Artykuł metodologiczny

Fluorescencyjne obrazowanie przyżyciowe w celu zbadania dynamiki sygnalizacji wapniowej wywołanej obciążeniem w osteocytach myszy

DOI:

10.3791/64366

⸱

24 lutego 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Meinig School of Biomedical Engineering, Cornell University, 2Sibley School of Mechanical and Aerospace Engineering, Cornell University, 3Department of Biomedical Engineering, The City College of New York, 4Department of Neuroscience, Albert Einstein College of Medicine, 5Department of Orthopaedic Surgery, Albert Einstein College of Medicine, 6Department of Molecular Pharmacology, Albert Einstein College of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecny artykuł opisuje wykonywanie metody obrazowania przyżyciowego w celu obserwacji mechanicznie indukowanej sygnalizacji wapniowej osadzonych osteocytów in vivo w czasie rzeczywistym w odpowiedzi na mechaniczne obciążenie trzeciej kości śródstopia myszy na poziomie tkankowym.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tkanka kostna jest niezwykle wrażliwa na różnice w wielkości obciążenia mechanicznego. Osteocyty, komórki dendrytyczne, które tworzą syncytium w całej kości, są odpowiedzialne za funkcję mechanosensoryczną tkanki kostnej. Badania wykorzystujące histologię, modelowanie matematyczne, hodowle komórkowe i hodowle narządów kostnych ex vivo znacznie poszerzyły wiedzę na temat mechanobiologii osteocytów. Jednak podstawowe pytanie, w jaki sposób osteocyty reagują i kodują informacje mechaniczne na poziomie molekularnym in vivo, nie jest dobrze poznane. Wewnątrzkomórkowe wahania stężenia wapnia w osteocytach stanowią użyteczny cel do dowiedzenia się więcej o ostrych mechanizmach mechanotransdukcji kości. W tym miejscu przedstawiamy metodę badania mechanobiologii osteocytów in vivo, łącząc szczep myszy z fluorescencyjnie kodowanym genetycznie wskaźnikiem wapnia wyrażonym w osteocytach z systemem ładowania i obrazowania in vivo w celu bezpośredniego wykrywania poziomu wapnia w osteocytach podczas ładowania. Osiąga się to za pomocą trzypunktowego urządzenia do zginania, które może dostarczać dobrze zdefiniowane obciążenia mechaniczne do trzeciej kości śródstopia żywych myszy, jednocześnie monitorując fluorescencyjnie wskazywane odpowiedzi wapniowe osteocytów za pomocą mikroskopii dwufotonowej. Technika ta pozwala na bezpośrednią obserwację in vivo zdarzeń sygnalizacji wapniowej osteocytów w odpowiedzi na obciążenie całej kości i jest przydatna w dążeniu do ujawnienia mechanizmów w mechanobiologii osteocytów.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Macierz kostna jest zorganizowana zgodnie z zapotrzebowaniem mechanicznym1,2 i może zmieniać się dynamicznie, aby uwzględnić zmieniające się wymagania mechaniczne3,4,5. Przełomowe prace dotyczące mechanizmu mechanosensorycznego w kości zostały opublikowane jako praca modelowa około 30 lat temu6,7,8, gdzie zaproponowano, że osteocyty osadzone w kości odczuwają mechaniczną deformację na poziomie tkanki poprzez ruch płynów w swoim lokalnym środowisku. Model ten został zweryfikowany eksperymentalnie w eksperymentach in vitro i ex vivo, w których wyraźnie wykazano, że osteocyty są dość wrażliwe mechanicznie1,2,3,4,5,6 a także wyrażają cytokiny, które kierują zachowaniem osteoblastów budujących kości7 oraz osteoklasty8,9,10,11,12.

Sygnalizacja wapniowa jest wszechobecnym drugim przekaźnikiem, który został uznany za centralną postać i niezawodny cel eksperymentalny w mechanobiologii osteocytów13,14,15,16. Sygnalizacja wapniowa ma tę zaletę, że jest szeroko badana w biologii komórki17, co oznacza, że wiele wiadomo o jej dalszych skutkach i odpowiednich narzędziach fluorescencyjnych dostępnych do obserwacji eksperymentalnych. W analizach in vitro wykorzystano sygnalizację wapniową jako sposób identyfikacji mechanicznej aktywacji osteocytów i scharakteryzowania dynamicznego zachowania sygnalizacyjnego5,18,19. Warto zauważyć, że obserwacja sygnalizacji wapniowej w linii komórkowej osteocytów dostarczyła ostatecznych dowodów na to, że aktywacja płynu w przyczepach integryny wzdłuż procesu komórkowego jest prawdopodobnie główną formą aktywacji przepływu płynu20. To badanie jest jednym z wielu, które pokazują użyteczność sygnalizacji wapniowej. Jest niezawodnie indukowany poprzez mechaniczną aktywację osteocytów i dlatego służy jako silny cel do badania mechanobiologii osteocytów.

