Metoda badania korelacji między lokalną strukturą kolagenu a właściwościami mechanicznymi tkanki włóknistej blaszki miażdżycowej

Summary

Opracowaliśmy proces mechano-obrazowania do badania heterogenicznych strukturalnych i mechanicznych właściwości blaszek miażdżycowych. Rurociąg ten umożliwia korelację lokalnego dominującego kąta i dyspersji orientacji włókien kolagenowych, zachowania podczas pękania i odcisków palców naprężeń włóknistej tkanki płytki nazębnej.

Abstract

Pęknięcie blaszek miażdżycowych w tętnicach wieńcowych i szyjnych jest główną przyczyną śmiertelnych zdarzeń sercowo-naczyniowych. Jednak mechanika pękania niejednorodnej, wysoce kolagenowej tkanki płytki nazębnej i jej związek z włóknistą strukturą tkanki nie jest jeszcze znana. Istniejące metody badania mechaniki płytki nazębnej ograniczają się do uzyskania jedynie ogólnych właściwości mechanicznych tkanki płytki nazębnej, w oparciu o założenie jednorodności strukturalnej tkanki. Jednak włóknista tkanka płytki nazębnej jest strukturalnie niejednorodna, prawdopodobnie głównie ze względu na lokalne różnice w architekturze włókien kolagenowych.

Opisany tutaj potok obrazowania mechanicznego został opracowany w celu badania niejednorodnych strukturalnych i mechanicznych właściwości płytki. W tym procesie lokalna architektura kolagenu w tkance jest charakteryzowana za pomocą mikroskopii wielofotonowej (MPM) z generacją drugiej harmonicznej (SHG), a zachowanie tkanki jest charakteryzowane w warunkach jednoosiowej próby rozciągania przy użyciu cyfrowej analizy korelacji obrazu (DIC). Ten eksperymentalny rurociąg umożliwia korelację lokalnego dominującego kąta i dyspersji orientacji włókien kolagenowych, zachowania podczas pękania oraz odcisków palców naprężeń włóknistej tkanki płytki nazębnej. Zdobyta wiedza jest kluczem do lepszego zrozumienia, przewidywania i zapobiegania pęknięciom blaszki miażdżycowej.

Introduction

Udar niedokrwienny, często wywoływany przez pęknięcie blaszki miażdżycowej w tętnicach szyjnych, jest jedną z głównych przyczyn śmiertelności i zachorowalności na całym świecie¹. Jednak obecne strategie planowania leczenia chirurgicznego w celu zapobiegania udarowi związanemu z miażdżycą tętnic szyjnych nie obejmują oceny ryzyka pęknięcia płytki nazębnej². Dzieje się tak głównie dlatego, że wcześniej sugerowane biomarkery ryzyka, takie jak grubość czapy płytki nazębnej³ i rozmiar rdzenia lipidowego⁴, okazały się mieć nieoptymalną wartość predykcyjną dla przyszłych zdarzeń klinicznych^5,6. Lepsze zrozumienie mechaniki i mechanizmów pękania blaszki miażdżycowej jest niezbędne do optymalizacji oceny ryzyka pęknięcia blaszki miażdżycowej i identyfikacji nowych markerów ryzyka blaszek miażdżycowych.

Pęknięcie płytki miażdżycowej to lokalne zdarzenie mechaniczne, w którym wysoce włóknista tkanka płytki nazębnej nie wytrzymuje mechanicznego obciążenia wywieranego na nią przez ciśnienie krwi i traci swoją integralność strukturalną⁷. Mimo to, mechanika pęknięcia płytki nazębnej i jej związek z leżącą u jej podstaw mikrostrukturą są słabo poznane⁸. Kilka badań eksperymentalnych, które charakteryzowały cechy niewydolności tkanki blaszki miażdżycowej^{9,10,11,12,13} podały ogólne właściwości mechaniczne pękania (tj. ostateczne odkształcenie i wytrzymałość na zerwanie przy rozciąganiu), uzyskane przy założeniu jednorodności strukturalnej tkanki. Jednak włóknista tkanka płytki nazębnej jest strukturalnie niejednorodna, prawdopodobnie głównie z powodu lokalnych różnic w architekturze włókien kolagenowych¹⁴. Co więcej, związek między charakterystyką uszkodzeń mechanicznych tkanki płytki nazębnej a architekturą kolagenu został zbadany dopiero w niedawnym badaniu Johnstona i wsp. Autorzy wykazali różnicę między płytkami w dominującej orientacji włókien i podali wyższe naprężenia końcowe i niższe odkształcenia końcowe dla próbek włóknistej czapeczki nazębnej o przeważającej obwodowej orientacji włókien¹⁵. Jednak badania ograniczały się również do ogólnych właściwości mechanicznych i strukturalnych.

Aby rzucić światło na podstawowe informacje o lokalnej architekturze kolagenu i lokalnych właściwościach mechanicznych tkanki płytki włóknistej, w obecnym badaniu opracowaliśmy potok obrazowania mechanicznego. Ten rurociąg ex vivo umożliwia ilościowe określenie lokalnego kierunku i dyspersji włókien kolagenowych, a także miejscowego odkształcenia pękającego. Rurociąg obejmuje obrazowanie MPM z SHG w celu zobrazowania włókien kolagenowych w tkance płytki nazębnej, a także DIC i jednoosiowe testy rozciągania w celu ilościowego określenia charakterystyki pękania tkanki.

Mikroskopia wielofotonowa-generacja drugiej harmonicznej (MPM-SHG) stała się popularną techniką badania kolagenu w tkankach biologicznych¹⁶. Technika ta ma wiele zalet w porównaniu z innymi technikami obrazowania kolagenu, takimi jak histologia¹⁷, obrazowanie tensora dyfuzji (DTI)¹⁴ i rozpraszanie światła pod małym kątem (SALS)¹⁵. Po pierwsze, obrazowanie MPM-SHG jest nieniszczące, co czyni je idealnym rozwiązaniem w połączeniu z badaniami mechanicznymi¹⁸. Po drugie, sygnał SHG jest specyficzny dla kolagenu, a zatem nie jest konieczne barwienie tkanki. Ze względu na długie fale wzbudzenia (bliska podczerwień) głębokość penetracji jest większa niż w przypadku innych technik mikroskopowych¹⁶. Wysoka rozdzielczość (na poziomie μm) uzyskana dzięki obrazowaniu SHG pozwala również na wizualizację poszczególnych włókien. Daje to wiele możliwości, takich jak lokalna kwantyfikacja liczby włókien kolagenowych, orientacja włókien kolagenowych i dystrybucja¹⁹.

Cyfrowa korelacja obrazów (DIC) w połączeniu z testami mechanicznymi jest powszechnie stosowaną metodą uzyskiwania lokalnych właściwości mechanicznych tkanek biologicznych²⁰. W przypadku DIC przemieszczenie plamek nałożonych na powierzchnię tkanki jest śledzone poprzez porównanie obrazów z kamer o dużej prędkości uzyskanych podczas testów mechanicznych²⁰. Ta metoda przetwarzania końcowego obrazu służy do szacowania odkształceń powierzchni całego pola próbki²⁰ i może być również używana do badania zachowania podczas pękania tkanki²¹.

Protocol

Wszystkie metody opisane w tym artykule zostały zatwierdzone przez Komitet Badań Etycznych w Centrum Medycznym Erasmus w Rotterdamie; uzyskano świadomą zgodę od pacjentów przed pobraniem próbki płytki. Schemat przepływu pracy protokołu jest podany w Rysunek 1.

