Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Test wiązania białek powierzchniowych komórek oparty na cytometrii przepływowej do oceny selektywności i swoistości aptameru przeciwnowotworowego

4.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64304

⸱

13 września 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Medicine, Deakin University, 2Institute for Mental and Physical Health and Clinical Translation, School of Medicine, Deakin University

W tym artykule

Podsumowanie

Koniecznym krokiem w rozwoju aptameru przeciwnowotworowego jest przetestowanie jego wiązania z celem. Demonstrujemy test oparty na cytometrii przepływowej w celu zbadania tego wiązania, podkreślając znaczenie włączenia aptameru kontroli ujemnej i komórek rakowych, które są dodatnie lub ujemne dla tego konkretnego białka.

Streszczenie

Kluczowym wyzwaniem w opracowaniu aptameru przeciwnowotworowego jest efektywne określenie selektywności i swoistości opracowanego aptameru w stosunku do docelowego białka. Ze względu na kilka zalet w porównaniu z przeciwciałami monoklonalnymi, rozwój aptamerów zyskał ogromną popularność wśród badaczy nowotworów. Systematyczna ewolucja ligandów przez wzbogacanie wykładnicze (SELEX) jest najpowszechniejszą metodą opracowywania aptamerów specyficznych dla białek będących przedmiotem zainteresowania. Po badaniu SELEX szybki i skuteczny test wiązania przyspiesza proces identyfikacji, potwierdzając selektywność i swoistość aptameru.

Ten artykuł wyjaśnia krok po kroku test wiązania oparty na cytometrii przepływowej aptamera specyficznego dla cząsteczki adhezji komórkowej nabłonka (EpCAM). Transbłonowa glikoproteina EpCAM ulega nadekspresji w większości nowotworów i odgrywa rolę w inicjacji, progresji i przerzutach raka. Dlatego jest cennym kandydatem do celowanego dostarczania leków do nowotworów. Aby ocenić selektywność i swoistość aptameru w stosunku do EpCAM związanego z błoną, wymagane są komórki EpCAM dodatnie i ujemne. Dodatkowo wymagany jest niewiążący aptamer EpCAM o podobnej długości i strukturze 2-wymiarowej (2D) do aptameru wiążącego EpCAM. Test wiązania obejmuje różne (bufor blokujący, bufor myjący, bufor inkubacyjny i bufor FACS) i etapy inkubacji.

Aptamer jest inkubowany z liniami komórkowymi. Po etapach inkubacji i mycia komórki zostaną ocenione za pomocą czułego testu cytometrii przepływowej. Analiza wyników wskazuje na wiązanie aptameru specyficznego dla EpCAM z komórkami EpCAM-dodatnimi, a nie z komórkami EpCAM-ujemnymi. W komórkach EpCAM-dodatnich jest to przedstawiane jako przesunięcie pasma w wiązaniu aptameru EpCAM w prawo w porównaniu z kontrolą aptamera niewiążącego. W komórkach EpCAM-ujemnych odpowiednie pasma aptamerów wiążących i niewiążących EpCAM nakładają się na siebie. Świadczy to o selektywności i swoistości aptamiru EpCAM. Chociaż ten protokół koncentruje się na aptamie EpCAM, protokół ma zastosowanie do innych opublikowanych aptamerów.

Wprowadzenie

Rak jest nadal jedną z głównych przyczyn śmiertelności na całym świecie1. Pomimo znacznej poprawy w leczeniu nowotworów w ostatnich dziesięcioleciach, opracowywanie leków przeciwnowotworowych jest nadal przedmiotem wielu dyskusji. Dzieje się tak dlatego, że chemioterapii, jako podstawa leczenia raka, towarzyszą poważne skutki uboczne, które ograniczają przestrzeganie zaleceń przez pacjenta. Co więcej, oporność nowotworów na leczenie wywołana chemioterapią ograniczyła jej zastosowanie jako jedynego wyboru interwencji medycznej. Zastosowanie przeciwciał monoklonalnych (mAb) wprowadziło wzmocnioną odpowiedź na leczenie raka2. Uzasadnieniem stosowania przeciwciał monoklonalnych była poprawa skuteczności chemioterapeutyków i zminimalizowanie ich działań niepożądanych. Jednak podawanie przeciwciał monoklonalnych również stało się wyzwaniem. Wynikało to nie tylko z reakcji immunologicznych wywołanych przez mAb, ale także z powodu zależnych od zwierząt i wysokich kosztów produkcji oraz trudnych warunków przechowywania3. Wprowadzenie aptamerów w latach dziewięćdziesiątych XX wieku4 wzbudziło nowe nadzieje w leczeniu raka, ponieważ zastosowanie aptamerów może rozwiązać problemy związane z mAb.

