Artykuł metodologiczny

Nadwrażliwość kontaktowa jako mysi model alergicznego kontaktowego zapalenia skóry

3.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64329

⸱

26 września 2022

 ,  ,  , 
1Department of Clinical Immunology, Wroclaw Medical University, 2Department of Medical Physiology, Chair of Biomedical Sciences, Institute of Physiotherapy, Faculty of Health Sciences, Jagiellonian University Medical College, 3Chair of Biomedical Sciences, Faculty of Health Sciences, Jagiellonian University Medical College

W tym artykule

Informacja o sprostowaniu

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Podsumowanie

Nadwrażliwość kontaktowa (CHS) to mysi eksperymentalny model alergicznego kontaktowego zapalenia skóry (ACD). CHS opiera się na uczuleniu na reaktywny hapten poprzez malowanie ogolonej skóry klatki piersiowej i brzucha, a następnie prowokację skóry ucha rozcieńczonym haptenem, powodując reakcję obrzęku, która jest oceniana na różne sposoby.

Streszczenie

Nadwrażliwość kontaktowa (CHS) to eksperymentalny model alergicznego kontaktowego zapalenia skóry (ACD), który można badać na myszach. Badanie to ma na celu przedstawienie obiektywnej metody laboratoryjnej, która może pomóc w badaniu reakcji CHS u myszy, którą można zmierzyć i określić ilościowo za pomocą różnych testów. Aby wywołać CHS, w dniu "0" myszy uczulono na wcześniej ogolone miejsce poprzez malowanie skóry brzucha haptenem 2,4,6-trinitrochlorobenzenem (TNCB) w mieszaninie acetonu i etanolu, podczas gdy myszy z kontrolą ujemną uczulono pozorowanym roztworem samego nośnika-acetonu-etanolu. W dniu "4" wyjściową grubość ucha mierzono mikrometrem przed wywołaniem CHS (prowokacji) poprzez malowanie obu uszu rozcieńczonym TNCB zarówno w grupie testowej, jak i kontrolnej. Po 24 godzinach opuchliznę ucha mierzono mikrometrem. CHS jest przykładem odpowiedzi immunologicznej za pośrednictwem limfocytów T, która powoduje obrzęk tkanki objętej stanem zapalnym, osiągając szczyt 24 godziny po prowokacji skórnej tym samym haptenem. Wzrost obrzęku ucha korelował ze zwiększoną masą ucha, aktywnością mieloperoksydazy (MPO), stężeniem cytokin prozapalnych w ekstraktach z uszu, zwiększonym pogrubieniem obrzękowej skóry właściwej w badaniu histologicznym i przepuszczalnością naczyń usznych. Stwierdzono również wzrost stężenia przeciwciał IgG1 specyficznych dla TNP w surowicach grupy testowej w porównaniu z myszami kontrolnymi. Dodatkowo CHS może być z powodzeniem przenoszony za pomocą komórek efektorowych CHS uzyskanych od dawców uprzednio uczulonych TNCB. Komórki efektorowe CHS podawano dożylnie naiwnym myszom-biorcom, które następnie prowokowano tym samym rozcieńczonym haptenem. Obrzęk ucha zmierzono mikrometrem 24 godziny później.

Wprowadzenie

Alergiczne kontaktowe zapalenie skóry (ACD) jest powszechną chorobą zapalną skóry w krajach uprzemysłowionych, spowodowaną reakcją nadwrażliwości typu IV, wynikającą z ekspozycji na chemikalia o niskiej masie cząsteczkowej zwane haptenami. Substancje powodujące uczulenie kontaktowe u ludzi obejmują jony metali ciężkich (chrom, nikiel, żelazo, kobalt), terpentynę, substancje zapachowe, barwniki i konserwanty obecne w kosmetykach (np. p-fenylenodiamina), niektóre leki (np. neomycyna, benzokaina), antybiotyki β-laktamowe (np. penicylina), chemikalia wytwarzane przez rośliny (pentadekacatechol, substancja obecna w trującym bluszczu), a także hydrochinon stosowany w przemyśle fotograficznym1,2. Czynniki etiologiczne ACD są bardzo wysokie, ponieważ w samym przemyśle stosuje się ponad 100 000 substancji chemicznych, a każdego roku syntetyzuje się 2 000 nowych. Do tej pory zidentyfikowano ponad 3700 cząsteczek, które mogą być haptenami/alergenami kontaktowymi3. Reakcja nadwrażliwości kontaktowej (CHS) jest eksperymentalnym modelem ACD, który może być badany na myszach, świnkach morskich i szczurach i może być wywołany przez miejscowe stosowanie na skórę reaktywnych haptenów chemicznych rozpuszczonych w rozpuszczalnikach organicznych4,5,6. Badanie to ma na celu opisanie obiektywnej metody laboratoryjnej, która może pomóc w badaniu reakcji CHS u myszy, którą można zmierzyć i określić ilościowo za pomocą różnych testów.

CHS składa się z faz uwrażliwiania (indukcji) i efektora (wyzwania). W modelach zwierzęcych hapteny najpierw wiążą się kowalencyjnie z białkami w organizmie, tworząc neoantygeny. W fazie uczulenia aktywowane keratynocyty sprzyjają migracji i dojrzewaniu komórek dendrytycznych skóry (sDC) poprzez wytwarzanie cytokin prozapalnych-czynnika martwicy nowotworu α (TNF-α) i interleukiny 1β (IL-1β)7. Naskórkowe komórki Langerhansa (LC) prezentują antygeny podczas fazy indukcji CHS i efektora8. LC wystawione na działanie haptenów podczas uczulenia sprzyjają indukcji zarówno komórek regulatorowych, jak i efektorowych9. Coraz więcej dowodów z kilku badań sugeruje, że w odpowiedziach CHS mogą pośredniczyć komórki Th1 CD4 + MHC klasy II, lokalnie uwalniające interferon-γ (IFN-γ) w celu wykorzystania charakterystycznego nacieku zapalnego, limfocyty Tc1 CD8 + MHC klasy I, które mogą również uwalniać IFN-γ, ale głównie pośredniczą w cytotoksycznym uszkodzeniu keratynocytów, a teraz także komórki Th17 wytwarzające interleukinę 17 (IL-17)10, 11.