1. Pobieranie tkanek, obrazowanie metodą mikrotomografii komputerowej (μCT) i przygotowanie próbki testowej

1. Pobieranie i przechowywanie tkanek
   1. Zbierz świeże próbki blaszek miażdżycowych tętnic szyjnych od pacjentów, którzy wyrazili na to zgodę, którzy przeszli operację endarterektomii tętnicy szyjnej.
      UWAGA: Próbki blaszek miażdżycowych pobrane z tej operacji składają się z chorej warstwy błony wewnętrznej tętnicy szyjnej, w tym nagromadzenia tłuszczu (puli lipidów) i zwapnień²².
   2. Usunąć resztki krwi za pomocą soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (1x PBS) i osuszyć próbkę gazikiem.
   3. Umieść próbkę w probówce o pojemności 15 ml za pomocą pęsety. Zatrzaskowo zamroź tkankę, umieszczając probówkę w ciekłym azocie na 10 minut.
   4. Po błyskawicznym zamrożeniu próbkę należy przechowywać w zamrażarce w temperaturze -80 °C do dnia obrazowania μCT.
      UWAGA: Szybkie zamrażanie minimalizuje tworzenie się kryształów, co prowadzi do uszkodzeń mikrostrukturalnych w tkance. Poprzednie badania nad tkanką aorty świń wykazały, że błyskawiczne zamrażanie i przechowywanie w temperaturze -80 °C nie miało znaczącego wpływu na właściwości mechaniczne tkanki²³.
2. Obrazowanie μCT
   1. W dniu obrazowania μCT należy pobrać próbkę płytki nazębnej z probówki o pojemności 15 ml. Jeśli tkanka przyklei się do probówki, napełnij probówkę PBS w temperaturze pokojowej. Pozostawić tkankę w PBS do czasu, gdy próbka będzie mogła zostać wyjęta z probówki.
   2. Dokładnie osusz próbkę płytki nazębnej bibułą.
   3. Włącz system μCT, naciskając zielony przycisk. Naciśnij przycisk rozgrzewki w oprogramowaniu CT u dołu ekranu i odczekaj 15 minut.
   4. Ręcznie umieścić filtr rentgenowski Cu 0,06 mm + Al 0,5 mm w systemie μCT.
   5. Wybierz folder, w którym mają być przechowywane obrazy.
   6. Wybierz parametry w lewym panelu. Z list rozwijanych można wybrać czas skanowania 4 min, rozdzielczość 172 μm, napięcie 90 kV, natężenie prądu 88 mA, pole widzenia 86 mm i obrót o 360°.
   7. Otwórz drzwiczki urządzenia. Wyciągnij platformę ręcznie.
   8. Umieść parafilm na platformie i umieść próbkę na platformie (w kierunku dalszego krańca platformy).
   9. Ręcznie umieść platformę w urządzeniu i zamknij drzwi.
   10. Aktywuj tryb na żywo (ikona oka). Przesuń platformę za pomocą strzałek w urządzeniu, aby wyśrodkować próbkę w polu widzenia.
   11. Rozpocznij obrazowanie (ikona w dolnej środkowej części). Po zakończeniu obrazowania naciśnij ikonę drzwi na dole (pod przyciskiem przerwania).
   12. Po badaniu μCT należy ponownie zamrozić próbkę płytki nazębnej, jak opisano w kroku 1.1.3. Przechowywać w temperaturze -80 °C do dnia obrazowania za pomocą mikroskopii wielofotonowej i badań mechanicznych.
   13. Otwórz pobrane pliki DICOM obrazowania μCT w oprogramowaniu 3D Slicer o otwartym kodzie źródłowym²⁴.
   14. Przejdź do edytora segmentów. Wybierz opcję Utwórz nową segmentację | wolumin do analizy jako wolumin główny.
   15. Kliknij Dodaj, aby dodać segment. Naciśnij jego nazwę i kolor, aby zmienić te parametry.
   16. Aby zdefiniować segmenty, należy kliknąć na próg efektów | w dolnej części okna. Użyj tego narzędzia progowego, aby rozróżnić zwapniałe (>450 HU) i niezwapniałe (<450 HU) obszary tkanki. Po wybraniu progu naciśnij Zastosuj w dolnej części.
   17. Naciśnij Pokaż 3D (po prawej stronie opcji Dodaj), aby wyświetlić segmentację w widoku 3D. Jeśli istnieją obszary segmentacji, które nie są pożądane, usuń je z efektem nożyczek.
   18. Zmień przezroczystość segmentów w module segmentacji, klikając nazwę żądanej segmentacji.
       UWAGA: Jeśli to możliwe, obrazowanie μCT i przegląd obrazów μCT można wykonać tego samego dnia, co reszta protokołu. W takim przypadku pomiń krok 1.2.12. Weź jednak pod uwagę, że kolejne kroki tego protokołu są również czasochłonne i powinny być wykonane tego samego dnia. Po pewnym nabraniu wprawy, przy opisanych ustawieniach i tkance, obrazowanie μCT powinno zająć ~45 min, przegląd obrazów μCT ~15 min, przygotowanie próbki testowej pojedynczej próbki testowej ~1 h, mikroskopia ~4 h, a jednoosiowa próba rozciągania ~2 h.
3. Przygotowanie próbki testowej
   1. W dniu obrazowania kolagenu i badań mechanicznych należy rozmrozić płytkę nazębną przez zanurzenie w PBS w temperaturze pokojowej na około 10 minut.
   2. Otwórz konstrukcję 3D płytki utworzonej w krokach 1.2.13-1.2.18 w oprogramowaniu slicera 3D.
   3. Wykorzystaj naturalne punkty orientacyjne tkanki płytki nazębnej, aby określić, które części rekonstrukcji 3D odpowiadają rzeczywistej próbce płytki nazębnej. Określ, który obszar rekonstrukcji 3D nie zawiera zwapnień i wizualnie zidentyfikuj ten obszar w rzeczywistej płytce nazębnej.
   4. Rozetnij płytkę nazębną wzdłuż osi podłużnej tętnicy za pomocą nożyczek chirurgicznych i pęsety. Jeśli nacięcie jest już obecne po operacji, zacznij od tego cięcia, aby optymalnie wykorzystać tkankę. Jeżeli próbka nie ma kształtu rurkowatego i trudno jest określić kierunek wzdłużny, należy wykluczyć próbkę z badania.
   5. Wytnij prostokątne próbki testowe z próbek płytki nazębnej. Upewnij się, że próbki testowe są tak duże, jak to możliwe, unikając obszarów tkanek zawierających łzy lub zwapnienia. Zachowaj ostrożność podczas tego cięcia, ponieważ małe rozdarcie lub pęknięcie na krawędzi badanej próbki może spowodować propagację pęknięć z istniejącego pęknięcia podczas próby rozciągania.
   6. Upewnij się, że próbki testowe mają stosunek szerokości do długości (WL) wynoszący <1 długości miernika po zamontowaniu w próbie rozciągania. Jeśli próbki spełniają ten wymóg, nadają się do odpowiednich prób rozciągania pod względem warunków brzegowych²⁵.
      UWAGA: Zakres w przykładowych wymiarach może być duży. Próbki, które testowali autorzy, miały długość miernika w zakresie od 3,4 do 12,9 mm i szerokość w zakresie od 1,6 do 6,4 mm.