Aptamery to krótkie sekwencje kwasów nukleinowych, które są specjalnie produkowane dla określonego celu. Systematyczna ewolucja ligandów przez wzbogacanie wykładnicze (SELEX) jest powszechną metodą w produkcji aptamerów. W SELEX interesujące białko jest inkubowane z biblioteką losowych sekwencji nukleotydowych, a następnie poprzez serię cykli iteracyjnych aptamer specyficzny dla tego białka jest oczyszczany. Aptamery mają podobną selektywność docelową i swoistość jak mAb, dlatego rozwój leków w tej dziedzinie daje obiecujące przyszłe zastosowania. Aptamery specyficzne dla biomarkerów nowotworowych mogą być stosowane jako pojedyncze leki i narzędzia diagnostyczne raka5,6,7. Ze względu na swoją nanorozmiarową strukturę, aptamery te mogą również działać jako nośniki leków, dostarczając czynniki cytotoksyczne specyficznie do nowotworu8. Zwiększyłoby to skuteczność celowanego dostarczania leków i zmniejszyłoby liczbę niepożądanych reakcji związanych z chemioterapią, niezamierzonych. Co więcej, te nanoleki charakteryzują się wysoką penetracją tkanek, co czyni je pożądanym kandydatem do dostarczania i leczenia leków w głębokich nowotworach. Aptamery mogą być również zaprojektowane tak, aby celowały w transportery ulegające ekspresji na barierze krew-mózg (BBB) w celu poprawy dostarczania leków do guzów mózgu9. Dobrym przykładem takiego aptameru są dwufunkcyjne aptamery, ukierunkowane na receptor transferyny (TfR)10 w celu zwiększenia dostarczania leku przez barierę krew-mózg i dostarczające ładunek leku cytotoksycznego do komórek nowotworowych11.

Pomimo wszystkich zalet aptamerów, rozwój leków w tej dziedzinie nie przyniósł jeszcze wprowadzonego na rynek, skutecznego leku przeciwnowotworowego. Jedną z przyczyn takiego stanu rzeczy może być brak standardowych i powtarzalnych metod, które mogłyby być stosowane na całym świecie przez badaczy w tej dziedzinie. W niniejszej pracy przedstawiono krok po kroku protokół wiązania aptameru z natywnym białkiem ulegającym ekspresji na powierzchni komórki. Protokół ten jest niezbędnym krokiem w przedklinicznej ocenie aptamerów przeciwnowotworowych. Test przeprowadza się w celu wykazania selektywności i swoistości oczyszczonego aptameru pobranego z SELEX lub opublikowanej sekwencji aptamerów w celu potwierdzenia selektywności i swoistości. Ten test oparty na cytometrii przepływowej jest szybkim, wiarygodnym i czułym testem, który dokładnie pokazuje selektywność i swoistość aptameru, w którym aptamer jest testowany na białkach na powierzchni komórki12,13,14. Metoda ta została zademonstrowana przy użyciu powiązania aptameru specyficznego dla EpCAM pokazanego w tym artykule15. EpCAM, jako glikoproteina transbłonowa, odgrywa rolę w sygnalizacji komórek nowotworowych, progresji, migracji i przerzutach16,17. Aby wykazać selektywność i swoistość tego aptameru, wykorzystano komórki nowotworowe EpCAM-dodatnie i -ujemne. Wcześniej opracowany aptamer specyficzny dla EpCAM, TEPP (5′-GC GCG GTAC CGC GC TA ACG GA GGTTGCG TCC GT-3′) oraz aptamer kontroli ujemnej, TENN (5′-GC GCG TGCA CGC GC TA ACG GA TTCCTTT TCC GT-3), były używane odpowiednio jako aptamery wiążące i niewiążące EpCAM10. 3' koniec zarówno TEPP, jak i TENN zostały oznaczone fluoroforem TYE665.

TEPP to dwufunkcyjny aptamer, który z jednej strony atakuje EpCAM, a z drugiej TfR. To sprawiło, że TEPP stał się odpowiednim kandydatem do podawania leków na guzy mózgu EpCAM+. Wykorzystując swój specyficzny dla TfR koniec, TEPP przenika przez barierę krew-mózg, a za pomocą końca specyficznego dla EpCAM znajduje guz i dostarcza swój ładunek (np. leki cytotoksyczne) do guza. TENN ma podobną długość i strukturę 2D jak TEPP, ale nie ma powinowactwa do EpCAM lub TfR, a zatem jest odpowiednim aptamerem kontroli ujemnej. W artykule przedstawiono testowanie wiązania aptameru z białkiem docelowym za pomocą TEPP i TENN za pomocą cytometrii przepływowej. Protokół ten ma zastosowanie do opracowywania aptamerów specyficznych dla komórek. Ma to również zastosowanie do dalszych analiz uzupełniających i potwierdzających sekwencji aptamerowych dostępnych w literaturze. Protokół może być również używany przez osoby nowe w dziedzinie aptamerów, które rozważają wykorzystanie wcześniej opublikowanego aptameru do celów badawczo-rozwojowych (R&D). W niniejszej pracy przeanalizowano dwie dostępne w literaturze sekwencje aptamerowe.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Przed rozpoczęciem eksperymentu należy założyć środki ochrony indywidualnej, w tym fartuch laboratoryjny, rękawice i okulary ochronne. Szczegóły dotyczące materiałów, odczynników, sprzętu i oprogramowania używanych w tym protokole znajdują się w Tabeli materiałów.

