Artykuł metodologiczny

Wykrywanie celów oparte na aptamierach ułatwione przez 3-stopniową izotermiczną reakcję amplifikacji wykładniczej G-Quadruplex

DOI:

10.3791/64342

⸱

6 października 2022

 ,  , 
1Aptagen LLC

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecny protokół demonstruje użycie szybkiego, 3-stopniowego, opartego na aptamie testu wykładniczego amplifikacji do wykrywania celów. Przygotowanie próbki, wzmocnienie sygnału i rozwój koloru są omówione w celu wdrożenia tego systemu do rozpoznawania obecności teofiliny w porównaniu z kofeiną.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aptamery to cząsteczki rozpoznające cele, które wiążą się z wysokim powinowactwem i specyficznością. Cechy te można wykorzystać do kontrolowania innych cząsteczek ze zdolnością generowania sygnału. W przypadku opisanego tutaj systemu, rozpoznawanie celu za pomocą domeny aptamerycznej, Stem II zmodyfikowanego rybozymu młota, aktywuje samorozszczepiający się rybozym poprzez stabilizację początkowo nieustrukturyzowanego konstruktu. Cis-rozszczepiający RNA działa na styku łodygi III i łodygi I, tworząc dwa produkty rozszczepienia. Dłuższy produkt rozszczepienia przygotowuje izotermiczną reakcję wykładniczej amplifikacji (EXPAR) dwóch podobnych katalitycznie aktywnych G-kwadrupleksów. Te powstałe produkty amplifikacji katalizują redukcję peroksydazy, która jest sprzężona z redukcją substratu kolorymetrycznego z wyjściem, które można wykryć gołym okiem. 3-częściowy system opisany w niniejszym badaniu ulepsza metody wykrywania, takie jak testy immunoenzymatyczne (ELISA), wytwarzając wizualnie wykrywalny sygnał wskazujący na obecność teofiliny już o 0,5 μM w ciągu zaledwie 15 minut.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aptamery to zazwyczaj jednoniciowe DNA lub RNA wybrane w procesie ewolucyjnym o wysokim powinowactwie wiązania i swoistości do pożądanych celów1. Oprócz zdolności wiązania, aptamery mogą być połączone z motywami i sterować nimi za pomocą funkcji wyjścia sygnału2,3, wzmacniając wspomniany sygnał i poprawiając czułość systemu. System izotermicznej reakcji wykładniczego wzmocnienia G-quadruplex (GQ-EXPAR) jest trzyczęściowym systemem (Rysunek 1), który wytwarza sygnał wizualny, gdy kolejne składniki są dodawane do pojedynczego naczynia reakcyjnego w celu wytworzenia wizualnego wyjścia4. System ten pozwala na wykrycie określonego celu, w tym teofiliny, w danej próbce w ciągu 15 minut przy użyciu usprawnionego przepływu pracy, aby umożliwić szybkie, specyficzne wykrycie interesującego celu. Metodę tę należy uwzględnić w odniesieniu do próbek, w przypadku których specyficzne oznaczanie ilościowe stężenia docelowego stanowi mniejsze zagrożenie niż wysoka swoistość odpowiedzi w krótkim czasie.

Ryboprzełącznik allosteryczny, cząsteczka RNA (rybozym) zmieniająca strukturę, która ulega samodzielnemu rozszczepieniu, wytwarza początkowy sygnał. Konstrukt ten oparty jest na rybozymie młota, z domeną aptameryczną wprowadzoną w Stem II jako regulator aktywności rozszczepienia. Jego funkcja samorozszczepienia jest aktywowana, gdy jego domena aptameryczna jest ustabilizowana podczas wiązania z target5. W przeciwnym razie przełącznik jest nieaktywny w swoim stanie natywnym.

Następująca po sobie reakcja amplifikacji wykładniczej (EXPAR) wykorzystuje uwolnienie samorozszczepionej nici RNA z pierwszego etapu do zapoczątkowania izotermicznej reakcji amplifikacji6. Produkt amplifikacji EXPAR ma aktywność peroksydazy7, działając jako podstawa dla ostatniego etapu systemu. Kiedy niektóre podłoża są utleniane w połączeniu z rozpadem nadtlenków, wytwarzają one fluorescencyjną moc wyjściową, którą można zmierzyć na różnych instrumentach. Inne popularne podłoża można zastąpić w celu wytworzenia kolorowego produktu do wykrywania wizualnego. EXPAR i aktywność peroksydazy w jego produktach wzmacniających działają jak 2-stopniowy wzmacniacz sygnału, zwiększając czułość do wyższych poziomów w porównaniu z konwencjonalnymi strategiami7,8.