Mechanotransdukcja osteocytów in vivo jest wysoce zależna od ich bezpośredniego mikrośrodowiska. Białka wiążące macierz (np. proteoglikany, integryny) zapewniają funkcjonalne przyłączenia między błonami komórkowymi osteocytów w układzie, który ma kluczowe znaczenie dla aktywacji płynów w komórce21,22. Chociaż dwuwymiarowe (2D) analizy in vitro są pomocne, są one ograniczone, ponieważ nie obejmują tych krytycznych cech trójwymiarowych (3D). Preparaty ex vivo sygnalizacji wapniowej osteocytów przy użyciu mikroskopii konfokalnej rzuciły nieco światła na to, jak osteocyty reagują, zachowując otaczającą macierz w stanie nienaruszonym13,16. Uważa się jednak, że usunięcie dopływu krwi z kości zmienia składniki odżywcze i dynamikę płynów w układzie lacunokanicznym. Badanie mechanobiologii osteocytów wymaga zbadania in vivo sygnalizacji osteocytów indukowanej obciążeniem.

Badania in vivo komórek osadzonych w kości były znacznie utrudnione przez ograniczenia tradycyjnych technik obrazowania, takich jak jasne pole i mikroskopia konfokalna. Osteocyty są umieszczone w zmineralizowanej macierzy 23 składającej się z hydroksyapatytu, kolagenu typu 1 i innych białek niekolagenowych, które ograniczają dostępność optyczną24 i sprawiają, że badanie in vivo jest technicznie trudne. Jednak ostatnie postępy w nieliniowym obrazowaniu fluorescencyjnym i genetycznie kodowanych reporterach wapnia stwarzają możliwość przezwyciężenia tych wyzwań.

Tutaj przedstawiamy nowatorskie podejście z możliwością obrazowania osteocytów in vivo w celu pomiaru sygnalizacji wapniowej z rozdzielczością na poziomie komórkowym25. Osiągnięto to dzięki zastosowaniu dynamicznego markera fluorescencyjnego wykorzystującego genetycznie kodowany wskaźnik wapnia po raz pierwszy w osteocytach myszy. Myszy z ekspresją GCaMP6f sterowaną przez osteocyty DMP1-Cre wykazują widoczną fluorescencję w osteocytach w całej korze trzonowej śródstopia myszy17,26. Używamy trzypunktowego systemu gięcia w celu zastosowania fizjologicznych poziomów wielkości odkształcenia w zakresie 250-2,000 με27. Technika ta pozwala na wizualizację in vivo dynamiki sygnalizacji wapniowej osteocytów podczas mechanicznego obciążenia całej kości i może być przydatna dla każdego, kto chce zrozumieć mechanobiologię osteocytów. Metoda ta byłaby odpowiednia dla badaczy chcących rozszerzyć swoją pracę z analiz in vitro na zastosowania in vivo, zwłaszcza przy zachowaniu funkcjonalnych analiz molekularnych (tj. badania aktywności komórkowej poprzez sygnalizację wapniową) w przeciwieństwie do szeroko zakrojonych badań fenotypowania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie metody zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) na Uniwersytecie Cornella.