Kilka różnych modeli CHS wykorzystujących różne gatunki12,13,14 i hapteny zostały opracowane (szczegółowe porównanie różnych haptenów, rozpuszczalników i czasu aplikacji podsumowano w Tabeli 1). Mysz, często używany gatunek laboratoryjny, ma kilka zalet w badaniu CHS. Wśród myszy występuje więcej szczepów, nokautów (KO) i zwierząt transgenicznych w porównaniu z innymi gatunkami, co czyni je bardzo atrakcyjnym animalem15. Ponadto model CHS wymaga wielu zwierząt, a myszy są tutaj bardziej ekonomiczne. Modele zwierzęce nie naśladują ACD we wszystkich aspektach; W szczególności wykazują strupy i złuszczanie, co nie jest powszechne u ludzi16,17. Cechy choroby przewlekłej są trudne do odtworzenia, głównie dlatego, że opisany model nie zakłada stosowania haptenu przez długi okres czasu. Jednak tutaj potwierdzono, że wiele istotnych aspektów ACD jest reprodukowanych. Wykazano również, że podobnie jak u ludzi, cechy te są związane z miejscowymi reakcjami alergicznymi. Wybór haptenu, jego rozpuszczalnika i jego zastosowania przedstawione w tym protokole były podyktowane faktem, że wyniki zostały potwierdzone licznymi testami in vitro oraz że był on testowany i modyfikowany w laboratorium przez wiele lat, aż do ustalenia obecnej wersji. Modele mysie pozwalają na analizę podzbiorów komórek lub cytokin, które są zaangażowane w rozwój ACD i są niezbędne do przedklinicznej oceny nowych metod leczenia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty przedstawione w tym artykule zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi I Lokalnej Komisji Etycznej ds. Badań na Zwierzętach w Krakowie. Wszystkie opisane zabiegi zostały wykonane zgodnie z lokalnymi zaleceniami, w szczególności dotyczącymi stosowania ketaminy/ksylazyny jako środka znieczulającego, stosowania substancji po obu stronach uszu, odcinania ucha oraz pobierania krwi poprzez usunięcie gałki ocznej. W niniejszym badaniu wykorzystano BALB/c (haplotyp H-2d), CBA/J (H-2k) i C57BL/6 (H-2b) samce i samice myszy w wieku 6-12 tygodni (patrz tabela materiałów). Dla istotności statystycznej najlepiej, jeśli każda grupa myszy składa się z 10-12 zwierząt.

1. Przygotowanie zwierząt

  1. Wyczyść stół operacyjny 70% roztworem etanolu przed i po wszystkich zabiegach. Jeśli używasz myszy, które wymagają sterylnych warunków, wykonuj wszystkie operacje w komorze bezpieczeństwa biologicznego.

2. Oznaczanie myszy do identyfikacji

  1. Oznacz myszy, goląc skórę żyletką: #0 - nieoznaczone, #2 - na prawej przedniej łapie, #3 - po prawej stronie, #4 - po prawej tylnej łapie, #5 - u nasady ogona, #6 - po lewej tylnej łapie, #7 - po lewej stronie, #8 - po lewej przedniej łapie.
    UWAGA: Ze względu na wywołaną reakcję, myszy nie mogą być klasycznie znakowane przez uderzanie w uszy lub znakowanie. Myszy nie były znieczulone podczas znakowania.

3. Indukcja CHS

UWAGA: Ta procedura jest opisana w Rysunek 1.

  1. Wykonaj uczulenie (indukcję), wykonując poniższe czynności.
    1. W dniu "0" należy ogolić myszy na klatce piersiowej i brzuchu (kwadrat 2 cm x 2 cm), nakładając szare mydło z wodą i goląc żyletką.
      UWAGA: Przed nałożeniem haptenu należy odczekać 6 godzin, aby skóra nie uległa podrażnieniu.
    2. Przygotować 5% hapten: 2,4,6-trinitrochlorobenzen (TNCB, patrz tabela materiałów) w mieszaninie aceton-etanol (stosunek 1:3) lub sam nośnik (aceton-etanol). Roztwory należy przygotować tuż przed użyciem w szklanej fiolce i chronić ją przed światłem, przykrywając fiolkę folią aluminiową.
    3. Tego samego dnia należy uczulić myszy, nakładając 150 μl 5% haptenu na wcześniej ogolone miejsce. W grupie myszy kontrolnych należy zastosować sam nośnik w celu oceny nieswoistej reakcji zapalnej. Przed ponownym umieszczeniem zwierzęcia w klatce odczekaj 30 sekund, pozwalając haptenowi wyschnąć.
      UWAGA: Używaj rękawiczek; TNCB powoduje ciężką reakcję alergiczną u większości ludzi.
  2. Wykonaj pomiar wywołania (prowokacji) i obrzęku ucha.
    1. W dniu "4" przygotować 0,4% hapten: TNCB w mieszaninie acetonu i oliwy z oliwek (stosunek 1:1). Roztwór należy przygotować tuż przed użyciem w szklanej fiolce i chronić przed światłem, przykrywając fiolkę folią aluminiową.
    2. Znieczulić myszy za pomocą dootrzewnowego (i.p.) wstrzyknięcia mieszaniny ketaminy (90-120 mg / kg) i ksylazyny (5-10 mg / kg) (patrz tabela materiałów) w celu głębokiego znieczulenia. Upewnij się, że mysz jest w pełni znieczulona przez co najmniej 5 minut przez uszczypnięcie palca.
    3. Zmierzyć grubość ucha (pomiar 0 h, linia podstawowa) za pomocą mikrometru (patrz Tabela Materiałów) przez obserwatora nieświadomego grup eksperymentalnych.
    4. Nałóż 10 μl 0,4% haptenu po obu stronach uszu w obu grupach (testowej i kontrolnej). Przed ponownym umieszczeniem zwierzęcia w klatce odczekaj 30 s i pozwól haptenowi wyschnąć.
    5. W dniu "5", 24 godziny po zastosowaniu haptenu, powtórzyć kroki 3.2.2-3.2.3 dla pomiaru trwającego 24 godziny.
    6. Oceń odpowiedź CHS, obliczając różnicę w grubości małżowiny usznej przed i po prowokacji za pomocą haptenu: 24 h grubości ucha (μm) - 0 h grubości ucha (μm). Policz każde ucho jako osobny pomiar. Następnie wyraź obrzęk ucha w mikrometrach (μm) ± błąd standardowy średniej (SEM) (Tabela 2, Rysunek 3).

