Method Article

Test wiązania białek powierzchniowych komórek oparty na cytometrii przepływowej do oceny selektywności i swoistości aptameru przeciwnowotworowego

DOI:

10.3791/64304

⸱

September 13th, 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Medicine, Deakin University, 2Institute for Mental and Physical Health and Clinical Translation, School of Medicine, Deakin University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Koniecznym krokiem w rozwoju aptameru przeciwnowotworowego jest przetestowanie jego wiązania z celem. Demonstrujemy test oparty na cytometrii przepływowej w celu zbadania tego wiązania, podkreślając znaczenie włączenia aptameru kontroli ujemnej i komórek rakowych, które są dodatnie lub ujemne dla tego konkretnego białka.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kluczowym wyzwaniem w opracowaniu aptameru przeciwnowotworowego jest efektywne określenie selektywności i swoistości opracowanego aptameru w stosunku do docelowego białka. Ze względu na kilka zalet w porównaniu z przeciwciałami monoklonalnymi, rozwój aptamerów zyskał ogromną popularność wśród badaczy nowotworów. Systematyczna ewolucja ligandów przez wzbogacanie wykładnicze (SELEX) jest najpowszechniejszą metodą opracowywania aptamerów specyficznych dla białek będących przedmiotem zainteresowania. Po badaniu SELEX szybki i skuteczny test wiązania przyspiesza proces identyfikacji, potwierdzając selektywność i swoistość aptameru.

Ten artykuł wyjaśnia krok po kroku test wiązania oparty na cytometrii przepływowej aptamera specyficznego dla cząsteczki adhezji komórkowej nabłonka (EpCAM). Transbłonowa glikoproteina EpCAM ulega nadekspresji w większości nowotworów i odgrywa rolę w inicjacji, progresji i przerzutach raka. Dlatego jest cennym kandydatem do celowanego dostarczania leków do nowotworów. Aby ocenić selektywność i swoistość aptameru w stosunku do EpCAM związanego z błoną, wymagane są komórki EpCAM dodatnie i ujemne. Dodatkowo wymagany jest niewiążący aptamer EpCAM o podobnej długości i strukturze 2-wymiarowej (2D) do aptameru wiążącego EpCAM. Test wiązania obejmuje różne (bufor blokujący, bufor myjący, bufor inkubacyjny i bufor FACS) i etapy inkubacji.

Aptamer jest inkubowany z liniami komórkowymi. Po etapach inkubacji i mycia komórki zostaną ocenione za pomocą czułego testu cytometrii przepływowej. Analiza wyników wskazuje na wiązanie aptameru specyficznego dla EpCAM z komórkami EpCAM-dodatnimi, a nie z komórkami EpCAM-ujemnymi. W komórkach EpCAM-dodatnich jest to przedstawiane jako przesunięcie pasma w wiązaniu aptameru EpCAM w prawo w porównaniu z kontrolą aptamera niewiążącego. W komórkach EpCAM-ujemnych odpowiednie pasma aptamerów wiążących i niewiążących EpCAM nakładają się na siebie. Świadczy to o selektywności i swoistości aptamiru EpCAM. Chociaż ten protokół koncentruje się na aptamie EpCAM, protokół ma zastosowanie do innych opublikowanych aptamerów.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rak jest nadal jedną z głównych przyczyn śmiertelności na całym świecie1. Pomimo znacznej poprawy w leczeniu nowotworów w ostatnich dziesięcioleciach, opracowywanie leków przeciwnowotworowych jest nadal przedmiotem wielu dyskusji. Dzieje się tak dlatego, że chemioterapii, jako podstawa leczenia raka, towarzyszą poważne skutki uboczne, które ograniczają przestrzeganie zaleceń przez pacjenta. Co więcej, oporność nowotworów na leczenie wywołana chemioterapią ograniczyła jej zastosowanie jako jedynego wyboru interwencji medycznej. Zastosowanie przeciwciał monoklonalnych (mAb) wprowadziło wzmocnioną odpowiedź na leczenie raka2. Uzasadnieniem stosowania przeciwciał monoklonalnych była poprawa skuteczności chemioterapeutyków i zminimalizowanie ich działań niepożądanych. Jednak podawanie przeciwciał monoklonalnych również stało się wyzwaniem. Wynikało to nie tylko z reakcji immunologicznych wywołanych przez mAb, ale także z powodu zależnych od zwierząt i wysokich kosztów produkcji oraz trudnych warunków przechowywania3. Wprowadzenie aptamerów w latach dziewięćdziesiątych XX wieku4 wzbudziło nowe nadzieje w leczeniu raka, ponieważ zastosowanie aptamerów może rozwiązać problemy związane z mAb.

