Artykuł metodologiczny

Termoobrazownik o żywotności fluorescencji do zastosowań biomedycznych

DOI:

10.3791/64321

⸱

7 kwietnia 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Biochemistry and Cell Biology, University College Cork, 2Cancer Research@UCC, University College Cork, 3Centre for Microscopy, Characterisation and Analysis (CMCA), The University of Western Australia, 4Physics Department, Brookhaven National Laboratory

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł opisuje użycie nowego, szybkiego imagera optycznego do makroskopowego obrazowania czasu życia fotoluminescencji próbek emitujących długie rozpady. Opisano procedury integracji, akwizycji i analizy obrazu, a także przygotowanie i charakterystykę materiałów sensorów do obrazowania oraz zastosowania imagera w badaniu próbek biologicznych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł przedstawia nowy fotoluminescencyjny aparat do obrazowania żywotności przeznaczony do mapowania stężenia tlenu cząsteczkowego (O2) w różnych próbkach fosforyzujących, począwszy od powłok w stanie stałym, wrażliwych na O2, a skończywszy na żywych próbkach tkanek zwierzęcych barwionych rozpuszczalnymi sondami czułymi na O2. W szczególności wykorzystano sondę bliskiej podczerwieni NanO2-IR opartą na nanocząstkach, która jest pobudliwa dzięki diodzie elektroluminescencyjnej (LED) o długości fali 625 nm i emituje światło o długości fali 760 nm. System obrazowania oparty jest na kamerze Timepix3 (Tpx3Cam) oraz adapterze optomechanicznym, w którym znajduje się również wzmacniacz obrazu. Mikroskopia obrazowania przez cały czas trwania fosforescencji O2 (PLIM) jest powszechnie wymagana do różnych badań, ale obecne platformy mają ograniczenia w zakresie dokładności, ogólnej elastyczności i użyteczności.

Prezentowany tutaj system to szybki i bardzo czuły imager, który jest zbudowany na zintegrowanym czujniku optycznym i module chipa odczytu, Tpx3Cam. Wykazano, że wytwarza sygnały fosforescencji o wysokiej intensywności i stabilne wartości czasu życia z barwionych powierzchniowo próbek tkanki jelitowej lub śródświetlnych barwionych fragmentów jelita grubego i umożliwia szczegółowe mapowanie poziomów O2 w tkankach w ciągu około 20 s lub mniej. Przedstawiono również wstępne eksperymenty dotyczące obrazowania niedotlenienia w przeszczepionych nowotworach u zwierząt nieprzytomnych. Opisujemy również, w jaki sposób można ponownie skonfigurować imager do użytku z materiałami wrażliwymi naO2 na bazie barwników Pt-porfiryny przy użyciu diody LED 390 nm do wzbudzenia i filtra pasmowoprzepustowego 650 nm do emisji. Ogólnie rzecz biorąc, stwierdzono, że kamera PLIM zapewnia dokładne pomiary ilościowe wartości czasu życia zastosowanych sond i odpowiednich dwuwymiarowych map stężeniaO2. Jest również przydatny do obrazowania metabolicznego modeli tkanek ex vivo i żywych zwierząt.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O2 jest jednym z kluczowych parametrów środowiskowych dla systemów żywych, a wiedza o rozmieszczeniu O2 i jego dynamice jest ważna dla wielu badań biologicznych1,2,3. Ocena natlenienia tkanek za pomocą sond fosforyzujących4,5,6,7,8 i PLIM9,10,11,12,13 zyskują na popularności w biologicznych oraz badania medyczne3,9,14,15,16,17,18,19. Dzieje się tak dlatego, że PLIM, w przeciwieństwie do pomiarów intensywności fluorescencji lub fosforescencji, nie ma wpływu na czynniki zewnętrzne, takie jak stężenie sondy, fotowybielanie, intensywność wzbudzenia, wyrównanie optyczne, rozpraszanie i autofluorescencja.