4. Biopsje ucha

  1. Bezpośrednio po 24 godzinnym pomiarze grubości ucha (gdy mysz jest jeszcze w głębokim znieczuleniu) odetnij uszy jak najbliżej czaszki nożyczkami. Pobrać biopsje z dystalnej strony uszu, wykonując stempel o średnicy 6 mm za pomocą stempla do biopsji (patrz Tabela materiałów).
    1. Zmierz masę ucha (krok 4.2) i dodatkowo wykonaj jeden z następujących testów na tej samej biopsji ucha: test mieloperoksydazy (MPO) (krok 4.3) lub pomiar in vitro stężenia cytokin w ekstraktach z uszu (np. IFN-γ, IL-17A, TNF-α [krok 4.4]).
      UWAGA: Obetnij uszy przed pobraniem krwi. Po tej procedurze myszy muszą zostać poddane eutanazji (np. przez zwichnięcie szyjki macicy).
  2. Zmierz masę każdej biopsji ucha na wadze analitycznej i wyraź ją w miligramach (mg) (Rysunek 4).
  3. Wykonaj test MPO, wykonując poniższe czynności.
    1. Przygotować bufor homogenizacyjny, rozpuszczając 0,5% bromku heksadecylottrimetyloamoniowego w 50 mmol buforze fosforanowym KH2PO4/Na2HPO4 i dostosowując pH do 6,0 (stosować w temperaturze pokojowej, RT).
    2. Homogenizować biopsje w probówkach do mikrowirówek o pojemności 2 ml z 500 μl przygotowanego buforu przez 10 minut przy użyciu homogenizatora z kulkami ze stali nierdzewnej o średnicy 5 mm (dodać dwa kulki na fiolkę) (patrz tabela materiałów). Następnie schłodzić próbkę przez 15 minut w temperaturze 4 °C i homogenizować ją przez dodatkowe 10 minut.
      UWAGA: Probówki do mikrowirówek mają okrągłe dno, dzięki czemu kulki mogą się łatwo poruszać.
    3. Zamrozić homogenaty w temperaturze -20 °C przez 30 minut. Rozmrozić i odwirować (upewnić się, że próbki są rozmrożone). Powtórz tę procedurę 3 razy.
    4. Odwirować homogenaty w temperaturze 3 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Zebrać supernatanty za pomocą pipety. Wyraż aktywność MPO w jednostkach (U) na 1 mg białka.
      UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać. Próbki są stabilne w temperaturze -20 °C przez 3 miesiące.
    5. Aby zmierzyć aktywność MPO, należy przeprowadzić reakcję enzymatyczną, mieszając 20 μl supernatantu i 200 μl substratu MPO (0,167 mg/ml dichlorowodorku orto-dianizyny w 50 mmol buforu KH2PO4/Na2HPO4 z 5 x 10−4% H202) i dodać do 96-dołkowych płytek płaskodennych. Inkubować płytki przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
    6. Przygotować krzywą wzorcową, używając 20 μl wzorca MPO w stężeniach od 0,008 U do 0,5 U w 200 μL substratu MPO. Przygotować ślepą próbkę z samym podłożem MPO.
      UWAGA: Używaj maski podczas pracy z dichlorowodorkiem ortodianizyny.
      UWAGA: Płytki muszą być wykonane z polipropylenu, który ma mniejszą zdolność wiązania, więc białka lub DNA nie będą się wiązać.
    7. Zmierzyć gęstość optyczną (OD) przy długości fali λ = 460 nm. Reakcja enzymatyczna jest stabilna przez 10 minut. Odczytaj aktywność MPO w badanych próbkach z krzywej wzorcowej.
    8. Aby zmierzyć stężenie białka, należy użyć 20 μl supernatantu, przeprowadzić test z użyciem zestawu kwasu bicynchoninowego do oznaczania białka (patrz tabela materiałów) i zmierzyć OD przy λ = 562 nm (Rysunek 5).
  4. Wykonaj pomiar in vitro cytokin w ekstrakcie z ucha.
    1. Homogenizować biopsje ucha w temperaturze pokojowej w probówkach mikrowirówkowych o pojemności 2 ml z 500 μl odczynnika do ekstrakcji białek tkankowych (T-PER) przez 10 minut przy użyciu homogenizatora z kulkami ze stali nierdzewnej o średnicy 5 mm (dodać dwa koraliki/fiolkę). Następnie schłodzić próbkę przez 15 minut w temperaturze 4 °C i homogenizować ją przez dodatkowe 10 minut.
      UWAGA: Probówki do mikrowirówek mają okrągłe dno, dzięki czemu kulki mogą się łatwo poruszać.
    2. Odwirować homogenaty w temperaturze 3 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać. Próbki są stabilne w temperaturze -80 °C przez 6 miesięcy.
    3. Oceń poziomy cytokin za pomocą dostępnego na rynku zestawu ELISA (np. IFN-γ) (patrz tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta (Rysunek 6).

5. Histologia tkanki ucha

  1. Bezpośrednio po 24-godzinnym pomiarze grubości ucha, gdy mysz jest jeszcze głęboko znieczulona, odetnij uszy jak najbliżej czaszki nożyczkami (krok 4.1).
    UWAGA: Po tej procedurze myszy muszą zostać poddane eutanazji (np. przez zwichnięcie szyjki macicy).
  2. Wykonaj zatapianie parafiny w blokach tkanki, wykonując poniższe czynności.
    1. Bezpośrednio po wyjęciu umieść ucho w ~10 ml 10% formaliny na 24 godziny.
    2. Umieść uszy w kasecie do przetwarzania tkanek. Umieścić kasety w automatycznym procesorze (patrz tabela materiałów) dla cykli odwadniania (alkohol 70%, 90%, 100%, 30 minut każdy w temperaturze pokojowej), cykli oczyszczania (ksylen 3x, 30 minut każdy w temperaturze pokojowej) i cykli infiltracji wosku (parafina 3x, każdy po 30 minut w temperaturze 56 °C).
    3. Wyjmij kasety z automatycznego procesora i przytrzymaj płytę grzewczą, aż będzie to potrzebne. Napełnij foremkę do wosku ciepłym woskiem (z dozownika).
    4. Wyjmij sekcje z kasety za pomocą rozgrzanych kleszczyków i umieść je w formie; następnie umieść podstawę kasety na wierzchu formy, a następnie wypełnij większą ilością wosku. Umieść go w schłodzonej wodzie na zimnej płycie na 30 minut, aby parafina zastygła, tworząc blok zawierający próbkę.
    5. Użyj mikrotomu obrotowego (patrz Tabela materiałów), aby wyciąć odcinki o grubości ~5 μm. Zanurz sekcje w ciepłej kąpieli, aby je spłaszczyć. Podnieś skrawki na szklane szkiełko mikroskopowe. Pozostaw je do wyschnięcia w temperaturze RT, aby upewnić się, że sekcje przylegają do szkiełka.
      UWAGA: Używaj szkiełek, które eliminują potrzebę nakładania materiałów adhezyjnych lub powłok białkowych, aby zapobiec utracie skrawków tkanki podczas barwienia.
  3. Wykonaj barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E).
    1. Przygotuj 17 naczyń barwiących z następującymi elementami: ksylen (cztery naczynia), 100% etanol (alkohol absolutny) (cztery naczynia), 90% etanol, 80% etanol, 70% etanol, 50% etanol, PBS (trzy szalki), roztwór hematoksyliny, roztwór eozyny. Przenieś szkiełka z jednego naczynia do drugiego zgodnie z poniższymi krokami i wykonaj wszystkie w RT.
      UWAGA: Procedurę w każdym naczyniu można powtórzyć około 10x (np. jeśli używane jest naczynie na 20 szkiełek, można uzyskać 200 plam bez zmiany płynów).
    2. Odparafinować skrawki przez inkubację w temperaturze 65 °C przez 30 minut w inkubatorze. Zanurz szkiełka w ksylenie na 30 minut. Powtarzać 1x w nowym ksylenie przez 30 min.
    3. Zanurz szkiełka w 100% etanolu na 5 minut. Powtórz 1x w nowym 100% etanolu przez 5 minut. Zanurz szkiełka w rzędzie etanolu, 90%, 80%, 70% i 50%, na 2 minuty w każdym rozcieńczeniu.
    4. Zanurz szkiełka w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) na 5 minut. Zetrzyj nadmiar płynu z okolic tkanki i tylnej strony szkiełek.
    5. Skrawki barwić w roztworze hematoksyliny (patrz Tabela Materiałów) przez 7-8 min. Myć pod bieżącą wodą przez 30 s od odwrotnej strony, aby nie uszkodzić sekcji. Powtórz krok 5.3.4.
    6. Zabarwić skrawki roztworem eozyny (patrz tabela materiałów) przez 30 s. Umyć zgodnie z opisem w kroku 5.3.5, a następnie powtórzyć krok 5.3.4.
    7. Zanurz szkiełka w 100% etanolu (alkoholu bezwzględnym) na 2 min. Powtórz 1x w nowym 100% etanolu przez 2 min.
    8. Zanurz szkiełka w ksylenie na 5 min. Powtórz 1x w nowym ksylenie przez 5 min.
    9. Pozostaw sekcje do wyschnięcia na powietrzu przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Dodaj kroplę podłoża montażowego (patrz Tabela materiałów) na szkiełko nakrywkowe, a następnie umieść je w górnej części sekcji.
  4. Zbadaj przekrój pod mikroskopem świetlnym pod powiększeniem 20x lub 40x i uchwyć obrazy (Rysunek 7).

