Artykuł metodologiczny

Indukowane laserowo pomiary potencjału czynnościowego kardiomiocytów na układach mikroelektrod w celu zwiększenia predykcyjności bezpieczeństwa farmakologii

3.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64355

⸱

13 września 2022

 ,  ,  , 

W tym artykule

Podsumowanie

Kombinacja poracji laserowej i matryc mikroelektrod (MEA) pozwala na rejestrację kardiomiocytów z hodowanych pierwotnych i pochodzących z komórek macierzystych zapisów podobny do potencjału czynnościowego. Kształt fali zapewnia lepszy wgląd w sposób działania badanych związków niż standardowe nagrania. Łączy on patch-clamp i odczyt MEA, aby jeszcze bardziej zoptymalizować badania nad bezpieczeństwem kardiologicznym w przyszłości.

Streszczenie

Zagrażająca życiu arytmia serca wywołana lekiem jest często poprzedzona przedłużonymi potencjałami czynnościowymi serca (AP), którym często towarzyszą małe proarytmiczne fluktuacje potencjału błonowego. Kształt i przebieg w czasie frakcji repolaryzacyjnej AP może mieć kluczowe znaczenie dla obecności lub braku arytmii.

Matryce mikroelektrod (MEA) umożliwiają łatwy dostęp do efektów związków kardiotoksycznych poprzez potencjały pola zewnątrzkomórkowego (FP). Chociaż jest to potężne i ugruntowane narzędzie w badaniach i farmakologii bezpieczeństwa serca, kształt fali FP nie pozwala wywnioskować oryginalnego kształtu AP ze względu na zasadę zapisu zewnątrzkomórkowego i wynikające z tego wewnętrzne filtrowanie prądu przemiennego (AC).

Nowatorskie urządzenie, opisane tutaj, może wielokrotnie otwierać błonę kardiomiocytów hodowanych na elektrodach MEA w wielu punktach czasowych hodowli, używając wysoce skupionej nanosekundowej wiązki laserowej. Poracja lasera powoduje przekształcenie sygnału elektrofizjologicznego z FP w wewnątrzkomórkowe AP (laser-induced AP, liAP) i umożliwia rejestrację transkomórkowych odchyleń napięcia. Ten wewnątrzkomórkowy dostęp pozwala na lepszy opis kształtu AP oraz lepszą i bardziej czułą klasyfikację potencjałów proarytmicznych niż zwykłe zapisy MEA. System ten jest rewolucyjnym rozszerzeniem istniejących metod elektrofizjologicznych, umożliwiając dokładną ocenę efektu kardiotoksycznego ze wszystkimi zaletami zapisów opartych na MEA (łatwe, ostre i przewlekłe eksperymenty, analiza propagacji sygnału itp.).

Wprowadzenie

Wkład elektryczny bicia serca wynika ze złożonego i precyzyjnie zsynchronizowanego współdziałania wielu kanałów i transporterów serca, a także precyzyjnie dostrojonej propagacji sygnałów elektrycznych przez mięsień sercowy1. Zmiana tych ściśle skoordynowanych mechanizmów (np. stosowanie leków) może skutkować poważnymi konsekwencjami dla funkcji serca (tj. zagrażającą życiu arytmią)2,3. Arytmie definiuje się jako nieregularne bicie serca, które zmienia normalny rytm serca, co może mieć zagrażające życiu konsekwencje. Mogą być one spowodowane albo upośledzoną inicjacją fali pobudzenia serca, albo nieprawidłową propagacją pobudzenia serca4, co z kolei skutkuje dysfunkcją mechanizmu pompowania serca.

Wiele kandydatów na leki o silnym działaniu musi zostać wykluczonych z dalszych badań we wczesnej fazie rozwoju leku ze względu na ich (pro)arytmiczny potencjał2,3. Modulują one kluczowe kanały sercowe (np. ludzki kanał genowy związany z eterem (hERG), które są odpowiedzialne za prawidłowe tworzenie i terminację potencjału czynnościowego serca, a także późniejszą propagację sygnału5.

Firmy farmaceutyczne rutynowo używają pomiarów patch-clamp lub układów mikroelektrod (MEA) do badania potencjalnych kardiotoksycznych efektów off-target wywołanych przez kandydatów na leki. Zapisy patch-clamp pozwalają rozszyfrować wpływ substancji na kanały jonowe serca oraz analizować transkomórkowy potencjał czynnościowy serca z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną6,7. Jednak do wad tej techniki należy niska przepustowość przy ręcznym zacisku krosowym i ograniczone zastosowanie automatyzacji ze względu na zależność tej metody od komórek w zawiesinie. Ponadto nie można badać skutków przewlekłych ze względu na inwazyjność metody. Wreszcie, zazwyczaj tylko pojedyncze komórki są badane jednocześnie, a nie cały syncytium serca, co uniemożliwia odniesienie się do informacji o propagacji sygnału.

Barwniki wrażliwe na napięcie są cenne do nieinwazyjnego badania potencjałów czynnościowych serca i arytmii wywołanych lekami8. Pozwalają one na badanie aktywności zarówno pojedynczej komórki, jak i syncytium. Wadą tej metody jest działanie cytotoksyczne zarówno barwników jako takich, jak i produktu reakcji podczas oświetlenia. Są one używane do ostrych eksperymentów i prawie nie mają zastosowania w badaniach długoterminowych9,10,11. Białka wrażliwe na napięcie jako alternatywa poczyniły znaczne postępy w ciągu ostatnich kilku lat pod względem użyteczności i czułości, ale wymagają modyfikacji genetycznej komórek będących przedmiotem zainteresowania i nie mają wysokiej rozdzielczości czasowej w porównaniu z technikami elektrofizjologicznymi12.