1. Przygotowanie materiałów i sprzętu

  1. Zaprojektuj i zbuduj urządzenie obciążające śródstopie do użytku z górnym mikroskopem wielofotonowym.
    UWAGA: Szczegóły dotyczące specyfikacji komponentów i działania urządzenia są opisane w dokumentacji uzupełniającej poprzedniego badania25. Krótko mówiąc, główne komponenty składają się z siłownika połączonego szeregowo z ogniwem obciążnikowym i wspornikiem załadowczym, łaźni wodnej i sworznia podparcia. Siłownik i ogniwo obciążnikowe można dostać w sprzedaży i powinny być w stanie pomieścić obciążenia do 300 g. Łaźnia wodna, sworzeń podparcia i wspornik ładunku powinny być wykonane z tytanu lub stali nierdzewnej. Mogą być wytwarzane we własnym zakresie lub komercyjnie za pomocą druku 3D z metalu.
  2. Skalibruj wartości wielkości odkształcenia do przemieszczenia siłownika z wyprzedzeniem dla poszczególnych grup myszy (tj. płeć, leczenie, genotyp). Odbywa się to za pomocą mapowania odkształceń powierzchniowych w procedurze opisanej w poprzednim badaniu25.
  3. Użyj myszy z tłem C57BL / 6, w wieku 16-18 tygodni, które wyrażają fluorescencyjne konstrukty wskaźnika wapnia w osteocytach. Ukierunkowaną ekspresję osteocytów osiąga się poprzez krzyżowanie myszy GCaMP6f i Dmp1-Cre aktywowanych floksami. Szczegóły dotyczące strategii hodowlanych i dostawców myszy założycieli są opisane we wcześniej opublikowanym badaniu25.
  4. Wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne, wspornik obciążenia, łaźnię wodną i sworzeń podparcia za pomocą autoklawu (57,2 °C, 15 psi, 3-4 min). Zdezynfekuj obiektywy mikroskopu 100% etanolem.
  5. Włącz komponenty elektroniczne, w tym źródło lasera, mikroskop, ogniwo obciążnikowe i siłownik. Odczekaj 15-20 minut, aby każdy składnik rozgrzał się przed obrazowaniem przyżyciowym.
    1. Upewnij się, że elementy siłownika i ogniwa obciążnikowego są połączone i aktywowane w urządzeniu sterującym. Generuj oprogramowanie sterujące za pomocą różnych platform, w tym Matlab, LabView i Python, zgodnie z preferencjami użytkownika. Główny kod Matlaba użyty w tym badaniu nazywa się Actuator_Control_Software_withLoadCell.m (wewnątrz folderu MT3 Loading Device Control Software.zip Supplementary File 1).
      UWAGA: Większość dostępnych na rynku mikroskopów dwufotonowych jest dostarczana z solidnym oprogramowaniem do obrazowania. Kluczowymi cechami wymaganymi dla tej metody są możliwość dostrojenia lasera do odpowiedniego wzbudzenia dla GCaMP6f (920 nm), możliwość regulacji natężenia mocy lasera oraz zbiór szeregów czasowych o częstotliwości co najmniej 6 Hz. Przed przystąpieniem do eksperymentów należy potwierdzić połączenie lasera z oprogramowaniem do obrazowania oraz odpowiedni układ ścieżki światła dla obrazowania dwufotonowego. Jest to potwierdzane na różne sposoby w zależności od konfiguracji obrazowania. Zwykle jest to wskaźnik świetlny.

2. Chirurgia

  1. Przygotuj etap chirurgiczny i wysterylizuj powierzchnię 70% etanolem. Upewnij się, że podczas zabiegów chirurgicznych stosowane są techniki aseptyki. Utrzymuj poziom czystości wymagany dla tego protokołu, ponieważ jest to procedura terminalna.
  2. Znieczulić mysz odparowanym izofluranem zmieszanym z powietrzem lub tlenem klasy medycznej o natężeniu przepływu 1 l/min. Przeprowadzić wstępne znieczulenie w komorze indukcyjnej dla gryzoni za pomocą 3%-5% izofluranu. Utrzymuj znieczulenie na poziomie 1%-2,5% izofluranu w stożku nosowym do zabiegów obrazowania chirurgicznego i przyżyciowego.
  3. Umieść urządzenie grzewcze pod myszą lub obok niej, aby pomóc w utrzymaniu homeostatycznej temperatury ciała. Monitoruj temperaturę ciała myszy, tętno i saturację tlenem przez cały czas trwania operacji. Utrzymuj częstość oddechów między 60-80 oddechami na minutę i utrzymuj ją, dostosowując dawkę izofluranu.
  4. Umieść mysz w pozycji leżącej. Potwierdź głębokość znieczulenia przed nacięciem za pomocą uszczypnięcia palca u nogi. Zidentyfikuj lokalizację między drugą a trzecią kością śródstopia. Wykonaj nacięcie skalpela przez skórę właściwą między drugą a trzecią kością śródstopia, zaczynając od dystalnego końca i postępując proksymalnie wzdłuż długości kości (~5 mm).
    UWAGA: Kości śródstopia są dystalne do kości skokowych na łapie i biegną bezpośrednio proksymalnie do dystalnych paliczków. Składają się z kości śródstopia (przyśrodkowej do bocznej) I, II, III, IV i V. Trzecia kość śródstopia jest wyśrodkowana pośrodku zgiętej części tylnej łapy.
  5. Za pomocą kleszczy otwórz pole operowane, pociągając skórę w kierunku krawędzi przyśrodkowych/bocznych. Wytnij ścięgna prostowników za pomocą prostych nożyczek Vannas, aby odsłonić trzecią kość śródstopia.
  6. Włożyć środkowy sworzeń podparcia urządzenia obciążającego kość śródstopia pod trzecią kość śródstopia.
    1. Początkowo włóż szpilkę w małą przestrzeń na dystalnym końcu, gdzie trzecia kość śródstopia styka się z bliższym paliczkiem, a następnie przesuń szpilkę proksymalnie, aż spocznie na środku trzonu trzeciej kości śródstopia.
    2. Zachowaj szczególną ostrożność, aby zagwarantować bezpośrednie połączenie między kością a szpilką, z wyłączeniem wszelkich mięśni i powięzi. Ma to kluczowe znaczenie dla stabilnego obrazowania podczas ładowania protokołów.
  7. Chwyć kostkę kleszczami i umieść stopę w łaźni wodnej wypełnionej solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco (8-10 ml). Zamocuj łapę na miejscu za pomocą wspornika załadowczego i podłącz wspornik do układu siłownika/ogniwa obciążnikowego. Ukończone przygotowanie chirurgiczne i rozmieszczenie w urządzeniu jest pokazane na Rysunek 1.