6. Test przepuszczalności naczyń krwionośnych

UWAGA: Alternatywnie do pomiaru grubości ucha, można przeprowadzić test przepuszczalności naczyń krwionośnych.

  1. Uczulić myszy w dniu "0" (kroki 3.1.1-3.1.3), a następnie w dniu "4" znieczulić myszy (krok 3.2.2) i bezpośrednio nałożyć hapten na uszy (krok 3.2.4), pomijając pomiar ucha 0 h.
  2. Po 23 godzinach od prowokacji znieczulij myszy (krok 3.2.2).
  3. Wstrzyknąć dożylnie (dożylnie) 8,3 μl/g masy ciała 1% niebieskiego barwnika Evansa (patrz tabela materiałów) w buforowanym fosforanem soli fizjologicznej (DPBS) firmy Dulbecco.
  4. Znieczulenie myszy ponownie w głębokim znieczuleniu (krok 3.2.2)-1 godzinę po wstrzyknięciu niebieskiego Evansa.
  5. Pobrać biopsję ucha (krok 4.1).
    UWAGA: Po tej procedurze myszy muszą zostać poddane eutanazji (np. przez zwichnięcie szyjki macicy).
  6. Usunąć barwnik z tkanki, umieścić stemple w probówkach zawierających 1 ml formamidu i inkubować w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 przez 18 godzin.
  7. Odwirować biopsje przy 3 000 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. Zebrać supernatanty za pomocą pipety.
  8. Zmierzyć średnicę zewnętrzną przy długości fali λ = 565 nm w 96-dołkowych płytkach płaskodennych w stosunku do ślepej próby zawierającej formamid. Kolor jest stabilny przez 24 godziny. Odczytaj stężenie badanych próbek z krzywej wzorcowej (użyj stężeń błękitu Evansa w zakresie od 0,2 do 30 μg barwnika/ml formamidu) (Rysunek 8).
    UWAGA: Płytki muszą być wykonane z polipropylenu, który ma mniejszą zdolność wiązania, więc białka lub DNA nie będą się wiązać.

7. Pobieranie surowicy i pomiar przeciwciał przeciwko immunoglobulinie anty-TNP (IgG1)

  1. Po pobraniu biopsji ucha (krok 4.1), gdy mysz jest jeszcze w głębokim znieczuleniu, wyjmij gałkę oczną pęsetą, delikatnie dociśnij mysz i zbierz krew z zatoki zadoczodołowej do rurki (fiolka z żelem do uzyskania surowicy, patrz Tabela materiałów). Alternatywną metodą pobierania krwi może być przebicie serca strzykawką i pobranie krwi.
    UWAGA: Krew należy pobrać po usunięciu uszu. Ta sama metoda krwawienia musi być stosowana w całym badaniu ze względu na potencjalne różnice w parametrach krwi18. Po tej procedurze myszy muszą zostać poddane eutanazji (np. przez zwichnięcie szyjki macicy).
  2. Odwrócić co najmniej 6x, odczekać 30 minut, aż krew się skrzepnie, a następnie odwirować przy 1,300-2,000 x g przez 10 minut w temperaturze RT.
    UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać. Próbka jest stabilna w temperaturze -20 °C przez 6 miesięcy.
  3. Pokryć 96-dołkową płytkę z płaskim dnem 50 μl albuminy surowicy bydlęcej sprzężonej z 2,4,6-trinitrofenylem (TNP-BSA) rozpuszczonej w DPBS przy uzgodnieniu 10 μg/ml. Następnie pokryć drugą płytkę albuminą surowicy bydlęcej (BSA) rozpuszczoną w DPBS (tło) w stężeniu 10 μg/ml. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Surowica myszy zawiera przeciwciała (Abs) przeciwko BSA, dlatego próbki należy przetestować na obu płytkach, a następnie wykonać obliczenia (OD TNP-BSA - OD BSA).
  4. Umyj płytki 300 μl DPBS zawierającego 0,05% Tween 20. Powtórz 3 razy.
  5. Przygotować rozcieńczalnik do oznaczania (AD): DPBS zawierający 1% BSA. Zablokuj studzienki AD na 1 godzinę w RT. Umyj ponownie (krok 7.4).
  6. Przygotuj wzorzec wewnętrzny (iSTD): uczulić myszy za pomocą TNCB (kroki 3.1.1-3.1.3), a 10 dni po uczuleniu zebrać i odpytywać surowicę od wszystkich dawców (kroki 7.1 i 7.2).
  7. Dodać do płytki 50 μl stopniowanych stężeń iSTD rozcieńczonych AD w celu wytworzenia krzywej wzorcowej (opisanej w tabeli 3). Dodać do płytki 50 μl próbek surowicy. Przetestuj każdą próbkę i krzywą wzorcową na obu płytkach (pokrytych TNP-BSA i BSA). Inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Umyć płytki (krok 7.4).
  8. Dodać 50 μl biotynylowanego przeciwciała monoklonalnego anty-mysiego IgG1 (mAb, patrz tabela materiałów) rozcieńczonego w stosunku 1:250 AD i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Umyć ponownie (krok 7.4).
  9. Dodać 50 μl streptawidyny z peroksydazy chrzanowej (streptawidyny HRD, patrz tabela materiałów) rozcieńczonej w stosunku 1:2000 z AD i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Umyj płytkę (krok 7.4).
  10. Dodać 50 μl substratu TMB (patrz tabela materiałów) i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
  11. Zatrzymać reakcję enzymatyczną, dodając 25 μl 1 M H2SO4; reakcja jest stabilna przez 30 minut.
  12. Zmierzyć średnicę zewnętrzną przy długości fali λ = 450 nm i tle o długości fali 570 nm (tło należy odjąć od każdego pomiaru 450 nm). Przedstawiając wyniki, odejmij pomiary BSA od TNP-BSA dla próbek i krzywej wzorcowej. Następnie oblicz jednostkę (U) przeciwciał zgodnie z krzywą standardową (Rysunek 9).