Informacje z najnowszej inicjatywy13 stwierdza, że MEA są szeroko stosowane w badaniach bezpieczeństwa kardiologicznego jako alternatywne podejście elektrofizjologiczne, ponieważ stanowią potężne i dobrze ugruntowane narzędzie do badania funkcji serca i bezpieczeństwa farmakologicznego. Kardiomiocyty są hodowane jako syncytium bezpośrednio na chipach, a potencjały pola zewnątrzkomórkowego (FP) są rejestrowane nieinwazyjnie za pomocą mikroelektrod zintegrowanych z substratem. Ta zasada nagrywania pozwala na przeprowadzanie badań przesiewowych o zwiększonej przepustowości przez kilka dni, co sprawia, że nadają się one do badań farmaceutycznych nad skutkami przewlekłymi. Wynikowy przebieg FP jest pochodną wewnątrzkomórkowego AP14. Parametry takie jak współczynnik uderzeń, amplituda początkowej części FP i czas trwania FP są łatwo dostępne15. Inne istotne kryteria, takie jak rozróżnienie między wydłużeniem a triangulacją FP (ważnego markera proarytmii16,17) są niedostępne ze względu na efekt filtrowania AC tej techniki. Co więcej, wykrywanie innych małych zdarzeń proarytmicznych, takich jak wczesna i opóźniona depolaryzacja (odpowiednio EAD i DAD), jest często łatwe do przeoczenia ze względu na ich małą amplitudę.

Tutaj opisujemy metodę uzyskiwania dostępu do potencjału błony wewnątrzkomórkowej poprzez otwarcie błony kardiomiocytów. Urządzenie IntraCell (zwane dalej wewnątrzkomórkowym urządzeniem rejestrującym) umożliwia wielokrotne otwieranie błony kardiomiocytów hodowanych na elektrodach MEA za pomocą wysoce skoncentrowanej wiązki lasera nanosekundowego za pośrednictwem określonego zjawiska fizycznego (powierzchniowy rezonans plazmonowy)18. W rezultacie nagranie przechodzi ze zwykłego FP w wewnątrzkomórkowy AP (laser-induced AP, liAP). Protokół pokazuje, w jaki sposób pozwala to na uzyskanie dostępu do kinetycznych aspektów przebiegu, których nie można łatwo uchwycić poprzez analizę FP. Metoda ta stanowi pomost między tradycyjnym wewnątrzkomórkowym patch-clampem a zapisami MEA. Technologia ta stanowi zatem potężne rozszerzenie obecnych metod oceny bezpieczeństwa kardiologicznego.

Protokół

1. Przygotowanie indukowanych pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych

UWAGA: Kardiomiocyty iCell2 (określane jako kardiomiocyty pochodzące z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych [iPSC]) zostały przygotowane zgodnie z protokołem dostarczonym przez dostawcę. Protokół zostanie pokrótce podsumowany w następnej sekcji.

  1. Rozmrażanie i konserwację pożywki w temperaturze 4 °C przez 24 godziny przed użyciem.
  2. Przygotować otoczkę fibronektyny, rozpuszczając sterylną fibronektynę w sterylnej wodzie o stężeniu 1 mg/ml. Zamrażać przechowywać ten zapas w porcjach (np. 25 μl na podwielokrotność). Rozcieńczyć podany roztwór podstawowy w stosunku 1:20 w sterylnym zrównoważonym roztworze soli (dPBS) firmy Dulbecco.
  3. Za pomocą pipety o pojemności 10 μl pokryć pola elektrod wcześniej autoklawowanych MEA pod kapturem z przepływem laminarnym, kroplami w sterylnych warunkach. W tym celu upuść 5 μl roztworu powlekającego fibronektynę na pola elektrody i obserwuj tworzenie się kropli na powierzchni elektrody. Uważaj, aby nie dotykać wrażliwych elektrod.
    UWAGA: Aby utrzymać sterylne warunki, przenieś chip MEA na sterylną szalkę Petriego przed wyjęciem go z okapu z przepływem laminarnym.
  4. Inkubować powlekane MEA przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C, najlepiej w inkubatorze.
  5. Rozmrażać kriowiał zawierający kardiomiocyty w łaźni wodnej o temperaturze około 37 °C przez 2 minuty, aż pozostanie tylko niewielka ilość kryształków lodu. Delikatnie przenieść roztwór komórkowy do probówki o pojemności 50 ml.
  6. Dodać 1 ml pożywki galwanicznej do pustego kriowiu. Przelewać roztwór kroplami przez okres 90 s do probówki o pojemności 50 ml, aby zmniejszyć szok osmotyczny. Delikatnie dodaj dodatkowe 8 ml medium galwanicznego do probówki.
  7. Zawiesinę komórek należy dokładnie wymieszać za pomocą pipety o pojemności 10 ml. Oblicz całkowitą liczbę żywotnych komórek za pomocą automatycznej cytometrii fluorescencyjnej. Numer powinien być zbliżony do numeru w karcie katalogowej dostarczonej przez producenta.
  8. Wirować roztwór komórek przez 3 minuty w temperaturze 200 x g w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant przez aspirację za pomocą szklanej pipety podłączonej do systemu pompowania. Dostosuj liczbę komórek w zakresie od 6 000 do 15 000 żywotnych komórek/μL.
    UWAGA: Liczba ogniw zwykle mieści się w zakresie podanym powyżej, ale może się różnić w zależności od odpowiedniego dostawcy.
  9. Usunąć roztwór powlekający, który został nałożony w kroku 1.3 z obszaru elektrody MEA za pomocą pipety o pojemności 10 μl bezpośrednio przed wysiewem komórek. Wysiewaj komórki natychmiast po usunięciu, aby uniknąć wysuszenia powłoki. W tym celu należy zasiać komórki kroplami w ilości 4 μl zarówno dla 6-dołkowych, jak i 1-dołkowych MEA na polach elektrod w taki sam sposób, jak w przypadku powłoki.
  10. Pozostawić komórki do przylegania przez 1 godzinę w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przed napełnieniem studzienek sterylnym podłożem galwanicznym podgrzanym do około 37 °C w temperaturze 200 μl dla MEA 6-dołkowej i 1 ml dla MEA z pojedynczą studzienką pod okapem z przepływem laminarnym.
  11. Wykonać pełną wymianę medium 48 godzin po poszyciu pod pokrywą z przepływem laminarnym. W tym celu należy usunąć podłoże galwaniczne przez zassanie za pomocą szklanej pipety podłączonej do systemu pompowego. Następnie dodać do studzienek 200 μl sterylnego podłoża konserwacyjnego podgrzanego do temperatury 37 °C.
  12. Wykonuj pełne zmiany podłoża co drugi dzień.
  13. Rozpocznij pomiar komórek 5-8 dni po rozmrożeniu. Wykonaj pełną wymianę podłoża na 2 godziny przed rozpoczęciem eksperymentów.