3. Obrazowanie

UWAGA: Kompletny zestaw mikroskopii dwufotonowej używany w tym protokole ma dwa pakiety oprogramowania: Chameleon Discovery GUI V2.0.6 dla lasera (Rysunek 2) i ThorImageLS4.0 dla mikroskopu (Rysunek 3). Aby wykonać obraz na dwufotonie, naciśnij Live ( Rysunek 3, niebieski przycisk odtwarzania). Przeprowadzając eksperyment w celu zobrazowania i zapisania danych, naciśnij przycisk przechwytywania (Rysunek 3, zakładka u góry, obok opcji Ustawienia przechwytywania). Są one specyficzne dla sprzętu i dostawców użytych w tym eksperymencie, ale wiele alternatyw z niezbędnymi specyfikacjami znajdującymi się w tym protokole (długości fal wzbudzenia, rozmiar widocznego okna, szybkość przechwytywania obrazu itp.) również by działało.

  1. Bardzo ostrożnie podnieś zestaw urządzenia ładującego za pomocą myszy i umieść go na platformie mikroskopu.
  2. Zacznij od obiektywu o małym powiększeniu w trybie epifluorescencji (Rysunek 3, menu rozwijane u góry z opcjami Multiphoton lub Fluorescence Setup), aby zlokalizować i wyśrodkować środkowy trzon kości.
  3. Po zlokalizowaniu obszaru zainteresowania przełącz się na większe powiększenie obiektywu zanurzonego w wodzie (20x-40x) i przełącz optykę na dwufotonową (Rysunek 3, menu rozwijane u góry z opcjami Ustawienia wielofotonowe lub fluorescencyjne).
    UWAGA: Zalecany rozmiar pola widzenia to co najmniej 250 μm x 250 μm dla aktywności komórkowej i można go uzyskać z zoomem optycznym lub cyfrowym, w zależności od systemu obrazowania.
    1. Odpowiednia minimalna gęstość pikseli to 512 x 512 pikseli. Aby ustawić gęstość pikseli, użyj ustawień Galvo/Resonance Area Control (Rysunek 3).
    2. Szukając zwrotu z inwestycji, unikaj fotowybielania, zmniejszając moc za pomocą opcji Power Control ( Rysunek 3) i zwiększając wzmocnienie PMT w ustawieniach Galvo/Resonance Scanner Control (Rysunek 3).
    3. Zidentyfikuj powierzchnię kości w trybie dwufotonowym, szukając włóknistej autofluorescencji okostnej w zielonym kanale, który wykorzystuje filtr pasmowoprzepustowy wyśrodkowany na 525 nm.
      UWAGA: Autofluorescencja jest najbardziej widoczna przy długości fali wzbudzenia 1,000 nm, ale jest również dostępna przy wzbudzeniu 920 nm (Rysunek 3, Sterowanie laserem wielofotonowym). Ten punkt orientacyjny jest ważny dla określenia względnej głębokości ROI w korze śródstopia podczas obserwacji osteocytów. Należy zauważyć, że podczas eksperymentów z szeregami czasowymi dokładna głębokość obrazowanej płaszczyzny nie jest rejestrowana, chociaż zwykle waha się ona w granicach 15-30 μm. Jeśli pożądane są dokładne pomiary głębokości, konieczne byłoby wykonanie stosu z.
  4. Przeprowadź testowe ładowanie próbne, aby upewnić się, że przygotowanie chirurgiczne i ustawienie w urządzeniu ładującym skutecznie osiągnęły stabilne pole zwrotu z inwestycji (tj. brak przemieszczenia w płaszczyźnie Z). Krótko mówiąc, uruchom cykl ładowania, aby ocenić stabilność preparatu chirurgicznego. Wykonaj ładowanie, uruchamiając sekcję Switch on Servo and Move w kodzie Matlaba.
    1. Zastosuj niewielką tarę. Upewnij się, że odpowiednie protokoły ładowania fal haversine są przygotowane z wyprzedzeniem. Wprowadzić odpowiednie parametry obciążenia uzyskane podczas kalibracji w ppkt 1.2. Wykonaj ładowanie, uruchamiając sekcję Switch on Servo and Move w kodzie Matlaba.
    2. Jeśli na ekranie widoczny jest ruch komórek, który wynika z mikroruchów kości w odpowiedzi na obciążenie lub oddychanie, wybierz inny zwrot z inwestycji wzdłuż kierunków y lub z, aby upewnić się, że znajduje się on bezpośrednio nad środkowym kołkiem podparcia. Jeśli ruch nie ustąpi, należy ręcznie wyregulować chirurgiczne ułożenie szpilki pod trzecią kością śródstopia.
