięcia cieńszych sekcji, ponieważ może to zniszczyć próbkę żółci z powodu wibracji poruszającego się ostrza.
5. Dostosuj grubość sekcji, prędkość i amplitudę drgań zgodnie z grubością i rozmiarem galasa (40 μm lub 60 μm).
6. Dodaj wodę destylowaną do łaźni wodnej i zacznij od dzielenia na sekcje.
7. Ostrożnie zebrać skrawki za pomocą kleszczy lub szczotki i przenieść je do probówki mikrowirówkowej zawierającej 1 ml buforu 1x PBS (pH 7,4).
   UWAGA: Zazwyczaj im wyższa amplituda drgań, tym lepsza jakość przekroju. W przypadku niezakażonych hipokotyli lub galasów, które nie zawierają dojrzałych zarodników spoczynkowych, amplituda drgań może być utrzymywana na poziomie 1,2 mm z prędkością 0,60 mm·^s−1. W przypadku dużych galasów z częściową utratą integralności komórkowej i widocznymi oznakami dojrzewania zarodników, amplitudę drgań należy zmniejszyć do 0,55 mm przy prędkości 0,45 mm·^s−1.

6. Oczyszczanie próbek

1. Usunąć 1x PBS z probówki mikrowirówki i dodać 200-500 μl roztworu czyszczącego (Tabela 1).
2. Od teraz przechowuj próbki w temperaturze pokojowej w ciemności. Upewnij się, że przedmioty są zawsze zanurzone w roztworze czyszczącym.
3. Wymień roztwór czyszczący na nowy, jeśli jego kolor zmieni się po pewnym czasie podczas przetwarzania próbki.
   UWAGA: Kolor roztworu klarującego może zmienić kolor na żółtawy w wyniku przetwarzania próbki. W takim przypadku zaleca się zastąpienie roztworu w celu poprawy oczyszczania tkanek.

7. Procedura barwienia

1. W przypadku barwienia ścian komórkowych bielą Calcofluor (w celu nakładania komórek roślinnych) należy przygotować 5% v/v białego barwnika Calcofluor (patrz Tabela Materiałów) w roztworze klarującym. Plamić przez co najmniej 5 minut w ciemności.
2. Do barwienia lipidów czerwienią nilową (do barwienia spoczynkowych zarodników i kropelek oleju w zakażonych komórkach) należy przygotować 1 mg/ml roztworu podstawowego (patrz tabela materiałów) w roztworze klarującym. Rozcieńczyć go dalej, aby uzyskać 1:99. Plamić przez co najmniej 10 minut w ciemności.
3. W przypadku podstawowego barwienia ligniną Fuchsin należy przygotować 0,2% w/v bejcy (patrz Tabela materiałów) w roztworze klarującym. Bejcować przez co najmniej 10 minut w ciemności.
   UWAGA: Podczas podwójnego barwienia próbki są najpierw barwione czerwienią nilową przez 10 minut przed nałożeniem Calcofluor White. Nadmiar roztworów barwiących był usuwany po każdym kroku. Jeśli przedmiot wydaje się przesadzony, usuń nadmiar plamy, myjąc ją roztworem czyszczącym. W razie potrzeby rozcieńczyć plamy za pomocą roztworu czyszczącego. Zawsze barwić próbkę czerwienią nilową/zasadową fuksyną przed barwieniem Calcofluorem. Barwienie najpierw Calcofluorem może zapobiec prawidłowemu zabarwieniu zarodników czerwienią nilową.

8. Mikroskopia

1. Zamontuj oczyszczone skrawki na szkiełku mikroskopowym i obserwuj pod mikroskopem epifluorescencyjnym lub konfokalnym (patrz tabela materiałów). Użyj roztworu czyszczącego jako medium montażowego, aby zapobiec wysuszeniu próbki.
2. Korzystaj z wielu trybów akwizycji do jednoczesnego obrazowania więcej niż jednego widma fluorescencji.
   UWAGA: Widma wzbudzenia/emisji użyte w przedstawionym protokole są następujące: dla czerwieni nilowej 553/636 nm, dla autofluorescencji ksylemu 380/475 nm, dla fuksyny zasadowej 561/650 nm, dla bieli Calcofluor 405/475 nm, dla erRFP 585/608 nm oraz dla GFP 488/509 nm (tab. 2).