2. Obrazowanie za pomocą mikroskopii wielofotonowej

1. Preparaty
   1. Przed dniem obrazowania kolagenu i badań mechanicznych podzielić 40 g bazy z elastomeru silikonowego na dwie probówki o pojemności 50 ml i dodać 2 g utwardzacza do każdej probówki (w stosunku 1:10) za pomocą pipety Pasteura. Wymieszać oba składniki za pomocą pipety.
   2. Wirować probówki przez 1 minutę przy sile 700 × g, aby usunąć jak najwięcej pęcherzyków powietrza.
   3. Wypełnij szalkę Petriego (o średnicy 10 cm) cienką warstwą (około 0,5-1 cm) krzemu i albo inkubuj ją w piekarniku w temperaturze 65 °C przez 3 godziny, albo umieść w temperaturze pokojowej na 48 godzin.
   4. Weź próbkę testową płytki nazębnej i przymocuj oba jej końce do silikonu, wbijając igły w tkankę (Rysunek 2A). Upewnij się, że luminalna strona sample jest skierowana do góry. Włóż igły w obszar próbki, który będzie znajdował się w zaciskach urządzenia do prób rozciągania podczas próby mechanicznej.
   5. Załóż okulary ochronne. Użyj bocznego noża, aby skrócić igły tak, aby wystawały mniej niż kilka milimetrów ponad powierzchnię próbki, aby zapobiec uszkodzeniu obiektywu mikroskopu. Wypełnić szalkę Petriego PBS, aż próbka zostanie zanurzona.
2. Konfiguracja mikroskopii
   1. Upewnij się, że w mikroskopie wielofotonowym zamontowany jest właściwy obiektyw. Użyj obiektywu zoptymalizowanego do przepuszczania światła podczerwonego o powiększeniu 20x.
   2. Uruchom system mikroskopu. Otwórz oprogramowanie operacyjne mikroskopu.
   3. Gdy zostaniesz poproszony o zainicjowanie stołu do obrazowania, upewnij się, że ramię kondensora mikroskopu jest cofnięte, a obiektyw znajduje się w najniższej pozycji.
   4. Aktywuj laser wielofotonowy.
   5. Umieść szalkę Petriego z próbką testową pod obiektywem, jak w Rysunek 3. Pamiętaj, aby nie umieszczać obiektywu nad próbką, ponieważ ustawienia lasera nadal wymagają optymalizacji. W przeciwnym razie ewentualna duża moc światła laserowego może doprowadzić do uszkodzenia tkanki.
   6. Upewnij się, że obiektyw jest lekko zanurzony w PBS. W razie potrzeby użyj pipety, aby dodać dodatkową PBS.
   7. Ustaw długość fali światła na 880 nm.
      UWAGA: Ta długość fali została wybrana, ponieważ filtr emisyjny SHG w zastosowanym układzie dwufotonowym ma środkową długość fali około 440 nm. W przypadku innych mikroskopów inna długość fali może być bardziej odpowiednia.
3. Skanowanie kafelków i wybór lokalizacji obrazowania
   1. Wyłącz laser wielofotonowy i aktywuj tryb jasnego pola mikroskopu. Następnie włącz tryb skanowania na żywo.
   2. Ustawić stolik w taki sposób, aby obiektyw znajdował się nad próbką i ustawić ostrość na powierzchni próbki. Wyłącz tryb skanowania na żywo.
   3. Na karcie akwizycji, w drugim panelu, zmień współczynnik powiększenia na 1, przesuwając odpowiedni pasek.
      UWAGA: Ten współczynnik powiększenia wraz ze współczynnikiem powiększenia obiektywu (20x) określa rozmiar przechwyconego obrazu (739 μm x 739 μm).
   4. Na karcie akwizycji, w drugim panelu, zmień prędkość skanowania na 400 Hz, średnią linii na 1, a rozdzielczość na 128 x 128 pikseli na obraz (rozmiar piksela ~5,8 μm x 5,8 μm) za pomocą list rozwijanych.
   5. Na karcie pozyskiwania, w pierwszym panelu, kliknij symbol wzoru rastrowego i poczekaj, aż pojawi się panel skanowania kafelków.
   6. Włącz tryb skanowania na żywo. Przesuń obiektyw w róg próbki za pomocą pokręteł na panelu inteligentnym i kliknij symbol pozycji znacznika w panelu skanowania kafelków. Powtórzyć tę czynność dla każdego rogu próbki. Jeśli zostanie to wykonane poprawnie, siatka ze wszystkimi wybranymi kafelkami do obrazowania pojawi się na pomarańczowo.
   7. Wyłącz funkcję automatycznego zszywania zębów.
   8. Kliknij przycisk start w prawym dolnym rogu ekranu, aby utworzyć skan kafelków całej powierzchni próbki w celu uzyskania przeglądu geometrii próbki.
      UWAGA: W oparciu o opisane ustawienia, tkankę i system mikroskopu, uzyskanie skanu płytki całej powierzchni próbki zajmuje ~10 min.
   9. Po zeskanowaniu płytki obserwuj współrzędne x i y w lewym górnym rogu każdej płytki w panelu skanowania płytek, wyświetlane automatycznie przez oprogramowanie systemu mikroskopowego. Zanotuj te współrzędne w arkuszu kalkulacyjnym.
   10. W oprogramowaniu mikroskopu, w panelu skanowania kafelków, obserwuj liczbę płytek w kierunkach x i y w polu zwanym polem skanowania. Zwróć uwagę na rozmiar skanu kafelka w arkuszu kalkulacyjnym. Oblicz współrzędne pozostałych płytek, dodając/odejmując rozmiar płytki (739 μm).
       UWAGA: Te współrzędne są niezbędne do określenia dokładnej lokalizacji płytek, które mają być skanowane za pomocą obrazowania SHG. Jeśli całkowity czas obrazowania nie jest problemem, wszystkie kafelki można obrazować bez pomijania żadnej płytki.
   11. Ze skanowania kafelków wybierz kafelki, które mają zostać zobrazowane za pomocą obrazowania SHG. W przypadku tego wyboru unikaj płytek, które będą znajdować się w zaciskach i pozostaw jedną płytkę między każdą wybraną płytką zarówno w kierunku wzdłużnym, jak i obwodowym, jak pokazano na Rysunek 2B.
4. Wizualizacja kolagenu: obrazowanie SHG
   1. Wyłącz światła w pomieszczeniu i przykryj stolik mikroskopu tkaniną zaciemniającą, aby żadne światło z pomieszczenia nie docierało do detektora.
      UWAGA: Zminimalizowanie światła docierającego do detektorów zmniejszy szumy podczas akwizycji obrazu.
   2. Włącz laser wielofotonowy (MP).
   3. Wybierz detektor NDD (non-descanned detection), który jest wyposażony w filtr pasmowoprzepustowy 430-450 nm.
   4. Zidentyfikuj lokalizację kafelków, które mają zostać zobrazowane, korzystając z informacji uzyskanych w kroku 2.3.10. Wpisz współrzędne w wyznaczonych polach i kliknij Enter, aby cel przeniósł się na prawy kafelek. Włącz tryb skanowania na żywo.
      UWAGA: W przypadku innych mikroskopów lub nowszych wersji oprogramowania operacyjnego przenoszenie do lokalizacji w obrębie skanowania płytek może odbywać się automatycznie. W takim przypadku zanotowanie współrzędnych x i y każdego kafelka (krok 2.3.10) i wypełnienie współrzędnych w oprogramowaniu operacyjnym (krok 2.4.4) nie jest konieczne.
   5. Zwiększ moc lasera MP za pomocą suwaka w górnym panelu pod ustawieniami ścieżki wiązki, aby uzyskać najwyższą możliwą moc lasera bez znacznego wybielania. Następnie dostosuj wzmocnienie detektora, aby uzyskać jasne obrazy, ale bez nasyconych pikseli, za pomocą pokrętła na inteligentnym panelu lub klikając nazwę detektora w obszarze Ustawienia ścieżki wiązki | Dodatkowe kanały. Typowe wartości wzmocnienia detektora mieszczą się w zakresie od 500 do 800 V.
   6. Użyj pokrętła pozycji Z na inteligentnym panelu, aby wyregulować płaszczyznę ostrości.
   7. Przejdź na górę próbki i ustaw pozycje górnej części stosu z, klikając grot strzałki w panelu z-stack (pod zakładką akwizycji | 3. panel).
   8. Następnie skoncentruj się na próbce, aż sygnał SHG przestanie być wykrywany - to jest koniec stosu. Ponownie kliknij grot strzałki w panelu z-stack, aby ustawić tę pozycję. Po zakończeniu wyłącz tryb skanowania na żywo.
      UWAGA: Tkanka może nie być całkowicie płaska. W związku z tym powierzchnia próbki w różnych obszarach tkanki może mieć nieco inne położenie w kierunku z.
   9. Na karcie akwizycji, w drugim panelu, utrzymuj prędkość skanowania na poziomie 400 Hz, ustaw średnią linii na 2, a rozdzielczość na 512 x 512 pikseli na obraz (rozmiar piksela ~1,4 μm x 1,4 μm), korzystając z list rozwijanych. Włącz dwukierunkowy przycisk skanowania X.
   10. Kliknij rozmiar kroku z w panelu stosu z i wypełnij rozmiar kroku z wynoszący 3 μm w polu. Kliknij przycisk Start w prawym dolnym rogu ekranu, aby utworzyć stos z. Po zakończeniu pamiętaj, aby zapisać współrzędne kafelka w nazwie pliku lub nadać każdemu kafelkowi własny numer (jak w Rysunek 2B).
       UWAGA: Na podstawie opisanych ustawień, tkanki i systemu mikroskopowego, pozyskanie stosu z pojedynczej płytki zajmuje ~10-15 min. Etapy przygotowawcze (kroki 2.4.4-2.4.10) są uwzględnione w tym szacunkowym czasie.