      UWAGA: Dobry obszar zainteresowania (ROI) to taki, w którym komórki nie poruszają się w płaszczyźnie/ognisku ani poza nią. Ruch w kierunkach x i y można dostosować do przetwarzania końcowego za pomocą wtyczki do dopasowywania szablonów w ImageJ.
  5. Przeprowadzić obrazowanie stosu Z lub serii t z obciążeniem zgodnie z projektem eksperymentalnym, aby rejestrować odpowiednio morfometryczne lub dynamiczne zdarzenia sygnalizacyjne wywołane obciążeniem.
    1. Ustaw długość fali wzbudzenia dla wskaźnika fluorescencyjnego (np. 920 nm dla GCaMP6f). W przypadku stosu z użyj wystarczająco niskiej rozdzielczości, aby uchwycić cechy osteocytów, takie jak kroki 0,25-1 μm. W przypadku serii t użyj ustawień, aby próbkować co najmniej 6 razy większą szybkość ładowania. W przypadku szybkości ładowania 1 Hz, obrazowanie z szybkością 6 klatek na sekundę (FPS) reprezentuje minimalnie odpowiednią szybkość przechwytywania (Rysunek 3, Sterowanie skanerem Galvo/rezonansowym).
    2. W przypadku wczytywania i obrazowania na żywo zbieraj niezaładowane dane bazowe dla każdego ataku. W tym badaniu preferowane jest 60 s obrazowania bez obciążenia, a następnie 60 s ładowania i obrazowania. Zaprojektuj odpowiednio protokoły ładowania i obrazowania. Aby zebrać dane, naciśnij Capture (Rysunek 3, zakładka u góry, obok Capture Setup).
      1. Okres refrakcji dla pełnej odpowiedzi sygnalizacyjnej wapnia w komórkach kostnych szacuje się na około 15 min28. Odczekaj co najmniej tyle czasu między sekwencyjnymi atakami ładowania podczas zbierania dynamicznych danych sygnalizacyjnych.
      2. Przez cały czas trwania eksperymentu nie należy pozostawiać zwierzęcia bez opieki, aby upewnić się, że nie obudzi się niespodziewanie ze znieczulenia lub nie doświadczy stresu bez możliwości interwencji.
        UWAGA: Eutanazja na końcu procedury powinna być przeprowadzona poprzez zwichnięcie szyjki macicy lub inne odpowiednie środki zgodnie z metodami zatwierdzonymi przez IACUC. Jest to protokół nieprzeżywalności, co oznacza, że wszystkie zwierzęta są poddawane eutanazji po obrazowaniu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj przedstawiamy metodologię badania sygnalizacji wapniowej w osadzonych osteocytach in vivo przy użyciu ostrego przygotowania chirurgicznego i wielofotonowego obrazowania fluorescencyjnego. Zielony sygnał fluorescencyjny można zaobserwować na podstawie genetycznie kodowanych wskaźników wapnia w osteocytach poprzez ekspresję DMP1-Cre. Rysunek 4 to jednopłaszczyznowy obraz osadzonych osteocytów. Należy zauważyć, że wszystkie komórki są znakowane i wyrażają wyjściową zielo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Trudno jest eksperymentalnie badać osteocyty ze względu na ich osadzone w macierzy tkanek twardych, do której szybko się pogarszają lub różnicują po usunięciu tej niszy. Badania nad osteocytami wymagały ogromnej pomysłowości w ciągu ostatnich 3 dekad, takich jak stworzenie linii podobnych do osteocytów 29,30,31, ustanowienie protokołów izolacji pierwotnych osteocytów32,33, a nawet wysiłki mając...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
#3 Uchwyt skalpelaMikroskopia elektronowa Nauki72040-03Materiały chirurgiczne
20x Obiektyw do zanurzenia w wodzieOlympusXLUMPLFLN20XWJest to obiektyw 20x, ale 40x może być również używany do tego protokołu. Zalecamy zanurzenie w wodzie, ponieważ podczas obrazowania należy ją zanurzyć w kąpieli, więc obiektyw na świeżym powietrzu może powodować aberracje
