Indukowane laserowo pomiary potencjału czynnościowego kardiomiocytów na układach mikroelektrod w celu zwiększenia predykcyjności bezpieczeństwa farmakologii

Summary

Kombinacja poracji laserowej i matryc mikroelektrod (MEA) pozwala na rejestrację kardiomiocytów z hodowanych pierwotnych i pochodzących z komórek macierzystych zapisów podobny do potencjału czynnościowego. Kształt fali zapewnia lepszy wgląd w sposób działania badanych związków niż standardowe nagrania. Łączy on patch-clamp i odczyt MEA, aby jeszcze bardziej zoptymalizować badania nad bezpieczeństwem kardiologicznym w przyszłości.

Abstract

Zagrażająca życiu arytmia serca wywołana lekiem jest często poprzedzona przedłużonymi potencjałami czynnościowymi serca (AP), którym często towarzyszą małe proarytmiczne fluktuacje potencjału błonowego. Kształt i przebieg w czasie frakcji repolaryzacyjnej AP może mieć kluczowe znaczenie dla obecności lub braku arytmii.

Matryce mikroelektrod (MEA) umożliwiają łatwy dostęp do efektów związków kardiotoksycznych poprzez potencjały pola zewnątrzkomórkowego (FP). Chociaż jest to potężne i ugruntowane narzędzie w badaniach i farmakologii bezpieczeństwa serca, kształt fali FP nie pozwala wywnioskować oryginalnego kształtu AP ze względu na zasadę zapisu zewnątrzkomórkowego i wynikające z tego wewnętrzne filtrowanie prądu przemiennego (AC).

Nowatorskie urządzenie, opisane tutaj, może wielokrotnie otwierać błonę kardiomiocytów hodowanych na elektrodach MEA w wielu punktach czasowych hodowli, używając wysoce skupionej nanosekundowej wiązki laserowej. Poracja lasera powoduje przekształcenie sygnału elektrofizjologicznego z FP w wewnątrzkomórkowe AP (laser-induced AP, liAP) i umożliwia rejestrację transkomórkowych odchyleń napięcia. Ten wewnątrzkomórkowy dostęp pozwala na lepszy opis kształtu AP oraz lepszą i bardziej czułą klasyfikację potencjałów proarytmicznych niż zwykłe zapisy MEA. System ten jest rewolucyjnym rozszerzeniem istniejących metod elektrofizjologicznych, umożliwiając dokładną ocenę efektu kardiotoksycznego ze wszystkimi zaletami zapisów opartych na MEA (łatwe, ostre i przewlekłe eksperymenty, analiza propagacji sygnału itp.).

Introduction

Wkład elektryczny bicia serca wynika ze złożonego i precyzyjnie zsynchronizowanego współdziałania wielu kanałów i transporterów serca, a także precyzyjnie dostrojonej propagacji sygnałów elektrycznych przez mięsień sercowy¹. Zmiana tych ściśle skoordynowanych mechanizmów (np. stosowanie leków) może skutkować poważnymi konsekwencjami dla funkcji serca (tj. zagrażającą życiu arytmią)^2,3. Arytmie definiuje się jako nieregularne bicie serca, które zmienia normalny rytm serca, co może mieć zagrażające życiu konsekwencje. Mogą być one spowodowane albo upośledzoną inicjacją fali pobudzenia serca, albo nieprawidłową propagacją pobudzenia serca⁴, co z kolei skutkuje dysfunkcją mechanizmu pompowania serca.

Wiele kandydatów na leki o silnym działaniu musi zostać wykluczonych z dalszych badań we wczesnej fazie rozwoju leku ze względu na ich (pro)arytmiczny potencjał^2,3. Modulują one kluczowe kanały sercowe (np. ludzki kanał genowy związany z eterem (hERG), które są odpowiedzialne za prawidłowe tworzenie i terminację potencjału czynnościowego serca, a także późniejszą propagację sygnału⁵.

Firmy farmaceutyczne rutynowo używają pomiarów patch-clamp lub układów mikroelektrod (MEA) do badania potencjalnych kardiotoksycznych efektów off-target wywołanych przez kandydatów na leki. Zapisy patch-clamp pozwalają rozszyfrować wpływ substancji na kanały jonowe serca oraz analizować transkomórkowy potencjał czynnościowy serca z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną^6,7. Jednak do wad tej techniki należy niska przepustowość przy ręcznym zacisku krosowym i ograniczone zastosowanie automatyzacji ze względu na zależność tej metody od komórek w zawiesinie. Ponadto nie można badać skutków przewlekłych ze względu na inwazyjność metody. Wreszcie, zazwyczaj tylko pojedyncze komórki są badane jednocześnie, a nie cały syncytium serca, co uniemożliwia odniesienie się do informacji o propagacji sygnału.