Jednak obecne platformy PLIM O2 są ograniczone przez swoją czułość, szybkość pozyskiwania obrazów, dokładność i ogólną użyteczność. Skorelowane czasowo zliczanie pojedynczych fotonów (TCSPC), w połączeniu z procedurą skanowania rastrowego, jest często stosowane w urządzeniach PLIM i FLIM (FLIM) do obrazowania przez cały czas życia20,21,22. Ponieważ jednak PLIM wymaga długiego czasu przebywania piksela (w zakresie milisekund), czas pozyskiwania obrazu jest znacznie dłuższy niż wymagany dla aplikacji FLIM20,22,23. Inne techniki, takie jak bramkowane kamery CCD/CMOS, nie mają czułości pojedynczych fotonów i mają niską liczbę klatek na sekundę20,24,25,26. Co więcej, istniejące systemy PLIM są najczęściej używane w formacie mikroskopowym, podczas gdy systemy makroskopowe są mniej popularne27.

Oparty na TCSPC makro imager PLIM 28 został stworzony w celu przezwyciężenia wielu z tych ograniczeń. Konstrukcja imagera została znacznie ułatwiona dzięki zastosowaniu nowego adaptera optomechanicznego, Cricket, który ma następujące elementy: i) dwa adaptery C-mount, które zapewniają łatwe sprzężenie modułu kamery z tyłu i obiektywu z przodu; ii) wewnętrzną obudowę wzmacniacza obrazu oraz gniazdo zasilania dla tego ostatniego po zewnętrznej stronie Cricketa; (iii) przestrzeń wewnętrzna za adapterem C-mount z przodu po stronie strony, w której przed wzmacniaczem można umieścić standardowy filtr emisji spalin 25 mm; oraz iv) wbudowana optyka kolimacyjna światła z regulatorami pierścieniowymi, które umożliwiają optyczne wyrównanie/ustawianie ostrości między obiektywem a aparatem w celu uzyskania wyraźnych obrazów na chipie aparatu.

W zmontowanym imagerze, moduł kamery jest połączony z tylną stroną adaptera Cricket, w którym znajduje się również wzmacniacz obrazu składający się z fotokatody, po której następuje płytka mikrokanałowa (MCP), wzmacniacz i szybki scyntylator, luminofor P47. Wewnątrz Cricketa zamontowany jest filtr emisyjny 760 nm ± 50 nm, a soczewka obiektywu NMV-50M11'' jest przymocowana do adaptera C-mount z przodu. Na koniec obiektyw i aparat są ustawione optycznie z regulatorami pierścieniowymi.

Rolą wzmacniacza jest wykrywanie nadlatujących fotonów i przekształcanie ich w szybkie rozbłyski światła na chipie kamery, które są rejestrowane i wykorzystywane do generowania rozpadów emisji i obrazów z całego życia. Moduł kamery składa się z zaawansowanego układu czujników optycznych opartego na TCSPC (256 pikseli x 256 pikseli) oraz układu odczytu nowej generacji29,30,31,32,33, które umożliwiają jednoczesny zapis czasu przybycia (TOA) i czasu przekroczenia progu (TOT) rozbłysków fotonów na każdym pikselu układu obrazowania z rozdzielczością czasową 1,6 ns i szybkość odczytu 80 Mpixel/s.

W tej konfiguracji kamera ze wzmacniaczem ma czułość na pojedyncze fotony. Jest oparty na danych i systemie szybkiego odczytu detektora pikseli (SPIDR) 34. Rozdzielczość przestrzenna kamery, którą wcześniej charakteryzowano za pomocą planarnych fosforyzujących czujnikówO2 i maski płytki o rozdzielczości. Funkcja odpowiedzi przyrządu (IRF) została zmierzona poprzez obrazowanie płaskiego czujnika fluorescencyjnego przy tych samych ustawieniach, które są używane do wszystkich innych pomiarów. Czas życia barwnika wynoszący około 2,6 ns był na tyle krótki, że można go było wykorzystać do pomiaru IRF w trybie PLIM. Imager może obrazować obiekty o wymiarach do 18 mm x 18 mm z rozdzielczością przestrzenną i czasową odpowiednio 39,4 μm i 30,6 ns (pełna szerokość przy połowie maksimum)28.