Results

Z czerwienią nilową, która barwi lipidy i suberynę, można zobaczyć patogen spoczynkowy zarodniki zawierające lipidy (Rysunek 3A,B). W związku z tym, stosując podwójne barwienie, można uzyskać wyraźne obrazy, aby przyjrzeć się wzorcowi rozmieszczenia patogenów w galasach. Barwienie przeciwstawne za pomocą Calcofluor white tworzy kontrast i pomaga jednocześnie śledzić rozwój ksylemu z dojrzewaniem P. brassicae (Rysunek 3B).

Powstawanie i rozwój ksylemu można również sprawdzić obserwując autofluorescencję w próbkach niebarwionych (Rysunek 4A) lub używając barwników, takich jak Basic Fuchsin, które umożliwiają obrazowanie ligniny na podstawie fluorescencji (Rysunek 4B).

Korzystając z tej metody, można śledzić zmiany ekspresji genów lub odpowiedzi na regulatory wzrostu. Doskonałym przykładem jest sytuacja, w której rośliny Arabidopsis zawierające konstrukt pHCA2:erRFP zostały wykorzystane do wizualizacji ekspresji genu HIGH CAMBIAL ACTIVITY 2 (HCA2) w tkance łyka w galasach klubowych. Aktywność genu HCA2 została wcześniej odkryta w merystematycznie aktywnych komórkach kambium i komórek linii łyka¹⁵. W tym przypadku kolokalizuje się z łykiem w późnych stadiach rozwoju żółci napędzanego przez P. brassicae, a jego aktywność odzwierciedla, w jaki sposób P. brassicae zwiększa złożoność łyka (Ryc. 5). Uzyskany obraz pokazuje proliferację łyka w późnym stadium rozwoju żółci, kiedy kambium ulega fragmentacji. Rysunek 5A pokazuje nieoczyszczony fragment dłoni żółci, podczas gdy Rysunek 5B pokazuje bardziej wyraźne i zlokalizowane sygnały fluorescencyjne uzyskane przez sekcję wibratomową, a następnie oczyszczanie tkanki. Obiekty zostały wybarwione bielą Calcofluor. Rysunek 6 porównuje ten obraz (Rysunek 6B) z podobnym obszarem przedstawionym w galasach z żywicą i mikrotomach (Rysunek 6A) w rozdzielczości 21 DPI. Zróżnicowane odpowiedzi cytokininowe między zakażonymi i niezakażonymi roślinami oceniano, sprawdzając ekspresję markera TCS:GFP (Two Component Signalling) ¹⁶ w rozwijających się galasach (Ryc. 7). Podczas obrazowania słabych sygnałów GFP w galasach i tkankach z wtórnymi zgrubieniami, ważne jest, aby pamiętać, że dodatkowy sygnał tła spowodowany autofluorescencją dojrzałych komórek ksylemu jest również wychwytywany podczas obrazowania.