Wykrycie teofiliny w porównaniu z kofeiną jest używane jako przykład specyficzności tej platformy wykrywania, ponieważ różnią się one tylko jedną grupą metylową (Rysunek 2). Ta demonstracja systemu daje wynik kolorymetryczny do wizualnego wykrywania teofiliny o długości co najmniej 500 nM.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zobacz Tabelę Uzupełniającą 1 (tabelę ustawień reakcji) dla przygotowania probówki, w tym konkretnych objętości i stężeń składników reakcji. Przedstawiony tutaj protokół wykorzystuje wstępnie zmontowany zestaw platformy detekcyjnej, zgodnie z opisem w tabeli materiałów. Wszystkie elementy muszą być przechowywane na lodzie, chyba że wskazano inaczej.

1. Przygotowanie rybozymu

UWAGA: Podstawowym składnikiem wykrywania jest allosteryczny (regulowany przez aptamer) rybozym rozpoznający teofilinę (patrz Tabela Uzupełniająca 2).

  1. Zbierz 5 U kinazy polinukleotydowej T4 (0,5 μl, patrz tabela materiałów) w probówce PCR, która zostanie użyta do aktywacji produktów rozszczepienia rybozymu.
    UWAGA: Ten składnik jest dodawany jako pierwszy, aby użytkownik mógł zobaczyć prawidłowe dozowanie enzymu.
  2. Dodać 1 μl wstępnie przygotowanego 5x buforu rybozymu (patrz tabela materiałów) do każdej probówki z próbką (probówki do PCR).
  3. W celu wizualnego wykazania swoistości dodać 1,5 μl 2 mM teofiliny (tarcza) lub 2 mM kofeiny (kontrola) (patrz tabela materiałów) do każdej probówki z próbką jako próbki do badań.
    UWAGA: W celu wyznaczenia krzywej wzorcowej zaleca się rozpoczęcie od analitu 3,125 mM i testowanie pięciokrotnych rozcieńczeń do 0,001 mM.
  4. Dokładnie wymieszać każdą probówkę z próbką, pipetując 5-10 razy.
  5. Dodać 2 μl RNA o długości 600 nM zawierającego domenę aptameryczną specyficzną dla celu (patrz tabela materiałów) do każdej probówki z próbką, aby uzyskać końcowe stężenie 240 nM w 5 μl roztworu testowego, a następnie szybko wymieszać pipetując i umieścić na zimnym bloku, aby zminimalizować sygnał tła.
    UWAGA: ważne jest, aby początkowo przygotować wszystkie reakcje bez rybozymu, ponieważ reakcja samorozszczepienia rozpocznie się natychmiast po połączeniu rybozymu z buforem rybozymu i może wytworzyć znaczne tło.
  6. Po przygotowaniu wszystkich probówek reakcyjnych inkubować każdą próbkę (5 μl) w temperaturze pokojowej (23 °C) dokładnie przez 3 minuty za pomocą timera. Po inkubacji natychmiast umieścić probówki z próbkami w lodowisku (4 °C).

2. GQ-EXPAR

  1. Dodać 3,5 μl mieszaniny enzymatycznej niknazy i polimerazy (patrz tabela materiałów) do każdej probówki z próbką i dobrze wymieszać.
    UWAGA: Wymagane stężenia enzymów zależą od sekwencji rozpoznawania, typów enzymów i temperatur reakcji, których kombinację określono empirycznie.
  2. Dodać 31,5 μl mieszaniny reakcyjnej EXPAR zawierającej matrycę, nukleotydy i bufor reakcyjny (patrz tabela materiałów) do każdej probówki z próbką i pipety, aby wymieszać.
    UWAGA: Stężenia składników są optymalizowane w oparciu o enzymy i sekwencje produktów polimerazy.
  3. Po przygotowaniu wszystkich próbek każdą z przygotowanych próbek (40 μl) inkubować w temperaturze 55 °C dokładnie przez 5 minut, używając timera. Jeśli to możliwe, inkubuj na termocyklerze, chociaż podgrzewana pokrywka nie jest konieczna.
  4. Po zakończeniu inkubacji natychmiast umieścić probówki z próbkami w lodowisku (4 °C).