Aptamery to krótkie sekwencje kwasów nukleinowych, które są specjalnie produkowane dla określonego celu. Systematyczna ewolucja ligandów przez wzbogacanie wykładnicze (SELEX) jest powszechną metodą w produkcji aptamerów. W SELEX interesujące białko jest inkubowane z biblioteką losowych sekwencji nukleotydowych, a następnie poprzez serię cykli iteracyjnych aptamer specyficzny dla tego białka jest oczyszczany. Aptamery mają podobną selektywność docelową i swoistość jak mAb, dlatego rozwój leków w tej dziedzinie daje obiecujące przyszłe zastosowania. Aptamery specyficzne dla biomarkerów nowotworowych mogą być stosowane jako pojedyncze leki i narzędzia diagnostyczne raka5,6,7. Ze względu na swoją nanorozmiarową strukturę, aptamery te mogą również działać jako nośniki leków, dostarczając czynniki cytotoksyczne specyficznie do nowotworu8. Zwiększyłoby to skuteczność celowanego dostarczania leków i zmniejszyłoby liczbę niepożądanych reakcji związanych z chemioterapią, niezamierzonych. Co więcej, te nanoleki charakteryzują się wysoką penetracją tkanek, co czyni je pożądanym kandydatem do dostarczania i leczenia leków w głębokich nowotworach. Aptamery mogą być również zaprojektowane tak, aby celowały w transportery ulegające ekspresji na barierze krew-mózg (BBB) w celu poprawy dostarczania leków do guzów mózgu9. Dobrym przykładem takiego aptameru są dwufunkcyjne aptamery, ukierunkowane na receptor transferyny (TfR)10 w celu zwiększenia dostarczania leku przez barierę krew-mózg i dostarczające ładunek leku cytotoksycznego do komórek nowotworowych11.

Pomimo wszystkich zalet aptamerów, rozwój leków w tej dziedzinie nie przyniósł jeszcze wprowadzonego na rynek, skutecznego leku przeciwnowotworowego. Jedną z przyczyn takiego stanu rzeczy może być brak standardowych i powtarzalnych metod, które mogłyby być stosowane na całym świecie przez badaczy w tej dziedzinie. W niniejszej pracy przedstawiono krok po kroku protokół wiązania aptameru z natywnym białkiem ulegającym ekspresji na powierzchni komórki. Protokół ten jest niezbędnym krokiem w przedklinicznej ocenie aptamerów przeciwnowotworowych. Test przeprowadza się w celu wykazania selektywności i swoistości oczyszczonego aptameru pobranego z SELEX lub opublikowanej sekwencji aptamerów w celu potwierdzenia selektywności i swoistości. Ten test oparty na cytometrii przepływowej jest szybkim, wiarygodnym i czułym testem, który dokładnie pokazuje selektywność i swoistość aptameru, w którym aptamer jest testowany na białkach na powierzchni komórki12,13,14. Metoda ta została zademonstrowana przy użyciu powiązania aptameru specyficznego dla EpCAM pokazanego w tym artykule15. EpCAM, jako glikoproteina transbłonowa, odgrywa rolę w sygnalizacji komórek nowotworowych, progresji, migracji i przerzutach16,17. Aby wykazać selektywność i swoistość tego aptameru, wykorzystano komórki nowotworowe EpCAM-dodatnie i -ujemne. Wcześniej opracowany aptamer specyficzny dla EpCAM, TEPP (5′-GC GCG GTAC CGC GC TA ACG GA GGTTGCG TCC GT-3′) oraz aptamer kontroli ujemnej, TENN (5′-GC GCG TGCA CGC GC TA ACG GA TTCCTTT TCC GT-3), były używane odpowiednio jako aptamery wiążące i niewiążące EpCAM10. 3' koniec zarówno TEPP, jak i TENN zostały oznaczone fluoroforem TYE665.

TEPP to dwufunkcyjny aptamer, który z jednej strony atakuje EpCAM, a z drugiej TfR. To sprawiło, że TEPP stał się odpowiednim kandydatem do podawania leków na guzy mózgu EpCAM+. Wykorzystując swój specyficzny dla TfR koniec, TEPP przenika przez barierę krew-mózg, a za pomocą końca specyficznego dla EpCAM znajduje guz i dostarcza swój ładunek (np. leki cytotoksyczne) do guza. TENN ma podobną długość i strukturę 2D jak TEPP, ale nie ma powinowactwa do EpCAM lub TfR, a zatem jest odpowiednim aptamerem kontroli ujemnej. W artykule przedstawiono testowanie wiązania aptameru z białkiem docelowym za pomocą TEPP i TENN za pomocą cytometrii przepływowej. Protokół ten ma zastosowanie do opracowywania aptamerów specyficznych dla komórek. Ma to również zastosowanie do dalszych analiz uzupełniających i potwierdzających sekwencji aptamerowych dostępnych w literaturze. Protokół może być również używany przez osoby nowe w dziedzinie aptamerów, które rozważają wykorzystanie wcześniej opublikowanego aptameru do celów badawczo-rozwojowych (R&D). W niniejszej pracy przeanalizowano dwie dostępne w literaturze sekwencje aptamerowe.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Przed rozpoczęciem eksperymentu załóż środki ochrony osobistej, w tym fartuch laboratoryjny, rękawice i gogle. Szczegółowe informacje na temat materiałów, odczynników, sprzętu i oprogramowania użytego w tym protokole można znaleźć w Tabeli materiałów.