2. Nagrania MEA

UWAGA: Urządzenie używane do przekształcania sygnału FP na liAP składa się z pionowego mikroskopu i lasera o długości fali 1064 nm.

  1. Umieść system MEA na górze urządzenia z uchwytem na wióry MEA wyśrodkowanym nad otworem obiektywu. Ustaw konfigurację MEA tak, aby obiektyw znajdował się bezpośrednio pod otworem systemu MEA, aby umożliwić laserowi skupienie się na elektrodach.
  2. Przenieść chip MEA z wyhodowanymi komórkami z inkubatora do zestawu MEA na 15 minut przed rejestracją, umożliwiając komórkom regenerację po zakłóceniach mechanicznych.
  3. Ostrożnie wyczyść podkładki stykowe i styki za pomocą izopropanolu i bawełnianego wacika, aby zmniejszyć poziom hałasu. Ostrożnie umieść MEA w konfiguracji MEA. Umieść chip MEA z logo na dole w lewym górnym rogu (6-dołkowy MEA) lub z elektrodą odniesienia po lewej stronie (MEA jednodołkowa).
  4. Ustaw zintegrowane z systemem MEA ogrzewanie na 38 °C. Umieść małą komorę na chipie MEA, aby stale perfaktorować komórki nawilżonym karbogenem (5%CO2 i 95%O2), aby odtworzyć warunki w inkubatorze i zapobiec parowaniu.
  5. Zamknij pokrywę urządzenia. Zintegrowany wyłącznik bezpieczeństwa umożliwia aktywację lasera tylko wtedy, gdy pokrywa jest zamknięta nad chipem MEA. Ustaw filtr systemowy MEA za pomocą programu konfiguracyjnego MEA na 0,1 Hz lub mniej górnoprzepustowego i 3,500 Hz dolnoprzepustowego.
  6. Do nagrywania należy używać MC_Rack oprogramowania (oprogramowania do nagrywania) lub dowolnego alternatywnego oprogramowania. Dostosuj zakres wejściowy do swoich potrzeb, upewniając się, że sygnał nie nasyca amplifier i częstotliwość próbkowania (np. 20 kHz). Użyj funkcji długoterminowego wyświetlania w oprogramowaniu, aby sprawdzić nagranie.

3. Laserowe poracjonowanie komórek

  1. Po włożeniu chipa MEA do konfiguracji MEA i skonfigurowaniu oprogramowania, zainicjuj mechanikę lasera za pomocą oprogramowania FB Alps (oprogramowanie inicjujące).
  2. Najpierw kliknij przycisk Inicjalizacja. Pod koniec inicjalizacji wirtualny punkt laserowy znajdzie się odpowiednio w studzience D dla MEA z 6 dołkami i w lewym dolnym rogu dla MEA z jedną studnią.
  3. Przesuń wirtualny punkt laserowy za pomocą Ctrl + kliknięcie myszą na środek elektrody D5 i dostosuj ostrość. Dostosuj ostrość, naciskając Ctrl + przewijanie kółkiem myszy.
  4. Naciśnij przycisk Ustaw P1. Wirtualny punkt laserowy automatycznie przesunie się do dołka F. Powtórz proces z elektrodą F5 i wybierz Ustaw P2.
  5. Po tej procedurze punkt lasera przesunie się do dołka B. Powtórz ten sam proces z elektrodą B5 i naciśnij Ustaw P3 w oprogramowaniu. System jest teraz wyrównany.
  6. Dostosuj moc lasera i czas procesu do potrzeb swoich komórek. W tym przypadku wykorzystano 40% mocy i 25% czasu procesu.
  7. Aby włączyć laser, kliknij przycisk Laser Off (Laser wyłączony), który pojawi się jako laser włączony. Przełącz się na oprogramowanie do nagrywania, wybierz filename i kliknij czerwony przycisk nagrywania, a następnie przycisk Odtwórz w górnej części okna, aby zarejestrować pomiar.
  8. Zapisz linię bazową 60 s przed otwarciem komórek za pomocą lasera. Przełącz się z powrotem na oprogramowanie inicjujące.
  9. Dezaktywuj elektrody, które mają być wykluczone przez laser na wirtualnej mapie po prawej stronie za pomocą Ctrl + kliknięcie myszą. Wybierz interesujące Cię elektrody, aktywując je na reprezentacji matrycy po prawej stronie okna oprogramowania.
  10. Aby uruchomić laser, użyj Alt + kliknięcie myszą i wybierz środkową elektrodę tej studni. To inicjuje laser do automatycznego otwierania komórek na każdej elektrodzie tej studni. Powtórz dla każdej studzienki. Laser automatycznie otworzy wtedy wszystkie wcześniej aktywowane elektrody wybranej studni.