Barwniki wrażliwe na napięcie są cenne do nieinwazyjnego badania potencjałów czynnościowych serca i arytmii wywołanych lekami⁸. Pozwalają one na badanie aktywności zarówno pojedynczej komórki, jak i syncytium. Wadą tej metody jest działanie cytotoksyczne zarówno barwników jako takich, jak i produktu reakcji podczas oświetlenia. Są one używane do ostrych eksperymentów i prawie nie mają zastosowania w badaniach długoterminowych^9,10,11. Białka wrażliwe na napięcie jako alternatywa poczyniły znaczne postępy w ciągu ostatnich kilku lat pod względem użyteczności i czułości, ale wymagają modyfikacji genetycznej komórek będących przedmiotem zainteresowania i nie mają wysokiej rozdzielczości czasowej w porównaniu z technikami elektrofizjologicznymi¹².

Informacje z najnowszej inicjatywy¹³ stwierdza, że MEA są szeroko stosowane w badaniach bezpieczeństwa kardiologicznego jako alternatywne podejście elektrofizjologiczne, ponieważ stanowią potężne i dobrze ugruntowane narzędzie do badania funkcji serca i bezpieczeństwa farmakologicznego. Kardiomiocyty są hodowane jako syncytium bezpośrednio na chipach, a potencjały pola zewnątrzkomórkowego (FP) są rejestrowane nieinwazyjnie za pomocą mikroelektrod zintegrowanych z substratem. Ta zasada nagrywania pozwala na przeprowadzanie badań przesiewowych o zwiększonej przepustowości przez kilka dni, co sprawia, że nadają się one do badań farmaceutycznych nad skutkami przewlekłymi. Wynikowy przebieg FP jest pochodną wewnątrzkomórkowego AP¹⁴. Parametry takie jak współczynnik uderzeń, amplituda początkowej części FP i czas trwania FP są łatwo dostępne¹⁵. Inne istotne kryteria, takie jak rozróżnienie między wydłużeniem a triangulacją FP (ważnego markera proarytmii^16,17) są niedostępne ze względu na efekt filtrowania AC tej techniki. Co więcej, wykrywanie innych małych zdarzeń proarytmicznych, takich jak wczesna i opóźniona depolaryzacja (odpowiednio EAD i DAD), jest często łatwe do przeoczenia ze względu na ich małą amplitudę.

Tutaj opisujemy metodę uzyskiwania dostępu do potencjału błony wewnątrzkomórkowej poprzez otwarcie błony kardiomiocytów. Urządzenie IntraCell (zwane dalej wewnątrzkomórkowym urządzeniem rejestrującym) umożliwia wielokrotne otwieranie błony kardiomiocytów hodowanych na elektrodach MEA za pomocą wysoce skoncentrowanej wiązki lasera nanosekundowego za pośrednictwem określonego zjawiska fizycznego (powierzchniowy rezonans plazmonowy)18. W rezultacie nagranie przechodzi ze zwykłego FP w wewnątrzkomórkowy AP (laser-induced AP, liAP). Protokół pokazuje, w jaki sposób pozwala to na uzyskanie dostępu do kinetycznych aspektów przebiegu, których nie można łatwo uchwycić poprzez analizę FP. Metoda ta stanowi pomost między tradycyjnym wewnątrzkomórkowym patch-clampem a zapisami MEA. Technologia ta stanowi zatem potężne rozszerzenie obecnych metod oceny bezpieczeństwa kardiologicznego.

Protocol

1. Przygotowanie indukowanych pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych

UWAGA: Kardiomiocyty iCell² (określane jako kardiomiocyty pochodzące z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych [iPSC]) zostały przygotowane zgodnie z protokołem dostarczonym przez dostawcę. Protokół zostanie pokrótce podsumowany w następnej sekcji.