8. Adoptywne przeniesienie komórek efektorowych CHS

UWAGA: Ta procedura jest przedstawiona w Rysunek 2.

  1. Dawcy (w stosunku jeden dawca:1 biorca): uczulić myszy na TNCB w dniu "0" (kroki 3.1.1-3.1.3).
  2. W dniu "4" znieczulenie myszy (krok 3.2.2).
  3. Po zdezynfekowaniu skóry należy odizolować pachowe i pachwinowe węzły chłonne (ALN) oraz śledzionę (SPL) za pomocą kleszczy. Zbierz ALN w jednej fiolce, a SPL w innej.
    UWAGA: Za mięśniem piersiowym w każdej pachy znajduje się jeden pachowy węzeł chłonny. Jeden pachwinowy węzeł chłonny w okolicy biodra znajduje się obok trzech naczyń krwionośnych. Śledziona znajduje się po lewej stronie ciała, za jelitem i żołądkiem19. Upewnij się, że obszar operacyjny jest zdezynfekowany, w tym skóra i włosy. Pracuj ze sterylnymi narzędziami, w tym sterylnymi rękawicami, w komorze bezpieczeństwa biologicznego, aby utrzymać sterylne warunki. Po tej procedurze myszy muszą zostać poddane eutanazji (np. przez zwichnięcie szyjki macicy).
  4. Rozgnieć tkankę między oszronionymi końcami dwóch szkiełek mikroskopowych. Przepuścić zawiesinę komórek przez sitko o wielkości porów 70 μm (patrz tabela materiałów).
  5. Umyj komórki DPBS uzupełnionym 1% płodową surowicą bydlęcą (FBS). Wirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Zdekantować supernatant i ponownie zawiesić pozostały osad komórkowy w 1-5,0 ml DPBS.
  6. Policz żywe komórki za pomocą hemocytometru20 z błękitem trypanowym i zmieszaj 10 μl zawiesiny komórek z 90-990 μl (w zależności od liczby komórek) błękitu trypanowego. Weź pod uwagę rozcieńczenie przy obliczaniu liczby komórek (10x-100x).
  7. Przygotować mieszaninę ALNs i SPL (stosunek 1:1): 8,0 x 106 do 7,0 x 107/mysz w 200 μl DPBS.
  8. Biorcy (nieleczone myszy syngeniczne): znieczulić naiwne myszy biorców (krok 3.2.2) i wstrzyknąć dożylnie przygotowaną mieszaninę komórek efektorowych CHS (krok 8.7). W grupie kontrolnej myszy nie należy wstrzykiwać żadnych komórek.
  9. Zmierz grubość ucha przed (0 h) i po (24 h) wyzwaniu (kroki 3.2.1-3.2.6) (Rysunek 10).
  10. Dodatkowo należy wykonać testy na wyizolowanych komórkach efektorowych CHS (np. fenotypowanie komórek lub pomiar wytwarzanych cytokin przez komórki efektorowe CHS za pomocą cytometrii przepływowej). Można również ustalić hodowle komórkowe i ocenić zdolność komórek efektorowych CHS do proliferacji w obecności antygenu lub ilość wydzielanych cytokin w supernatantach hodowli21,22 (dane nie są prezentowane).
    UWAGA: Wykonanie dodatkowych badań wymaga odpowiednio większej liczby dawców komórek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Dla indukcji CHS, zwierzęta były uwrażliwiane poprzez malowanie skóry (brzucha) 150 μL 5% TNCB lub pozorowane uczulanie samym pojazdem. W dniu "4" reakcje obrzęku uszu obu uszu zostały wywołane przez malowanie kontaktowe (prowokacja) 10 μl 0,4% TNCB zarówno u myszy uprzednio uczulonych na TNCB (grupa testowa), jak i myszy z grupy kontrolnej (uczulone pozorowane). Przedstawione dane pokazują, że u myszy uczulonych na TNCB i prowokowanych 4 dni później rozwinął się znacznie zwiększony obrzęk ucha w porównaniu z my...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