1. Bufory wymagane do testu

  1. Przygotuj bufory potrzebne do tego eksperymentu – bufor SELEX wymagany do zwijania aptameru, bufor blokujący (BB), bufor do przemywania (WB) oraz bufor wiązania (BiB) (Tabela 1) – świeżo w dniu eksperymentu i przechowuj na lodzie lub w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Każdy aptamer wymaga unikalnych warunków zwijania, w tym odpowiedniego buforu SELEX i temperatury zwijania. Należy dokładnie powtórzyć metody opisane w oryginalnym artykule przedstawiającym dany aptamer10. W tym eksperymencie wszystkie bufory przygotowuje się w roztworze soli fizjologicznej Dulbecco (DPBS). Objętość buforu potrzebna w każdym eksperymencie zależy od liczby linii komórkowych, liczby replikat oraz liczby testowanych stężeń aptameru.
SkładnikiWymagana objętość
ElementStężenie
Bufor SELEXMgCl25 mM50 µL na próbkę + 10% błąd pipetowania
Bufor blokującyMgCl25 mM500 µL na linię komórkową
BSA a1 mg/mL
tRNA b0,1 mg/mL
FBS c10% (v/v)
Bufor płuczącyMgCl25 mM1 mL do pierwszego płukania + 100 µL na próbkę testową + 10% błąd pipetowania
Bufor wiązaniaMgCl25 mM50 µL na próbkę + 10% błąd pipetowania
BSA2 mg/mL
tRNA0,2 mg/mL
FBS20% (v/v)

Tabela 1: Bufory wymagane do testu wiązania. aAlbumina surowicy bydlęcej, bKwas rybonukleinowy transportujący, cSurowica cielęca.

2. Przygotowanie aptamerów

UWAGA: Aptomery wykorzystywane w teście są oznaczone fluorescencyjną cząsteczką reporterową, dlatego należy chronić je przed światłem.

  1. Przed rozpoczęciem eksperymentu przygotuj 100 µM roztwór macierzysty (roztwór A) testowych i kontrolnych aptymerów, używając wody ultraczystej pozbawionej pirogenów i RNaz (Rysunek 1).
    UWAGA: W celu długoterminowego przechowywania roztwór A należy przechowywać w zamrażarce w temperaturze -20 °C.
  2. Przygotuj roztwór B jako robocze stężenie aptymerów, rozcieńczając roztwór A buforem SELEX (Tabela 1). Aby postępować zgodnie z niniejszym protokołem, rozcieńcz roztwór A do stężenia 1000 nM, aby uzyskać roztwór B (Rysunek 1).
  3. Aby przygotować aptymer do tworzenia trójwymiarowej (3D) struktury, w probówce o pojemności 250 µL rozcieńcz roztwór B buforem SELEX, aby uzyskać wymaganą objętość i stężenie aptymeru do zwijania.
    UWAGA: Zwinięte aptymery będą narażone na równą objętość komórek. Dlatego stężenie aptymeru ustalone do zwijania powinno być 2 razy wyższe niż pożądane stężenie końcowe. Użyj równania (1) do obliczenia wymaganych objętości i stężeń. Pamiętaj o dodatkowych 10% objętości na błąd pipetowania.
    Concentrationstock A × Volumestock A = Concentrationstock B × Volumestock B  (1)

Schemat procesu przygotowania aptamerów: aptamer liofilizowany, bufor SELEX, termocykler, roztwory magazynowe.
Rycina 1: Schemat przedstawiający etapy przygotowania aptamerów. 1Roztwór magazynowy 1 przechowuje się w temperaturze -20 °C w celu długoterminowego zachowania. 2Roztwory robocze przygotowuje się w buforze SELEX i nie przechowuje. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

3. Utrzymanie komórek nowotworowych

UWAGA: Przed rozpoczęciem badania upewnij się, że komórki znajdują się na wczesnych pasażach, wykazują typowe cechy morfologiczne i są wolne od mikoplazm. W celu sprawdzenia selektywności i specyficzności aptameru idealnie są wymagane linie komórkowe o wysokim, umiarkowanym oraz niskim/ujemnym poziomie ekspresji białka docelowego.

  1. Zasej komórki do butelki hodowlanej T75, stosując odpowiednie warunki hodowli. Hoduj je w inkubatorze wilgotnym z 5% CO2, w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: W tym badaniu zastosowano zmodyfikowane medium Eagle’a Dulbecco (DMEM) wzbogacone 10% cielęcą surowicą płodową (pełne medium).
  2. Gdy komórki osiągną około 80% zacieśnienia, przesiej je do nowej butelki zawierającej świeże pełne medium.
    UWAGA: W zależności od białka docelowego i linii komórkowej, 80% zacieśnienia może stanowić odpowiednią populację komórek do testu wiązania. Dla linii komórkowych użytych w tym eksperymencie, MDA-MB-231 i HEK 293T, 80% zacieśnienia jest odpowiednie. Na tym etapie przejdź do sekcji 4, testu wiązania. Zawsze sprawdź ekspresję białka docelowego, stosując przeciwciała monoklonalne specyficzne dla tego białka.