Poniższe protokoły opisują montaż makroimagera i jego późniejsze użycie do mapowania stężenia O2 w próbkach biologicznych zabarwionych poprzednio scharakteryzowaną sondą O2 w bliskiej podczerwieni, NanO2-IR35. Sonda jest jasną, fotostabilną, przepuszczalną dla komórek sondą z czujnikiemO2 opartą na barwniku platyny (II) benzoporfiryny (PtBP). Jest pobudliwy przy 625 nm, emituje przy 760 nm i zapewnia solidną odpowiedź optyczną naO2 w zakresie fizjologicznym (0%-21% lub 0-210 μMO2). Zademonstrowano również, że kamera charakteryzuje różne materiały czujników na bazie barwników Pt(II)-porfiryny. Ogólnie rzecz biorąc, imager jest kompaktowy i elastyczny, podobny do zwykłego aparatu fotograficznego. W obecnej konfiguracji imager jest odpowiedni do różnych zastosowań PLIM o szerokim polu. Zastąpienie diody LED szybkim źródłem laserowym jeszcze bardziej poprawi wydajność kamery, a potencjalnie może umożliwić nanosekundowe zastosowania FLIM.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury na zwierzętach zostały przeprowadzone na podstawie zezwoleń wydanych przez Urząd Regulacji Produktów Zdrowotnych (HPRA, Irlandia) zgodnie z Dyrektywą Rady Wspólnot Europejskich (2010/63/UE) i zostały zatwierdzone przez Komitet Etyki Eksperymentów na Zwierzętach University College Cork.

1. Przygotowanie próbki

  1. Barwienie sondą żywych próbek tkanek ex vivo
    1. Do zastosowań ex vivo należy użyć świeżo wyizolowanych próbek tkanek od 4-tygodniowej samicy myszy Balb/c.
    2. W dniu eksperymentu poddaj mysz eutanazji przez dekapitację i szybko wypreparuj fragmenty okrężnicy (jelita grubego) o wielkości około 10 mm. Natychmiast przemyć je buforem PBS, umieścić w pożywce DMEM uzupełnionej 10 mM buforem Hepes (pH 7,2) i inkubować w temperaturze 37 °C36.
    3. W celu barwienia powierzchniowego surowiczej strony jelita, przenieść żywe próbki tkanek do mini-szalki, nałożyć 2 ml kompletnego DMEM zawierającego 1 mg/ml sondy NanO2-IR w celu pokrycia próbek tkanek i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Komórki w tkance pośmiertnej pozostają żywe przez wiele godzin w hodowli. NaNO2-IR wykazuje niewielką cytotoksyczność, dlatego wszystkie eksperymenty zakończono w ciągu 4 godzin po izolacji tkanek.
    4. W celu barwienia głębokich tkanek śródświetlnych ex vivo, przenieś kawałki jelita na suchą szalkę Petriego i usuń nadmiar DMEM za pomocą bibuły filtracyjnej.
    5. Wstrzyknąć 1 μl DMEM zawierającego 1 mg/ml NanO2-IR35 do światła za pomocą strzykawki Hamiltona i inkubować próbki przez 15 minut lub do 4 h.
      UWAGA: NaNO2-IR wykazuje niewielkie długoterminowe działanie cytotoksyczne; Dlatego wszystkie eksperymenty powinny być zakończone w ciągu 4 godzin po izolacji tkanek.
  2. Przygotowanie barwionej tkanki nowotworowej u żywych zwierząt
    1. W przypadku zastosowań in vivo należy wstępnie wybarwić komórki CT26 przez 18 godzin w pożywce bez surowicy zawierającej sondę NaNO2-IR w dawce 0,05 mg/ml.
    2. Wziąć mysz, ogolić obszar wstrzyknięcia w prawym boku i wstrzyknąć strzykawką 200 μl mieszaniny 1 × 105 niebarwionych komórek i 1 × 105 komórek wstępnie wybarwionych NanO2-IR .
    3. Pozwól guzom rosnąć u myszy, okresowo monitorując rozmiar guza za pomocą suwmiarki i wagę zwierzęcia37. Zwierzęta ze przeszczepionymi guzami stają się gotowe do obrazowania w siódmym dniu wzrostu guza.
      UWAGA: Objętość guza obliczono za pomocą równania (1):
      V = (L × W2)/2 (1)
      gdzie L jest średnicą guza, a W is średnicą prostopadłą do średnicy L.
    4. Uśmierc zwierzęta przez zwichnięcie szyjki macicy tuż przed obrazowaniem.