CHS jest indukowany przez hapteny, które wiążą się z antygenami białkowymi w skórze, tworząc neoantygeny. CHS odbywa się za pośrednictwem miejscowej zewnątrznaczyniowej rekrutacji krążących komórek T efektorowych CHS specyficznych dla antygenu, co powoduje obrzęk badanej tkanki, osiągający szczyt 24 godziny po ekspozycji wtórnej skóry na ten sam hapten6. Obrzęk tkanki jest spowodowany głównie naciekaniem leukocytów i zależnym od leukocytów odkładaniem fibryny24. Zm...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez subwencję SUBZ. A020.22.060 Uniwersytetu Medycznego we Wrocławiu oraz dzięki grantom Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa Wyższego N N401 545940 do MS i IP2012 0443 72 do MMS.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
70% etanoluMerck KGaA, Darmstadt, Niemcy65350-Mdo dezynfekcji powierzchni
96-dołkowe płytki płaskodenne, polipropylenGreiner Bio-One GmbH, Kremsmunster, Austria655101do pomiaru MPO i niebieskiego Evansa - płytki powinny być wykonane z polipropylenu, który ma mniejszą zdolność wiązania, aby białka lub DNA nie wiązały
Aceton (odczynnik ACS, ≥ 99,5%)Merck KGaA, Darmstadt, Niemcy179124
Folia aluminiowaMerck KGaA, Darmstadt, NiemcyZ185140
Waga analitycznaSartorius Weighing Technology GmbH, Getynga, NiemcyPRACTUM224-1s, 29105177
Automatyczny procesor tkanekMediMeas Instruments, Sarsehri, Haryana, IndieMTP-E-212automatycznie przygotuj próbki tkanek poprzez utrwalanie, odwadnianie, oczyszczanie i infiltrację ich parafiną
BD Vacutainer SST II Advance (tubka z żelem do otrzymywania surowicy)Becton Dickinson (BD), Franklin Lakes, NJ, USAZestaw
kwasu bicynchoninowego do oznaczania białekMerck KGaA, Darmstadt, NiemcyBCA1-1KT
Biotyna Szczur Anty-Mysia IgG1Becton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, USA553441
BSA (albumina surowicy bydlęcej)Merck KGaA, Darmstadt, NiemcyA9418, 2 mg/ml
Sitko komórkowe, wielkość porów 70 i mu; mBIOLOGIX, Chiny15-1070nadaje się do probówek 50 ml
Szkiełko nakrywkoweVWR, Radnor, Pensylwania, Stany Zjednoczone631-158324 mm, ale możliwe jest użycie innego rozmiaru
Pojemność pipet jednorazowych: 5 mL, 10 mL, 25 mlMerck KGaA, Darmstadt, NiemcyZ740301, Z740302, Z740303
DPBS (Dulbecco′ s sól fizjologiczna buforowana fosforanami)ThermoFisher Scientific,  Waltham, Massachusetts, Stany Zjednoczone14190144bez wapnia, bez magnezu, hodowla komórek ssaków
DPX Uchwyt DPX do histologiiMerck KGaA, Darmstadt, Niemcy6522podłoża montażowe do H-E, mogą być używane inne np. balsam kanadyjski
Pęseta Dumont 5 - prostaAnimalab, Poznań, Polska11251-10FSTNarzędzia chirurgiczne do zabiegów na myszach (powinny być sterylizowane)
Pęseta Dumont 7 - wygiętaAnimalab, Poznań, Polska11272-50FSTNarzędzia chirurgiczne do zabiegów na myszach (powinny być sterylizowane)
Roztwór eozyny Y, alkoholMerck KGaA, Darmstadt, NiemcyHT110116
Probówki Eppendorf Safe-Lock 1,5 mlEppenforf, Niemcy3,01,20,086polipropylen
Probówki Eppendorf Safe-Lock, 2,0 mlEppenforf, Niemcy3,01,20,094polipropylen, okrągłe dno (kulki homogenizacyjne mogą się łatwo poruszać)
Etanol 100% (alkohol bezwodny)Merck KGaA, Darmstadt, Niemcy1.07017
Etanol 96%Merck KGaA, Darmstadt, Niemcy1.59010
Evans blueMerck KGaA, Darmstadt, NiemcyE2129
FBS (płodowa surowica bydlęca)ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA
Roztwór formaliny, buforowany obojętnie, 10%Merck KGaA, Darmstadt, NiemcyHT501128
Formamid 99,5% (GC)Merck KGaA, Darmstadt, NiemcyF7503
Zamrażarka -20 ° CBosch, NiemcyGSN54AW30
Lodówka +4 ° C / zamrażarka -20 ° CBosch, NiemcyKGV36V10hodowla komórkowa ssaków, kwalifikacja, Brazylia, 10 x 50 ml
Szklane szkiełka mikroskopowe, SuperFrost PlusVWR, Radnor, Pensylwania, Stany Zjednoczone631-0108, 631-0446, 631-0447, 631-0448, 631-0449Szkiełka, które eliminują potrzebę nakładania materiałów klejących lub powłok białkowych, aby zapobiec utracie jakichkolwiek skrawków tkanek podczas barwienia.
Pad graficzny PryzmatGraphPad Software Inc.v. 9.4.0
Mydło szarePollena Ostrzeszó w, Producent Chemii Gospodarczej Sp. z o.o. , Sp. K., PolskaBiały jelen mydło w kostceszare Mydło w Kostce Naturalne Hipoalergiczne. Ogólnie dostępny produkt
H2SO4 (kwas siarkowy) 1 mol/l (1 M)Merck KGaA, Darmstadt, Niemcy1.60313
Roztwór hematoksyliny HarrisMerck KGaA, Darmstadt, NiemcyHHS16
VWR, Avantor, USA612-5719zalecana
jest ręczna komora liczącaBromek heksadecylotrimetyloamoniowyMerck KGaA, Darmstadt, NiemcyH5882
HomogenizatorQIAGEN Hilden, NiemcyHomogenizator Tissue Lyser LT, SN 23.1001/05234kulkami ze stali nierdzewnej (średnica 5 mm) do probówek wirówkowych 2 ml
Peroksydaza chrzanowa streptawidyna (streptawidyna HRP)Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, USASA-5004-1
Roztwór nadtlenku wodoru (H202)Merck KGaA, Darmstadt, NiemcyH1009