4. Test wiązania

UWAGA: Rycina 2 podsumowuje kroki wymagane w teście wiązania w komórkach przylegających.

  1. W szafce bezpieczeństwa biologicznego klasy II zbierz komórki z każdej kolby do probówek w następujący sposób:
    1. Zbierz i odrzuć pożywkę z kolby, dodaj 2 mL roztworu PBS, rozprowadź go po komórkach, a następnie zbierz i odrzuć roztwór PBS. Powtórz ten krok jeszcze dwukrotnie, aby usunąć wszelkie ślady pożywki, które mogą dezaktywować trypsynę. Dodaj 1 mL trypsyny/EDTA o stężeniu 0,25% do każdej kolby i inkubuj przez 5–10 minut w 37 oC. Obserwuj oderwanie komórek pod mikroskopem.
    2. Dodaj 1 mL pełnej pożywki do komórek i pipetuj w górę i w dół, aby uzyskać zawiesinę pojedynczych komórek. Przenieś komórki pipetą do odpowiedniej probówki i odwirowuj przy 200 × g przez 5 minut.
      UWAGA: W przypadku komórek nieprzylegających zebrać komórki do probówki, odwirować (200 × g, 5 min) i przejść do kroku 4.1.3.
    3. Odrzucić supernatant i zawiesić komórki w 1 mL świeżej pożywki. Policz komórki metodą barwienia błękitem trypanowym, poprzez rozcieńczenie określonej objętości zawiesiny komórkowej błękitem trypanowym. Rozprowadź około 15 µL mieszaniny pomiędzy komorą do liczenia komórek a szkiełkiem nakrywkowym. Policz komórki jak opisano wcześniej18, używając równania (2):
      Wzór na stężenie komórek, równanie do obliczania całkowitej liczby komórek na mL, mikroskopowe liczenie komórek. (2)
      UWAGA: Użyj możliwie najmniejszej objętości zawiesiny komórkowej i zanotuj współczynnik rozcieńczenia. Na przykład zmieszanie równych objętości zawiesiny komórkowej i 0,04% błękitu trypanowego daje współczynnik rozcieńczenia równy 2. Upewnij się, że żywotność komórek (żywe komórki/całkowita liczba komórek × 100) wynosi około 90% dla większości linii komórek przylegających przed przejściem dalej. Martwe komórki nieswoiście wychwytują aptamery i wpływają na wyniki19. Można również zastosować inne metody liczenia komórek, np. licznik komórek.
    4. Zbierz wymaganą liczbę komórek, upewniając się, że na każdy próbkę testową przypada 10 × 104 komórek. Dolicz dodatkowe 10% objętości na błąd pipetowania.
      UWAGA: Ważne jest, aby zawsze zachować tę samą liczbę komórek pomiędzy eksperymentami i replikami.
    5. Inkubuj komórki przez 2 godziny w 37 °C, aby umożliwić stabilizację białka docelowego w błonie komórkowej po enzymatycznym oderwaniu.
      UWAGA: Czas inkubacji może się różnić w zależności od badanego białka.
  2. W trakcie tej 2-godzinnej inkubacji:
    1. Ustaw temperaturę wirówki na 4 °C. Pozostaw tRNA i zapasy aptamerów w temperaturze pokojowej lub na lodzie, aby się odmroziły. Aby chronić cząsteczkę reporterową fluorescencyjną, chronić probówki z aptamerami przed światłem.
      UWAGA: Rola tRNA polega na blokowaniu miejsc wiązania kwasów nukleinowych.
    2. Przygotuj bufor SELEX, BB, WB oraz BiB (patrz sekcja 1), trzymając je wszystkie na lodzie lub w 4 °C. Ustaw cyklator termiczny na pusty cykl. Umieść 96-dołkową czarną płytę oraz probówki do cytometrii przepływowej na lodzie.
      UWAGA: Ustawienie cyklatora termicznego na pusty cykl przygotowuje system chłodzenia i ogrzewania, co pomaga uzyskać bardziej powtarzalne wyniki.
  3. Po zakończeniu 2-godzinnej inkubacji odwirowuj komórki przy 500 × g przez 5 minut. Odrzuć supernatant i zawieś komórki w 500 µL buforu BB. Inkubuj komórki przez 30 minut w 4 °C z okresowym mieszaniem.
  4. W trakcie tej 30-minutowej inkubacji przeprowadź faldowanie aptamerów w następujący sposób:
    1. Przygotuj roztwory aptamerów o stężeniu 2x (patrz sekcja 2), następnie wymieszaj i inkubuj aptamery w cyklatorze termicznym zgodnie z wymaganymi warunkami faldowania. Dla tego aptameru przeciw EpCAM zastosuj następujące warunki faldowania: 95 °C przez 5 minut, następnie 22 °C przez 10 minut i 37 °C przez 15 minut.
      UWAGA: Zawsze należy uwzględnić kontrolę ujemną (tj. bufor SELEX bez aptamerów).
  5. Po zakończeniu 30-minutowej inkubacji odwirowuj komórki (500 × g, 5 min, 4 °C), usuń supernatant, dodaj 1 mL buforu WB i ponownie odwirowuj komórki (500 × g, 5 min, 4 °C). Usuń supernatant i zawieś komórki w odpowiedniej objętości buforu BiB.
  6. Pipetuj 50 µL zawieszonych komórek do każdej studzienki lodowatej, 96-dołkowej czarnej płyty. Trzymaj komórki na lodzie, aby zahamować wewnątrzkomórkowe przenikanie białka docelowego.
  7. Pipetuj 50 µL aptamerów na 50 µL zawiesiny komórek, wymieszaj i inkubuj w ciemności przez 30 minut w 4 °C. Odwirowuj płytę przy 500 × g przez 5 minut w 4 °C i ostrożnie usuń supernatant.
  8. Ostrożnie zawieś osad w buforze WB i odwirowuj przy 500 × g przez 5 minut. Powtórz krok płukania (4.7) dwukrotnie i zawieś w 100 µL buforu WB do analizy cytometrycznej.
    UWAGA: Zobacz Rysunek 3 w celu zapoznania się ze schematem oddziaływań między aptamerami a komórkami.