2. Konfiguracja obrazowania PLIM

  1. Weź adapter Cricket i zdejmij jego tylny adapter C-mount, aby uzyskać dostęp do obudowy wzmacniacza wewnątrz. Włóż wzmacniacz obrazu MCP-125 do tej komory i włóż adapter C-mount z powrotem.
  2. Zdejmij adapter C-mount z przodu Cricket, włóż filtr emisji 760 nm ± 50 nm i zamocuj go, wkładając z powrotem C-mount.
  3. Podłącz moduł kamery Tpx3Cam do tylnej części modułu Cricket za pomocą adaptera C-mount
  4. Podłącz obiektyw do przedniej części modułu Cricket za pomocą adaptera C-mount.
  5. Zamontuj cały zespół kamery na górze czarnej skrzynki optycznej, przodem do dołu w stronę stolika, na którym próbki będą obrazowane (Rysunek 1).
  6. Zamontuj super jasną diodę LED o długości fali 624 nm na słupku podłączonym do płytki stykowej wewnątrz czarnej skrzynki.
  7. Podłącz diodę LED do zasilacza i generatora impulsów. Włącz diodę LED i ustaw na niej ostrość, aby zapewnić skuteczne i równomierne wzbudzenie obrazowanych próbek.
  8. Podłącz kamerę do innego generatora impulsów i zsynchronizuj impulsy wysyłane do kamery i klasy LED38.
  9. Za pomocą specjalnego i gniazda na urządzeniu Cricket podłącz wzmacniacz do standardowego zasilacza i ustaw wzmocnienie na 2,7 V.
  10. Korzystając z możliwości ustawiania ostrości obiektywu i adaptera Cricket, ustaw ostrość optykę kamery na stoliku próbki, aby wygenerować wyraźne obrazy próbek o dobrym kontraście i jasności.
  11. W przypadku stosowania w imagerze z barwnikami Pt-porfiryny należy wymienić diodę LED 625 nm na diodę LED 390 nm do wzbudzenia, a filtr 760 nm ± 50 nm na filtr 650 nm ± 50 nm w module Cricket.