3. Testy mechaniczne

1. Przygotowanie jednoosiowego zestawu do prób rozciągania
   1. Przygotuj zestaw do poziomej próby rozciągania (Rysunek 4) gotowy do użycia, postępując zgodnie z instrukcjami testera rozciągania (np. włącz oprogramowanie, zamocuj zaciski, zamocuj ogniwo obciążnikowe).
   2. Aby zminimalizować poślizg badanej próbki, przymocuj dwustronną taśmę piankową (Rysunek 4A, B-2) do wewnętrznych powierzchni zacisków testera rozciągania i papier ścierny do wewnętrznej strony taśmy piankowej. W końcu papier ścierny będzie miał kontakt z badaną próbką.
   3. Umieść łaźnię grzewczą (Rysunek 4A,B-3) w odpowiednim miejscu. Napełnij łaźnię grzewczą PBS do poziomu dolnej powierzchni zacisków, tak aby nie sięgała jeszcze do papieru ściernego.
   4. Włącz źródło zasilania łaźni grzewczej i ustaw temperaturę na około 37 °C.
   5. Zamontuj szybką kamerę nad systemem prób rozciągania (Rysunek 4A-4), na przykład za pomocą statywu laboratoryjnego, a obiektyw o ogniskowej 50 mm zamontuj na kamerze za pomocą pierścienia przedłużającego.
   6. Upewnij się, że zaciski są ostre, a pole widzenia jest wystarczająco duże, aby zarejestrować próbkę podczas całej procedury rozciągania (szerokość pola widzenia: ± szerokość próbki; Długość pola widzenia: ± 2x długość próbki).
   7. Zamontuj system oświetleniowy (Rysunek 4A-5) nad systemem prób rozciągania, na przykład za pomocą stanowiska laboratoryjnego. Włącz system oświetlenia i dostosuj natężenie i lokalizację światła tak, aby na powierzchni PBS nie było odbić, które można zaobserwować na obrazie z kamery.
   8. Dostosuj czas ekspozycji i wzmocnienie aparatu, aby uzyskać wyraźne obrazy.
   9. Ustaw oprogramowanie do akwizycji obrazu tak, aby rejestrowało obraz z prędkością 30 klatek/s w rozdzielczości 5,2 MP.
      UWAGA: Ta wysoka liczba klatek na sekundę jest potrzebna do przeprowadzenia późniejszej analizy DIC i zbadania zachowania podczas pękania.
   10. Ustaw prędkość przemieszczenia jednego z zacisków w taki sposób, aby globalna szybkość odkształcania inżynieryjnego podczas testów mechanicznych była zbliżona do fizjologicznej szybkości odkształcania in vivo tkanki
       (5%/s dla tkanki płytki nazębnej26).
2. Generowanie wzoru plamkowego
   UWAGA: Ten protokół wzorca plamek jest oparty na wcześniejszych pracach Walsha i wsp.²⁷.
   1. Wysuszyć próbkę, delikatnie przecierając ją bibułą.
   2. Umieść barwnik tkankowy w przeznaczonym do tego wiadrze aerografu.
   3. Podłącz aerograf do kompresora. Włącz kompresor aerografu i ustaw ciśnienie na 25 PSI.
   4. Spróbuj stworzyć optymalny wzór plamek na papierze przed spryskaniem tkanki. Spryskaj kilka razy, aż zostanie osiągnięty stosunek czerni do bieli 50:50²⁸. Przesuwaj igłę aerografu do przodu i do tyłu, aby dostosować chropowatość wzoru plamki, aż rozmiar plamki będzie zbliżony do rozmiaru 3-5 pikseli szybkiej kamery²⁹.
      UWAGA: Wzór plamek będzie używany do dwóch różnych celów. Po pierwsze, przemieszczenie tych plamek mierzy się, porównując obrazy z kamer o dużej prędkości uzyskane podczas testów mechanicznych (DIC, krok 4.2). Po drugie, ten wzór plamek służy do identyfikacji miejsca pęknięcia na obrazie stanu niezdeformowanego próbki (krok 4.3.1).
   5. Trzymaj aerograf w odległości około 30 cm od badanej próbki i spryskaj powierzchnię światła.
   6. Pozwól barwnikowi związać się z próbką przez 1 minutę w temperaturze pokojowej przed zanurzeniem próbki w PBS.
3. Jednoosiowa próba rozciągania
   1. Umieścić próbkę w zaciskach testera rozciągania, tak aby kierunek obwodowy próbek był wyrównany z kierunkiem rozciągania przy rozciąganiu, a stroną luminalną próbki skierowaną do góry. Upewnij się, że początkowa długość miernika jest ustawiona tak, aby współczynnik WL pasków wynosił <1.
   2. Dokręć uchwytów, dokręcając momentem 20 cNm za pomocą śrubokręta dynamometrycznego. Rób to stopniowo, przykładając mały moment obrotowy do każdej przed zastosowaniem końcowego momentu obrotowego.
   3. Sprawdź wzrokowo, czy próbka nie zawiera żadnych rozdarć, które mogłyby mieć wpływ na testy.
   4. Wprowadzić więcej PBS do łaźni grzewczej, aż próbka zostanie zanurzona i poczekać, aż temperatura PBS ponownie osiągnie 37 °C.
   5. Uzyskaj obraz kalibracyjny za pomocą szybkiej kamery, w którym próbka testowa i linijka są zawarte jako odniesienie. Upewnij się, że linijka znajduje się w tej samej odległości od obiektywu aparatu, co powierzchnia świetlna próbki.
   6. Wytaruj ogniwo obciążnikowe i rozpocznij rejestrowanie globalnych pomiarów siły i przemieszczenia z ogniwa obciążnikowego i siłownika testera rozciągania.
   7. Wyprostuj próbkę, stosując rozciąganie wstępne 0,05 N, aby pozbyć się luzu w próbce. Wykonaj 10 cykli kondycjonowania wstępnego do 10% naprężenia w oparciu o pomiar długości miernika przez siłownik po zastosowaniu rozciągnięcia wstępnego.
   8. Rozpocznij jednoosiową próbę rozciągania aż do całkowitego uszkodzenia próbki, jednocześnie nagrywając film z deformacji próbki za pomocą szybkiej kamery. Po niewydolności tkanki przestań rejestrować globalne pomiary siły i przemieszczenia.
      UWAGA: Niektóre komercyjne testery rozciągania mogą automatycznie wykonywać kroki 3.3.6-3.3.9. Obecny protokół opisuje ręczne kroki, które należy podjąć, jeśli ta automatyczna opcja nie jest zawarta w używanym testerze rozciągania.
   9. Usunąć badaną próbkę z urządzenia do prób rozciągania i odpowiednio ją wyrzucić.
   10. Podczas testowania następnej próbki załóż papier ścierny i taśmę piankową na zaciski.