A.M. Bickford Omnicon F/AIRAM Bickford80120Rozsądna odpowiedź na problemy z gazem anestezjologicznym na sali operacyjnej, filtr gazu anestezjologicznego F/AIR został specjalnie zaprojektowany do usuwania odpadowych gazów anestezjologicznych, takich jak izofluran, Halothane, Enfluran itp. ze środowiska sali operacyjnej.
Zestaw A.M. Bickford Omnicon F/AIR AM Bickford80000Cały zestaw z rurką i adapterami do podłączenia F/AIR do konfiguracji
B6J. Cg-Gt(ROSA)26Sortm95.1(CAG-GCaMP6f)Hze/MwarJThe Jackson Laboratory28865GCaMP6f Myszy do krzyżowania z myszami Dmp1-Cre
B6N. FVB-Tg(Dmp1-cre)1Jqfe/BwdJThe Jackson Laboratory23047Dmp1-Cre Myszy do krzyżowania z myszami GCaMP6f 
Kompresyjne ogniwo obciążnikoweFUTEK Advanced Sensor Technology, Inc.905898LCM100 , 1000 g , Subminiaturowe ogniwo obciążnikowe do rozciągania i ściskania (z gwintem miniaturowym/liniowym) , RoHS bezołowiowe, Materiał - 17-4 PH SS , Gwint M3x0.5 , 34 Awg 4-żyłowy poliestrowy w oplocie, 5 stóp
Long Corning 500 mL DPBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco), 1x [+] wapń, magnezVWR International21-030-CVWanna zrównoważona jonowo, która zawiera wapń, zanurza śródstopie podczas obrazowania
Narzędzie dentystyczneMikroskopia elektronowa NaukiMateriały chirurgiczne
Alkohol etylowy czysty 200-procentowy odczynnik ACS >99,5%Sigma AldrichSIAL-459844-500MLCele sterylizacji
Sworzeń podparciaFathomN/AWytwarzany przez bezpośrednie spiekanie laserowe 3D stali nierdzewnej (stop PH1) z plików 3D SolidWorks STL. Pierwotnym dostawcą był GPI Prototype & Manufacturing Services, Inc, obecnie przejęta przez FATHOM, specyfikacje są podane we wcześniej opublikowanym dokumencie
Zestaw wyjściowy USB220 o wysokiej rozdzielczości i szybkościFUTEK Advanced Sensor Technology, Inc.717435Służy do podłączenia ogniwa obciążnikowego do laptopa
ImageJ 1.53t z Javą 1.8.0_172 (dla 64-bitowego systemu Windows)NIHNie dotyczyZainstaluj tutaj https://imagej.nih.gov/ij/
IsofluranePiramal Critical Care66794-013-25100% wziewny płyn
Wspornik załadunkowyFathomN/AWykonane przez bezpośrednie spiekanie laserowe 3D stali nierdzewnej (stopu PH1) z plików 3D SolidWorks STL. Pierwotnym dostawcą był GPI Prototype & Manufacturing Services, Inc, obecnie przejęta przez FATHOM, specyfikacje są podane we wcześniej opublikowanym dokumencie
MATLAB R2019aMathWorksDo uruchomienia urządzenia ładującego
Matrx VIP 3000 waporyzator dobrze napełnij izofluranButler Schein Animal Health14309Parownik do znieczulenia
Pulsoksymetr Nonin Model 2500A Vet2500A Vet
Serwo piezoelektryczne sterownikPI-USAE-625Element elektroniczny zalecany przez firmę do stosowania z siłownikiem
Liniowy siłownik piezoelektryczny PiezoMove o wysokiej sztywnościPI-USAP-602.5SLSiłownik do urządzenia załadowczego
Ostrza skalpela, nr 10 do uchwytu nr 3, opakowanie 100 sztMikroskopia elektronowa Sciences72044-10Materiały chirurgiczne
Pęseta ze stali nierdzewnej z ostrymi, cienkimi końcówkami. Długość: 120 mmMikroskopia elektronowa Sciences78326-42Materiały chirurgiczne
Mikroskop wielofotonowy Thorlabs BergamoThorLabsN/A Jestto tylko system obrazowania i nie ma dołączonego lasera, chociaż ThorLabs ma opcje laserowe w razie potrzeby
Tytanowo-szafirowy kameleon Discovery NX z całkowitą kontrolą mocy (TPC)KoherentnyNie dotyczyTechnicznie rzecz biorąc, system ten ma dwa lasery, oba przestrajalne i stałe. Jednak do protokołu potrzebne jest tylko przestrajanie. 
Nożyczki sprężynowe Vannas - krawędź tnąca 4 mmFine Science Tools15018-10Materiały chirurgiczne
Kąpiel wodnaFathomN/AWykonane przez bezpośrednie spiekanie laserowe 3D stali nierdzewnej (stop PH1) z plików 3D SolidWorks STL. Pierwotnym dostawcą był GPI Prototype & Manufacturing Services, Inc, obecnie przejęta przez FATHOM, specyfikacje znajdują się w wcześniej opublikowanym dokumencie
parowy .