1. wymagane do testu

  1. Przygotować wymagane do tego doświadczenia - bufor SELEX wymagany do składania aptamerów, bufor blokujący (BB), bufor płuczący (WB) i bufor wiążący (BiB) (tabela 1) - świeżo w dniu doświadczenia i przechowywać je na lodzie lub w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Każdy aptamer wymaga unikalnego warunku składania. Obejmuje to bufor SELEX i warunki temperatury składania. Należy dołożyć starań, aby w pełni odtworzyć metody z oryginalnego artykułu opisującego aptamer10. W tym eksperymencie wszystkie są przygotowywane w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco. Objętość buforu wymagana w każdym eksperymencie zależy od liczby linii komórkowych, liczby powtórzeń i liczby badanych stężeń aptamerów.
SkładnikiWymagana wolumin
przedmiotkoncentracja
Bufor SELEXMgCl25 mM50 μl na próbkę + 10% błąd pipetowania
Bufor blokującyMgCl25 mM500 μL na linię komórkową
BSA a1 mg/ml
tRNA b0,1 mg/ml
FBS c10% (v/v)
Bufor do płukaniaMgCl25 mM1 ml na pierwsze płukanie + 100 μl na próbkę testową + 10% błąd pipetowania
Bufor wiązaniaMgCl25 mM50 μL na próbkę + 10% błąd pipetowania
Bsa2 mg/ml
tRNA0,2 mg/ml
FBS (Sieć Usługowa20% (v/v)

Tabela 1: wymagane do testu wiążącego. ZAAlbumina surowicy bydlęcej, bTransfer kwasu rybonukleinowego, cSurowica bydlęca płodu.

2. Przygotowanie aptamerów

UWAGA: Aptamery używane w teście są oznaczone cząsteczką reporterową fluorescencji, dlatego należy zachować ostrożność, aby chronić je przed światłem.

  1. Przed eksperymentem przygotuj zapas 100 μM (zapas A) aptamerów testowych i kontrolnych, używając ultraczystej wody wolnej od pirogenów i RNaz (Rysunek 1).
    UWAGA: W celu długotrwałej konserwacji bulion A należy przechowywać w zamrażarce w temperaturze -20 °C.
  2. Przygotować materiał B jako stężenie robocze aptamerów, rozcieńczając wsad A przy użyciu buforu SELEX (tabela 1). Aby postępować zgodnie z tym protokołem, rozcieńczyć zapas A do 1,000 nM, aby przygotować zapas B (Rysunek 1).
  3. Aby aptamer był gotowy do tworzenia struktury trójwymiarowej (3D), w probówce o pojemności 250 μl należy rozcieńczyć materiał B buforem SELEX, aby przygotować wymaganą objętość i stężenie aptameru do składania.
    UWAGA: Złożone aptamery zostaną wystawione na działanie równej objętości komórek. Dlatego stężenie aptameru, który jest ustawiony do składania, powinno być 2x bardziej skoncentrowane niż pożądane stężenie końcowe. Użyj równania (1), aby obliczyć wymagane objętości i stężenia. Należy pamiętać o uwzględnieniu dodatkowych 10% objętości w przypadku błędu pipetowania.
    Stężeniezapasu A × Wolumenzapasu A = Stężeniezapasu B × Wolumenzapasu B (1)

figure-protocol-1
Rysunek 1: Diagram przedstawiający etapy przygotowania aptamerów. 1Magazyn 1 jest przechowywany w temperaturze -20 °C w celu długotrwałej konserwacji. cyfra arabskaStężenia robocze są przygotowywane w buforze SELEX i nie są magazynowane. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. Utrzymanie komórek rakowych

UWAGA: Przed rozpoczęciem badania upewnij się, że komórki osiągnęły swój wczesny numer pasażu, wykazują typowe cechy morfologiczne i są wolne od mykoplazmy. Aby przetestować selektywność i swoistość aptameru, idealnie wymagane są linie komórkowe, które są wysokimi, umiarkowanymi i niskimi/ujemnymi ekspresorami białka będącego przedmiotem zainteresowania.

  1. Wysiać komórki w kolbie hodowlanej T75, stosując odpowiednie warunki hodowli. Hoduj je w inkubatorze z wilgotnością 5% CO2 w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: W tym badaniu zastosowano zmodyfikowaną pożywkę Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnioną 10% płodową surowicą bydlęcą (kompletna pożywka).
  2. Gdy komórki osiągną ~80% konfluencji, należy je przenieść do nowej kolby zawierającej świeżą, kompletną pożywkę.
    UWAGA: W zależności od interesującego białka i linii komórkowej, 80% konfluencja może zapewnić odpowiednią populację komórek do testu wiązania. W przypadku linii komórkowych w tym eksperymencie, MDA-MB-231 i HEK 293T, odpowiednia jest 80% konfluencja. Na tym etapie przejdź do sekcji 4, Test wiążący. Zawsze sprawdzaj ekspresję interesującego Cię białka, używając mAb specyficznych dla tego białka.