4. Analiza danych

1. Analiza organizacji kolagenu
   1. Otwórz stosy z uzyskane podczas MPM za pomocą SHG w ImageJ i utwórz projekcje maksymalnej intensywności (MIP) dla każdego stosu z.
   2. Przeanalizuj każdy MIP za pomocą narzędzia FOA (Fiber Orientation Analysis) opartego na MATLAB o otwartym kodzie źródłowym³⁰, aby zmierzyć kąt orientacji poszczególnych włókien kolagenowych obecnych w płytkach. Użyj następujących parametrów: Skale: [3 4 5] lub [2 4 6], w zależności od średnicy naczynia, oraz Próg naczynia: 0,999, 0,9995 lub 0,9999, w zależności od intensywności sygnału SHG.
      UWAGA: Więcej szczegółów na temat korzystania z tego narzędzia można znaleźć w instrukcji oprogramowania³¹.
   3. Użyj innego narzędzia opartego na MATLAB o otwartym kodzie źródłowym, FibLab³², aby dopasować rozkład Gaussa do histogramu rozkładu kątów.
      UWAGA: Więcej szczegółów na temat korzystania z tego narzędzia można znaleźć w instrukcji oprogramowania³².
   4. Z wykresu rozkładu Gaussa uzyskanego za pomocą FibLab wyodrębnij następujące parametry strukturalne z przestrzeni roboczej MATLAB: dominujący kąt włókna (μ_p), który jest trybem rozkładu, odchylenie standardowe (σ_p) rozkładu kąta włókna oraz frakcję anizotropową (P_ani = 1 − P_iso).
      UWAGA: Frakcja izotropowa to obszar pod linią bazową w rozkładzie Gaussa, podczas gdy frakcja anizotropowa zawiera obszar piku na szczycie tej linii bazowej³³. Zarówno σ_p, jak i P_ani dostarczają informacji o dyspersji orientacji włókien w obszarze płytki.
   5. Do celów kontroli wzrokowej należy wykreślić _{μ p} za pomocą linii zorientowanych, a σ_{p i P ani} za pomocą map kolorów.
2. Cyfrowa analiza obrazu i analiza pęknięć
   1. Przeprowadź oględziny obrazów z kamery, aby zidentyfikować klatkę, w której następuje inicjacja pęknięcia. Na tej ramce wizualnie zidentyfikuj miejsce pęknięcia.
   2. Przeprowadź oględziny obrazów z kamery, aby zidentyfikować ewentualne pęknięcia lub rozdarcia w miejscu pęknięcia na początku testów mechanicznych. Jeśli takie rozdarcie jest obecne, należy wykluczyć próbkę z analizy.
   3. Przeprowadź analizę DIC za pomocą oprogramowania Ncorr (v1.2) opartego na otwartym kodzie źródłowym opartego na MATLAB (wersja 1.2)³⁴. Postępuj zgodnie z instrukcjami w Ncorr manual³⁵.
      1. Wykorzystaj obrazy z kamery zarejestrowane podczas próby rozciągania za pomocą szybkiej kamery do DIC. Wybierz ostatnią klatkę przed ostatecznym rozciąganiem aż do awarii (po kondycjonowaniu wstępnym) jako obraz referencyjny. W przypadku bieżących obrazów zaznacz wszystkie obrazy od początku końcowego rozciągania do ostatniej klatki przed klatką, w której nastąpiło zainicjowanie zerwania.
      2. Wybierz powierzchnię próbki jako obszar zainteresowania (ROI). Wyklucz obszary, które znajdują się w pobliżu (około 1 mm) zacisków, ponieważ naprężenia w tych obszarach będą pod dużym wpływem uchwytów.
      3. Wykonaj analizę DIC przy użyciu następujących parametrów: Promień podzbioru: 30 pikseli; Odstępy między podzbiorami: trzy piksele; Odcięcie iteracji: 50; Norma odcięcia wektora różnicy: 10-5; Promień odkształcenia: 5; Automatyczna propagacja, krok #: 5.
      4. Z analizy DIC za pomocą Ncorr uzyskaj rozkłady Greena-Lagrange'a (lub szczepu Eulera) ROI. Użyj tych rozkładów odkształceń, aby obliczyć średnie odkształcenie Greena-Lagrange'a dla całej powierzchni próbki płytki w ostatniej klatce przed pęknięciem. Oblicz odkształcenie Greena-Lagrange'a w miejscu pęknięcia.
3. Korelacja danych konstrukcyjnych i mechanicznych w miejscu pęknięcia
   1. Wykorzystując naturalne punkty orientacyjne w badanej próbce i naniesione plamki na badanej próbce, określ miejsce pęknięcia (określone w kroku 4.2.1) na obrazie referencyjnym (krok 4.2.3.1).
   2. Korzystając z naturalnych punktów orientacyjnych w próbce testowej, nałóż obraz referencyjny i skan płytki (krok 2.3), aby zidentyfikować miejsce pęknięcia na skanie płytki. Zidentyfikuj płytkę MPM-SHG, w której nastąpiło pęknięcie. Jeśli pęknięcie nie znajduje się na kafelku zeskanowanym za pomocą MPM-SHG, zidentyfikuj płytkę znajdującą się najbliżej miejsca pęknięcia. Uzyskaj parametry konstrukcyjne znalezione na płytce, na której nastąpiło pęknięcie.

Results

Pobieranie tkanek i przygotowanie próbki do badań
W wyniku pobrania tkanek uzyskuje się próbki tkanki włóknistej płytki nazębnej, które można rozciąć na poszczególne próbki testowe w celu obrazowania strukturalnego i jednoosiowych prób rozciągania. Idealnie, pobrana próbka tkanki włóknistej zawiera obszary z niewielkimi lub żadnymi rozdarciami (Ryc. 5A) i makrozwapnieniami (Ryc. 5B). Nadmiar tych rozdarć i zwapnień (Rysunek 5C) może prowadzić do powstania próbek płytki nazębnej, które nie spełniają wcześniej wspomnianego wymogu wymiarowania próbki WL 1.