4. Obchodzenie się z lekami i ich stosowanie

  1. Przygotować wszystkie substancje, które mają być użyte do testów narkotykowych, świeżo w dniu pomiarów. Upewnij się, że końcowe stężenie aplikacji jest 10 razy wyższe w pożywce, aby uzyskać rozcieńczenie 1:10 w studzienkach.
  2. Rozpuść nifedypinę, E4031 i dofetylid najpierw w DMSO w stężeniu mM, a następnie dalej w pożywce do 10x pożądanego stężenia. Nigdy nie przekraczaj końcowego stężenia DMSO wynoszącego 0,1% w studni.
  3. Rejestruj aktywność wyjściową przez 60 sekund. Rozpocznij porację indukowaną laserem, jak opisano w kroku 3 protokołu, co spowoduje przekształcenie FP w kształt liAP.
  4. Zastosuj wszystkie leki w pojedynczym stężeniu na studzienkę. Usunąć 20 μl pożywki z każdej studzienki odpowiednio w przypadku MEA 6-dołkowych i 100 μl w przypadku MEA z pojedynczą studzienką. Dodać 20 μl lub 100 μl, w zależności od rodzaju MEA, roztworu podstawowego leku, który ma być mierzony, do studzienki i ostrożnie pipetować w górę i w dół 2-3 razy. Wykonaj co najmniej trzy replikacje każdego leku i stężenia, aby uzyskać znaczenie statystyczne.
  5. Pozwól związkom myć się przez 300 sekund. W tym czasie kształt liAP może przekształcić się z powrotem w kształt FP. Ponownie wywołaj porację wywołaną laserem i rejestruj możliwe efekty wywołane związkiem na liAP przez dodatkowe 60 sekund.

5. Eksport danych

  1. Wybierz odpowiednie elektrody, odtwarzając nagranie w oprogramowaniu do nagrywania. Użyj MC_DataTool, aby przekonwertować pliki MC_Rack na pliki .txt ASCII.
  2. Kliknij Plik> Otwórz MCD > Wybierz plik MC_Rack. Kliknij przycisk txt (niebieski tekst).
  3. Wybierz elektrodę. Wybrana elektroda zostanie pokazana na liście po prawej stronie.
  4. Kliknij Przeglądaj, aby wybrać folder i zmienić nazwę nowego pliku .txt. Kliknij Zapisz.
  5. Usuń zaznaczenie wyeksportowanej elektrody i wybierz następną elektrodę do wyeksportowania. Powtórz procedurę dla wszystkich interesujących Cię elektrod.

6. Obsługa danych i analiza statystyczna

  1. Zaimportuj przekonwertowane ślady binarne do R19. Wizualizuj/analizuj dane za pomocą niestandardowych skryptów zawierających następujące pakiety: dplyr, tidyr i ggplot220,21,22.

Wyniki

System rejestrujący wykorzystany do zapisu aktywności elektrycznej z hodowlanych kardiomiocytów składał się ze standardowego systemu MEA wyposażonego w podgrzewacz oraz komorę z karbogenem, podłączonego do komputera. System ustawiono na urządzeniu do rejestracji wewnątrzkomórkowej, które z kolei zostało zamontowane na małej jednostce antywibracyjnej (Rycina 1A-B).

Kardiomiocyty pochodzące z iPSC2 zaczęły bić spontanicznie w ciągu 2-3 dni po rozmrożeniu (dni in vitro, DIV), co było widoczne pod mikroskopem. Od DIV 4 częstotliwość skurczów stała się regularna, a na większości elektrod w poszczególnych studniach chipów MEA można było wykryć potencjały polowe (FP) z amplitudami szczyt-szczyt komponentu depolaryzującego w zakresie od 1 do 5 mV. Aktywność elektryczną wykryto w ponad 95% badanych studni. Od DIV 7 wzrosło prawdopodobieństwo odrywania się komórek, co uniemożliwiło dalsze wykorzystanie tych studni.

Oprogramowanie do sterowania laserowo indukowanym otwarciem błony umożliwia regulację zarówno mocy, jak i czasu trwania procesu laserowego, który pośredniczy w otwarciu błony komórkowej wyłącznie na badanej elektrodzie (Rycina 1C), podczas gdy pozostałe elektrody w danej studzience pozostają nienaruszone. Podczas gdy zbyt zachowawcze ustawienia nie zmieniały kształtu fali potencjału polowego (FP), zbyt wysokie wartości prowadziły do prawdopodobnego uszkodzenia kardiomiocytów, co objawiało się gwałtownym, ale przejściowym biciem lub utratą sygnału. Po ustawieniu wartości na 40% mocy i 25% czasu procesu, co było dobrze tolerowane przez komórki, wyzwolenie impulsu laserowego spowodowało liczne zmiany w rejestrowanym kształcie fali (przykładowy zapis przedstawiono na Rycynie 1D). W tych warunkach makroskopowo nie zaobserwowano żadnych zmian w materiale elektrody. Amplituda rejestrowanego sygnału wzrosła znacząco 4,1 ± 0,41 (n = 20, zakres 1,34-8,83) raza, co przeanalizowano na podstawie losowo wybranego podzbioru pomiarów, dając amplitudy od 7 do 2 mV. Ponadto kształt fali zmienił się ze standardowej formy FP z szybkim, dwufazowym i przejściowym odchyleniem napięcia na początku, po którym następowała faza plateau powracająca do poziomu bazowego oraz niewielkie odchylenie wskazujące koniec FP, w kształt zbliżony do wewnątrzkomórkowo rejestrowanego potencjału czynnościowego (AP) z szybkim wzrostem, wydłużoną zdepolaryzowaną fazą plateau i fazą repolaryzacji z niedoborem poniżej poziomu bazowego (Rycina 1E). Te odchylenia napięcia zdefiniowaliśmy jako laserowo indukowany potencjał czynnościowy (liAP). W większości przypadków przejście to było przejściowe i przynajmniej częściowo odwróciło się w ciągu 5 min. Przewodzenie sygnału w obrębie syncytium serca pozostało niezmienione po indukcji liAP (Rycina 2), co wskazuje, że pozostałe syncytium nie zostało dotknięte potencjalnym uszkodzeniem spowodowanym impulsem laserowym.