1. Rozmrażanie i konserwację pożywki w temperaturze 4 °C przez 24 godziny przed użyciem.
2. Przygotować otoczkę fibronektyny, rozpuszczając sterylną fibronektynę w sterylnej wodzie o stężeniu 1 mg/ml. Zamrażać przechowywać ten zapas w porcjach (np. 25 μl na podwielokrotność). Rozcieńczyć podany roztwór podstawowy w stosunku 1:20 w sterylnym zrównoważonym roztworze soli (dPBS) firmy Dulbecco.
3. Za pomocą pipety o pojemności 10 μl pokryć pola elektrod wcześniej autoklawowanych MEA pod kapturem z przepływem laminarnym, kroplami w sterylnych warunkach. W tym celu upuść 5 μl roztworu powlekającego fibronektynę na pola elektrody i obserwuj tworzenie się kropli na powierzchni elektrody. Uważaj, aby nie dotykać wrażliwych elektrod.
   UWAGA: Aby utrzymać sterylne warunki, przenieś chip MEA na sterylną szalkę Petriego przed wyjęciem go z okapu z przepływem laminarnym.
4. Inkubować powlekane MEA przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C, najlepiej w inkubatorze.
5. Rozmrażać kriowiał zawierający kardiomiocyty w łaźni wodnej o temperaturze około 37 °C przez 2 minuty, aż pozostanie tylko niewielka ilość kryształków lodu. Delikatnie przenieść roztwór komórkowy do probówki o pojemności 50 ml.
6. Dodać 1 ml pożywki galwanicznej do pustego kriowiu. Przelewać roztwór kroplami przez okres 90 s do probówki o pojemności 50 ml, aby zmniejszyć szok osmotyczny. Delikatnie dodaj dodatkowe 8 ml medium galwanicznego do probówki.
7. Zawiesinę komórek należy dokładnie wymieszać za pomocą pipety o pojemności 10 ml. Oblicz całkowitą liczbę żywotnych komórek za pomocą automatycznej cytometrii fluorescencyjnej. Numer powinien być zbliżony do numeru w karcie katalogowej dostarczonej przez producenta.
8. Wirować roztwór komórek przez 3 minuty w temperaturze 200 x g w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant przez aspirację za pomocą szklanej pipety podłączonej do systemu pompowania. Dostosuj liczbę komórek w zakresie od 6 000 do 15 000 żywotnych komórek/μL.
   UWAGA: Liczba ogniw zwykle mieści się w zakresie podanym powyżej, ale może się różnić w zależności od odpowiedniego dostawcy.
9. Usunąć roztwór powlekający, który został nałożony w kroku 1.3 z obszaru elektrody MEA za pomocą pipety o pojemności 10 μl bezpośrednio przed wysiewem komórek. Wysiewaj komórki natychmiast po usunięciu, aby uniknąć wysuszenia powłoki. W tym celu należy zasiać komórki kroplami w ilości 4 μl zarówno dla 6-dołkowych, jak i 1-dołkowych MEA na polach elektrod w taki sam sposób, jak w przypadku powłoki.
10. Pozostawić komórki do przylegania przez 1 godzinę w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ przed napełnieniem studzienek sterylnym podłożem galwanicznym podgrzanym do około 37 °C w temperaturze 200 μl dla MEA 6-dołkowej i 1 ml dla MEA z pojedynczą studzienką pod okapem z przepływem laminarnym.
11. Wykonać pełną wymianę medium 48 godzin po poszyciu pod pokrywą z przepływem laminarnym. W tym celu należy usunąć podłoże galwaniczne przez zassanie za pomocą szklanej pipety podłączonej do systemu pompowego. Następnie dodać do studzienek 200 μl sterylnego podłoża konserwacyjnego podgrzanego do temperatury 37 °C.
12. Wykonuj pełne zmiany podłoża co drugi dzień.
13. Rozpocznij pomiar komórek 5-8 dni po rozmrożeniu. Wykonaj pełną wymianę podłoża na 2 godziny przed rozpoczęciem eksperymentów.

2. Nagrania MEA

UWAGA: Urządzenie używane do przekształcania sygnału FP na liAP składa się z pionowego mikroskopu i lasera o długości fali 1064 nm.

1. Umieść system MEA na górze urządzenia z uchwytem na wióry MEA wyśrodkowanym nad otworem obiektywu. Ustaw konfigurację MEA tak, aby obiektyw znajdował się bezpośrednio pod otworem systemu MEA, aby umożliwić laserowi skupienie się na elektrodach.
2. Przenieść chip MEA z wyhodowanymi komórkami z inkubatora do zestawu MEA na 15 minut przed rejestracją, umożliwiając komórkom regenerację po zakłóceniach mechanicznych.
3. Ostrożnie wyczyść podkładki stykowe i styki za pomocą izopropanolu i bawełnianego wacika, aby zmniejszyć poziom hałasu. Ostrożnie umieść MEA w konfiguracji MEA. Umieść chip MEA z logo na dole w lewym górnym rogu (6-dołkowy MEA) lub z elektrodą odniesienia po lewej stronie (MEA jednodołkowa).
4. Ustaw zintegrowane z systemem MEA ogrzewanie na 38 °C. Umieść małą komorę na chipie MEA, aby stale perfaktorować komórki nawilżonym karbogenem (5%_CO2 i 95%_O2), aby odtworzyć warunki w inkubatorze i zapobiec parowaniu.
5. Zamknij pokrywę urządzenia. Zintegrowany wyłącznik bezpieczeństwa umożliwia aktywację lasera tylko wtedy, gdy pokrywa jest zamknięta nad chipem MEA. Ustaw filtr systemowy MEA za pomocą programu konfiguracyjnego MEA na 0,1 Hz lub mniej górnoprzepustowego i 3,500 Hz dolnoprzepustowego.
6. Do nagrywania należy używać MC_Rack oprogramowania (oprogramowania do nagrywania) lub dowolnego alternatywnego oprogramowania. Dostosuj zakres wejściowy do swoich potrzeb, upewniając się, że sygnał nie nasyca amplifier i częstotliwość próbkowania (np. 20 kHz). Użyj funkcji długoterminowego wyświetlania w oprogramowaniu, aby sprawdzić nagranie.