Schemat przepływu przygotowania komórek i aptamerów dla SELEX; obejmuje etapy wirowania i cyklera termicznego.
Rycina 2: Schemat przedstawiający kroki przeprowadzania testu wiązania aptamer-białko. Skróty: SELEX = Systematyczna ewolucja ligandów metodą wykładniczego wzbogacania; BB = bufor blokujący; WB = bufor płukający; BiB = bufor wiązania. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Schemat wiązania aptameru EpCAM; przedstawia interakcję aptameru specyficznego i kontrolnego z komórkami EpCAM+/-.
Rycina 3: Schemat przedstawiający różne typy komórek i aptamerów wymagane do przeprowadzenia testu wiązania aptameru. Skrót: EpCAM = cząsteczka adhezyjna nabłonka. Rycina została utworzona za pomocą Biorender.com. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

5. Cytofleksometria i analiza danych

UWAGA: Przed włączeniem cytometru przepływowego upewnij się, że w jednostkach membranowych filtrów nie ma „bąbelków” w roztworze do zatrzymania, roztworze czyszczącym oraz w płynie osłonowym (0,9% NaCl). Usuń bąbelki, jeśli występują w kapsułkach. Upewnij się, że pojemnik na odpady jest pusty, a pojemniki z płynem osłonowym, wodą oraz 1% roztworem błękitu w wodzie ultraczystej są pełne.