3. Akwizycja obrazu

  1. Umieść próbkę przed obiektywem aparatu.
    UWAGA: Użyj regulowanego stolika x-y-z jako uchwytu próbki, aby dostosować pozycję próbki w celu uzyskania dobrej ostrości.
  2. Wyłącz wszystkie światła w pokoju.
  3. Włącz oprogramowanie Sophy, aby dostroić parametry operacyjne, takie jak ogniskowanie i wyrównanie próbki.
    UWAGA: Wraz z kamerą dostarczane jest oprogramowanie Sophy do ustawiania parametrów obrazowania i rejestrowania danych. Upewnij się, że oprogramowanie jest połączone z aparatem, sprawdzając kod aparatu. Do pozyskiwania danych użyliśmy jednak innego programu.
  4. W obszarze Moduły wybierz nieskończoną liczbę klatek i ustaw tryb działania pikseli na przekroczenie progu czasu.
  5. W obszarze Moduły przejdź do pozycji Podgląd i wybierz pozycję Aktywny moduł. Spowoduje to otwarcie okna Medpix/Timpix Frames.
  6. W tym oknie zmień skalę kolorów i obróć obraz do żądanej orientacji.
  7. Włącz wzmacniacz i rozpocznij nagrywanie.
    UWAGA: Użyj ekranu nagrywania oprogramowania Sophy, aby wizualnie potwierdzić wyrównanie i ostrość próbki oraz zoptymalizować parametry wzbudzenia LED do nagrywania.
  8. Zatrzymaj nagrywanie i zamknij oprogramowanie Sophy.
  9. Przejdź do terminala i użyj specjalnie zaprojektowanego oprogramowania, aby pobrać surowe dane w formacie binarnym i przetworzyć je po przetworzeniu (https://github.com/svihra/TimePix3).
    1. W terminalu uruchom następujące polecenia, aby zarejestrować dane:
      Cd Dokument/SPIDR/trunk/Release/
      ls
      ./Tpx3daq - i 1 - b 50 - m - s {Nazwa pliku} - t {czas pozyskiwania}
      UWAGA: Po wpisaniu "ls" sprawdź listę plików w bieżącym katalogu; upewnij się, że Tpx3daq jest widoczny.
    2. Poczekaj, aż wszystkie klatki zostaną nagrane.
    3. Aby przetworzyć dane, uruchom następujące polecenia w terminalu:
      cd Dokumenty/PrzetwarzanieDanych/Timepix3/Timepix3/
      root
      . L dataprocess.cpp++
      .x DRGUI. Z
    4. Poczekaj, aż otworzy się okno RRGui. Zaznacz wszystkie zmienne po lewej stronie, a po prawej Wszystkie dane, Pojedynczy plik i Centroid.
    5. Wybierz plik do przetworzenia i uruchom reduktor danych.
      UWAGA: Wszystkie przetworzone pliki pojawią się w tym samym folderze co plik raw.

4. Analiza danych

  1. Analizuj dane po przetworzeniu za pomocą dedykowanego programu napisanego w języku C, który zapisze dane do pliku obrazu .ics (https://github.com/lmhirvonen/timepix3cam).
  2. Otwórz .ics pliki obrazów za pomocą bezpłatnego oprogramowania do obrazowania w rozdzielczości czasowej (patrz tabela materiałów). Użyj dwóch funkcji wykładniczych, aby dopasować rozpady fosforescencji.
  3. Otwórz pliki obrazów dopasowanych .ics za pomocą dostępnego oprogramowania do analizy obrazu (patrz Spis materiałów).
  4. Korzystając z tabel przeglądowych, generuj obrazy czasu życia fosforescencji i koduj je w skali pseudokolorów (np. kolor niebieski dla krótkich czasów życia i czerwony dla długich okresów istnienia). Użyj funkcji Miara, aby obliczyć średnie wartości czasu życia dla całego obrazu lub określonych obszarów zainteresowania (ROI).
  5. Przelicz wartości żywotności na stężenie tlenu, korzystając z równania uzyskanego z dopasowania kalibracji O2 sondy36.
    UWAGA: W tej pracy użyto równania (2):
    O2 [μM] = −86,16 + 770,35 × e−0,049 × LT (2)

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dla zastosowań obrazowania ex vivo, fragmenty tkanek jelitowych były barwione przez miejscowe zastosowanie sondy NanO2-IR po stronie surowiczej tkanki. W celu głębszego zabarwienia wstrzyknięto 1 μl sondy do światła. W tym drugim przypadku ściana jelita o grubości 0,2-0,25 mm osłaniała sondę przed kamerą. Dwa procesy barwienia są pokazane w Rysunek 2A.