Podobieństwa do potencjałów czynnościowych (AP) rejestrowanych wewnątrzkomórkowo pozwoliły na wyznaczenie parametrów liAP, które nie są dostępne dla FP (przykładowe parametry przedstawiono m.in. na Rysunku 3A), przede wszystkim pomiar czasu trwania liAP w określonych punktach czasowych (np. w 20%, 50% i 90%) (Rysunek 3B), analogicznie do APD20/50/90 powszechnie stosowanych w opisie AP.

Następnie przetestowano odpowiedź kardiomiocytów otwartych za pomocą lasera na powszechnie stosowane farmakologiczne związki narzędziowe o działaniu kardioaktywnym. Przykładowy schemat protokołu znajduje się na Rysunku 3C. Ponieważ transformacja liAP nie zawsze utrzymywała się przez cały eksperyment, aplikację związków przeprowadzano w formie pojedynczego stężenia na studzienkę, a nie w sposób kumulatywny, aby skrócić całkowity czas rejestracji. Niemniej jednak, przed zastosowaniem badanego związku konieczne było ponowne otwarcie komórek lub otwarcie innego obszaru elektrody.

Dodanie specyficznego blokera kanałów wapniowych typu L2+ bloker kanałów, Nifedipine23,24, skrócił fazę plateau liAP w sposób zależny od stężenia, a tym samym skrócił cały liAP (Rycina 4A,B). Skrócenie to było porównywalne z wynikami analizy uzyskanej z potencjałów polowych (FP) kardiomiocytów z elektrod niepoddanych manipulacji (Rysunek 4C), co wskazuje, że ta metoda rejestracji nie wywoła działań niepożądanych w porównaniu z klasycznymi rejestracjami potencjałów polowych (FP).

E4031 hamuje repolaryzację istotnego kanału potasowego Kv1.11 (hERG)25 i prowadzi do arytmicznego zachowania kardiomiocytów przy zwiększonych stężeniach. Podobnie jak w analizie uzyskanej z zapisów FP, E4031 zwiększył czas trwania liAP w sposób zależny od stężenia (Rysunek 5). Ponadto, przy stężeniach wynoszących 0.01 µM or wyższych, pod koniec liAP widoczne były niewielkie dodatnie wychylenia napięcia. Wychylenia te stawały się bardziej wyraźne przy wyższych stężeniach, co wskazywało na przejściową nową depolaryzację, w przeciwieństwie do FP, w których wychylenia te były praktycznie niewidoczne (patrz Rysunek 5B-C, górne (FP) względem dolnych (liAP) zapisów). Zjawisko to jest znane jako wczesna depolaryzacja ponowna (EAD). Przy najwyższym stężeniu 0.1 µMte EAD przekształcały się z czasem w pobudzenia ektopowe, które są przedwczesnymi potencjałami czynnościowymi (Rysunek 5C). Zarówno EAD, jak i pobudzenia ektopowe są kluczowymi wskaźnikami aktywności proarytmicznej. Na końcu przykładu przedstawionego w Rysunek 5Daktywność elektryczna doprowadziła do arytmicznego bicia. Ponadto zależności koncentracja-odpowiedź wykazane w rejestracjach FP i liAP były zgodne (Rycina 5E). Odnotowano jednak znacznie większą zmienność danych FP, wynikającą ze słabej składowej repolaryzacji potencjałów polowych przy wyższych stężeniach badanego związku. Wydaje się to być cechą charakterystyczną dla kardiomiocytów pochodzących z iPSC.2 mają również tendencję do generowania niefizjologicznie długich potencjałów czynnościowych w warunkach kontrolnych (czas trwania potencjałów czynnościowych > (70 ms). System MEA zastosował wbudowany filtr prądu przemiennego (AC) o częstotliwości 0,1 Hz, co z kolei doprowadziło do częściowego przefiltrowania kształtu liAP, choć bez przesłonięcia informacji jakościowych dotyczących początku i końca podstawowego AP.

Okazało się, że początkowe występowanie proarytmicznych odchyleń napięcia można było wykryć przy niższych stężeniach w liAP w porównaniu z rejestracjami FP. Na Rysunku 6 przedstawiono zapis aktywności elektrycznej podczas aplikacji dofetylidu w stężeniu 3 µM. Rejestracja została przeprowadzona w tej samej studzince. Chociaż zarówno FP, jak i liAP wykazały czas trwania wynoszący około 2 s, przebieg FP był niepozorny i prezentował regularne odchylenia repolaryzacyjne. Jednocześnie pod koniec liAP widoczne stały się EAD o różnej amplitudzie. Ten wzrost istotnej wrażliwości farmakologiczno-bezpieczeństwa dodatkowo potwierdza ustalenie, że liAP indukowane przez rezonans plazmonowy powierzchni pozwalają na lepszą kwalifikację fazy repolaryzacji, a tym samym pomagają w lepszym poznaniu mechanizmu działania badanych związków testowych.

