Method Article

Wyznaczanie kinetyki in vitro i komórkowej inkinety włączania fluorogenicznych aptamerów RNA

DOI:

10.3791/64367

⸱

August 9th, 2022

 ,  , 
1Department of Chemistry and Henry Eyring Center for Cell & Genome Science, University of Utah

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół przedstawia dwie metody określania kinetyki aptamerów fluorogennego RNA: Szpinak2 i Brokuły. Pierwsza metoda opisuje, w jaki sposób mierzyć kinetykę aptamerów fluorogennych in vitro za pomocą czytnika płytkowego, podczas gdy druga metoda szczegółowo opisuje pomiar kinetyki aptamerów fluorogennych w komórkach za pomocą cytometrii przepływowej.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aptamery fluorogennego RNA zostały zastosowane w żywych komórkach do oznaczania i wizualizacji RNA, raportowania ekspresji genów i aktywacji biosensorów fluorescencyjnych, które wykrywają poziomy metabolitów i cząsteczek sygnałowych. W celu zbadania zmian dynamicznych w każdym z tych układów pożądane jest uzyskanie pomiarów w czasie rzeczywistym, ale dokładność pomiarów zależy od kinetyki reakcji fluorogenicznej, która jest szybsza niż częstotliwość próbkowania. W tym miejscu opisano metody określania kinetyki włączania in vitro i komórkowej dla aptamerów fluorogennego RNA za pomocą czytnika płytek wyposażonego odpowiednio w iniektor próbki i cytometr przepływowy. Pokazujemy, że kinetyka in vitro aktywacji fluorescencji aptamerów Spinach2 i Brokułów może być modelowana jako dwufazowe reakcje asocjacyjne i mają różne stałe szybkości faz szybkich wynoszące odpowiednio 0,56 s-1 i 0,35 s-1. Ponadto wykazaliśmy, że kinetyka komórkowa aktywacji fluorescencji Spinacha2 w Escherichia coli, która jest dodatkowo ograniczona przez dyfuzję barwnika do bakterii Gram-ujemnych, jest nadal wystarczająco szybka, aby umożliwić dokładną częstotliwość pobierania próbek w skali minutowej. Te metody analizy kinetyki aktywacji fluorescencji mają zastosowanie do innych opracowanych aptamerów fluorogennego RNA.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Reakcje fluorogenne to reakcje chemiczne, które generują sygnał fluorescencyjny. Aptamery fluorogennego RNA zazwyczaj pełnią tę funkcję poprzez wiązanie barwnika o małej cząsteczce w celu zwiększenia jego fluorescencji (Rysunek 1A) < sup class = "xref">1. Opracowano różne systemy aptamerów fluorogennego RNA, które składają się ze specyficznych sekwencji aptamerów RNA i odpowiadających im ligandów barwnikowych1. Aptamery fluorogennego RNA zostały dołączone do transkryptów RNA jako znaczniki fluorescencyjne, które umożliwiają obrazowanie żywych komórek mRNA i niekodujących RNA2,3,4. Zostały one również umieszczone po sekwencjach promotorowych jako fluorescencyjne reportery ekspresji genów, podobnie jak w przypadku użycia białka zielonej fluorescencji (GFP) jako reportera, z wyjątkiem tego, że funkcja raportowania jest na poziomie RNA5,6. Wreszcie, aptamery fluorogennego RNA zostały włączone do biosensorów fluorescencyjnych opartych na RNA, które są zaprojektowane do wyzwalania reakcji fluorogenicznej w odpowiedzi na określoną małą cząsteczkę. Biosensory fluorescencyjne oparte na RNA zostały opracowane do obrazowania żywych komórek różnych niefluorescencyjnych metabolitów i cząsteczek sygnałowych7,8,9,10,11.

Rośnie zainteresowanie rozwojem aptamerów fluorogennego RNA do wizualizacji dynamicznych zmian w lokalizacji RNA, ekspresji genów i sygnałach małocząsteczkowych. Dla każdego z tych zastosowań pożądane jest uzyskanie pomiarów w czasie rzeczywistym, ale dokładność pomiarów zależy od kinetyki reakcji fluorogenicznej, która jest szybsza niż częstotliwość próbkowania. W tym miejscu opisujemy metody określania kinetyki in vitro dla aptamerów fluorogennego RNA Spinach212 i Broccoli13 za pomocą czytnika płytek wyposażonego w wstrzykiwacz próbki oraz określania kinetyki włączania komórkowego dla Spinach2 wyrażonego w Escherichia coli za pomocą cytometru przepływowego. Te dwa aptamery RNA zostały wybrane, ponieważ zostały zastosowane do badania lokalizacji RNA2,3,4, były używane w reporters5, 6 i biosensors7,8,9,10,11i odpowiednie ligandy barwnikowe (DFHBI lub DFHBI-1T) są dostępne w handlu. Podsumowanie ich właściwości in vitro określonych w literaturze znajduje się w tabeli 14,13,14, które wpłynęły na opracowanie protokołu (np. użyte długości fal i stężenia barwnika). Wyniki te pokazują, że reakcje fluorogenne, na które wpływają aptamery RNA, są szybkie i nie powinny utrudniać dokładnych pomiarów dla pożądanych zastosowań biologicznych komórek.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Eksperyment kinetyczny in vitro