4. Test wiązania

UWAGA: Rysunek 2 podsumowuje kroki wymagane w teście wiązania w przylegających komórkach.

  1. W komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II zebrać komórki każdej kolby w probówkach w następujący sposób:
    1. Zebrać i wyrzucić pożywkę do kolby, dodać 2 ml PBS, rozprowadzić po komórkach, a następnie zebrać i wyrzucić PBS. Powtórz ten krok jeszcze dwa razy, aby usunąć wszelkie ślady pożywki, które mogą dezaktywować trypsynę. Dodać 1 ml 0,25% trypsyny/EDTA do każdej kolby i inkubować przez 5-10 minut w temperaturze 37 oC. Wizualizuj oderwanie komórek pod mikroskopem.
    2. Dodaj 1 ml kompletnej pożywki do komórek i pipetuj komórki w górę iw dół, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową. Odpipetować komórki do odpowiedniej probówki i odwirować przy 200 × g przez 5 min.
      UWAGA: W przypadku komórek, które nie przylegają, należy zebrać komórki do probówki, odwirować (200 × g, 5 min) i przejść do kroku 4.1.3.
    3. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1 ml świeżej pożywki. Policz komórki za pomocą barwienia błękitem trypanowym, rozcieńczając pewną objętość zawiesiny komórek błękitem trypanowym. Rozprowadzić ~15 μl mieszaniny między hemocytometrem a szkłem nakrywkowym. Policz komórki zgodnie z wcześniejszym opisem18, używając równania (2):
      figure-protocol-2 (2)
      UWAGA: Należy użyć minimalnej możliwej objętości zawiesiny komórek i zwrócić uwagę na współczynnik rozcieńczenia. Na przykład zmieszanie równych objętości zawiesiny komórkowej i 0,04% błękitu trypanowego daje współczynnik rozcieńczenia 2. Przed kontynuowaniem upewnij się, że wysoka żywotność (żywe komórki/całkowita liczba komórek × 100) wynosząca ~90% dla większości przylegających linii komórkowych. Martwe komórki niespecyficznie pobierają aptamery i zmieniają wyniki19. Możliwe jest użycie innych technik zliczania komórek, takich jak użycie licznika komórek.
    4. Zbierz wymaganą liczbę komórek, upewniając się, że masz 10 ×10 4 komórek na próbkę testową. Weź pod uwagę dodatkowe 10% objętości w przypadku błędu pipetowania.
      UWAGA: Ważne jest, aby zawsze zachowywać tę samą liczbę komórek między eksperymentami i powtórzeniami.
    5. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 2 godziny><, aby umożliwić stabilizację białka będącego przedmiotem zainteresowania na błonie komórkowej po enzymatycznym oderwaniu. UWAGA: Ten okres inkubacji może się różnić w zależności od białka będącego przedmiotem zainteresowania.
  2. Podczas tej 2 godzinnej inkubacji:
    1. Ustawić temperaturę wirówki na 4 °C. Pozostawić tRNA i zapasy aptameru w temperaturze pokojowej lub na lodzie do rozmrożenia. Aby chronić cząsteczkę reporterową fluorescencji, chroń probówki aptamerowe przed światłem.
      UWAGA: Rolą tRNA jest blokowanie miejsc wiązania kwasów nukleinowych.
    2. Przygotować bufor SELEX, BB, WB i BiB (patrz sekcja 1), utrzymując je wszystkie na lodzie lub w temperaturze 4 °C. Ustaw termocykler na pusty cykl. Umieść 96-dołkową czarną płytkę i probówki do cytometrii przepływowej na lodzie.
      UWAGA: Ustawienie termocyklera na pusty cykl przygotowuje system chłodzenia i ogrzewania oraz pomaga uzyskać bardziej powtarzalne wyniki.
  3. Po 2 godzinach inkubacji odwirować komórki w temperaturze 500 × g przez 5 minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 500 μl BB. Inkubować komórki w temperaturze 4 °C przez 30 minut z przerywanym mieszaniem.
  4. Podczas tej 30-minutowej inkubacji należy wykonać składanie aptamerów w następujący sposób:
    1. Uzupełnić 2x stężenia aptamerów (patrz sekcja 2), a następnie wymieszać i inkubować aptamery w termocyklerze, zgodnie z wymaganymi warunkami składania. Dla tego aptamera EpCAM należy zastosować następujące warunki składania: 95 °C, 5 min, a następnie 22 °C, 10 min i 37 °C, 15 min.
      UWAGA: Zawsze należy dołączyć kontrolę ujemną (tj. bufor SELEX bez aptamerów).
  5. Po 30 minutowej inkubacji odwirować komórki (500 × g, 5 min, 4 °C), usunąć supernatant, dodać 1 ml WB i ponownie odwirować komórki (500 × g, 5 min, 4 °C). Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w odpowiedniej objętości BiB.
  6. Odpipetować 50 μl zawieszonych komórek do każdego dołka lodowato zimnej, 96-dołkowej czarnej płytki. Utrzymuj komórki na lodzie, aby zahamować internalizację białka będącego przedmiotem zainteresowania.
  7. Odpipetować 50 μl aptamerów na komórki o objętości 50 μl, wymieszać i inkubować w ciemności w temperaturze 4 °C przez 30 minut. Odwirować płytkę w temperaturze 500 × g, 5 min, 4 °C i ostrożnie usunąć supernatant.
  8. Ostrożnie zawiesić osad w WB i odwirować przy 500 × g przez 5 minut. Powtórzyć etap płukania (4.7) 2x i ponownie zawiesić w 100 μl WB do analizy cytometrycznej przepływowej.
    UWAGA: Zobacz Rysunek 3 dla diagramu interakcji między aptamerami a komórkami.