3. Rozwój kolorów

  1. Dodać 2 μl roztworu Hemina (25 μM, patrz tabela materiałów) do każdej probówki z próbką i dobrze wymieszać.
  2. Dodać 58 μl dostępnego w handlu roztworu TMB (patrz tabela materiałów) do każdej probówki z próbką i dobrze wymieszać.
  3. Inkubować reakcję rozwoju barwy (100 μl) w temperaturze pokojowej przez co najmniej 3 minuty i do 30 minut.
    UWAGA: (Opcjonalnie) Rozwój koloru można zatrzymać, dodając 20 μl 2 M kwasu siarkowego.
  4. Odczytać próbki jakościowo na oko lub określić ilościowo wyniki za pomocą czytnika płytek absorbancji przy długości fali 450 nm, jeśli reakcje rozwoju barwy zostały zatrzymane przy użyciu kwasu siarkowego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Platforma detekcyjna przedstawiona w Rysunek 1 przekształca rozpoznanie celu aptamerycznego w wizualnie wyraźne różnice między preparatami próbki (cel vs. nie-cel, Rysunek 2) w krótkim czasie. Rybozym allosteryczny zidentyfikowany przez Soukup et al.5 posłużył jako punkt wyjścia do stworzenia mniej hałaśliwej sekwencji z odpowiedzią na cel w stosunku do próbek kontrolnych i ujemnych. Zoptymalizowany konstrukt był w stanie rozpoznać zaledwie 500 nM ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiona tutaj metoda wykorzystuje przejście między początkowo nieuporządkowaną strukturą drugorzędową w rybozymie allosterycznym a dodatkową stabilnością uzyskaną poprzez wiązanie celu z domeną aptameryczną w celu aktywacji rybozymu młota rozszczepiającego cis. Stabilność rybozymu została dostosowana w celu zminimalizowania aktywności katalitycznej pod nieobecność celu, jednocześnie umożliwiając wiązanie celu w celu przywrócenia aktywnej struktury. Ponadto należy zwrócić uwagę na zrównoważenie wielu enzymów wymagan...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aptagen, LLC produkuje i sprzedaje zestaw demonstracyjny GQ-EXPAR dla tych, którzy chcą mieć bezpośrednie doświadczenie z systemem wykrywania opartym na aptamie.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez Fundusze na Rozwój i Rozwój od Aptagen LLC.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Roztwór dichlorowodorku 3,3',5,5'-tetrametylobenzydyny (TMB) z H2O2, "MaxSignal TMB Microwell Substrate Solution"PerkinElmerFOOD-1806-1000Odczynnik do rozwoju koloru. Zminimalizuj ekspozycję na światło i atmosferę. Poprzednio numer katalogowy BIOO Scientific 1806.
Dostarczany w zestawie demonstracyjnym Apta-beacon jako rura 3-2.
5'- TCC CTC CCT CCC TCC CAG TCC AGA CTC TTC CCT CCC CCC TCC CTC CCA GA-Biotyna-3Integrated DNA Technologies (IDT)Niestandardowa, zoptymalizowana matryca DNA QtQ47 dla EXPAR do produkcji G-quadruplex, zagruntowanej przez G-quadruplex. Jest to wykorzystywane w "wykładniczej" części EXPAR, aby szybko zwiększyć ilość DNAzymu używanego do opracowywania koloru w kroku 3. Szablon zawiera 3'-biotynę, aby zapobiec niezamierzonemu rozszerzeniu przez polimerazę DNA Bst 2.0 podczas EXPAR.
Część zestawu demonstracyjnego Apta-beacon Tube 2-2.
5'-GGG AAC UAU ACA ACC UAG GGC GAC CCU GAU GAG CCU UAU ACC AGC CGA AAG GCC CUU GGC AGA CGU UGA AAC GGU GAA AGC CGU AGG UUG CCC UAG UUG UUG UAG GUU GUA UAG UU-3'Zintegrowane technologie DNA (IDT)Niestandardowasekwencja rybozymu allosterycznego rozpoznająca teofilinę (samorozszczepiający się rybozym regulowany przez domenę aptamerową RNA dla teofiliny) zmodyfikowana z Soukup et al.
Soukup, GA, Emilsson, GAA i Breaker, RR (2000) Zmiana molekularnego rozpoznawania aptamerów RNA przez selekcję allosteryczną, Journal of molecular biology 298, 623-632.
Dostarczana w zestawie demonstracyjnym Apta-beacon jako rurka 1-3.
5'-TCC CTC CCT CCC TCC CAG TCC AGA CTC TAC GGC TTT CAC CGT TTC AAC G-Biotyna-3Integrated DNA Technologies (IDT)Niestandardowazoptymalizowana matryca DNA P3tQ49 dla EXPAR do produkcji G-quadruplex, zagruntowana produktem rozszczepienia P3. Jest to używane w Kroku 2 do translacji produktu rozszczepienia na DNAzyme używany do opracowywania koloru w Kroku 3. Szablon zawiera 3'-biotynę, aby zapobiec niezamierzonemu rozszerzeniu przez polimerazę DNA Bst 2.0 podczas EXPAR.