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lu, X. L., Huo, B., Park, M., Guo, X. E. Calcium response in osteocytic networks under steady and oscillatory fluid. Bone. 51 (3), 466-473 (2012).
  2. Wu, D., Schaffler, M. B., Weinbaum, S., Spray, D. C. Matrix-dependent adhesion mediates network responses to physiological stimulation of the osteocyte cell process. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 12096-12101 (2013).
  3. Verbruggen, S. W., Vaughan, T. J., McNamara, L. M. Fluid flow in the osteocyte mechanical environment: A fluid-structure interaction approach. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 13 (1), 85-97 (2013).
  4. Genetos, D. C., Kephart, C. J., Zhang, Y., Yellowley, C. E., Donahue, H. J. Oscillating fluid flow activation of gap junction hemichannels induces atp release from MLO-Y4 osteocytes. Journal of Cellular Physiology. 212 (1), 207-214 (2007).
  5. Lu, X. L., Huo, B., Chiang, V., Guo, X. E. Osteocytic network is more responsive in calcium signaling than osteoblastic network under fluid flow. Journal of Bone and Mineral Research. 27 (3), 563-574 (2012).
  6. Schaffler, M. B., Kennedy, O. D. Osteocyte signaling in bone. Current Osteoporosis Reports. 10 (2), 118-125 (2012).
  7. Kramer, I., et al. Osteocyte Wnt/ -Catenin signaling is required for normal bone homeostasis. Molecular and Cellular Biology. 30 (12), 3071-3085 (2010).
  8. Nakashima, T., et al. Evidence for osteocyte regulation of bone homeostasis through RANKL expression. Nature Medicine. 17 (10), 1231-1234 (2011).
  9. Kennedy, O. D., et al. Activation of resorption in fatigue-loaded bone involves both apoptosis and active pro-osteoclastogenic signaling by distinct osteocyte populations. Bone. 50 (5), 1115-1122 (2012).
  10. Rawlinson, S. C. F., Wheeler-Jones, C. P. D., Lanyon, L. E. Arachidonic acid for loading induced prostacyclin and prostaglandin E2 release from osteoblasts and osteocytes is derived from the activities of different forms of phospholipase A2. Bone. 27 (2), 241-247 (2000).
  11. David, V., et al. Ex vivo bone formation in bovine trabecular bone cultured in a dynamic 3D bioreactor is enhanced by compressive mechanical strain. Tissue Engineering Part A. 14 (1), 117-126 (2008).
  12. Davies, C. M., et al. Mechanically loaded ex vivo bone culture system "Zetos": systems and culture preparation. European Cell & Materials. 11, 57-75 (2006).
  13. Adachi, T., et al. Osteocyte calcium signaling response to bone matrix deformation. Journal of Biomechanics. 42 (15), 2507-2512 (2009).
  14. Huo, B., Lu, X. L., Guo, X. E. Intercellular calcium wave propagation in linear and circuit-like bone cell networks. Philosophical Transactions of the Royal Society A: Mathematical, Physical and Engineering Sciences. 368 (1912), 617-633 (2010).
  15. Morrell, A. E., et al. Mechanically induced Ca2+ oscillations in osteocytes release extracellular vesicles and enhance bone formation. Bone Research. 6, 6(2018).
  16. Jing, D., et al. In situ intracellular calcium oscillations in osteocytes in intact mouse long bones under dynamic mechanical loading. FASEB Journal. 28 (4), 1582-1592 (2014).
  17. Chen, T. -W., Wardill, T. J., Sun, Y., Pulver, S. R., Renninger, S. L. Ultra-sensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  18. Jacobs, C. R., Temiyasathit, S., Castillo, A. B. Osteocyte mechanobiology and pericellular mechanics. Annual Review of Biomedical Engineering. 12, 369-400 (2010).