figure-results-1
Rycina 1Układ do rejestracji wewnątrzkomórkowej oraz przykładowe zapisy. (A) Przegląd konfiguracji. (B) Widok z góry systemu rejestracyjnego z otwartym wzmacniaczem rejestrującym MEA. (C) Oprogramowanie inicjujące z wirtualną mapą MEA po prawej stronie. 1: stół antywibracyjny, 2: rejestracja wewnątrzkomórkowa system, 3: osłona laserowa, 4: komora z nawilżonym karbogenem, 5: system grzewczy MEA, 6: płyta interfejsu MEA, 7: 1-dołkowy chip MEA wewnątrz wzmacniacza rejestrującego.D) Przykłady rejestracji z jednej elektrody przed i po indukcji liAP. Góra: rejestracja trwająca około 6 min. Linie przerywane oznaczają powiększone obszary przedstawione na dole. (E) Powiększony obraz FP (góra) i liAP (dół). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-2
Rycina 2Wzorzec propagacji sygnału pozostaje zachowany po indukcji liAP. Kodowanie w fałszywych kolorach propagacji sygnału fali pobudzenia w obrębie syncytium. Kolor niebieski oznacza wczesne punkty czasowe (począwszy od -4 ms), a kolor czerwony późne punkty czasowe (+3 ms) dla sygnału otrzymanego z elektrody referencyjnej E54, zgodnie z paskiem skali kolorów. Sygnał przemieszcza się od prawego górnego do lewego dolnego rogu macierzy elektrod.A) Przed indukcją liAP, (B) 1 min po indukcji liAP. (C) 4 min po indukcji liAP. Symbol błyskawicy wskazuje punkt indukcji laserowej przy elektrodzie 64. Należy zauważyć, że nie widać różnicy w ogólnym kierunku propagacji. Czarne prostokąty oznaczają nieprawidłowe dane. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-3
Rysunek 3Definicja parametru FP/liAP oraz protokół rejestracji. (A) Parametry, które można wyodrębnić z klasycznego FP. (B) Dodatkowe parametry, które można uzyskać z liAPs. (C) Oś czasu pomiaru leku. Od lewej do prawej: rejestracja kontrolna przez 60 s, indukcja liAP, rejestracja liAP przez 60 s, aplikacja leku, czas nasycenia (wash-in) 30 s, ponowna indukcja liAP, rejestracja liAP przez 60 s. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

figure-results-4
Rycina 4Nifedypina skraca kardiologiczny liAP w sposób zależny od stężenia. (A) Góra: zapisy FP w próbie kontrolnej (niebieski) oraz w obecności 0.3 µM Nifedypina (czerwony). Ślady są wyświetlane z przesunięciem osi y w celu lepszej wizualizacji. Dół: ślady liAP z tego samego zapisu MEA, skutkujące skróceniem liAP przy jednoczesnym zwiększeniu częstotliwości uderzeń. (B) Superpozycja pojedynczych liAP podczas kontroli (kolor niebieski) oraz zastosowania różnych stężeń nifedypiny (kolor czerwony). a: 0.01 µM, b: 0.1 µM, oraz c: 0.3 µMZwróć uwagę na skracanie się czasu trwania liAP wraz ze wzrostem stężeń. (C) Zależność koncentracyjno-odpowiedzi szerokości sygnału uzyskanej z rejestracji FP (czarny) i liAP (czerwony). Dane pochodzą z n = 3 eksperymentów i zostały znormalizowane względem kontroli. Słupki błędów wskazują błąd standardowy średniej. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-5
Rycina 5E4031 indukuje zachowania (pro-)arytmiczne. (A) FP (góra) i liAP (dół) w warunkach kontrolnych. (B-C) FP i liAP rejestrowano w różnych punktach czasowych po zastosowaniu E4031 (0.1 µM). Po 80 s pierwsze EAD są widoczne na końcu liAP (B; zaznaczone czerwoną strzałką). W obecności badanego związku EAD przekształcają się w skurcze ektopowe po 320 s (C). (D) Po 530 s syncytium sercowe wchodzi w stan tachykardii. Zapis przedstawiony na podstawie pomiaru liAP. (E) Zależność stężenie-odpowiedź dla szerokości FP (czarny) i liAP (czerwony). Dane z n = 4 eksperymentów, znormalizowane względem kontroli. Słupki błędów oznaczają błąd standardowy średniej. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-6
Rycina 6Wykrywanie zdarzeń proarytmicznych jest bardziej czułe w liAP niż w FP. (A) rejestracja FP i (B) rejestracja liAP w tej samej studzience podczas aplikacji 3 µM Dofetylid. Choć pod koniec niektórych liAP-ów (późnych polimorficznych potencjałów czynnościowych) można wykryć EAD (wczesne depolaryzacje podepolaryzacyjne), pozostają one niewykrywalne w zapisach FP (potencjałów polowych). Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

Dyskusja

Ta innowacyjna metoda demonstruje nowy sposób badania in vitro farmakologicznej modulacji potencjału czynnościowego serca podczas stosowania kardioaktywnych związków narzędzi farmakologicznych.

Klasyczne zapisy MEA pozwalają na zapisy FP, które są pochodną sercowego AP14. Ten pośredni zapis uwzględnia przebieg czasowy de- i repolaryzacji, a tym samym eliminuje istotne cechy AP. Ponadto, chociaż transkomórkowa zmiana napięcia AP zwykle osiąga wartości około 100 mV, ogólna amplituda FP pozostaje porównywalnie niska, z amplitudami szczytowymi między kilkoma 100 μV a niskimi jednocyfrowymi wartościami mV. Ze względu na zasadę zapisu, faza repolaryzacji jest niewielka; w wielu przypadkach jest on ledwo wykrywalny i często ma niejasny kształt, co utrudnia określenie końca FP. Otwarcie błony komórkowej pozwala nam uzyskać dostęp do napięcia wewnątrzkomórkowego, odsłaniając tym samym przebieg czasowy AP serca. Istnieje wiele zalet tej metody nagrywania w porównaniu z nagraniami FP. Po pierwsze, amplituda sygnału jest bardziej widoczna, co zapewnia lepszy stosunek sygnału do szumu. Po drugie, kształt fali skutkuje lepszym wykrywaniem repolaryzacji. Po trzecie, kształt fazy repolaryzacji przyczynia się do wglądu w sposób działania badanego związku, zapewniony przez stromość relaksacji sygnału. I wreszcie, metoda ta oferuje lepszą czułość wykrywania krytycznych działań niepożądanych leków, co wykazano w przykładzie rejestracji pokazanym na rysunku 6 dla występowania EAD w liAP, ale nie w FP.