3. Laserowe poracjonowanie komórek

1. Po włożeniu chipa MEA do konfiguracji MEA i skonfigurowaniu oprogramowania, zainicjuj mechanikę lasera za pomocą oprogramowania FB Alps (oprogramowanie inicjujące).
2. Najpierw kliknij przycisk Inicjalizacja. Pod koniec inicjalizacji wirtualny punkt laserowy znajdzie się odpowiednio w studzience D dla MEA z 6 dołkami i w lewym dolnym rogu dla MEA z jedną studnią.
3. Przesuń wirtualny punkt laserowy za pomocą Ctrl + kliknięcie myszą na środek elektrody D5 i dostosuj ostrość. Dostosuj ostrość, naciskając Ctrl + przewijanie kółkiem myszy.
4. Naciśnij przycisk Ustaw P1. Wirtualny punkt laserowy automatycznie przesunie się do dołka F. Powtórz proces z elektrodą F5 i wybierz Ustaw P2.
5. Po tej procedurze punkt lasera przesunie się do dołka B. Powtórz ten sam proces z elektrodą B5 i naciśnij Ustaw P3 w oprogramowaniu. System jest teraz wyrównany.
6. Dostosuj moc lasera i czas procesu do potrzeb swoich komórek. W tym przypadku wykorzystano 40% mocy i 25% czasu procesu.
7. Aby włączyć laser, kliknij przycisk Laser Off (Laser wyłączony), który pojawi się jako laser włączony. Przełącz się na oprogramowanie do nagrywania, wybierz filename i kliknij czerwony przycisk nagrywania, a następnie przycisk Odtwórz w górnej części okna, aby zarejestrować pomiar.
8. Zapisz linię bazową 60 s przed otwarciem komórek za pomocą lasera. Przełącz się z powrotem na oprogramowanie inicjujące.
9. Dezaktywuj elektrody, które mają być wykluczone przez laser na wirtualnej mapie po prawej stronie za pomocą Ctrl + kliknięcie myszą. Wybierz interesujące Cię elektrody, aktywując je na reprezentacji matrycy po prawej stronie okna oprogramowania.
10. Aby uruchomić laser, użyj Alt + kliknięcie myszą i wybierz środkową elektrodę tej studni. To inicjuje laser do automatycznego otwierania komórek na każdej elektrodzie tej studni. Powtórz dla każdej studzienki. Laser automatycznie otworzy wtedy wszystkie wcześniej aktywowane elektrody wybranej studni.

4. Obchodzenie się z lekami i ich stosowanie

1. Przygotować wszystkie substancje, które mają być użyte do testów narkotykowych, świeżo w dniu pomiarów. Upewnij się, że końcowe stężenie aplikacji jest 10 razy wyższe w pożywce, aby uzyskać rozcieńczenie 1:10 w studzienkach.
2. Rozpuść nifedypinę, E4031 i dofetylid najpierw w DMSO w stężeniu mM, a następnie dalej w pożywce do 10x pożądanego stężenia. Nigdy nie przekraczaj końcowego stężenia DMSO wynoszącego 0,1% w studni.
3. Rejestruj aktywność wyjściową przez 60 sekund. Rozpocznij porację indukowaną laserem, jak opisano w kroku 3 protokołu, co spowoduje przekształcenie FP w kształt liAP.
4. Zastosuj wszystkie leki w pojedynczym stężeniu na studzienkę. Usunąć 20 μl pożywki z każdej studzienki odpowiednio w przypadku MEA 6-dołkowych i 100 μl w przypadku MEA z pojedynczą studzienką. Dodać 20 μl lub 100 μl, w zależności od rodzaju MEA, roztworu podstawowego leku, który ma być mierzony, do studzienki i ostrożnie pipetować w górę i w dół 2-3 razy. Wykonaj co najmniej trzy replikacje każdego leku i stężenia, aby uzyskać znaczenie statystyczne.
5. Pozwól związkom myć się przez 300 sekund. W tym czasie kształt liAP może przekształcić się z powrotem w kształt FP. Ponownie wywołaj porację wywołaną laserem i rejestruj możliwe efekty wywołane związkiem na liAP przez dodatkowe 60 sekund.

5. Eksport danych

1. Wybierz odpowiednie elektrody, odtwarzając nagranie w oprogramowaniu do nagrywania. Użyj MC_DataTool, aby przekonwertować pliki MC_Rack na pliki .txt ASCII.
2. Kliknij Plik> Otwórz MCD > Wybierz plik MC_Rack. Kliknij przycisk txt (niebieski tekst).
3. Wybierz elektrodę. Wybrana elektroda zostanie pokazana na liście po prawej stronie.
4. Kliknij Przeglądaj, aby wybrać folder i zmienić nazwę nowego pliku .txt. Kliknij Zapisz.
5. Usuń zaznaczenie wyeksportowanej elektrody i wybierz następną elektrodę do wyeksportowania. Powtórz procedurę dla wszystkich interesujących Cię elektrod.

6. Obsługa danych i analiza statystyczna

1. Zaimportuj przekonwertowane ślady binarne do R¹⁹. Wizualizuj/analizuj dane za pomocą niestandardowych skryptów zawierających następujące pakiety: dplyr, tidyr i ggplot2^20,21,22.