Rysunek 1: Objawy choroby maczugi u rzepaku (B. napus) i Arabidopsis thaliana (Columbia-0) w temperaturze 26 DPI z zarodnikami Plasmodiophora brassicae. W przebiegu choroby na całym systemie korzeniowym rozwijają się duże galasy, przez co jest on niezwykle kruchy. Kończy się uwolnieniem zarodników do otaczającej gleby, aby sprzyjać przyszłym infekcjom. Górne części ciała rośliny również wykazują oznaki słabego wzrostu i rozwoju. Wreszcie, zainfekowane rośliny ulegają niszczącemu wpływowi na wzrost, metabolizm i rozwój, gdy system korzeniowy zostanie całkowicie uszkodzony, a roślina nie będzie już w stanie poradzić sobie z chorobą. Podziałka reprezentuje 1 cm. -INF oznacza próbnie zaszczepione, podczas gdy +INF oznacza rośliny zaszczepione P. brassicae. Z tej okazji przed usunięciem gleby przedstawiono zdjęcie roślin rzepaku, aby zaprezentować zdrowe systemy korzeniowe. Po umyciu zbiera się tylko hipokotyl i górną część korzenia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Ogólny przepływ pracy. Umyte systemy korzeniowe Arabidopsis są (A) preparowane, (B) mocowane, (C) osadzone w agarozie, (D) montowane i (E) cięte na wibratomie. Powstałe obiekty poddaje się oczyszczaniu tkanek (od 3 dni do kilku tygodni w RT w ciemności, w zależności od rodzaju i grubości tkanki). (F) Oczyszczone obiekty można następnie zabarwić i obejrzeć pod mikroskopem. (G) Podsumowanie przepływu pracy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Oznaczanie zarodników patogenów czerwonym barwnikiem Nilu. (A,B) Czerwień nilowa barwi lipidy w zarodnikach w stanie spoczynku, co doskonale sprawdza się w śledzeniu dojrzewania P. brassicae. (A) Powiększone komórki skolonizowane przez P. brassicae i wypełnione zarodnikami patogenów. (B) Dojrzałe komórki ksylemu są również barwione czerwienią nilową. Przekrój został wybarwiony białym Calcofluorem, aby zobaczyć nakład komórek gospodarza (A: soczewka obiektywu = 20x i grubość przekroju = 60 μm; B: Soczewka obiektywu = 5x i grubość przekroju = 60 μm). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Śledzenie stopnia rozwoju i dojrzewania ksylemu. (A) Lignina daje silną autofluorescencję po wzbudzeniu promieniowaniem UV; Dlatego dojrzały ksylem można stosunkowo łatwo rozróżnić. (B) Podwójne barwienie zasadową fuksyną i kalkofluorem daje lepsze wyniki, ponieważ wszystkie komórki są barwione tym drugim barwnikiem, podczas gdy dojrzały ksylem jest wyraźnie barwiony zasadową fuksyną. W ten sposób podwójne barwienie zapewnia obrazy o lepszym kontraście obrazującym zauważalne zahamowanie ksylogenezy (A: soczewka obiektywu = 10x i grubość przekroju = 60 μm; B: Soczewka obiektywu = 10x i grubość przekroju = 60 μm). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Specyficzny dla łyka sygnał dla genu HCA2 w hipokotylach roślin zakażonych P. brassicae przy 21 DPI. Aktywność promotora proHCA2::erRFP zawierającego transgeniczny Arabidopsis thaliana można zaobserwować w (A) i (B). Można zaobserwować różnice między nieoczyszczonym odcinkiem dłoni w panelu (A), w którym sygnał erRFP wydaje się rozproszony z powodu nałożenia i nakładania się warstw komórek, szczególnie w nierównych sekcjach dłoni. Z drugiej strony, (B) pokazuje przekrój wibratomu po oczyszczeniu tkanki, w którym sygnał erRFP precyzyjnie oznacza komórki łyka w dojrzałym pakiecie naczyniowym (soczewka obiektywu = 20x i grubość przekroju = 60 μm). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Porównanie między gruźlicą, galasami zatopionymi w żywicy i mikrotomowymi za pomocą fluorescencji. (A) Porównanie obrazów galasów z dodatkiem żywicy i mikrotomów, oraz (B) reprezentatywnego obiektu (również przedstawionego w Rysunek 5B) uzyskane za pomocą fluorescencji. Komórki ksylemu są oznaczone żółtymi gwiazdkami, obszar kambium żywymi zielonymi nawiasami, łyko cyjanowymi gwiazdkami, a komórki skolonizowane przez Plasmodiophora brassicae białym symbolem PB. Sekcje osadzone w żywicy (A) zapewniają dobrą rozdzielczość do badania rozmieszczenia zarodników spoczynkowych w przerośniętych narządach, stopnia postępu choroby i innych procesów, takich jak miejscowe zdrewnienie u odpornych roślin. Jednak opisany tutaj protokół (B) umożliwia czułą obserwację ekspresji genów lub akumulacji białek oraz wizualizację innych zmian fizjologicznych i ważnych cząsteczek, takich jak lipidy (w zarodnikach). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7: Śledzenie odpowiedzi sygnalizacyjnych cytokininy u hipokotyli roślin rzodkiewnika niezakażonych (-INF) i P. brassicae (+INF) w temperaturze 16 DPI. Marker TCS::GFP został użyty do scharakteryzowania odpowiedzi cytokininy w roślinie. Skrawki wibratomu poddano zabiegowi oczyszczającemu, a następnie barwieniu białym Calcofluorem. Na podstawie obrazu, przy 16 DPI, odpowiedzi cytokininy wydają się być znacznie zmniejszone w zakażonych galasach (prawy panel), podczas gdy pozostają silne, szczególnie w puli łyka (komórki, które ostatecznie różnicują się, tworząc tkankę łyka), u niezakażonych roślin (lewy panel) (soczewka obiektywu = 5x i grubość = 30 μm). Widoczne mogą być również pewne poziomy autofluorescencji ksylemu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