Część zestawu demonstracyjnego Apta-beacon Tube 2-2.
5x Bufor rybozymowyAptagen, LLCN/A5x skład: 600 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM MgCl2, 25 mM DTT. Używany w kroku 1.
dostarczany w zestawie demonstracyjnym apta-beacon jako rura 1-4.
Apta-beaconTM (GQ-EXPAR, TMB) Zestaw demonstracyjnyAptagen, LLCGQ-EXPAR-TMBZestaw demonstracyjny przedstawia specyfikę testu kolorymetrycznego poprzez wykrywanie trudnych celów małocząsteczkowych, teofiliny i kofeiny, które różnią się tylko jedną grupą metylową.
Polimeraza DNA Bst 2.0New England BiolabsM0537SPolimeraza z amplifikacją izotermiczną o aktywności przemieszczenia nici. Część mieszanki nikkazy i polimerazy, przygotowana w 9,375 U/uL.
Część zestawu demonstracyjnego Apta-beacon Tube 2-1.
Bufor 3.1New England BiolabsB6003SVIALW połączeniu z 2 μl 10-krotnego buforu do amplifikacji izotermicznej i 27,5 μl wody wolnej od nukleaz w celu wytworzenia 1,11-krotnego buforu EXPAR w EXPAR Mix. Ten produkt zastępuje poprzednio używany B7203SVIAL, który był częścią początkowego rozwoju systemu (ten sam skład, z wyjątkiem nierekombinowanego BSA).
Część zestawu demonstracyjnego Apta-beacon Tube 2-2.
KofeinaSigma-AldrichC0750-100GPrzeciwtarcza aptamerowa (kontrolna), przygotowana z wodą wolną od nukleaz.
Dostarczany w zestawie demonstracyjnym Apta-beacon jako tuba 1-1.
dNTPsNew England BiolabsN0447SCzęść mieszaniny reakcyjnej EXPAR.
Część zestawu demonstracyjnego Apta-beacon Tube 2-2.
EXPAR mieszanina reakcyjnaAptagen, LLCN/A0,44 mM dNTPs, 0,38 μ M P3tQ49, 0,38 μ M QtQ47, 44,44 mM Tris-HCl (pH 8,4), 63,5 mM NaCl, 31,5 mM KCl, 6,35 mM MgCl2, 1,27 mM MgSO4, 6,35 mM (NH4)2SO4, 63,5 i mu; g / ml BSA, 0,0635 % Tween 20,
Część zestawu demonstracyjnego Apta-beacon Tube 2-2.
HeminSigma-AldrichH9039Zawieszony w DMF do końcowego stężenia 25 uM.
Dostarczany w zestawie demonstracyjnym Apta-beacon jako rura 3-1.
Izotermiczny bufor amplifikacyjnyNew England BiolabsB0537SVIALW połączeniu z 2 μl 10x buforu 3,1 i 27,5 i mikro; L wody wolnej od nukleaz do wytworzenia 1,11x buforu EXPAR w EXPAR Mix.
Część zestawu demonstracyjnego Apta-beacon Tube 2-2.
MgCl2Amresco (VWR)E525-500MLKofaktor rybozymu Hammerhead, niezbędny do samodzielnego rozszczepienia.
Część zestawu demonstracyjnego Apta-beacon Tube 1-3.
Termocykler MJ PTC-100MJ Research, Inc.PTC-100Termocykler do kontroli temperatur inkubacji. Można użyć dowolnego termocyklera lub gorącego bloku.
N, N-dimetyloformamid (DMF)Sigma-Aldrich227056-100MLSłuży do ponownego zawieszenia heminy i maksymalizacji okresu przydatności do spożycia w zamrażarce.
Część zestawu demonstracyjnego Apta-beacon Tube 3-1.
Mieszanka niktazy-polimerazyAptagen, LLCN/ANT.BstNBI (9.375 jednostek/μ L) i polimeraza DNA Bst 2,0 (0,5 jednostki/μ L).
Dostarczany w zestawie demonstracyjnym apta-beacon jako rura 2-1.
Nt.BstNBINew England BiolabsR0607SEnzym nacinający umożliwiający ciągłą amplifikację izotermiczną. Część mieszanki niknazy i polimerazy, przygotowana w temperaturze 0,5 U/uL.
Część zestawu demonstracyjnego Apta-beacon Tube 2-1.
Bufor kinazy T4 NewEngland BiolabsB0201SVIALBufor dla enzymu niezbędnego do usuwania cyklicznego fosforanu.
Część zestawu demonstracyjnego Apta-beacon Tube 1-4.
Kinaza polinukleotydowa T4New England BiolabsM0201SUsuwa cykliczne fosforany po rozszczepieniu, aby umożliwić produktowi rozszczepienia przygotowanie reakcji amplifikacji izotermicznej.
Dostarczany w zestawie demonstracyjnym Apta-beacon jako probówki PCR.
Tecan GENios FLTecanGenios-FL TWTCzytnik płytek do pomiaru sygnału absorbancji z wyników kroku 3.
TheophyllineSigma-AldrichT1633-50GCel aptamerowy, przygotowany z wodą wolną od nukleaz.
Dostarczany w zestawie demonstracyjnym Apta-beacon jako rurka 1-2.
Tris-HClAmerican BioanalyticalAB14043-01000Aptamer binding buffer.
Część zestawu demonstracyjnego Apta-beacon Tube 1-4.
''