figure-protocol-3
Rysunek 2: Diagram przedstawiający etapy przeprowadzania testu wiązania aptameru z białkiem. Skróty: SELEX = Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichment; BB = bufor blokujący; WB = bufor do mycia; BiB = bufor wiążący. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-protocol-4
Rysunek 3: Diagram przedstawiający różne typy komórek i aptamerów wymaganych do przeprowadzenia testu wiązania aptamerów. Skrót: EpCAM = cząsteczka adhezji komórkowej nabłonka. Ten rysunek został stworzony przy użyciu Biorender.com. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figury.

5. Cytometria przepływowa i analiza danych

UWAGA: Przed włączeniem cytometru przepływowego upewnij się, że w jednostkach filtrów membranowych nie ma "pęcherzyków" dla roztworu zamykającego, roztworu czyszczącego i płynu osłonkowego (0,9% NaCl). "Wykrwawij" bąbelki, jeśli w kapsułkach są bąbelki. Upewnij się, że pojemnik na odpady jest pusty, a pojemniki z płynem osłonowym, wodą i 1% wybielaczem w ultraczystej wodzie są pełne.

  1. Włącz cytometr przepływowy, a następnie komputer.
    UWAGA: Szczegóły dotyczące obsługi cytometru przepływowego wyjaśnione tutaj są specyficzne dla maszyny i oprogramowania pokazanego na filmie (patrz Tabela materiałów). Inne oprogramowanie wymagałoby odpowiedniego przeszkolenia w obsłudze.
  2. Otwórz oprogramowanie do analizy cytometrii przepływowej, zaloguj się do programu i w zakładce Cytometr uruchom Fluidics Start-up.
  3. Aby utworzyć nowy eksperyment, na karcie eksperymentu kliknij pozycję Nowy folder i odpowiednio nazwij folder/eksperyment
    4. .
  4. Kliknij nowy folder, aby go wyróżnić, a następnie ponownie na karcie eksperymentu kliknij pozycję Nowy eksperyment i odpowiednio nazwij eksperyment.
  5. Aby dodać pierwszą próbkę/próbkę, na karcie eksperymentu kliknij Nowy okaz i nazwij odpowiednio ten preparat (nazwa linii komórkowej/próbki kontrolnej/próbki eksperymentalnej).
  6. Aby dodać próbkę probówki, zaznacz próbkę (grupę) i na karcie eksperymentu kliknij przycisk Nowa probówka. Dodaj odpowiednią liczbę probówek i nazwę.
  7. Aby przygotować wymagane wykresy, na karcie arkusza roboczego otwórz nowy arkusz. Gdy pojawi się nowe okno arkusza roboczego, otwórz następujące elementy za pomocą ekranu arkusza roboczego (najedź myszą na logo / obrazy, aby znaleźć nazwy):
    1. Przygotuj wykres punktowy rozproszenia do przodu (FSC) w porównaniu z rozproszeniem bocznym (SCC), aby wybrać populację, która Cię interesuje. Zdefiniuj pierwszą bramkę, identyfikując i wybierając populację będącą przedmiotem zainteresowania (P1) na wykresie gęstości rozproszenia z przodu i z boku. Nie należy uwzględnić szczątków, które stanowią populację o najniższym sygnale rozproszenia do przodu.
      UWAGA: Parametr FSC wykrywa komórki lub zdarzenia na podstawie ich rozmiaru, a SCC dyskryminuje je na podstawie ich szczegółowości20.
    2. Przygotuj wykres punktowy obszaru FSC (FSC-A) w funkcji wysokości FSC (FSC-H), aby wybrać populację pojedynczych komórek. Zdefiniuj drugą bramkę, wykluczając populacje komórek dubletowych, ponieważ komórki dubletowe znacząco wpływają na wyniki i wnioski. Wyklucz dublety, używając wykresów gęstości FSC-H i FSC-A, gdzie komórki o tym samym rozmiarze pokazują podobny obszar i wysokość. W związku z tym podkoszulki są grupowane po przekątnej i oddzielane od dubletów.
      UWAGA: FSC jest w przybliżeniu proporcjonalny do rozmiaru komórki. Impulsy napięciowe są definiowane jako FSC-H, intensywność sygnału, szerokość FSC, która odzwierciedla rozmiar komórki i czas trwania sygnału, oraz FSC-A, która wynosi H × W. Dublety mają podwójną szerokość i wartość powierzchni; dlatego bramkowanie dla podkoszulków opiera się na wykrywaniu dysproporcji między H, W i A spowodowanych dubletami.
    3. Przygotuj histogram liczby zdarzeń na tle interesującego nas fluoroforu.
  8. Przed rozpoczęciem cytometrii przepływowej upewnij się, że pulpit nawigacyjny akwizycji do sterowania akwizycją próbki, inspektorem i cytometrem w celu dostosowania parametrów napięcia, a także arkusz roboczy ze wszystkimi wykresami są otwarte.
    UWAGA: Do przeprowadzenia analizy potrzebne jest co najmniej 100 μl zawiesiny 10 ×10 4 komórek w probówce do cytometrii przepływowej. Szczególnie w przypadku niższych żywotności można przeprowadzić barwienie jodkiem propidyny, aby wybrać żywotną populację komórek21,22.