  19. Jing, D., et al. Spatiotemporal properties of intracellular calcium signaling in osteocytic and osteoblastic cell networks under fluid. Bone. 53 (2), 531-540 (2013).
  20. Thi, M. M., Suadicani, S. O., Schaffler, M. B., Weinbaum, S., Spray, D. C. Mechanosensory responses of osteocytes to physiological forces occur along processes and not cell body and require αVβ3 integrin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (52), 21012-21017 (2013).
  21. Wang, Y., McNamara, L. M., Schaffler, M. B., Weinbaum, S. A model for the role of integrins in flow induced mechanotransduction in osteyocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (40), 15941-15946 (2007).
  22. McNamara, L. M., Majeska, R. J., Weinbaum, S., Friedrich, V., Schaffler, M. B. Attachment of osteocyte cell processes to the bone matrix. The Anatomical Record. 292 (3), 355-363 (2009).
  23. Franz-Odendaal, T. A., Hall, B. K., Witten, P. E. Buried alive: How osteoblasts become osteocytes. Developmental Dynamics. 235 (1), 176-190 (2005).
  24. Jing, D., et al. Tissue clearing and its application to bone and dental tissues. Journal of Dental Research. 98 (6), 621-631 (2019).
  25. Lewis, K. J., et al. Osteocyte calcium signals encode strain magnitude and loading frequency in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (44), 11775-11780 (2017).
  26. Lu, Y., et al. DMP1-targeted Cre expression in odontoblasts and osteocytes. Journal of Dental Research. 86 (4), 320-325 (2007).
  27. Rubin, C. T., Lanyon, L. E. Dynamic strain similarity in vertebrates; an alternative to allometric limb bone scaling. Journal of Theoretical Biology. 107 (2), 321-327 (1984).
  28. Jacobs, C. R., et al. Differential effect of steady versus oscillating flow on bone cells. Journal of Biomechanics. 31 (11), 969-976 (1998).
  29. Kato, Y., Windle, J. J., Koop, B. A., Mundy, G. R., Bonewald, L. F. Establishment of an osteocyte-like cell line, MLO-Y4. Journal of Bone and Mineral Research. 12 (12), 2014-2023 (1997).
  30. Kato, Y., et al. Establishment of an osteoid preosteocyte-like cell MLO-A5 that spontaneously mineralizes in culture. Journal of Bone and Mineral Research. 16 (9), 1622-1633 (2001).
  31. Woo, S. M., Rosser, J., Dusevich, V., Kalajzic, I., Bonewald, L. F. Cell line IDG-SW3 replicates osteoblast-to-late-osteocyte differentiation in vitro and accelerates bone formation in vivo. Journal of Bone and Mineral Research. 26 (11), 2634-2646 (2011).
  32. vander Plas, A., Nijweide, P. J. Isolation and purification of osteocytes. Journal of Bone and Mineral Research. 7 (4), 389-396 (1992).
  33. Gu, G., Nars, M., Hentunen, T. A., Metsikkö, K., Väänänen, H. K. Isolated primary osteocytes express functional gap junctions in vitro. Cell and Tissue Research. 323 (2), 263-271 (2006).
  34. Paic, F., et al. Identification of differentially expressed genes between osteoblasts and osteocytes. Bone. 45 (4), 682-692 (2009).
  35. Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
  36. Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Sygnalizacja wapniowa osteocyt wmikroskopia dwufotonowaodpowied na obci enie mechanicznemechanobiologia ko cimyszy z wska nikiem wapniazginanie tr jpunktowesygnalizacja indukowana obci eniemobrazowanie in vivo

Powiązane artykuły