Wynikowe obrazy intensywności i PLIM są przedstawione w Rysunek 2B-G...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Powyższe protokoły zawierają szczegółowy opis montażu nowego imagera i jego działania w trybie mikrosekundowym FLIM/PLIM. Oparta na TCSPC kamera Tpx3Cam nowej generacji, sprzężona za pomocą adaptera optomechanicznego Cricket ze wzmacniaczem obrazu, filtrem emisyjnym i obiektywem makro, tworzy stabilny, kompaktowy i elastyczny moduł optyczny, który jest łatwy w obsłudze. Wykazano, że imager dobrze radzi sobie z szeregiem różnych próbek i zadań analitycznych, które obejmowały charakterystykę materiałów fosforyzujących i ob...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wsparcie finansowe dla tej pracy od Science Foundation Ireland, granty SFI/12/RC/2276_P2, SFI/17/RC-PhD/3484 i 18/SP/3522, oraz Breakthrough Cancer Research (Precision Oncology Ireland) są wdzięczne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
LED 627 nmExpressMożna zastąpić inną diodą LED w zależności od długości fali wzbudzenia czujnika. Używana dioda LED 390 nm do barwników Pt-porfiryna.
Filtr emisyjny 760 ± 50 nmEdmund Optics84-788Można go wymienić na inny filtr w zależności od długości fali emisji czujnika. Używany 650 ± Filtr pasmowoprzepustowy 50 nm do barwników Pt-porfirynowych.
Myszy Balb/cEnvigo, Wielka BrytaniaBalb/c
skrzynkaThorlabsXE25C9/M
Adapter do krykietaOgniwa PhotonisCricket-2
CT26 ATCCCT26. WThttps://www.atcc.org/products/crl-2638
DMEMSigma-AldrichD0697Można również korzystać z innych mediów
Oprogramowanie ImageJImageJDarmowe oprogramowanie do analizy obrazu. Można pobrać z: https://imagej.nih.gov/ij/index.html
Wzmacniacz obrazu MCP-125 z ekranem luminoforowym P47PhotonisPP0360EF
Mini naczyniaSarstedt83.3900.300Średnica 35 mm 
Folia z tworzywa mylarowego, 75 mikronów RS Ireland785-0795Można również stosować inne podłoża z tworzyw sztucznych
NanO2-IRdomowej robotynie dotyczySonda może być syntetyzowana zgodnie z opublikowaną metodą 'Tsytsarev V, Arakawa H, Borisov S, Pumbo E, Erzurumlu RS, Papkovsky DB. Obrazowanie in vivo aktywności metabolizmu mózgu za pomocą fosforyzującej sondy wrażliwej na tlen. J Metody neurosce. 2013 Czerwiec 15; 216(2):146-51. doi: 10.1016/j.jneumeth.2013.04.005. EPUB 2013 Kwiecień 25. PMID: 23624034; PMCID: PMC3719178." lub dostarczone przez nasze laboratorium.
NMV-50M11" 50 mm obiektywNavitarMożna stosować inne obiektywy kompatybilne z adapterami C-mount
Płytka optycznaThorlabsMB1836
Szalki PetriegoSarstedt82.1472.001Średnica 92 mm
ZasilaczTenma72-10495
Generator impulsówTenmaTGP110
SophyAmsterdam Scientific Instrumentsn/zDostarczane przez ASI wraz z Tpx3Cam
Tpx3CamAmsterdam Scientific InstrumentsTPXCAM
Tri2 SoftwareUniversity of Oxfordn/aOprogramowanie Free Time Resolved Imaging można pobrać ze strony: https://users.ox.ac.uk/~atdgroup/index.shtml
XYZ Translation StageThorlabsLT3
Części