  1. Włącz cyfrowy cytometr przepływowy, a następnie komputer.
    UWAGA: Szczegóły obsługi cytometru przepływowego wyjaśnione tutaj dotyczą konkretnego urządzenia i oprogramowania pokazanego na nagraniu (zobacz Tabelę materiałów). Inne oprogramowanie wymaga odpowiedniego szkolenia z zakresu jego użytkowania.
  2. Otwórz oprogramowanie do analizy cytometrii przepływowej, zaloguj się do programu, a następnie w zakładce Cytometr uruchom opcję Uruchomienie układu cieczy.
  3. Aby utworzyć nowy eksperyment, w zakładce Eksperyment kliknij Nowy folder i nadaj folderowi/eksperymentowi odpowiednią nazwę.
  4. Kliknij na nowy folder, aby go zaznaczyć, a następnie ponownie w zakładce Eksperyment kliknij Nowy eksperyment i nadaj eksperymentowi odpowiednią nazwę.
  5. Aby dodać pierwszą próbkę/specymin, w zakładce Eksperyment kliknij Nowy specymin i nadaj temu specyminowi odpowiednią nazwę (nazwa linii komórkowej/próbki kontrolnej/próbki eksperymentalnej).
  6. Aby dodać próbkę w probówce, zaznacz specymin (grupę), a następnie w zakładce Eksperyment kliknij Nowa probówka. Dodaj odpowiednią liczbę probówek i nadaj im nazwy.
  7. Aby przygotować wymagane wykresy, w zakładce Arkusz otwórz nowy arkusz. Gdy pojawi się okno nowego arkusza, otwórz następujące elementy za pomocą ekranu arkusza (przesuń kursorem myszy nad logo/obrazki, aby poznać ich nazwy):
    1. Przygotuj wykres rozrzutu rozpraszania w przód (FSC) względem rozpraszania bocznego (SCC), aby wybrać populację interesującą. Zdefiniuj pierwszą bramkę, identyfikując i wybierając populację interesującą (P1) na wykresie gęstości rozpraszania w przód i bocznego. Wyklucz pozostałości, które stanowią populację o najniższym sygnale rozpraszania w przód.
      UWAGA: Parametr FSC wykrywa komórki lub zdarzenia na podstawie ich wielkości, a SCC różnicuje je na podstawie ich ziarnistości20.
    2. Przygotuj wykres rozrzutu FSC-powierzchnia (FSC-A) względem FSC-wysokość (FSC-H), aby wybrać populację pojedynczych komórek. Zdefiniuj drugą bramkę, wykluczając populacje podwójnych komórek (doubletów), ponieważ znacznie wpływają one na wyniki i wnioski. Wyklucz doublety, korzystając z wykresów gęstości FSC-H względem FSC-A, gdzie komórki o tej samej wielkości wykazują podobną powierzchnię i wysokość. W związku z tym pojedyncze komórki (singlety) grupują się po przekątnej i oddzielają od doubletów.
      UWAGA: FSC jest w przybliżeniu proporcjonalne do wielkości komórki. Impulsy napięciowe są definiowane jako FSC-H (intensywność sygnału), FSC-szerokość (odzwierciedla wielkość komórki i czas trwania sygnału) oraz FSC-A, które jest równe H × W. Doublety mają podwójną szerokość i wartość powierzchni; dlatego bramkowanie singletów opiera się na wykrywaniu nieproporcjonalności między H, W i A spowodowanych przez doublety.
    3. Przygotuj histogram liczby zdarzeń względem badanego fluoroforu.
  8. Przed rozpoczęciem cytometrii przepływowej upewnij się, że otwarte są: panel sterowania pozyskiwaniem próbek, inspektor, cytometr do regulacji parametrów napięcia oraz arkusz z wszystkimi wykresami.
    UWAGA: Do przeprowadzenia analizy potrzeba co najmniej 100 µL zawiesiny komórkowej o stężeniu 10 × 104 komórek w probówce do cytometrii przepływowej. W przypadku szczególnie niskiej żywotności komórek można wykonać barwienie jodkiem propidyny, aby wybrać populację żywych komórek21,22.
  9. Aby uruchomić pierwszą próbkę, po lewej stronie ekranu upewnij się, że strzałka wskazująca na probówkę jest zielona. Jeśli strzałka nie jest zielona, kliknij ją, aby stała się zielona.
  10. Za pomocą pipety przenieś każdą próbkę z czarnej płytki 96-dołkowej do probówki do cytometrii przepływowej. Uruchom nienaleczoną, niepobraną próbkę kontrolną z niską prędkością.
  11. Na panelu pozyskiwania danych wybierz odpowiednią liczbę zdarzeń do zarejestrowania (30 000), zmień prędkość przepływu na niską i kliknij Pozyskaj dane.
  12. Dostosuj napięcie dla parametrów FSC i SCC. Upewnij się, że populacja komórek znajduje się centralnie na wykresie rozrzutu i że żadna komórka nie styka się z osiami wykresu, aby uniknąć utraty komórek interesujących.
  13. Zwiększ prędkość pozyskiwania do średniej lub wysokiej, aby analiza próbek przebiegła szybciej, ale nie przekraczaj 200 zdarzeń/s. Następnie kliknij Zarejestruj dane.
  14. Wykonaj bramkowanie dla P1 (Rycina 4A) oraz dla populacji pojedynczych komórek (Rycina 4B). Skonstruuj histogram zdarzeń względem użytego fluorochromu i wybierz P1 na podstawie danych (allofikoerytryna C (APC) w tym przypadku) (Rycina 4C).
  15. Po dostosowaniu napięcia, bramkowaniu i zarejestrowaniu danych, usuń próbkę i kliknij Następna probówka.
  16. Wstaw kolejną próbkę i powtórz rejestrację danych dla wszystkich próbek kontrolnych i testowych (Rycina 3).
  17. Po zebraniu wszystkich danych przepłucz cytometr przepływowy, uruchamiając trzy probówki: 50% roztwór błękitu, płukanie FACS oraz wodę ultraoczyszczoną, każda przez 5 minut przy wysokiej prędkości przepływu.
  18. Następnie z menu rozwijanego Cytometr kliknij Wyłączenie układu cieczy.
  19. Przed zamknięciem oprogramowania oraz wyłączeniem urządzenia i komputera wyeksportuj wyniki jako pliki .fcs na pendrive, aby je przesłać i przeanalizować, w następujący sposób:
    1. W oprogramowaniu analitycznym naciśnij przycisk Nowy, aby utworzyć nowy dokument i okno do przeprowadzenia analizy. Przeciągnij pliki z próbkami do nowego okna.
    2. Kliknij dwukrotnie, aby otworzyć próbkę niepobraną. Wybierz populację P1, kliknij dwukrotnie na populację P1, aby utworzyć wykres FSC-H względem FSC-A i wyznaczyć bramkę dla populacji pojedynczych komórek.
    3. Kliknij dwukrotnie na wybraną populację pojedynczych komórek, aby utworzyć histogram zdarzeń względem użytego fluorochromu.
    4. W oryginalnym oknie wybierz P1 i pojedyncze komórki i przeciągnij je do Wszystkie próbki, tak aby wszystkie próbki zawierały teraz tę samą bramkę.
    5. Kliknij przycisk Edytor układu, aby otworzyć okno Układy. Przeciągnij dwie próbki (kontrolną i testową) jedna na drugą, aby utworzyć nałożony histogram.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Ważnym aspektem odkrywania i opracowywania nowych leków jest zapewnienie selektywności i swoistości kandydata na lek. Oznacza to, że kandydat na lek powinien być w stanie odróżnić różne komórki i wpływać wyłącznie na interesującą nas populację komórek (selektywność). Selektywność bada się z wykorzystaniem linii komórkowych różniących się pod względem ekspresji badanego białka. W niniejszym badaniu linie komórkowe MDA-MB-231 oraz HEK 293T wybrano odpowiednio jako komórki EpCAM-dodatnie i -ujemne. Swoistość to kolejny para...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Kluczowym wyzwaniem związanym z opracowywaniem nowych aptamerów jest brak standardowych wytycznych, które miałyby zastosowanie do różnych etapów tego procesu. McKeague i in. wykazali ostatnio niektóre z powiązanych wyzwań, które prowadzą do niejasnych prezentacji danych w publikacjach i niemożności powtórzenia badań. Zaproponowali oni podstawowe wytyczne niezbędne do rozważenia przy charakterystyce aptamerów19. Test wiązania aptamerów jest krytycznym krokiem w badaniach przesiewowych i/lub charakt...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Autorzy dziękują za dofinansowanie SEED Instytutu Zdrowia Psychicznego i Fizycznego oraz Tłumaczeń Klinicznych (IMPACT), program "Alfred Deakin Postdoctoral Research Fellowship" na Uniwersytecie Deakin oraz stypendium "Australian Government Research Training Program".