  9. Aby uruchomić pierwszą próbkę, po lewej stronie ekranu upewnij się, że strzałka wskazująca probówkę jest zielona. Jeśli ta strzałka nie jest zielona, kliknij strzałkę, aby zmienić ją na zieloną.
  10. Za pomocą pipety przenieś każdą próbkę z 96-dołkowej czarnej płytki do probówki do cytometrii przepływowej. Uruchomić niepoddawaną obróbce, niebarwioną próbkę kontrolną z niską prędkością.
  11. Na pulpicie nawigacyjnym pozyskiwania wybierz odpowiednią liczbę zdarzeń do zarejestrowania (30 000), zmień natężenie przepływu na niskie, a następnie kliknij przycisk Pobierz dane.
  12. Dostosuj napięcie dla parametrów FSC i SCC. Upewnij się, że populacja komórek jest scentralizowana na wykresie kropkowym i że żadne komórki nie stykają się z żadną osią wykresu, aby uniknąć utraty interesujących komórek.
  13. Zwiększ prędkość akwizycji do średniej lub wysokiej, aby analizować próbki szybciej, ale nie przekraczaj więcej niż 200 zdarzeń/s. Następnie kliknij przycisk Nagraj dane.
  14. Wykonaj bramkowanie dla P1 (Rysunek 4A) i populacji pojedynczej komórki (Rysunek 4B). Skonstruuj histogram zdarzeń w odniesieniu do użytego fluorochromu i wybierz P1 na podstawie danych (w tym przypadku allofikocyjaniny (APC)) (Rysunek 4C).
  15. Po dostosowaniu napięcia, bramkowaniu i zarejestrowaniu danych, wyjmij próbkę i kliknij Następna probówka.
  16. Wstaw następną próbkę i powtórz rejestrację danych dla wszystkich próbek kontrolnych i testowych (Rysunek 3).
  17. Po zebraniu wszystkich danych umyj cytometr przepływowy, uruchamiając trzy probówki z 50% wybielaczem, płukaniem FACS i ultraczystą wodą, każda przez 5 minut przy wysokim natężeniu przepływu.
  18. Następnie z menu rozwijanego Cytometer (Cytometr) kliknij opcję Fluidics Shut Down.
  19. Przed zamknięciem oprogramowania i wyłączeniem urządzenia i komputera wyeksportuj wyniki jako pliki .fcs na dysk USB, aby je przesłać i przeanalizować w następujący sposób:
    1. W oprogramowaniu do analizy naciśnij przycisk NOWY, aby utworzyć nowy dokument i okno do obsługi analizy. Przeciągnij przykładowe pliki do nowego okna.
    2. Kliknij dwukrotnie, aby otworzyć niebarwioną próbkę. Wybierz populację P1, kliknij dwukrotnie populację P1, aby utworzyć wykres FSC-H w stosunku do FSC-A i bramkować populację pojedynczych komórek.
    3. Kliknij dwukrotnie bramkowane pojedyncze komórki, aby utworzyć histogram zdarzeń względem użytego fluorochromu.
    4. W oryginalnym oknie wybierz P1 i pojedyncze komórki, a następnie przeciągnij je do obszaru Wszystkie próbki, tak aby wszystkie próbki zawierały teraz to samo bramkowanie.
    5. Kliknij przycisk Edytor układów, aby otworzyć okno Układy. Przeciągnij dwie próbki (kontrolną i testową) jedna na drugą, aby utworzyć histogram nakładki.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ważnym aspektem odkrywania i rozwoju nowych leków jest zapewnienie selektywności i specyficzności kandydata na lek. Oznacza to, że kandydat na lek powinien być w stanie rozróżniać różne komórki i wpływać tylko na populację komórek będących przedmiotem zainteresowania (selektywność). Selektywność bada się przy użyciu linii komórkowych, które różnią się pod względem ekspresji białka będącego przedmiotem zainteresowania. W tym badaniu linie komórkowe MDA-MB-231 i HEK 293T zostały wybrane jako komórki EpCAM-dodatnie i -ujemn...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kluczowym wyzwaniem związanym z opracowywaniem nowych aptamerów jest brak standardowych wytycznych, które miałyby zastosowanie do różnych etapów tego procesu. McKeague i in. wykazali ostatnio niektóre z powiązanych wyzwań, które prowadzą do niejasnych prezentacji danych w publikacjach i niemożności powtórzenia badań. Zaproponowali oni podstawowe wytyczne niezbędne do rozważenia przy charakterystyce aptamerów19. Test wiązania aptamerów jest krytycznym krokiem w badaniach przesiewowych i/lub charakt...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują za dofinansowanie SEED Instytutu Zdrowia Psychicznego i Fizycznego oraz Tłumaczeń Klinicznych (IMPACT), program "Alfred Deakin Postdoctoral Research Fellowship" na Uniwersytecie Deakin oraz stypendium "Australian Government Research Training Program".