.

Roztwór czyszczący (toksyczny)
Składniki	Procent (%)	w 100 ml wody destylowanej
ksylitol	10%	10gr
Deoksycholan sodu	15%	15gr
mocznik	25 proc	25gr
10x PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami)		1x PBS (100 ml)
Zawartość NaCl	8 gramów	10 ml 10x PBS + 90 ml wody destylowanej
Kcl	0,2 grama
KH2PO4	0,24 grama
Na2HPO4 · 2H2O	1,81 gr
woda destylowana	100 ml
ph	pH dostosowane do 7,4 za pomocą HCl
Autoklaw i przechowywać w temperaturze 4 °C.

Tabela 1: Skład roztworu oczyszczającego i soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS).

Bejca fluorescencyjna/ Tag	Długości fal wzbudzenia/emisji	Zastosowany zestaw filtrów mikroskopowych
Czerwień Nilu	553/636 nm	Zestaw filtrów 43
Autofluorescencja ksylemu	380/475 nm	Zestaw filtrów 49
Calcofluor Biały	405/475 nm	Zestaw filtrów 49
Podstawowa Fuksina	561/650 nm	Zestaw filtrów 43
erRFP (zapytanie ofertowe)	585/608 nm	Zestaw filtrów 43
Dobra praktyka rolna	488/509 nm	Zestaw filtrów 38

Tabela 2: Widma wzbudzenia/emisji wybrane do niniejszego badania.

Discussion

Zastosowanie roztworu oczyszczającego na wyciętych wibratomem odcinkach galasów z pewnością zwiększa zdolność do badania interakcji biotroficznej między P. brassicae a rośliną żywicielską. Chociaż protokół czyszczenia dotyczy nawet sekcji dłoni, działa lepiej z sekcjami wibratomowymi. Utrwalanie próbek w utrwalaczu PFA działa jako krytyczny etap protokołu, ponieważ próbki mogą być następnie przechowywane w temperaturze 4 °C przez kilka dni przed przystąpieniem do sekcji. Zapewnia to elastyczność w przechowywaniu próbek przez ograniczony czas bez uszczerbku dla ekspresji i konserwacji białek fluorescencyjnych podczas utrwalania.

Czerwień Nilowa (w DMSO lub metanolu) jest niekompatybilna z sekcjami żywicy ze względu na swoją hydrofobowość, która rozpuszcza żywicę i niszczy sekcje zatopione w żywicy¹⁷. W związku z tym skrawki wibratomu okazują się pomocne w badaniu rozmieszczenia patogenu i jego cyklu życiowego w rozwijających się galasach, w których można łatwo zastosować barwienie czerwienią nilową.

Roztwór czyszczący zastosowany w tym protokole jest bardzo wszechstronny¹², co pozwala na stosowanie różnych barwników fluorescencyjnych w różnych kombinacjach do barwienia różnych biomolekuł/składników ścian komórkowych (suberyna, lignina, celuloza i chityna w interakcjach grzybowych). Możliwe jest również przeciwdziałanie barwieniu odcinków fluorescencyjnych linii markerowych GFP, a tym samym skorelowanie aktywności promotora lub wzorca akumulacji białka z obecnością patogenu w określonych komórkach lub regionach galasów. Jednak autofluorescencja tła z ksylemu i wypełnionych patogenami komórek olbrzymich nie mogła zostać wyeliminowana nawet po protokole oczyszczania. Stanowi to ograniczenie w patrzeniu na markery fluorescencyjne w późniejszych stadiach tworzenia się żółci, zwłaszcza przy użyciu mikroskopu epifluorescencyjnego i obrazowaniu słabych sygnałów.