Obrazowanie mikroskopią wielofotonową
Obrazowanie SHG i przetwarzanie końcowe obrazu zapewniają MIP-y z każdego obrazowanego kafelka (Rysunek 6A,B). Dalsza obróbka końcowa przez detekcję włókien ( Rysunek 6C) daje histogramy orientacji włókien ( Rysunek 6D), z których można wyodrębnić parametry strukturalne kolagenu ( Rysunek 6E). Ponadto do analizy wizualnej można uzyskać kolorowe mapy przedstawiające lokalne parametry kolagenu strukturalnego w całej próbce płytki nazębnej (Rysunek 6F, G). Dla reprezentatywnej próbki testowej w Rysunek 6 stwierdzono dużą zmienność parametrów strukturalnych kolagenu w obrębie próbki (średnia ± SD wynosząca μ_p = -34° ± 32°; σ_p = 21° ± 4°; P_ani = 0,49 ± 0,14, jeśli kierunek obwodowy jest zdefiniowany jako 0°). Ta zmienność wewnątrz próby podkreśla znaczenie uzyskiwania lokalnych parametrów strukturalnych zamiast zakładania jednorodności.

Testy mechaniczne<br /> Zachowanie przy zerwaniu
Szybka kamera dostarcza obrazy odkształceń i pęknięć próbek płytki nazębnej podczas testów mechanicznych (Rysunek 7). Na podstawie tych obrazów można zidentyfikować miejsce inicjacji pęknięcia i ścieżkę propagacji pęknięcia. Wyniki identyfikacji pęknięcia są nieoptymalne, jeśli na obrazach z kamery występują pęcherzyki lub odbicia lub jeśli pęknięcie rozchodzi się zbyt szybko, aby można je było uchwycić przy wybranej liczbie klatek na sekundę.

Lokalne wzorce szczepów
Cyfrowa analiza korelacji obrazu na nagraniach z kamer uzyskanych podczas jednoosiowej próby rozciągania dostarcza lokalnych map deformacji tkanek, takich jak mapy odkształceń Greena-Lagrange'a pokazane na rysunku Rysunek 8. Mapy te przedstawiają trzy składowe odkształcenia (ε_xx, ε_xy i ε_yy) w ramce przed inicjacją zerwania. Z tych map odkształceń można wyodrębnić średnie szczepy w obszarze zainteresowania i lokalne odkształcenia w miejscu, takim jak miejsce pęknięcia.

Dla reprezentatywnej próbki w Rysunek 8, dane lokalnego szczepu pokazują dużą zmienność wewnątrz próby. Dla reprezentatywnej próbki testowej w Rysunek 8, stwierdzono dużą zmienność wewnątrz próbki w lokalnych szczepach (zakresy obserwowanych szczepów są następujące: ε_xx = -0,30-0,17; ε_xy = -0,13-0,20; ε_yy = 0-0,40). Podkreśla to znaczenie pozyskiwania danych lokalnych zamiast ogólnych, średnich wartości uzyskanych przy założeniu jednorodności tkanki.

Korelacja informacji o tkankach mechanicznych i strukturalnych
Powyższe wyniki pozwalają na powiązanie miejscowej deformacji i zachowania tkanki przy pękaniu z architekturą kolagenu. Po zidentyfikowaniu miejsca pęknięcia na nagraniach z kamery (Rysunek 9A), można je odwzorować z powrotem na referencyjny obraz z kamery ( Rysunek 9B) i na skan płytki mikroskopowej ( Rysunek 9C). To pokazuje płytkę MPM-SHG, na której nastąpiło pęknięcie, oraz parametry strukturalne znalezione na tej płytce (Rysunek 9D). Parametry strukturalne znalezione na płytce, w której doszło do pęknięcia w reprezentatywnej próbie, pokazane na Rysunek 9, to_{μ p} = 28°, σ_p = 19° i P_ani = 0,6. Tę samą procedurę można również zastosować do miejsc niepękniętych tkanek. Ważne jest, aby pamiętać, że odwzorowanie miejsca pęknięcia na obrazie referencyjnym z ramki pęknięcia może być trudne w przypadku słabego wzoru plamek i niewyraźnych naturalnych punktów orientacyjnych. Ponadto, jeśli naturalne punkty orientacyjne tkanki nie są wystarczająco wyraźne, wspólna rejestracja nakładki skanowania kafelków i obrazów z kamery o dużej szybkości może być trudna.

Rysunek 1: Wykres przepływu pracy przedstawionego protokołu eksperymentalnego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Wybór płytek do obrazowania SHG na podstawie skanu płytki. (A) Próbka testowa przypięta do krzemu. (B) Skan kafelkowy badanej próbki uzyskanej za pomocą mikroskopii jasnego pola. Kafelki, które są wybrane do obrazowania SHG, są oznaczone niebieskimi kwadratami. (C) Projekcja maksymalnego natężenia MPM z SHG. Podziałka = 140 μm (C). Skróty: SHG = generacja drugiej harmonicznej; MPM = mikroskopia wielofotonowa. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Próbka płytki nazębnej umieszczona pod obiektywem mikroskopu wielofotonowego. Lokalizacja próbki płytki nazębnej jest zabezpieczona przez buforowaną fosforanami płytkę Petriego wypełnioną solą fizjologiczną. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Specjalnie zaprojektowany jednoosiowy tester rozciągania z zaznaczonymi różnymi komponentami. (A) Pełny przegląd systemu. Zwróć uwagę, że wkładki papieru ściernego w zaciskach są widoczne, ponieważ przymocowane są tylko dolne zaciski. (B) Powiększony obraz zacisków testera rozciągania z próbką do badań gotową do badania. Skróty: PVC = polichlorek winylu; LED = dioda elektroluminescencyjna. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Wyniki pobierania tkanek i przygotowania próbek z reprezentatywnych próbek. (A) Świeża i nienaruszona próbka płytki nazębnej, pobrana od pacjentów, którzy wyrazili na to zgodę, a którzy przeszli operację endarterektomii tętnicy szyjnej. (B) Rekonstrukcja 3D na podstawie skanu μCT. Zwapniała tkanka jest pokazana w kolorze jasnoniebieskim, a niezwapniała w kolorze czerwonym. Optymalna próbka bez zwapniałej tkanki można uzyskać z obszaru między niebieskimi liniami. (C) Rekonstrukcja 3D z tomografii komputerowej μCT wykazująca nieoptymalną blaszkę miażdżycową z nadmiarem zwapniałej tkanki. Podziałka = 3 mm. Skrót: μCT = mikrotomografia komputerowa. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Wyniki MPM-SHG z reprezentatywnej próby. (A) Przegląd skanowania kafelków; Wybrane kafelki do obrazowania są pokazane na niebiesko. (B) MIPy z różnych płytek. (C) Wykrywanie światłowodu przez narzędzie FOA z wybranego kafelka (#1). (D) Histogram orientacji światłowodu z wybranego kafelka. (E) Histogram orientacji włókien + dopasowanie Gaussa, z którego można wyodrębnić parametry strukturalne kolagenu z wybranej płytki. (F) Reprezentacja μ_p (orientacja czarnej linii) i σ_p (kolor tła) na całej próbce płytki. (G) Przedstawienie μ_p (orientacja linia) i P_ani (kolor tła) na całej próbce płytki. Podziałka = 140 μm (B,C). Skróty: MPM-SHG = mikroskopia wielofotonowa-generacja drugiej harmonicznej; MIP = prognozy maksymalnej intensywności; FOA = analiza orientacji włókien; μ_p = dominujący kąt włókna; P_ani = frakcja anizotropowa; σ_p = odchylenie standardowe rozkładu kąta światłowodu; P_iso = frakcja izotropowa. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7: Inicjacja i rozprzestrzenianie się pęknięcia w próbce tkanki płytki nazębnej podczas procedury próby rozciągania.1) Stan wstępnego rozciągnięcia, nienaruszona tkanka. 2) Inicjacja pęknięcia – pierwsza klatka, w której obserwuje się pęknięcie. Miejsce inicjacji pęknięcia jest oznaczone czerwonym kwadratem. 3) i 4) Propagacja pęknięcia. 5) Całkowite pęknięcie próbki płytki nazębnej. Podziałka = 1 mm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 8: Wzorce odkształceń Greena-Lagrange'a reprezentatywnej próbki (ε_xx, ε_xy i ε_yy) w klatce przed pęknięciem, uzyskane za pomocą analizy DIC. Podaje się średnią i odchylenie standardowe na całej płytce nazębnej wraz z odkształceniem w miejscu pęknięcia. Skróty: DIC = cyfrowa korelacja obrazu; ε_xx = odkształcenie podłużne; ε_xy = ścinanie; ε_yy = odkształcenie rozciągające. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 9: Nałóż obraz miejsca pęknięcia (czerwony kwadrat) na obrazy. (A) Obraz z kamery o dużej szybkości, na którym zidentyfikowano pęknięcie (ramka zerwania). (B) Obraz z kamery o dużej szybkości, w którym stosowane jest tylko rozciąganie wstępne (klatka odniesienia). (C) Obraz skanu płytki uzyskany za pomocą mikroskopii. (D) Kolorowa mapa przedstawiająca lokalne parametry strukturalne kolagenu na różnych płytkach. Przedstawiono μ_p (orientacja czarnej linii) i P_ani (kolor tła) na całej próbce płytki. Skróty: μ_p = dominujący kąt włókna; P_ani = frakcja anizotropowa. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