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Probówki do mikrowirówek 1,5 ml z dołączoną pokrywkąSigma-AldrichT6649
15 mL CellStar niebieska nakrętka, stożkowa dolna probówkaGreiner Bio One188271
5 ml pipety serologiczneGreiner Bio One606180
BD FACSCanto II Flow Cytometr Becton DickinsonBecton Dickinson N/A
BD FACSDiva V9.0BD BiosciencesN/A
Albumina surowicy bydlęcej (BSA), liofilizowany proszekSigma-AldrichTMA7906-50G
Hemocytometr jasnej liniiSigma-AldrichZ359629
Dulbecco' s Zmodyfikowane podłoże Eagle Medium (DMEM) Technologie życia w proszku o wysokiej zawartości glukozy12100046
Dulbecco" s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (DPBS)Life Technologies21300025
FlowJo, LLC 10.8.1BD BiosciencesN/A
Płodowa surowica bydlęca (FBS)BovogenSFBS-F
HEK293TKolekcja kultur typu amerykańskiegoACS-4500
Inkubator Heracell 150i CO2Thermo Fisher ScientificN/A
Wirówka Heraeus Megafuge 16RThermo Fisher ScientificN/A
Chlorek magnezu (MgCl2)Sigma-AldrichM8266
MDA-MB-231American Type Culture CollectionCRM-HTB-26
Microplate, PS, 96 dołków, F-bottom (studnia kominowa), BlackGreiner Bio One655076
MiniAmp Thermal CyclerThermo Fisher ScientificA37834
Tabletki soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS)Life Technologies18912014
Ultraczysta woda bez pirogenów i RNazMilli-Q
T75Cellstar658170
TENNIntegrated DNA TechnologiesN/A5′-GC GCG TGCA CGC GC TA ACG GA TTCCTTT TCC GT-3
TEPPIntegrated DNA TechnologiesN/A5′-GC GCG GTAC CGC GC TA ACG GA GGTTGCG TCC GT-3′
Transfer RNA (tRNA)Sigma-AldrichR8508-5X1ML
Trypan Blue SolutionLife Technologies15250061
Trypsin-EDTAGibco15400054
Kolba do hodowli komórkowych