Ze względu na niski poziom ekspresji/akumulacji sygnałów fluorescencyjnych, czynniki transkrypcyjne są trudne do wykrycia, ale dzięki tej technice możliwe jest uzyskanie dla nich zadowalających obrazów. Ogólnie rzecz biorąc, połączenie sekcji wibratomu z podejściem polegającym na oczyszczaniu tkanek rozszerza zestaw narzędzi do obserwacji histologicznych złożonych tkanek żółciowych. Elastyczność tego protokołu ułatwia proces utrwalania tkanek i skraca czas potrzebny na cięcie i obrazowanie świeżych próbek tkanek w celu obserwacji białek fluorescencyjnych i aktywności promotorów. Dzięki dalszym ulepszeniom i wykorzystaniu innych barwników fluorescencyjnych specyficznych dla różnych biomolekuł, metoda ta będzie oznaczać większy postęp w badaniach histologicznych i analizie obrazu gęstych, nieprzezroczystych tkanek o złożonej organizacji tkanek. W ostatnim czasie przedstawiona metoda oczyszczania tkanek stała się popularnym i szeroko stosowanym protokołem łączenia i umożliwiania jednoczesnego pozyskiwania różnych sygnałów fluorescencyjnych 11,12,13. Przyszły rozwój i modyfikacje takich technik znacznie poprawią rozdzielczość obrazu do obserwacji interakcji roślina-patogen na poziomie komórkowym.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2N Kwas siarkowy (H2SO4)	Roth	UN2796	Regulacja pH
Agaroza	PRONA	BGQT100	Osadzanie
Podstawowa Fuksyna	BIOSHOP	BSF410.5	Barwnik fluorescencyjny
Calcofluor White	Sigma Aldrich	18909-100ML-F	Barwnik fluorescencyjny
Komercyjny wybielacz	Domestos
Cyjanoakrylan / Klej błyskawiczny	Klej Kropelka
Dimetylosulfotlenek (DMSO)	BIOSHOP	DMS555.500	Solventowy
mikroskop epifluorescencyjny	Automatyczny mikroskop epifluorescencyjny Carl Zeiss M2 z systemem Colibri LED	Carl Zeiss M2 Carl Zeiss	Zestaw filtrów zestaw filtrów 38, 43, 49 używany
W pełni zautomatyzowany Vibratome	Leica	VT1200 S Światłomierz
/ Fotometr	LI-COR Biosciences	LI-250A + czujnik kwantowy LI-190R	Do pomiaru  natężenia światła w zakresie fal 400-700nm (PAR)
Taśma			Do naklejania bloku agarozy na formę
Murashige & Skoog Medium (MS Medium)	Duchefa Biochemie	MO222.0050	Podłoże do wzrostu roślin
Nil Red	Sigma Aldrich	N3013-100MG	Barwnik fluorescencyjny
Paraformaldehyd PFA	Sigma Aldrich	158127-100G	Utrwalacz
Chlorek potasu (KCl)	POCH	739740114	Składnik PBS
Wodorotlenek potasu (KOH)	Sigma Aldrich	P1767-250G	Regulacja pH
Fosforan potasu Monobasic (KH2PO4)	BIOSHOP	PPM302.500	Składnik PBS
Chlorek sodu (NaCl)	BIOSHOP	SOD001.1	Składnik PBS
Deoksycholan sodu	Sigma Aldrich	D6750-25G	Roztwór
oczyszczającyFosforan sodu dwuzasadowy (Na2HPO4 · 2H2O)	POCH	799490116	Składnik PBS
Triton X-100	BIOSHOP	TRX506.100	Utrwalacz
Mocznik	Sigma Aldrich	U5378-100G	Roztwór czyszczący
Pompa próżniowa/ciśnieniowa i eksykator	Welch firmy Gardner Denver	2522C-02	do próżni Roztwór oczyszczający do infiltracji
ksylitol	Sigma Aldrich	X3375-25G	(componenet)