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Papkovsky, D. B., Dmitriev, R. I. Imaging of oxygen and hypoxia in cell and tissue samples. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (16), 2963-2980 (2018).
  2. Carreau, A., El Hafny-Rahbi, B., Matejuk, A., Grillon, C., Kieda, C. Why is the partial oxygen pressure of human tissues a crucial parameter? Small molecules and hypoxia. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 15 (6), 1239-1253 (2011).
  3. Yoshihara, T., Hirakawa, Y., Hosaka, M., Nangaku, M., Tobita, S. Oxygen imaging of living cells and tissues using luminescent molecular probes. Journal of Photochemistry and Photobiology C: Photochemistry Reviews. 30, 71-95 (2017).
  4. Papkovsky, B. Phosphorescence based oxygen sensors essential tools for cell biology and life science research. 17th International Meeting on Chemical Sensors - IMCS. , 71-72 (2018).
  5. Tsytsarev, V., et al. In vivo imaging of brain metabolism activity using a phosphorescent oxygen-sensitive probe. Journal of Neuroscience Methods. 216 (2), 146-151 (2013).
  6. O'Donovan, C., Hynes, J., Yashunski, D., Papkovsky, D. B. Phosphorescent oxygen-sensitive materials for biological applications. Journal of Materials Chemistry. 15, 2946-2951 (2005).
  7. Dmitriev, R. I., Papkovsky, D. B. Optical probes and techniques for O 2 measurement in live cells and tissue. Cellular and Molecular Life Sciences. 69 (12), 2025-2039 (2012).
  8. Papkovsky, D. B., Zhdanov, A. V. Phosphorescence based oxygen sensors and probes for biomedical research. Advanced Environmental, Chemical, and Biological Sensing Technologies XIV. 10215, 102150(2017).
  9. Rumsey, W. L., Vanderkooi, J. M., Wilson, D. F. Imaging of phosphorescence: A novel method for measuring oxygen distribution in perfused tissue. Science. 241 (4873), 1649-1651 (1988).
  10. Hogan, M. C. Phosphorescence quenching method for measurement of intracellular PO 2 in isolated skeletal muscle fibers. Journal of Applied Physiology. 86 (2), 720-724 (1999).
  11. Apreleva, S. V., Wilson, D. F., Vinogradov, S. A. Tomographic imaging of oxygen by phosphorescence lifetime. Applied Optics. 45 (33), 8547-8559 (2006).
  12. Becker, W., Shcheslavskiy, V., Rück, A. Simultaneous phosphorescence and fluorescence lifetime imaging by multi-dimensional TCSPC and multi-pulse excitation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1035, 19-30 (2017).
  13. Wolfbeis, O. S. Luminescent sensing and imaging of oxygen: Fierce competition to the Clark electrode. BioEssays. 37 (8), 921-928 (2015).
  14. Dmitriev, R. I., Zhdanov, A. V., Nolan, Y. M., Papkovsky, D. B. Imaging of neurosphere oxygenation with phosphorescent probes. Biomaterials. 34 (37), 9307-9317 (2013).
  15. Shcheslavskiy, V. I., Neubauer, A., Bukowiecki, R., Dinter, F., Becker, W. Combined fluorescence and phosphorescence lifetime imaging. Applied Physics Letters. 108, 091111(2016).
  16. Babilas, P., et al. In vivo phosphorescence imaging of pO2 using planar oxygen sensors. Microcirculation. 12 (6), 477-487 (2005).
  17. Babilas, P., et al. Transcutaneous pO2 imaging during tourniquet-induced forearm ischemia using planar optical oxygen sensors. Skin Research and Technology. 14 (3), 304-311 (2008).
  18. Golub, A. S., Pittman, R. N. PO2 measurements in the microcirculation using phosphorescence quenching microscopy at high magnification. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 294 (6), 2905-2916 (2008).
  19. Zhdanov, A. V., Golubeva, A. V., Okkelman, I. A., Cryan, J. F., Papkovsky, D. B. Imaging of oxygen gradients in giant umbrella cells: An ex vivo PLIM study. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 309 (7), 501-509 (2015).
  20. Becker, W. Fluorescence lifetime imaging - Techniques and applications. Journal of Microscopy. 247 (2), 119-136 (2012).