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cancer. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/cancer#:~:text=Cancer%20is%20a%20leading%20cause.and%20rectum%20and%20prostate%20cancers (2022).
  2. Liu, J. K. H. The history of monoclonal antibody development - Progress, remaining challenges and future innovations. Annals of Medicine and Surgery. 3 (4), 113-116 (2014).
  3. Nakhjavani, M., Shigdar, S. Future of PD-1/PD-L1 axis modulation for the treatment of triple-negative breast cancer. Pharmacological Research. 175, 106019(2022).
  4. Bukari, B., Samarasinghe, R. M., Noibanchong, J., Shigdar, S. L. Non-invasive delivery of therapeutics into the brain: the potential of aptamers for targeted delivery. Biomedicines. 8 (5), 120(2020).
  5. Wu, X., Chen, J., Wu, M., Zhao, J. X. Aptamers: active targeting ligands for cancer diagnosis and therapy. Theranostics. 5 (4), 322(2015).
  6. Feng, X., et al. The aptamer functionalized nanocomposite used for prostate cancer diagnosis and therapy. Journal of Nanomaterials. 2022, (2022).
  7. Huang, J., et al. Advances in aptamer-based biomarker discovery. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 571(2021).
  8. Ashrafuzzaman, M. Aptamers as both drugs and drug-carriers. BioMed Research International. 2014, (2014).
  9. Nakhjavani, M., Samarasinghe, R. M., Shigdar, S. Triple-negative breast cancer brain metastasis: an update on druggable targets, current clinical trials, and future treatment options. Drug Discovery Today. , (2022).
  10. Macdonald, J., et al. Development of a bifunctional aptamer targeting the transferrin receptor and epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) for the treatment of brain cancer metastases. ACS Chemical Neuroscience. 8 (4), 777-784 (2017).
  11. Macdonald, J., et al. Bifunctional aptamer-doxorubicin conjugate crosses the blood-brain barrier and selectively delivers its payload to EpCAM-positive tumor cells. Nucleic Acid Therapeutics. 30 (2), 117-128 (2020).
  12. Shigdar, S., Agnello, L., Fedele, M., Camorani, S., Cerchia, L. Profiling cancer cells by cell-SELEX: use of aptamers for discovery of actionable biomarkers and therapeutic applications thereof. Pharmaceutics. 14 (1), 28(2021).
  13. Rahimizadeh, K., et al. Development of cell-specific aptamers: recent advances and insight into the selection procedures. Molecules. 22 (12), 2070(2017).
  14. Chen, M., et al. Development of cell-SELEX technology and its application in cancer diagnosis and therapy. International Journal of Molecular Sciences. 17 (12), 2079(2016).
  15. Shigdar, S., et al. The use of sensitive chemical antibodies for diagnosis: detection of low levels of EpCAM in breast cancer. PLoS One. 8 (2), 57613(2013).
  16. Ni, J., et al. Role of the EpCAM (CD326) in prostate cancer metastasis and progression. Cancer and Metastasis Reviews. 31 (3), 779-791 (2012).
  17. Ni, J., et al. Epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) is associated with prostate cancer metastasis and chemo/radioresistance via the PI3K/Akt/mTOR signaling pathway. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 45 (12), 2736-2748 (2013).
  18. McKeague, M., et al. Tissue Culture. Kruse, P. F., Patterson, M. K. , Academic Press. 395-397 (1973).
  19. McKeague, M., et al. The minimum aptamer publication standards (MAPS guidelines) for de novo aptamer selection. Aptamers. 6, 10-18 (2022).
  20. Schoofs, G., Van Hout, A., D'huys, T., Schols, D., Van Loy, T. A flow cytometry-based assay to identify compounds that disrupt binding of fluorescently-labeled CXC Chemokine ligand 12 to CXC Chemokine receptor 4. Journal of Visualized Experiments. (133), e57271(2018).
  21. McKinnon, K. M. Flow cytometry: an overview. Current Protocols in Immunology. 120 (1), 1-11 (2018).
  22. Kamiloglu, S., Sari, G., Ozdal, T., Capanoglu, E. Guidelines for cell viability assays. Food Frontiers. 1 (3), 332-349 (2020).
  23. Ruscito, A., DeRosa, M. C. Small-molecule binding aptamers: Selection strategies, characterization, and applications. Frontiers in Chemistry. 4, 14(2016).
  24. McKeague, M., et al. Comprehensive analytical comparison of strategies used for small molecule aptamer evaluation. Analytical Chemistry. 87 (17), 8608-8612 (2015).
  25. Henri, J., Bayat, N., Macdonald, J., Shigdar, S. A guide to using nucleic acid aptamers in cell based assays. Aptamers. 23, (2019).
  26. Mao, H., et al. The mechanism and regularity of quenching the effect of bases on fluorophores: the base-quenched probe method. Analyst. 143 (14), 3292-3301 (2018).
  27. McKeague, M., et al. Analysis of in vitro aptamer selection parameters. Journal of Molecular Evolution. 81 (5), 150-161 (2015).
  28. Chen, B., et al. Targeting negative surface charges of cancer cells by multifunctional nanoprobes. Theranostics. 6 (11), 1887(2016).
  29. Shigdar, S., et al. RNA aptamers targeting cancer stem cell marker CD133. Cancer Letters. 330 (1), 84-95 (2013).
  30. Amraee, M., Oloomi, M., Yavari, A., Bouzari, S. DNA aptamer identification and characterization for E. coli O157 detection using cell based SELEX method. Analytical Biochemistry. 536, 36-44 (2017).
  31. Yu, X. -X., et al. Selection and characterization of a novel DNA aptamer, Apt-07S specific to hepatocellular carcinoma cells. Drug Design, Development and Therapy. 14, 1535(2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Flow CytometryCell Surface ProteinAptamer Binding AssayAnticancer AptamerEpCAM AptamerProtein SelectivityProtein SpecificitySELEX MethodImmunophenotyping AssayDrug Delivery

Related Articles