Obecne badanie koncentrowało się na opracowaniu procesu obrazowania mechanicznego w celu zbadania korelacji między lokalną orientacją i dyspersją kolagenu, lokalnymi właściwościami mechanicznymi i zachowaniem pękania włóknistej tkanki miażdżycowej miażdżycy. Opisany w niniejszym dokumencie protokół jest innowacyjny z kilku powodów. Po pierwsze, po raz pierwszy zastosowano cyfrową korelację obrazu do pomiaru miejscowej deformacji tkanki płytki włóknistej pod wpływem obciążenia mechanicznego. Po drugie, protokół ten dostarcza informacji niezbędnych do analizy związku między miejscowym wzorcem deformacji a lokalną architekturą kolagenu w tkance płytki włóknistej. Znaczenie oceny miejscowej podkreślają zarówno dane dotyczące szczepu, jak i dane dotyczące kolagenu przedstawione w sekcji wyników, które pokazują niejednorodny charakter tkanki. W związku z tym zaleca się stosowanie technik umożliwiających ocenę miejscową, takich jak te stosowane w niniejszym protokole, do przyszłych badań właściwości płytki włóknistej.

Przygotowanie próbki testowej jest jednym z krytycznych etapów tego protokołu. Blaszki szyjne to głównie tkanki kolagenowe; Mogą jednak zawierać zwapnienia, które uważa się za wpływające na ogólne zachowanie mechaniczne płytki nazębnej^36,37. Ponieważ badanie koncentruje się na składniku tkanki włóknistej płytki nazębnej, unika się zwapnień w badanych próbkach dzięki zastosowaniu obrazowania μCT³⁸. Jeśli μCT nie jest dostępna, można rozważyć inne techniki obrazowania, takie jak MRI lub OCT³⁹, w celu wykrycia zwapniałych obszarów w blaszce miażdżycowej. Uzyskanie próbek do badania tkanek włóknistych, które są wolne od zwapnień i mają wystarczająco duży rozmiar, aby można je było przeprowadzić do badań mechanicznych, może być trudnym zadaniem w przypadku blaszek miażdżycowych, które są silnie zwapnione lub zawierają rozproszone zwapnienia. Kolejnym trudnym zadaniem w protokole jest wygenerowanie optymalnego wzoru plamek do cyfrowej korelacji obrazu. Optymalna rozdzielczość DIC wymaga proporcji czerni do bieli 50:50²⁸ i plamek o rozmiarze od trzech do pięciu pikseli^{29 w} celu zapewnienia odpowiedniej jakości. Niespełnienie tych wymagań może skutkować niedokładnymi pomiarami odkształceń miejscowych. Wreszcie, mapowanie miejsca pęknięcia na obrazach SHG może być trudne, jeśli naturalne punkty orientacyjne tkanki nie są wyraźne. W przypadku takich próbek pomocne będzie zastosowanie kilku markerów odniesienia do tkanki przed obrazowaniem.

Technika MPM-SHG stosowana w obecnym protokole jest lepsza od wielu innych technik obrazowania kolagenu, ponieważ jest to technika o wysokiej rozdzielczości i nieniszcząca o stosunkowo dużej głębokości penetracji. Ograniczeniem jest jednak głębokość penetracji (<400 μm) MPM-SHG, która nie pozwala na zobrazowanie całej grubości badanych próbek, która mieściła się w zakresie od 0,5 do 2 mm. W niedawnym badaniu z wykorzystaniem rezonansu magnetycznego tensora dyfuzji (DT-MRI) wykazaliśmy, że dominująca orientacja włókien w głębszych częściach tkanki płytki nazębnej może być inna niż w bardziej powierzchownych, świetlnych częściach tkanki¹⁴. W związku z tym uzasadnione są dalsze badania w celu zbadania lokalnej architektury kolagenu w głębszych częściach próbek grubej tkanki włóknistej płytki nazębnej i jej związku z lokalną mechaniką tkanek. W tym celu można wykorzystać spolaryzowane obrazowanie w dziedzinie częstotliwości przestrzennej (pSFDI). Doniesiono, że ta niedawno opracowana technika obrazowania optycznego może potencjalnie mierzyć orientację włókien na głębokości nawet 0,8 mm w płatkach zastawki mitralnej¹². pSFDI oferuje również szybką akwizycję, co może również ułatwić wizualizację całego obszaru próbki, a nie tylko wyboru płytek, jak ma to miejsce w obecnym protokole. Innym ograniczeniem obecnego protokołu jest to, że można zidentyfikować tylko deformację powierzchni. W przyszłych badaniach do tego protokołu może zostać włączony lustrzany multi-view DIC⁴⁰ lub cyfrowa korelacja objętości (DVC)⁴¹ w celu uzyskania dodatkowych informacji na temat wolumetrycznych, podpowierzchniowych odkształceń.