Results

System rejestracji używany do rejestrowania aktywności elektrycznej z hodowanych kardiomiocytów składał się ze standardowego systemu MEA wyposażonego w grzałkę i komorę na karbogen podłączoną do komputera. System został umieszczony na wewnątrzkomórkowym urządzeniu rejestrującym, które z kolei zostało zamontowane na małej jednostce antywibracyjnej (Rysunek 1A-B).

kardiomiocyty pochodzące z iPSC² zaczęły bić samoistnie w ciągu 2-3 dni po rozmrożeniu (dni in vitro, DIV) i były widoczne pod mikroskopem. Począwszy od DIV 4, częstotliwość dudnień stała się regularna, a potencjały pola zewnątrzkomórkowego (FP) o amplitudach międzyszczytowych komponentu depolaryzującego od 1 do 5 mV można było wykryć na większości elektrod w odpowiednich studzienkach chipów MEA. Aktywność elektryczną udało się wykryć w ponad 95% badanych odwiertów. Począwszy od DIV 7, prawdopodobieństwo oderwania komórek wzrosło, co uniemożliwiło dalsze korzystanie z tych studni.

Oprogramowanie do kontrolowania indukowanego laserem otwarcia błony pozwala dostosować zarówno moc, jak i czas procesu lasera, który pośredniczy w otwarciu błony komórkowej tylko na badanej elektrodzie (Rysunek 1C), podczas gdy inne elektrody w odpowiedniej studni pozostają nienaruszone. Podczas gdy zbyt konserwatywne ustawienia nie zmieniały kształtu fali FP, zbyt wysokie ustawienia powodowały przypuszczalne uszkodzenie kardiomiocytów, na co wskazywało energiczne, ale przejściowe bicie lub utratę sygnału. Po ustawieniu 40% mocy i 25% czasu procesu dobrze tolerowanym przez ogniwa, wyzwolenie impulsu laserowego spowodowało wielokrotne zmiany w zarejestrowanym kształcie fali (patrz Rysunek 1D dla przykładowego nagrania). W tych warunkach makroskopowo nie zaobserwowano żadnych zmian w materiale elektrody. Amplituda rejestrowanego sygnału znacznie wzrosła o 4,1 ± 0,41 (n = 20, zakres 1,34-8,83) razy, analizowana z losowo wybranego podzbioru nagrań, co dało amplitudy od 7 do 22 mV. Co więcej, przebieg przekształcił się ze standardowego kształtu FP z szybkim, dwufazowym i przejściowym odchyleniem napięcia na początku, po którym nastąpiła faza plateau z powrotem na linii podstawowej i niewielkie odchylenie wskazujące na koniec FP do kształtu, który był bliższy wewnątrzkomórkowo zarejestrowanemu AP z szybkim wzrostem, rozszerzoną zdepolaryzowaną fazą plateau i fazą repolaryzacji z niedoregulowaniem poniżej linii podstawowej (Rysunek 1E). Zdefiniowaliśmy te odchylenia napięcia jako AP indukowane laserem (liAP). W większości przypadków przejście było przejściowe i przynajmniej częściowo odwrócone w ciągu 5 minut. Propagacja sygnału w syncytium serca pozostała niezmieniona po indukcji liAP (Ryc. 2), co wskazuje, że na pozostałą syncytium nie miało wpływu potencjalne uszkodzenie przez impuls laserowy.

Podobieństwa do wewnątrzkomórkowych zapisanych AP pozwoliły na wyodrębnienie parametrów liAP, które nie są dostępne dla FP (dla przykładowych parametrów zobacz np. Rysunek 3A), przede wszystkim pomiar czasu trwania liAP w określonych punktach czasowych (np. przy 20%, 50% i 90%) (Rysunek 3B), analogiczny do APD20/50/90 powszechnie używanego do opisu APs.

Następnie przetestowaliśmy reakcję kardiomiocytów otwieranych laserem na powszechnie stosowane kardioaktywne związki narzędzi farmakologicznych. Przykładowy projekt protokołu można znaleźć w Rysunek 3C. Ponieważ transformacja liAP nie zawsze utrzymywała się przez cały eksperyment, aplikację związku przeprowadzono jako pojedyncze stężenie na studzienkę, a nie w sposób skumulowany, aby skrócić całkowity czas rejestracji. Niemniej jednak konieczne było albo ponowne otwarcie ogniw, albo otwarcie innego obszaru elektrody przed nałożeniem badanego związku.

Dodanie specyficznego blokera kanałów Ca²⁺ typu L, Nifedipine^23,24, zmniejszyło fazę plateau liAP w sposób zależny od stężenia, a tym samym skróciło cały liAP (Rysunek 4A,B). To skrócenie było porównywalne z analizą uzyskaną z FP kardiomiocytów z niemanipulowanych elektrod (Figura 4C), co wskazuje, że ta metoda zapisu nie miała negatywnych skutków w porównaniu z klasycznymi zapisami FP.