Do tej pory istnieją dwa sposoby uzyskania dostępu do wewnątrzkomórkowego AP. Pierwszy z nich uzyskuje się za pomocą elektroporacji26,27. W tym przypadku krótkie i silne impulsy napięcia przyłożone przez elektrody rejestrujące mogą otworzyć błonę komórkową28. Drugą możliwością jest otwarcie membrany za pomocą impulsu laserowego, z wykorzystaniem zjawiska fizycznego zwanego powierzchniowym rezonansem plazmonowym, jak pokazano tutaj. Jedną z zalet w porównaniu z elektroporacją jest zwiększone prawdopodobieństwo kolejnych otwarć. Ze względu na wysoce skupioną plamkę lasera (1-3 μm) efekt ten jest bardzo lokalnie ograniczony do interesującej nas elektrody. Co ciekawe, inicjacja liAP nie zmieniła propagacji sygnału uprawianego syncytium. Oznacza to, że chociaż integralność komórki jest uszkodzona, kardiomiocyty nie wydają się depolaryzować przez otwór w błonie.

Ta metoda ma swoje ograniczenia. Podobnie jak w przypadku elektroporacji, otwarcie membrany w większości przypadków nie trwa przez cały przebieg eksperymentu. Minimalne ustawienia mocy i czasu trwania impulsu laserowego wymagane do stabilnego otwarcia określonego typu ogniwa będącego przedmiotem zainteresowania muszą zostać określone niezależnie przed eksperymentami. Stwierdziliśmy (nie wykazano), że parametry drastycznie różnią się między różnymi typami komórek (w naszym przypadku kilka kardiomiocytów pochodzących z hiPS i pierwotnych). Pozwala to uniknąć niepotrzebnego stresu na komórkach podczas eksperymentu z testem złożonym i skutkuje bardziej wiarygodnymi i odtwarzalnymi danymi. Niezwykle ważne jest dostosowanie osi z, aby zapewnić wyraźne skupienie na ogniwach i elektrodach. Nieostry obraz z kamery daje plamkę lasera znajdującą się na nieoptymalnym poziomie, co potencjalnie może prowadzić do niemożności otwarcia błony komórkowej. Nawet przy najlepiej dobranych parametrach efekt liAP jest przejściowy, a amplituda zmniejsza się z czasem. Ponadto dostęp do przestrzeni wewnątrzkomórkowej komórek różni się między indukcjami liAP, zarówno w obrębie kolejnych otworów przy tej samej elektrodzie, jak i między elektrodami. Powoduje to dużą zmienność amplitudy liAP. Przyczyna nie jest jeszcze w pełni zrozumiała. Możliwe wyjaśnienia obejmują problemy mechaniczne, takie jak dryf ogniska lasera lub inna subkomórkowa lokalizacja otworu błony. Sprawia to, że analiza efektów amplitudy badanych związków jest w tym momencie skomplikowana. Ponadto rejestrowanie aktywności elektrycznej przez system MEA wymaga filtrowania górnoprzepustowego w celu skompensowania nieuniknionego dryfu linii bazowej. Chociaż w zastosowanym tutaj systemie filtrowanie to zostało ustawione na 0,1 Hz (najniższe ustawienie filtra dostępne dla tego systemu), efekty filtrowania w fazie plateau były nadal widoczne, co skutkowało powolnym trendem odchylania napięcia w kierunku linii bazowej podczas fazy plateau AP serca. Jest to szczególnie problematyczne w przypadku bardzo długich leżących u ich podstaw AP, takich jak kardiomiocyty iCell pochodzące z iPSC2 stosowane tutaj, które już generują AP >700 ms w warunkach kontrolnych. Zastosowanie układów o niższym filtrowaniu może lepiej zachować kształt AP i umożliwić jeszcze lepszy dostęp do przebiegu czasowego fazy repolaryzacji.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować firmie Foresee Biosystems za użyczenie systemu IntraCell podczas badań. Chcieliby również podziękować Hae In Chang za pomoc techniczną. Prace te otrzymały dofinansowanie z programu Unii Europejskiej w zakresie badań naukowych i innowacji Horyzont 2020 na podstawie umowy o udzielenie dotacji nr 964518 (ToxFree), z unijnego programu Europejskiej Rady ds. Innowacji Horyzont Europa, projektu SiMulTox (umowa o grant nr 101057769) oraz z Ministerstwa Spraw Gospodarczych, Pracy i Turystyki Badenii-Wirtembergii.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1-dołkowy chip MEAChannel Systems MCS GmbH 890301
6-dołkowy chip MEAChannel Systems MCS GmbH7600069
DMSO MerckKGaA20-139
Sigma-Aldrich		rozpuszczalnik do leków
DofetylidALOMONE LABS
SIEDZIBA IZRAELA		D-100Pomiar narkotyków
dPBSFisher Scientific GmbH12037539Coating
E4031ALOMONE LABS
SIEDZIBA IZRAELA		E-500Pomiar leków
FalconFisher Scientific GmbH10788561
FB Alps wersja 0.5.005Foresee Biosystems
FibronectinMerck KGaA11051407001Coating
iCell KardiomiocytyFUJIFILM Cellular
Dynamics, Inc. (FCDI)		C1016
IntraCellForesee Biosystems
IsopropanolCarl Roth GmbH + Co. KGCN09.1Do czyszczenia klocków kontaktowych MEA
Medium konserwacyjneFUJIFILM Cellular
Dynamics, Inc. (FCDI)		#M1003Do hodowli komórkowych
MC_Data NarzędzieMulti Channel Systems MCS GmbHEksport danych
MC_RackMulti Channel Systems MCS GmbHNagrywanie MEA
MEA 2100 - 2x60 - systemMulti Channel Systems MCS GmbH890485Do nagrań MEA
NifedypinaMerck KGaAN7634
Sigma-Aldrich		Drug-Measurement
Plating MediumFUJIFILM Cellular
Dynamics, Inc. (FCDI)		M1001Do hodowli komórkowych
TergazymeVWR International, LLC1304-1czyszczenie MEA
Multi Multi