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).
  2. Tang, J., Breaker, R. R. Rational design of allosteric ribozymes. Chemical Biology. 4 (6), 453-459 (1997).
  3. Stoltenburg, R., Reinemann, C., Strehlitz, B. SELEX--A (r)evolutionary method to generate high-affinity nucleic acid ligands. Biomolecular Engineering. 24 (4), 381-403 (2007).
  4. Liao, A. M., et al. A simple colorimetric system for detecting target antigens by a three-stage signal transformation-amplification strategy. Biochemistry. 57 (34), 5117-5126 (2018).
  5. Soukup, G. A., Emilsson, G. A., Breaker, R. R. Altering molecular recognition of RNA aptamers by allosteric selection. Journal of Molecular Biology. 298 (4), 623-632 (2000).
  6. Van Ness, J., Van Ness, L. K., Galas, D. J. Isothermal reactions for the amplification of oligonucleotides. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (8), 4504-4509 (2003).
  7. Cheng, X., Liu, X., Bing, T., Cao, Z., Shangguan, D. General peroxidase activity of G-quadruplex-hemin complexes and its application in ligand screening. Biochemistry. 48 (33), 7817-7823 (2009).
  8. Nie, J., et al. Reporter-triggered isothermal exponential amplification strategy in ultrasensitive homogeneous label-free electrochemical nucleic acid biosensing. Chemical Communications. 50 (47), 6211-6213 (2014).
  9. Tabuchi, T., Yokobayashi, Y. Cell-free riboswitches. RSC Chemical Biology. 2 (5), 1430-1440 (2021).
  10. Ao, Y., et al. Integration of an expression platform in the SELEX cycle to select DNA aptamer binding to a disease biomarker. ACS Omega. 7 (12), 10804-10811 (2022).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Aptamer Target DetectionG Quadruplex AmplificationRibozyme CleavageColorimetric DetectionPeroxidase ActivityTheophylline DetectionAbsorbance Plate ReaderRNA AptamerStandard Calibration Curve

Powiązane artykuły