Inkubator Heracell 150iThermo Electron LED Gmbh, Niemcy4107106837 oC w atmosferze 5 % CO2 oraz 65 0C do deparafinowania skrawków do histologii
Ketamina 100 mg/ml, roztwór do wstrzykiwańBiowet Puławy Sp. z o.o., Puławy, Polskakat.# niedostępny
KH2PO4 (diwodorofosforan potasu) 99,995% bezwodnej masyMerck KGaA, Darmstadt, Niemcy1.05108
Wirówka laboratoryjnaHeraeus Megafuge 1.0R, Thermo Scientific, NiemcyB00013899prędkość do 300 x g, z chłodzeniem do 4 0C
Wirówka laboratoryjnaHeraeus Fresco 21, Thermo Scientific, Niemcy75002425prędkość do 3 000 x g, z chłodzeniem do 4 0C
Maska (FFP2)VWR, Radnor, Pensylwania, Stany Zjednoczone111-0917do pracy z dichlorowodorkiem orto-dianizyny
MyszyJednostka Hodowli Katedry Nauk Biomedycznych, Wydział Nauk o Zdrowiu, Collegium Medicum Uniwersytetu Jagiellońskiego, Kraków, PolskaCBA/J, C57BL/6
MikrometrMitutoyo, Tokio, Japonia193-111cyfr Mikrometr zewnętrzny, Ogranicznik zapadkowy, Zakres 0-25mm, Podziałka 0,001mm, Dokładność +/- 0,002mm, https://shop.mitutoyo.pl/web/mitutoyo/pl_PL/all/all/Mikrometr%20analogowy%20/PR/193-111/index.xhtml  
mikropłytka, 96 dołków, mikrolon, wysokie wiązanie (do testu ELISA)Greiner Bio-One GmbH, Kremsmünster, Austria655061z powierzchniami wiążącymi maxi-sorp dla wiarygodnych i powtarzalnych wyników w testach kolorowych
Mikroskop z obiektywamiLeica Microsystems CMS GmbH, NiemcyDM1000, 294011-082007Badanie histologiczne przedstawione w pracy wykonano w systemie obrazowania ThermoFisher Scientific EVOS M5000, z obiektywami: FL 20X LWDPH, 0,40NA/3,1WD i FL 40X LWDPH 0,65NA/1,79WD
Mieloperoksydaza z ludzkich leukocytów (wzorzec MPO)Merck KGaA, Darmstadt, NiemcyM6908
Na2HPO4 x 7 H2O (fosforan sodu dwuzasadowy siedmiowodny)Merck KGaA, Darmstadt, NiemcyS9390
Oliwa z oliwekMerck KGaA, Darmstadt, Niemcy75343czysta, naturalna
mysz OptEIA IFN-γ Zestaw ELISABecton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, USA555138
Dichlorowodorek orto-dianizynyMerck KGaA, Darmstadt, NiemcyD3252
Wosk parafinowyMerck KGaA, Darmstadt, Niemcy76242koraliki, woskowate stałe
PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami)ThermoFisher Scientific,  Waltham, Massachusetts, Stany Zjednoczone20012027pH 7,2, ph-metr do hodowli komórek ssaków
Elmetron, PolskaCP-401
Pipety, zmienna objętość z końcówkamiMerck KGaA, Darmstadt, NiemcyEP3123000900-1EA3-pak, opcja 1, 0,5-10 uL/10-100 uL/100-1000 uL, zawiera epT.I.P.S.
ŻyletkaVWR, Radnor, Pensylwania, Stany ZjednoczonePERS94-0462Ostrza skrobaków i nóż, jednokrawędziowe, aluminiowy grzbiet, 100 ostrzy w pudełku, pakowane pojedynczo
Mikrotom obrotowyMRC Laboratory-Instruments, Essex, CM20 2HU UKHIS-202A
Nożyczki - proste, ostre / ostreAnimalab, Poznań, Polska14060-10FSTNarzędzia chirurgiczne do zabiegów na myszach (powinny być sterylizowane)
Zakrętka (otwarta góra)Merck KGaA, Darmstadt, Niemcy27056polipropylenowa zaślepka z otworem, do użytku z 22  fiolka ml z gwintem 20-400
SpektrofotometrBioTek Instruments, USA201446uniwersalny spektrofotometr do mikropłytek: λ zakres: 200 - 999 nm, zakres pomiaru absorbancji: 0,000 - 4,000 Abs
Naczynie do barwienia 20 szkiełek ze stojakiemMerck KGaA, Darmstadt, NiemcyS6141np. 20 naczyń do barwienia szkiełek w komplecie z pokrywkami, stojakiem na suwaki i uchwytem
Sterylny jednorazowy dziurkacz do biopsji 6mmIntegra LifeSciences, Princeton, NJ, Stany Zjednoczone33-36
Nożyczki chirurgiczneAnimalab, Poznań, Polska52138-46Narzędzia chirurgiczne do zabiegów na myszach (powinny być sterylizowane)
Kasety do przetwarzania tkanekMerck KGaA, Darmstadt, NiemcyZ672122kasety do przetwarzania/zatapiania tkanek z pokrywką
Zestaw odczynników do substratów TMBBecton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, USA555214
TNCB (2,4,6-trinitrochlorobenzen)Tokyo Chemical Industry CO., LTD, JaponiaC0307
TNP-BSA (albumina surowicy bydlęcej sprzężona z 2,4,6-trinitrofenylem)Biosearch Technologies LGC, Petaluma, CA, USAT-5050
T-PER (odczynnik do ekstracji białek tkankowych)ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA78510
Probówki 15 mL sterylneMerck KGaA, Darmstadt, NiemcyCLS430055 (Corning)polipropylen, stożkowe dno
Probówki 50 mL, sterylneMerck KGaA, Darmstadt, NiemcyCLS430290 (Corning)polipropylen, stożkowe dno
Tween 20Merck KGaA, Darmstadt, NiemcyP1379
Fiolki, zakręcana górka, przezroczyste szkło (tylko fiolka) 22 mLMerck KGaA, Darmstadt, Niemcy27173do przygotowania haptenu, przykręcany tak, aby nie parował
Kąpiel wodnaAJL Electronic, PolskaLW102
Dozownik wosku (parafiny)VWR, Radnor, Pensylwania, Stany Zjednoczone114-8737
Ksylazyna (ksylapan, ksylapan, 20 mg/ml) roztwór do wstrzykiwańVetoquinol Biowet Sp. z o.o., Gorzów Wielkopolski, Polskakat.# niedostępny
Ksylen (stopień histologiczny)Merck KGaA, Darmstadt, Niemcy534056
366882 Testy i analiza białek A3160802 Zalecany jest hemocytometr z