Bibliografia

  1. Shah, M., Akar, F. G., Tomaselli, G. F. Molecular basis of arrhythmias. Circulation. 112 (16), 2517-2529 (2005).
  2. Bowlby, M. R., Peri, R., Zhang, H., Dunlop, J. hERG (KCNH2 or Kv11.1) K+ channels: screening for cardiac arrhythmia risk. Current Drug Metabolism. 9 (9), 965-970 (2008).
  3. Priest, B. T., Bell, I. M., Garcia, M. L. Role of hERG potassium channel assays in drug development. Channels (Austin). 2 (2), 87-93 (2008).
  4. Fenton, F., Cherry, E., Glass, L. Cardiac arrhythmia. Scholarpedia. 3 (7), 1665(2008).
  5. Tisdale, J. E., et al. Drug-induced arrhythmias: A scientific statement from the American Heart Association. Circulation. 142 (15), 214-233 (2020).
  6. Kramer, J., et al. MICE models: superior to the HERG model in predicting Torsade de Pointes. Scientific Reports. 3, 2100(2013).
  7. Rampe, D., Roy, M. -L., Dennis, A., Brown, A. M. A mechanism for the proarrhythmic effects of cisapride (Propulsid): high affinity blockade of the human cardiac potassium channel HERG. FEBS Letters. 417 (1), 28-32 (1997).
  8. Girouard, S. D., Laurita, K. R., Rosenbaum, D. S. Unique properties of cardiac action potentials recorded with voltage-sensitive dyes. Journal of Cardiovascular Electrophysiology. 7 (11), 1024-1038 (1996).
  9. Herron, T. J., Lee, P., Jalife, J. Optical imaging of voltage and calcium in cardiac cells & tissues. Circulation Research. 110 (4), 609-623 (2012).
  10. Hou, J. H., Kralj, J. M., Douglass, A. D., Engert, F., Cohen, A. E. Simultaneous mapping of membrane voltage and calcium in zebrafish heart in vivo reveals chamber-specific developmental transitions in ionic currents. Frontiers in Physiology. 5, 344(2014).
  11. Ronzhina, M., et al. Di-4-ANEPPS modulates electrical activity and progress of myocardial ischemia in rabbit isolated heart. Frontiers in Physiology. 12, 1-15 (2021).
  12. Beck, C., Gong, Y. A high-speed, bright, red fluorescent voltage sensor to detect neural activity. Scientific Reports. 9 (1), 15878(2019).
  13. Blinova, K., et al. International multisite study of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug proarrhythmic potential assessment. Cell Reports. 24 (13), 3582-3592 (2018).
  14. Kovacs, G. T. A. Electronic sensors with living cellular components. Proceedings of the IEEE. 91 (6), 915-929 (2003).
  15. Tertoolen, L. G. J., Braam, S. R., van Meer, B. J., Passier, R., Mummery, C. L. Interpretation of field potentials measured on a multi electrode array in pharmacological toxicity screening on primary and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Biochemical and Biophysical Research Communication. 497 (4), 1135-1141 (2018).
  16. Deo, M., Akwaboah, A., Tsevi, B., Treat, J. A., Cordeiro, J. M. Role of the rapid delayed rectifier K+ current in human induced pluripotent stem cells derived cardiomyocytes. Archives of Stem Cell and Therapy. 1 (1), 14-18 (2020).
  17. Hondeghem, L. M., Hoffmann, P. Blinded test in isolated female rabbit heart reliably identifies action potential duration prolongation and proarrhythmic drugs: importance of triangulation, reverse use dependence, and instability. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 41 (1), 14-24 (2003).
  18. Dipalo, M., et al. Intracellular action potential recordings from cardiomyocytes by ultrafast pulsed laser irradiation of fuzzy graphene microelectrodes. Science Advances. 7 (15), (2021).
  19. R Core Team. R: A language and environment for statistical computing: R Foundation for Statistical Computing. , Vienna Austria. Available from: https://www.r-project.org/ (2021).
  20. Wickham, H. ggplot2: Elegant graphics for data analysis. , Springer-Verlag. New York. (2009).
  21. Wickham, H., Girlich, M. tidyr: Tidy messy data: R package version 1.2.0. , Available from: https://tidyr.tidyverse.org (2022).
  22. Wickham, H., François, R., Henry, L., Müller, K. dplyr: A grammar of data manipulation. R package version 1.0.6. , Available from: https://tidyr.tidyverse.org (2021).
  23. Godfraind, T. Discovery and development of calcium channel blockers. Frontiers in Pharmacology. 8, 286(2017).
  24. Vater, W., et al. Pharmacology of 4-(2'-nitrophenyl)-2,6-dimethyl-1,4-dihydropyridine-3,5-dicarboxylic acid dimethyl ester (Nifedipine, BAY a 1040). Arzneimittelforschung. 22 (1), 1-14 (1972).
  25. Kim, I., Boyle, K. M., Carroll, J. L. Postnatal development of E-4031-sensitive potassium current in rat carotid chemoreceptor cells. Journal of Applied Physiology. 98 (4), 1469-1477 (2005).
  26. Edwards, S. L., et al. A multiwell cardiac µGMEA platform for action potential recordings from human iPSC-derived cardiomyocyte constructs. Stem Cell Reports. 11 (2), 522-536 (2018).
  27. Fendyur, A., Spira, M. E. Toward on-chip, in-cell recordings from cultured cardiomyocytes by arrays of gold mushroom-shaped microelectrodes. Frontiers in Neuroengineering. 5, 21(2012).
  28. Hayes, H. B., et al. Novel method for action potential measurements from intact cardiac monolayers with multiwell microelectrode array technology. Scientific Reports. 9 (1), 11893(2019).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Potencja y czynno ciowe indukowane laseremelektrofizjologia kardiomiocyt wrejestracja potencja w polowychdetekcja aktywno ci arytmicznejrejestracja napi cia wewn trzkom rkowegoarytmia indukowana lekamiocena kardiotoksyczno cikardiomiocyty z kom rek macierzystych
Indukowane laserowo pomiary potencjału czynnościowego kardiomiocytów na układach mikroelektrod w celu zwiększenia predykcyjności bezpieczeństwa farmakologii
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.