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówki do mikrowirówek 1,5 ml z dołączoną pokrywkąSigma-AldrichT6649
15 mL CellStar niebieska nakrętka, stożkowa dolna probówkaGreiner Bio One188271
5 ml pipety serologiczneGreiner Bio One606180
BD FACSCanto II Flow Cytometr Becton DickinsonBecton Dickinson N/A
BD FACSDiva V9.0BD BiosciencesN/A
Albumina surowicy bydlęcej (BSA), liofilizowany proszekSigma-AldrichTMA7906-50G
Hemocytometr jasnej liniiSigma-AldrichZ359629
Dulbecco' s Zmodyfikowane podłoże Eagle Medium (DMEM) Technologie życia w proszku o wysokiej zawartości glukozy12100046
Dulbecco" s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (DPBS)Life Technologies21300025
FlowJo, LLC 10.8.1BD BiosciencesN/A
Płodowa surowica bydlęca (FBS)BovogenSFBS-F
HEK293TKolekcja kultur typu amerykańskiegoACS-4500
Inkubator Heracell 150i CO2Thermo Fisher ScientificN/A
Wirówka Heraeus Megafuge 16RThermo Fisher ScientificN/A
Chlorek magnezu (MgCl2)Sigma-AldrichM8266
MDA-MB-231American Type Culture CollectionCRM-HTB-26
Microplate, PS, 96 dołków, F-bottom (studnia kominowa), BlackGreiner Bio One655076
MiniAmp Thermal CyclerThermo Fisher ScientificA37834
Tabletki soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS)Life Technologies18912014
Ultraczysta woda bez pirogenów i RNazMilli-Q
T75Cellstar658170
TENNIntegrated DNA TechnologiesN/A5′-GC GCG TGCA CGC GC TA ACG GA TTCCTTT TCC GT-3
TEPPIntegrated DNA TechnologiesN/A5′-GC GCG GTAC CGC GC TA ACG GA GGTTGCG TCC GT-3′
Transfer RNA (tRNA)Sigma-AldrichR8508-5X1ML
Trypan Blue SolutionLife Technologies15250061
Trypsin-EDTAGibco15400054
Kolba do hodowli komórkowych