Bibliografia

  1. Nosbaum, A., Vocanson, M., Rozieres, A., Hennino, A., Nicolas, J. F. Allergic and irritant contact dermatitis. European Journal of Dermatology. 19 (4), 325-332 (2009).
  2. Hertl, M., et al. Predominance of epidermal CD8+ T lymphocytes in bullous cutaneous reactions caused by beta-lactam antibiotics. The Journal of Investigative Dermatology. 101 (6), 794-799 (1993).
  3. Martin, S. F. T lymphocyte-mediated immune responses to chemical haptens and metal ions: implications for allergic and autoimmune disease. International Archives of Allergy and Immunology. 134 (3), 186-198 (2004).
  4. Takeyoshi, M., Iida, K., Suzuki, K., Yamazaki, S. Skin sensitization potency of isoeugenol and its dimers evaluated by a non-radioisotopic modification of the local lymph node assay and guinea pig maximization test. Journal of Applied Toxicology. 28 (4), 530-534 (2008).
  5. Nakamura, K., Aizawa, M. Studies on the genetic control of picryl chloride contact hypersensitivity reaction in inbred rats. Transplantation Proceedings. 13 (2), 1400-1403 (1981).
  6. Asherson, G. L., Ptak, W. Contact and delayed hypersensitivity in the mouse. I. Active sensitization and passive transfer. Immunology. 15 (3), 405-416 (1968).
  7. Honda, T., Egawa, G., Grabbe, S., Kabashima, K. Update of immune events in the murine contact hypersensitivity model: toward the understanding of allergic contact dermatitis. The Journal of Investigative Dermatology. 133 (2), 303-315 (2013).
  8. Kaplan, D. H., Jenison, M. C., Saeland, S., Shlomchik, W. D., Shlomchik, M. J. Epidermal langerhans cell-deficient mice develop enhanced contact hypersensitivity. Immunity. 23 (6), 611-620 (2005).
  9. Wang, L., et al. Langerin expressing cells promote skin immune responses under defined conditions. Journal of Immunology. 180 (7), 4722-4727 (2008).
  10. Wang, B., et al. CD4+ Th1 and CD8+ type 1 cytotoxic T cells both play a crucial role in the full development of contact hypersensitivity. Journal of Immunology. 165 (12), 6783-6790 (2000).
  11. Mori, T., et al. Cutaneous hypersensitivities to hapten are controlled by IFN-gamma-upregulated keratinocyte Th1 chemokines and IFN-gamma-downregulated langerhans cell Th2 chemokines. The Journal of Investigative Dermatology. 128 (7), 1719-1727 (2008).
  12. Peszkowski, M. J., Warfvinge, G., Larsson, A. Allergic and irritant contact responses to DNFB in BN and LEW rat strains with different TH1/TH2 profiles. Acta Dermato-Venereologica. 74 (5), 371-374 (1994).
  13. Henningsen, S. J., Mickell, J., Zachariae, H. Plasma kinins in dinitrochlorobenzene contact dermatitis of guinea-pigs. Acta Allergologica. 25 (5), 327-331 (1970).
  14. Maibach, H. I., Maguire, H. C. Elicitation of delayed hypersensitivity (DNCB contact dermatitis) in markedly panleukopenic guinea pigs. The Journal of Investigative Dermatology. 41, 123-127 (1963).
  15. Martel, B. C., Lovato, P., Bäumer, W., Olivry, T. Translational animal models of atopic dermatitis for preclinical studies. The Yale Journal of Biology and Medicine. 90 (3), 389-402 (2017).
  16. Jin, H., He, R., Oyoshi, M., Geha, R. S. Animal models of atopic dermatitis. The Journal of Investigative Dermatology. 129 (1), 31-40 (2009).
  17. Li, Y. Z., Lu, X. Y., Jiang, W., Li, L. F. Anti-inflammatory effect of qingpeng ointment in atopic dermatitis-like murine model. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2013, 907016(2013).
  18. Hoggatt, J., Hoggatt, A. F., Tate, T. A., Fortman, J., Pelus, L. M. Bleeding the laboratory mouse: Not all methods are equal. Experimental Hematology. 44 (2), 132-137 (2016).
  19. Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin, J. Isolation and th17 differentiation of naïve CD4 T lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. (79), e50765(2013).
  20. Vlab, A. Hemocytometer - Counting of Cells. Amrita University. , Available from: https://www.youtube.com/watch?v=MKS0KM3lr90 (2011).
  21. Majewska-Szczepanik, M., Strzepa, A., Marcińska, K., Wen, L., Szczepanik, M. Epicutaneous immunization with TNP-Ig and Zymosan induces TCRαβ+ CD4+ contrasuppressor cells that reverse skin-induced suppression via IL-17A. International Archives of Allergy and Immunology. 164 (2), 122-136 (2014).
  22. Majewska-Szczepanik, M., Zemelka-Wiącek, M., Ptak, W., Wen, L., Szczepanik, M. Epicutaneous immunization with DNP-BSA induces CD4+ CD25+ Treg cells that inhibit Tc1-mediated CS. Immunology and Cell Biology. 90 (8), 784-795 (2012).
  23. Directive 2010/63 / EU of the European Parliament and of the Council of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes. Official Journal of the European Union. , Available from: https://eur-lex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=OJ:L:2010:276:0033:0079:En:PDF (2010).
  24. Colvin, R. B., Dvorak, H. F. Role of the clotting system in cell-mediated hypersensitivity. II. Kinetics of fibrinogen/fibrin accumulation and vascular permeability changes in tuberculin and cutaneous basophil hypersensitivity reactions. Journal of Immunology. 114, 377-387 (1975).
  25. Szczepanik, M., et al. Regulation of contact sensitivity in non-obese diabetic (NOD) mice by innate immunity. Contact Dermatitis. 79 (4), 197-207 (2018).
  26. Askenase, P. W., Majewska-Szczepanik, M., Kerfoot, S., Szczepanik, M. Participation of iNKT cells in the early and late components of Tc1-mediated DNFB contact sensitivity: Cooperative role of γδ-T cells. Scandinavian Journal of Immunology. 73 (5), 465-477 (2011).
  27. Zemelka-Wiącek, M., Majewska-Szczepanik, M., Ptak, W., Szczepanik, M. Epicutaneous immunization with protein antigen induces antigen-non-specific suppression of CD8 T cell mediated contact sensitivity. Pharmacological Reports. 64 (6), 1485-1496 (2012).
  28. Van Loveren, H., et al. Use of micrometers and calipers to measure various components of delayed-type hypersensitivity ear swelling reactions in mice. Journal of Immunological Methods. 67 (2), 311-319 (1984).
  29. Tsuji, R. F., et al. B cell-dependent T cell responses: IgM antibodies are required to elicit contact sensitivity. The Journal of Experimental Medicine. 196 (10), 1277-1290 (2002).
  30. Campos, R. A., et al. Cutaneous immunization rapidly activates liver invariant Valpha14 NKT cells stimulating B-1 B cells to initiate T cell recruitment for elicitation of contact sensitivity. The Journal of Experimental Medicine. 198 (12), 1785-1796 (2003).
  31. Rühl-Muth, A. C., Maler, M. D., Esser, P. R., Martin, S. F. Feeding of a fat-enriched diet causes the loss of resistance to contact hypersensitivity. Contact Dermatitis. 85 (4), 398-406 (2021).
  32. Bour, H., et al. histocompatibility complex class I-restricted CD8+ T cells and class II-restricted CD4+ T cells, respectively, mediate and regulate contact sensitivity to dinitrofluorobenzene. European Journal of Immunology. 25 (11), 3006-3010 (1995).
  33. Majewska-Szczepanik, M., et al. Obesity aggravates contact hypersensitivity reaction in mice. Contact Dermatitis. 87 (1), 28-39 (2022).
  34. Katagiri, K., Arakawa, S., Kurahashi, R., Hatano, Y. Impaired contact hypersensitivity in diet-induced obese mice. Journal of Dermatological Science. 46 (2), 117-126 (2007).
  35. Bouloc, A., Cavani, A., Katz, S. I. Contact hypersensitivity in MHC class II-deficient mice depends on CD8 T lymphocytes primed by immunostimulating Langerhans cells. The Journal of Investigative Dermatology. 111 (1), 44-49 (1998).
  36. Martin, S., et al. Peptide immunization indicates that CD8+ T cells are the dominant effector cells in trinitrophenyl-specific contact hypersensitivity. The Journal of Investigative Dermatology. 115 (2), 260-266 (2000).
  37. Vennegaard, M. T., et al. Epicutaneous exposure to nickel induces nickel allergy in mice via a MyD88-dependent and interleukin-1-dependent pathway. Contact Dermatitis. 71 (4), 224-232 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Sprostowanie


Formal Correction: Erratum: Contact Hypersensitivity as a Murine Model of Allergic Contact Dermatitis
Posted by JoVE Editors on 1/19/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Contact Hypersensitivity as a Murine Model of Allergic Contact Dermatitis. The Protocol and Representative Results sections were updated.

Step 3.2.1 of the Protocol has been updated from:

On day "4", prepare 0.4% hapten: TNCB in an acetone-ethanol mixture (ratio 1:1). Prepare the solution just before use in a glass vial and protect it from light by covering the vial with aluminum foil.

to:

On day "4", prepare 0.4% hapten: TNCB in an acetone: olive oil mixture (ratio 1:1). Prepare the solution just before use in a glass vial and protect it from light by covering the vial with aluminum foil.

Figure 1 of the Representative Results has been updated from:

Mouse ear thickness measurement experiment diagram; TNCB-induced dermatitis comparison.
Figure 1: Induction of CHS. Sensitization, challenge, and ear measurement. Abbreviations: CHS = contact hypersensitivity reaction; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzene. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Mice sensitization process; diagram of control/test groups, TNCB application, ear thickness measurement.
Figure 1: Induction of CHS. Sensitization, challenge, and ear measurement. Abbreviations: CHS = contact hypersensitivity reaction; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzene. Please click here to view a larger version of this figure.

Figure 2 of the Representative Results has been updated from:

CHS induction in mice using TNCB, diagram showing sensitization, i.v. cell transfer, ear measurement.
Figure 2: Adoptive transfer of the CHS-effector cells. Abbreviations: ALNs =axillary and inguinal lymph nodes; CHS = contact hypersensitivity reaction; i.v. = intravenously; SPLs = spleens; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzene. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Mouse sensitization and TNCB application diagram; CHS study setup with control and test groups.
Figure 2: Adoptive transfer of the CHS-effector cells. Abbreviations: ALNs =axillary and inguinal lymph nodes; CHS = contact hypersensitivity reaction; i.v. = intravenously; SPLs = spleens; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzene. Please click here to view a larger version of this figure.

Tagi

Odpowied limfocyt w Tobrz k uchauczulenie haptenemoznaczenie mieloperoksydazyprzepuszczalno naczyniowatransfer kom rek efektorowychizolacja w z w ch onnych

Powiązane artykuły