  21. Jenkins, J., Dmitriev, R. I., Papkovsky, D. B. Imaging cell and tissue O 2 by TCSPC-PLIM. Advanced Time-Correlated Single Photon Counting Applications. Becker, W. , Springer. Cham, Switzerland. 225-247 (2015).
  22. Becker, W. Advanced TCSPC-FLIM techniques. Multiphoton Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging: Applications in Biology and Medicine. König, K. , De Gruyter. Berlin, Germany. 23-52 (2018).
  23. Wei, L., Yan, W., Ho, D. Recent advances in fluorescence lifetime analytical microsystems: Contact optics and CMOS time-resolved electronics. Sensors. 17 (12), 2800(2017).
  24. Hirvonen, L. M., Suhling, K. Wide-field TCSPC: Methods and applications. Measurement Science and Technology. 28, 012003(2017).
  25. Hirvonen, L. M., Festy, F., Suhling, K. Wide-field time-correlated single-photon counting (TCSPC) lifetime microscopy with microsecond time resolution. Optics Letters. 39 (19), 5602(2014).
  26. Sparks, H., et al. Characterisation of new gated optical image intensifiers for fluorescence lifetime imaging. Review of Scientific Instruments. 88 (1), 013707(2017).
  27. Chelushkin, P. S., Tunik, S. P. Progress in Photon Science: Emerging New Directions. 115, Springer. Cham, Switzerland. (2017).
  28. Sen, R., et al. A new macro-imager based on Tpx3Cam optical camera for PLIM applications. Proceedings of SPIE. , 113591(2020).
  29. Fisher-Levine, M., Nomerotski, A. TimepixCam: A fast optical imager with time-stamping. Journal of Instrumentation. 11, (2016).
  30. Nomerotski, A. Imaging and time stamping of photons with nanosecond resolution in Timepix based optical cameras. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research, Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 937. 937, 26-30 (2019).
  31. Poikela, T., et al. Timepix3: A 65K channel hybrid pixel readout chip with simultaneous ToA/ToT and sparse readout. Journal of Instrumentation. 9, 05013(2014).
  32. Nomerotski, A., et al. Characterization of TimepixCam, a fast imager for the time-stamping of optical photons. Journal of Instrumentation. 12, 01017(2017).
  33. Hirvonen, L. M., Fisher-Levine, M., Suhling, K., Nomerotski, A. Photon counting phosphorescence lifetime imaging with TimepixCam. Review of Scientific Instruments. 88, 013104(2017).
  34. Visser, J., et al. SPIDR: A read-out system for Medipix3 & Timepix3. Journal of Instrumentation. 10, 12028(2015).
  35. Tsytsarev, V., et al. In vivo imaging of brain metabolism activity using a phosphorescent oxygen-sensitive probe. Journal of Neuroscience Methods. 216 (2), 146-151 (2013).
  36. Sen, R., et al. Mapping O2 concentration in ex-vivo tissue samples on a fast PLIM macro-imager. Scientific Reports. 10, 19006(2020).
  37. Kersemans, V., Cornelissen, B., Allen, P. D., Beech, J. S., Smart, S. C. Subcutaneous tumor volume measurement in the awake, manually restrained mouse using MRI. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 37 (6), 1499-1504 (2013).
  38. Sen, R., et al. New luminescence lifetime macro-imager based on a Tpx3Cam optical camera. Biomedical Optics Express. 11 (1), 77-88 (2020).
  39. Papkovsky, D. B., et al. Phosphorescent polymer films for optical oxygen sensors. Biosensors and Bioelectronics. 7 (3), 199-206 (1992).
  40. Sen, R., et al. Characterization of planar phosphorescence based oxygen sensors on a TCSPC-PLIM macro-imager. Sensors and Actuators, B: Chemical. 321, 128459(2020).
  41. Lakowicz, J. R., Szmacinski, H., Nowaczyk, K., Berndt, K. W., Johnson, M. Fluorescence lifetime imaging. Analytical Biochemistry. 202 (2), 316-330 (1992).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Obrazowanie czasu ycia fluorescencjiobrazowanie czasu ycia fosforescencjimapowanie tlenukamera Timepix3tryb TCSPCobrazowanie tkanek zwierz cychnanocz steczkowa sonda tlenowawzmacniacz obrazuobrazowanie hipoksjibarwnik na bazie porfiryny platyny

Powiązane artykuły