Bibliografia

  1. Cancer. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/cancer#:~:text=Cancer%20is%20a%20leading%20cause.and%20rectum%20and%20prostate%20cancers (2022).
  2. Liu, J. K. H. The history of monoclonal antibody development - Progress, remaining challenges and future innovations. Annals of Medicine and Surgery. 3 (4), 113-116 (2014).
  3. Nakhjavani, M., Shigdar, S. Future of PD-1/PD-L1 axis modulation for the treatment of triple-negative breast cancer. Pharmacological Research. 175, 106019(2022).
  4. Bukari, B., Samarasinghe, R. M., Noibanchong, J., Shigdar, S. L. Non-invasive delivery of therapeutics into the brain: the potential of aptamers for targeted delivery. Biomedicines. 8 (5), 120(2020).
  5. Wu, X., Chen, J., Wu, M., Zhao, J. X. Aptamers: active targeting ligands for cancer diagnosis and therapy. Theranostics. 5 (4), 322(2015).
  6. Feng, X., et al. The aptamer functionalized nanocomposite used for prostate cancer diagnosis and therapy. Journal of Nanomaterials. 2022, (2022).
  7. Huang, J., et al. Advances in aptamer-based biomarker discovery. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 571(2021).
  8. Ashrafuzzaman, M. Aptamers as both drugs and drug-carriers. BioMed Research International. 2014, (2014).
  9. Nakhjavani, M., Samarasinghe, R. M., Shigdar, S. Triple-negative breast cancer brain metastasis: an update on druggable targets, current clinical trials, and future treatment options. Drug Discovery Today. , (2022).
  10. Macdonald, J., et al. Development of a bifunctional aptamer targeting the transferrin receptor and epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) for the treatment of brain cancer metastases. ACS Chemical Neuroscience. 8 (4), 777-784 (2017).
  11. Macdonald, J., et al. Bifunctional aptamer-doxorubicin conjugate crosses the blood-brain barrier and selectively delivers its payload to EpCAM-positive tumor cells. Nucleic Acid Therapeutics. 30 (2), 117-128 (2020).
  12. Shigdar, S., Agnello, L., Fedele, M., Camorani, S., Cerchia, L. Profiling cancer cells by cell-SELEX: use of aptamers for discovery of actionable biomarkers and therapeutic applications thereof. Pharmaceutics. 14 (1), 28(2021).
  13. Rahimizadeh, K., et al. Development of cell-specific aptamers: recent advances and insight into the selection procedures. Molecules. 22 (12), 2070(2017).
  14. Chen, M., et al. Development of cell-SELEX technology and its application in cancer diagnosis and therapy. International Journal of Molecular Sciences. 17 (12), 2079(2016).
  15. Shigdar, S., et al. The use of sensitive chemical antibodies for diagnosis: detection of low levels of EpCAM in breast cancer. PLoS One. 8 (2), 57613(2013).
  16. Ni, J., et al. Role of the EpCAM (CD326) in prostate cancer metastasis and progression. Cancer and Metastasis Reviews. 31 (3), 779-791 (2012).
  17. Ni, J., et al. Epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) is associated with prostate cancer metastasis and chemo/radioresistance via the PI3K/Akt/mTOR signaling pathway. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 45 (12), 2736-2748 (2013).
  18. McKeague, M., et al. Tissue Culture. Kruse, P. F., Patterson, M. K. , Academic Press. 395-397 (1973).
  19. McKeague, M., et al. The minimum aptamer publication standards (MAPS guidelines) for de novo aptamer selection. Aptamers. 6, 10-18 (2022).
  20. Schoofs, G., Van Hout, A., D'huys, T., Schols, D., Van Loy, T. A flow cytometry-based assay to identify compounds that disrupt binding of fluorescently-labeled CXC Chemokine ligand 12 to CXC Chemokine receptor 4. Journal of Visualized Experiments. (133), e57271(2018).
  21. McKinnon, K. M. Flow cytometry: an overview. Current Protocols in Immunology. 120 (1), 1-11 (2018).
  22. Kamiloglu, S., Sari, G., Ozdal, T., Capanoglu, E. Guidelines for cell viability assays. Food Frontiers. 1 (3), 332-349 (2020).
  23. Ruscito, A., DeRosa, M. C. Small-molecule binding aptamers: Selection strategies, characterization, and applications. Frontiers in Chemistry. 4, 14(2016).
  24. McKeague, M., et al. Comprehensive analytical comparison of strategies used for small molecule aptamer evaluation. Analytical Chemistry. 87 (17), 8608-8612 (2015).
  25. Henri, J., Bayat, N., Macdonald, J., Shigdar, S. A guide to using nucleic acid aptamers in cell based assays. Aptamers. 23, (2019).
  26. Mao, H., et al. The mechanism and regularity of quenching the effect of bases on fluorophores: the base-quenched probe method. Analyst. 143 (14), 3292-3301 (2018).
  27. McKeague, M., et al. Analysis of in vitro aptamer selection parameters. Journal of Molecular Evolution. 81 (5), 150-161 (2015).
  28. Chen, B., et al. Targeting negative surface charges of cancer cells by multifunctional nanoprobes. Theranostics. 6 (11), 1887(2016).
  29. Shigdar, S., et al. RNA aptamers targeting cancer stem cell marker CD133. Cancer Letters. 330 (1), 84-95 (2013).
  30. Amraee, M., Oloomi, M., Yavari, A., Bouzari, S. DNA aptamer identification and characterization for E. coli O157 detection using cell based SELEX method. Analytical Biochemistry. 536, 36-44 (2017).
  31. Yu, X. -X., et al. Selection and characterization of a novel DNA aptamer, Apt-07S specific to hepatocellular carcinoma cells. Drug Design, Development and Therapy. 14, 1535(2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Analiza wi zania aptameruaptamer EpCAMselektywno bia kowaspecyficzno bia kowametoda SELEXanaliza immunofenotypowaniadostarczanie lek w
Test wiązania białek powierzchniowych komórek oparty na cytometrii przepływowej do oceny selektywności i swoistości aptameru przeciwnowotworowego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.