E4031 hamuje repolaryzację odpowiedniego kanału potasowego Kv1.11 (hERG)²⁵ i prowadzi do arytmicznego zachowania kardiomiocytów w zwiększonych stężeniach. Podobnie jak w przypadku analizy uzyskanej z zapisów FP, E4031 wydłużył czas trwania liAP w sposób zależny od stężenia (Ryc. 5). Dodatkowo przy stężeniach 0,01 μM i wyższych widoczne były niewielkie dodatnie odchylenia napięcia na końcu liAP. Ugięcia te stawały się bardziej widoczne przy wyższych stężeniach, wskazując na przejściową nową depolaryzację, w przeciwieństwie do FP, gdzie te ugięcia były praktycznie niewidoczne (patrz Rysunek 5B-C, górne (FP) vs dolne (liAP)) ślady). To zachowanie jest znane jako wczesna dedepolaryzacja (EAD). Przy najwyższym stężeniu 0,1 μM, te EAD eskalowały z czasem do ektopowych dudnień, które są przedwczesnymi potencjałami czynnościowymi (Rysunek 5C). Zarówno EAD, jak i pobudzenia ektopowe są kluczowymi wskaźnikami aktywności proarytmicznej. Na końcu przykładu pokazanego w Rysunek 5D, aktywność elektryczna skutkowała arytmicznym dudnieniem. Również zależności stężenie-odpowiedź wyświetlane między zapisami FP i liAP były zgodne (Ryc. 5E). Istnieje jednak większa zmienność w danych FP wynikająca ze słabej składowej repolaryzacyjnej FP przy wyższych stężeniach badanego związku. Wydaje się, że charakterystyczną cechą kardiomiocytów pochodzących z iPSC² jest tendencja do generowania niefizjologicznie długich AP również w warunkach kontrolnych (czas trwania AP > 700 ms). System MEA zastosował wewnętrzne filtrowanie prądu przemiennego o częstotliwości 0,1 Hz, co z kolei skutkowało częściowo przefiltrowanym kształtem liAP, chociaż bez zasłaniania jakościowych informacji o początku i zakończeniu leżącego u podstaw AP.

Okazało się, że początkowe występowanie proarytmicznych odchyleń napięcia można było wykryć przy niższych stężeniach w liAP w porównaniu do zapisów FP. Pokazane w Rysunek 6 to zapis aktywności elektrycznej podczas stosowania Dofetilidu w stężeniu 3 μM. Nagranie uzyskano w tym samym odwiercie. Chociaż zarówno FP, jak i liAP wykazywały czas trwania około 2 s, przebieg FP nie rzucał się w oczy, prezentując regularne odchylenia repolaryzacyjne. W tym samym czasie, pod koniec liAP, EAD stały się widoczne. Ten wzrost istotnej czułości farmakologicznej dotyczącej bezpieczeństwa dodatkowo potwierdza odkrycie, że liAP indukowane przez powierzchniowy rezonans plazmonowy pozwalają na lepszą kwalifikację fazy repolaryzacyjnej, a tym samym pomagają dowiedzieć się więcej o sposobie działania badanych związków.