Obecny protokół eksperymentalny może być dalej rozszerzany lub modyfikowany na kilka sposobów w celu uzyskania dodatkowych informacji na temat mechaniki pękania płytki nazębnej i jej związku z leżącą u jej podstaw mikrostrukturą. Po pierwsze, obecny protokół obejmuje jednoosiową próbę rozciągania w kierunku obwodowym. Ten rodzaj badań mechanicznych został wybrany, ponieważ płytka nazębna doświadcza głównie rozciągania w kierunku obwodowym in vivo. W celu uzyskania bardziej wszechstronnej charakterystyki mechanicznej protokół ten można dodatkowo rozszerzyć o badanie inflacji, badanie dwuosiowe lub jednoosiowe badanie rozciągania w kierunku wzdłużnym. Po drugie, obecny protokół koncentruje się tylko na uzyskiwaniu lokalnych szczepów za pomocą DIC. Jednak bardziej kompletny obraz zachowania mechanicznego płytki nazębnej można uzyskać, włączając do protokołu również analizę naprężeń lokalnych, jednak wymaga to scharakteryzowania lokalnej sztywności. Chociaż obecnie jest to trudne, można to osiągnąć za pomocą technik obliczeniowych, takich jak metoda odwrotnych elementów skończonych ^42,43 i metoda pól wirtualnych⁴⁴. Oprócz adaptacji eksperymentalnej, do bieżącego protokołu można również dodać kilka dodatkowych kroków przetwarzania końcowego. Po pierwsze, zamiast tylko identyfikować miejsce pęknięcia, można zidentyfikować ścieżkę propagacji pęknięć za pomocą uzyskanych obrazów z kamer o dużej prędkości. Ta ścieżka propagacji może być skorelowana z lokalnymi parametrami konstrukcyjnymi i mechanicznymi. Po drugie, miejsce inicjacji pęknięcia zostało wizualnie zidentyfikowane w opisanym protokole. W poprzednim badaniu na tkankach niebiologicznych wykorzystano nieciągłości w pomiarach odkształceń DIC w celu wykrycia pęknięcia⁴⁵. Zastosowanie takiego automatycznego wykrywania pęknięcia na tkankach płytki nazębnej może poprawić dokładność wykrywania pęknięcia. Wreszcie, ogromną zaletą MPM-SHG w porównaniu z innymi technikami obrazowania kolagenu jest to, że wizualizuje poszczególne włókna kolagenowe. Dlatego dane uzyskane za pomocą tego protokołu mogą być również wykorzystane do zbadania dodatkowych lokalnych cech kolagenu, takich jak zawartość kolagenu.

Protokół ten może być wykorzystany do lepszego zrozumienia lokalnej charakterystyki tkanki płytki włóknistej, składnika, który mechanicznie ulega uszkodzeniu w przypadku pęknięcia płytki nazębnej in vivo. Informacje te są potrzebne do ustalenia nowych strukturalnych i funkcjonalnych markerów obrazowania, które przewidują pęknięcie blaszki miażdżycowej u pacjentów. Te nowe markery są konieczne, ponieważ wykazano, że wcześniej sugerowane biomarkery ryzyka mają nieoptymalną wartość predykcyjną dla przyszłych zdarzeń klinicznych ^5,6. W przyszłości OCT i ps-OCT mogą identyfikować i określać ilościowo tkankę włóknistą w układzie tętniczym 46,47,48. Ponadto szczep został uznany za zastępczy marker składu miejscowej płytki nazębnej⁴⁹. W związku z tym pomiary szczepów in vivo ⁴⁹ mogą potencjalnie pomóc w identyfikacji stabilności płytki nazębnej u pacjentów. Należy jednak zachować ostrożność z bezpośrednim przekładaniem uzyskanych wyników na pęknięcie płytki nazębnej in vivo. Po pierwsze, włóknista tkanka płytki miażdżycowej doświadcza bardziej złożonego obciążenia in vivo niż jednokierunkowe obciążenie rozciągające stosowane w tym protokole. Po drugie, blaszki miażdżycowe są strukturami wieloskładnikowymi; Na rozkład naprężeń i odkształceń in vivo w tkance płytki włóknistej może mieć wpływ obecność i lokalizacja innych składników płytki nazębnej, takich jak zwapnienia³⁷.

Ten potok obrazowania mechanicznego może być również wykorzystany do badania innych tkanek kolagenowych. Globalne badania mechaniczne i obrazowanie strukturalne kolagenu są już szeroko stosowane w tkankach biologicznych. Jednak lokalna ocena właściwości przed uszkodzeniem i uszkodzeniem, a także architektura kolagenu, ma kluczowe znaczenie dla dokładnej charakterystyki mechanicznej heterogenicznych tkanek włóknistych. Spodziewamy się, że struktura tego nowego protokołu dostarczy dalszych informacji na temat wzajemnych zależności między mikrostrukturą a mechaniką kilku tkanek biologicznych.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pierścień przedłużający 10 mm	Thorlabs Inc.	Rurka CML10
15 ml	VWR	525-0150
20x APO Obiektyw do zanurzenia w wodzie	Oprogramowanie Leica	507701
3D Slicer	Nie dotyczy	Wersja 4.11
Probówki 50 ml	VWR	525-0156
Pistolet aerografu AB 430 - średnica dyszy 0,3 mm	Conrad	4.01614E+12
Blackout, tkanina nylonowa z Powłoka poliuretanowa	Thorlabs
barwnik tkankowy	Polysciences inc	24113-2
Obiektyw aparatu, ogniskowa 50 mm	Thorlabs Inc.
Statyw fotograficzny	VWR	241-0093, 241-7311
Laser wielofotonowy Chameleon Ultra	Koherentna
sprężarka + wąż powietrzny	JUN-AIR, Conrad	B07GB9HC62, 4016138577198
Excel	Microsoft	2208
Taśma piankowa dwustronna, 1,9 x 150 cm	Pattex
Łaźnia grzewcza	Nie dotyczy		Wykonana na zamówienie
szybka kamera + oprogramowanie do obrazowania	Pixelink-Navitar Inc.	PL-D725
Ludzkie blaszki miażdżycowe tętnicy szyjnej (po operacji endarterektomii tętnicy szyjnej)	Nie dotyczy
Obraz J	Institute of Health	N/A
LAS-AF	Leica	w wersji 2.3	Oprogramowanie do obrazowania mikroskop wielofotonowy
LEICA TCS SP5 II	Leica		używany do obrazowania SHG
System oświetlenia	Instrumenty AMZ	LED-60TB	Służy do uzyskiwania wyraźnych obrazów za pomocą szybkiej kamery
MATLAB	MathWorks	Wersja R2021A
Oprogramowanie FibLab oparte na MATLAB	Uniwersytet Techniczny w Eindhoven	Nie dotyczy
Narzędzie FOA (Fibre Orientation Analysis) oparte na MATLAB	Uniwersytet Techniczny w Eindhoven	dotyczy
Oprogramowanie Ncorr oparte na MATLAB	Gruzja Instytut	Technologii wersja 1.2
Igły	Szmaragdowa	BDAM302986
szalka Petriego (średnica 10 cm)	VWR	BRND452000
Parafilm	Pipety Pasteura VWR	291-1214
	VWR	ELKA127-P511-000
Quantum GX2 Mikrotomografia komputerowa (μ CT) skaner + filtr rentgenowski Cu 0,06 mm + Al 0,5 mm	PerkinElmer	CLS149276
Linijka	Narzędzia precyzyjne	1800030
Papier ścierny (P180)	Conrad	4.00932E+12
Obcinak boczny	Conrad	4.25084E+12
Baza z elastomeru silikonowego i utwardzacz (Sylgard 184)	VWR	634165S
Tester rozciągania + oprogramowanie + zaciski	Nie dotyczy		Wykonane we własnym zakresie przy użyciu cylindrycznego siłownika liniowego (EACM2E10AZAK, Oriental Motor Ltd.) i ogniwa obciążnikowego 10 N (LCMFD-10N, Omega Engineering Inc.)
Wkrętak dynamometryczny	Garant, Hoffman group	659906