Rysunek 1: Konfiguracja zapisu wewnątrzkomórkowego i przykładowe nagrania. (A) Przegląd konfiguracji. (B) Widok z góry systemu nagrywającego z otwartym wzmacniaczem nagrywającym MEA. (C) Oprogramowanie inicjalizacyjne z wirtualną mapą MEA po prawej stronie. 1: stół antywibracyjny, 2: wewnątrzkomórkowy system nagrywania, 3: pokrywa chroniąca przed laserem, 4: nawilżana komora karbogeniczna, 5: system grzewczy MEA, 6: płytka interfejsu MEA, 7: 1-dołkowy układ MEA wewnątrz wzmacniacza nagrywającego. (D) Rejestrowanie przykładów z jednej elektrody przed i po indukcji liAP. U góry: nagranie trwające ok. 6 min. Kropkowane linie oznaczają rozwinięte obszary pokazane na dole. (E) Powiększone FP (na górze) i liAP (na dole). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Wzorzec propagacji sygnału pozostaje zachowany po indukcji liAP. Kodowanie fałszywymi kolorami propagacji sygnału fali wzbudzenia w syncytium. Niebieski oznacza wczesny (od -4 ms); kolor czerwony oznacza punkty czasu opóźnionego (+3 ms) od sygnału uzyskanego na elektrodzie odniesienia E54, zgodnie ze wskazaniami kolorowego paska. Sygnał przemieszcza się od prawego górnego rogu do lewego dolnego rogu układu elektrod. (A) Przed indukcją liAP, (B) 1 minutę po indukcji liAP. (C) 4 minuty po indukcji liAP. Symbol lampy błyskowej wskazuje punkt indukcji lasera na elektrodzie 64. Należy pamiętać, że nie jest widoczna żadna różnica w ogólnym kierunku propagacji. Czarne prostokąty oznaczają nieprawidłowe dane. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Definicja parametrów FP/liAP i protokół zapisu. (A) Parametry, które można wyodrębnić z klasycznego FP. (B) Dodatkowe parametry, które można uzyskać z liAPs. (C) Kalendarium pomiaru narkotyku. Od lewej do prawej: zapis kontrolny przez 60 s, indukcja liAP, zapis liAP przez 60 s, podanie leku, czas zmywania 300 s, ponowna indukcja liAP, rejestracja liAP przez 60 s. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Nifedypina skraca liAP serca w sposób zależny od stężenia. (A) Góra: Ślady FP w kontroli (niebieskie) i w obecności 0,3 μM Nifedypiny (czerwone). Ślady są wyświetlane z przesunięciem osi y dla lepszej wizualizacji. Dół: ślady liAP z tego samego nagrania MEA, co skutkuje skróceniem liAP w połączeniu ze wzrostem szybkości dudnienia. (B) Superpozycja pojedynczych liAP podczas kontroli (kolor niebieski) i stosowanie różnych stężeń nifedypiny (kolor czerwony). a: 0,01 μM, b: 0,1 μM i c: 0,3 μM. Należy zwrócić uwagę na skracanie czasu trwania liAP wraz ze wzrostem stężeń. (C) Zależność stężenie-odpowiedź szerokości sygnału uzyskanego z nagrań FP () i liAP (czerwony). Dane pochodzą z n = 3 eksperymentów i są znormalizowane do kontroli. Słupki błędu wskazują błąd standardowy średniej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: E4031 wywołuje (pro-)arytmiczne zachowanie. (A) FP (na górze) i liAP (na dole) w warunkach kontrolnych. (B-C) FP i liAP zarejestrowano w różnych punktach czasowych po zastosowaniu E4031 (0,1 μM). Po 80 s pierwsze EAD są widoczne na końcu liAP (B; oznaczone czerwoną strzałką). EAD przekształcają się w dudnienia ektopowe po 320 s w obecności badanego związku (C). (D) Po 530 s syncytium serca wchodzi w stan tachykardiowy. Ślad przedstawiony z nagrania liAP. (E) Zależność stężenie-odpowiedź szerokości FP () i liAP (czerwony). Dane z n = 4 eksperymentów, znormalizowane do kontroli. Słupki błędu wskazują błąd standardowy średniej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Wykrywanie zdarzeń proarytmicznych jest bardziej czułe w liAP niż FPs. (A) zapis FP i (B) zapis liAP w tym samym dołku podczas stosowania 3 μM Dofetilidu. Podczas gdy na końcu niektórych liAP EAD są wykrywalne, pozostają niewykrywalne w nagraniach FP. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

Ta innowacyjna metoda demonstruje nowy sposób badania in vitro farmakologicznej modulacji potencjału czynnościowego serca podczas stosowania kardioaktywnych związków narzędzi farmakologicznych.

Klasyczne zapisy MEA pozwalają na zapisy FP, które są pochodną sercowego AP¹⁴. Ten pośredni zapis uwzględnia przebieg czasowy de- i repolaryzacji, a tym samym eliminuje istotne cechy AP. Ponadto, chociaż transkomórkowa zmiana napięcia AP zwykle osiąga wartości około 100 mV, ogólna amplituda FP pozostaje porównywalnie niska, z amplitudami szczytowymi między kilkoma 100 μV a niskimi jednocyfrowymi wartościami mV. Ze względu na zasadę zapisu, faza repolaryzacji jest niewielka; w wielu przypadkach jest on ledwo wykrywalny i często ma niejasny kształt, co utrudnia określenie końca FP. Otwarcie błony komórkowej pozwala nam uzyskać dostęp do napięcia wewnątrzkomórkowego, odsłaniając tym samym przebieg czasowy AP serca. Istnieje wiele zalet tej metody nagrywania w porównaniu z nagraniami FP. Po pierwsze, amplituda sygnału jest bardziej widoczna, co zapewnia lepszy stosunek sygnału do szumu. Po drugie, kształt fali skutkuje lepszym wykrywaniem repolaryzacji. Po trzecie, kształt fazy repolaryzacji przyczynia się do wglądu w sposób działania badanego związku, zapewniony przez stromość relaksacji sygnału. I wreszcie, metoda ta oferuje lepszą czułość wykrywania krytycznych działań niepożądanych leków, co wykazano w przykładzie rejestracji pokazanym na rysunku 6 dla występowania EAD w liAP, ale nie w FP.

Do tej pory istnieją dwa sposoby uzyskania dostępu do wewnątrzkomórkowego AP. Pierwszy z nich uzyskuje się za pomocą elektroporacji^26,27. W tym przypadku krótkie i silne impulsy napięcia przyłożone przez elektrody rejestrujące mogą otworzyć błonę komórkową²⁸. Drugą możliwością jest otwarcie membrany za pomocą impulsu laserowego, z wykorzystaniem zjawiska fizycznego zwanego powierzchniowym rezonansem plazmonowym, jak pokazano tutaj. Jedną z zalet w porównaniu z elektroporacją jest zwiększone prawdopodobieństwo kolejnych otwarć. Ze względu na wysoce skupioną plamkę lasera (1-3 μm) efekt ten jest bardzo lokalnie ograniczony do interesującej nas elektrody. Co ciekawe, inicjacja liAP nie zmieniła propagacji sygnału uprawianego syncytium. Oznacza to, że chociaż integralność komórki jest uszkodzona, kardiomiocyty nie wydają się depolaryzować przez otwór w błonie.

Ta metoda ma swoje ograniczenia. Podobnie jak w przypadku elektroporacji, otwarcie membrany w większości przypadków nie trwa przez cały przebieg eksperymentu. Minimalne ustawienia mocy i czasu trwania impulsu laserowego wymagane do stabilnego otwarcia określonego typu ogniwa będącego przedmiotem zainteresowania muszą zostać określone niezależnie przed eksperymentami. Stwierdziliśmy (nie wykazano), że parametry drastycznie różnią się między różnymi typami komórek (w naszym przypadku kilka kardiomiocytów pochodzących z hiPS i pierwotnych). Pozwala to uniknąć niepotrzebnego stresu na komórkach podczas eksperymentu z testem złożonym i skutkuje bardziej wiarygodnymi i odtwarzalnymi danymi. Niezwykle ważne jest dostosowanie osi z, aby zapewnić wyraźne skupienie na ogniwach i elektrodach. Nieostry obraz z kamery daje plamkę lasera znajdującą się na nieoptymalnym poziomie, co potencjalnie może prowadzić do niemożności otwarcia błony komórkowej. Nawet przy najlepiej dobranych parametrach efekt liAP jest przejściowy, a amplituda zmniejsza się z czasem. Ponadto dostęp do przestrzeni wewnątrzkomórkowej komórek różni się między indukcjami liAP, zarówno w obrębie kolejnych otworów przy tej samej elektrodzie, jak i między elektrodami. Powoduje to dużą zmienność amplitudy liAP. Przyczyna nie jest jeszcze w pełni zrozumiała. Możliwe wyjaśnienia obejmują problemy mechaniczne, takie jak dryf ogniska lasera lub inna subkomórkowa lokalizacja otworu błony. Sprawia to, że analiza efektów amplitudy badanych związków jest w tym momencie skomplikowana. Ponadto rejestrowanie aktywności elektrycznej przez system MEA wymaga filtrowania górnoprzepustowego w celu skompensowania nieuniknionego dryfu linii bazowej. Chociaż w zastosowanym tutaj systemie filtrowanie to zostało ustawione na 0,1 Hz (najniższe ustawienie filtra dostępne dla tego systemu), efekty filtrowania w fazie plateau były nadal widoczne, co skutkowało powolnym trendem odchylania napięcia w kierunku linii bazowej podczas fazy plateau AP serca. Jest to szczególnie problematyczne w przypadku bardzo długich leżących u ich podstaw AP, takich jak kardiomiocyty iCell pochodzące z iPSC² stosowane tutaj, które już generują AP >700 ms w warunkach kontrolnych. Zastosowanie układów o niższym filtrowaniu może lepiej zachować kształt AP i umożliwić jeszcze lepszy dostęp do przebiegu czasowego fazy repolaryzacji.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-dołkowy chip MEA	Channel Systems MCS GmbH 890301
6-dołkowy chip MEA	Channel Systems MCS GmbH	7600069
DMSO Merck	KGaA	20-139 Sigma-Aldrich	rozpuszczalnik do leków
Dofetylid	ALOMONE LABS SIEDZIBA IZRAELA	D-100	Pomiar narkotyków
dPBS	Fisher Scientific GmbH	12037539	Coating
E4031	ALOMONE LABS SIEDZIBA IZRAELA	E-500	Pomiar leków
Falcon	Fisher Scientific GmbH	10788561
FB Alps wersja 0.5.005	Foresee Biosystems
Fibronectin	Merck KGaA	11051407001	Coating
iCell Kardiomiocyty	FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. (FCDI)	C1016
IntraCell	Foresee Biosystems
Isopropanol	Carl Roth GmbH + Co. KG	CN09.1	Do czyszczenia klocków kontaktowych MEA
Medium konserwacyjne	FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. (FCDI)	#M1003	Do hodowli komórkowych
MC_Data Narzędzie	Multi Channel Systems MCS GmbH		Eksport danych
MC_Rack	Multi Channel Systems MCS GmbH		Nagrywanie MEA
MEA 2100 - 2x60 - system	Multi Channel Systems MCS GmbH	890485	Do nagrań MEA
Nifedypina	Merck KGaA	N7634 Sigma-Aldrich	Drug-Measurement
Plating Medium	FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. (FCDI)	M1001	Do hodowli komórkowych
Tergazyme	VWR International, LLC	1304-1	czyszczenie MEA