  1. Przygotowanie matryc DNA metodą PCR
    1. Konfiguracja reakcji PCR: Aby przygotować reakcje PCR, połącz następujące odczynniki w cienkościennej probówce do PCR:
      33 μL wody podwójnie destylowanej (ddH2O)
      10 μl buforu 5x dla polimerazy DNA o wysokiej wierności
      5 μl po 2 mM trifosforanu dezoksyrybonukleozydu (dNTP)
      0,5 μl 40 μM startera do przodu
      0,5 μL 40 μM startera odwrotnego
      0,5 μl (10-100 ng) matrycy DNA (tylko do PCR Spinach2; Podkłady brokułowe nakładają się na siebie)
      0,5 μl polimerazy DNA o wysokiej wierności (dodać na końcu)
      UWAGA: Syntetyczne oligonukleotydy są często wysyłane w stanie suchym. Aby przygotować roztwory podstawowe, dodaj znaną objętość (zalecane 100 μl) ddH2O i zmierz A260 tego roztworu, aby określić stężenie zgodnie z prawem Beera, gdzie współczynnik ekstynkcji można obliczyć według reguł najbliższego sąsiedztwa online. Ten roztwór podstawowy może być następnie użyty do rozcieńczeń odpowiednich do użycia w PCR.
    2. Uruchom protokół termocyklera.
      1. Użyj następującego protokołu termocyklera, aby amplifikować pełnowymiarowe matryce DNA szpinaku2 i brokułów:
        Początkowa denaturacja: 98 °C przez 2 min
        35 cykli:
        Denaturacja: 98 °C denaturacja przez 15 s
        Wyżarzanie: 72 °C przez 30 s
        Rozszerzenie: 72 °C dla 30 s
        Końcowe przedłużenie: 72 °C przez 5 min.
      2. Po reakcji przeanalizuj małą porcję produktu za pomocą 2% żelu agarozowego wraz z drabinką o niskiej masie cząsteczkowej (zakres rozmiarów: 25-766 nukleotydów), aby potwierdzić obecność pożądanego produktu DNA.
      3. Oczyścić produkt za pomocą dostępnych w handlu zestawów do ekstrakcji żelowej lub PCR i eluować za pomocą ddH2O lub buforu dostarczonego przez producenta.
        UWAGA: Wybierając zestaw do czyszczenia PCR, upewnij się, że odcięcie masy cząsteczkowej kolumny jest wystarczająco niskie, aby zatrzymać T7-Brokuły (81 nukleotydów), w przeciwnym razie produkt PCR zostanie utracony.
        UWAGA: Opcjonalny punkt pauzy: przechowywać DNA w temperaturze -20 °C.
  2. Otrzymywanie RNA szpinaku2 i brokułów metodą transkrypcji in vitro (IVT)
    1. Ustaw reakcje transkrypcji.
      1. Aby przygotować 100 μl reakcji transkrypcyjnej, połącz następujące odczynniki w 1,5 ml probówki mikrowirówkowej: 10 μl 10x buforu transkrypcyjnego + 20 μl 10 mM trifosforanów rybonukleozydów (rNTP) + 1-64 μl matrycy DNA (łącznie 1 μg) + 2 μl pirofosfatazy nieorganicznej + ddH2O do 98 μL + 2 μL polimerazy T7 RNA (dodać na końcu).
      2. Inkubować tę reakcję przez 4 godziny w temperaturze 37 °C. Ugasić reakcję, dodając 100 μl 2x buforu ładującego żel mocznikowy (2x ULB), składającego się z 20% sacharozy, 0,1% dodecylosiarczanu sodu (SDS), 1x buforu tris-boranu-EDTA (1x TBE) i ~18 M mocznika.
        UWAGA: Opcjonalny punkt pauzy: przechowywać wygaszoną reakcję w temperaturze -20 °C.
  3. Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym (PAGE) oczyszczanie RNA
    1. PAGE oczyszczanie RNA2 i brokułów RNA
      UWAGA: Niespolimeryzowany (płynny lub sproszkowany) akryloamid jest wyjątkowo toksyczny. W przypadku ważenia sproszkowanego akrylamidu należy to zrobić w dygestorium. Zawsze noś odpowiedni sprzęt ochronny i natychmiast zdejmij rękawice zanieczyszczone proszkiem lub roztworem akrylamidu, dokładnie myjąc ręce. Jeśli akrylamid wejdzie w bezpośredni kontakt ze skórą, należy myć odsłonięty obszar wodą z mydłem przez co najmniej 15 minut. Jeśli akrylamid wejdzie w bezpośredni kontakt z oczami, należy je płukać wodą przez 15 minut.
      1. Przygotuj żel PAGE: Aby usunąć niechciane nieudane transkrypty i nieprzereagowane rNTP z produktu o pełnej długości, przygotuj 6% żel mocznikowo-poliakrylamidowy. Ogólnie rzecz biorąc, żele o wymiarach 28 cm x 16,5 cm x 1,5 mm można stosować z grzebieniem 8-dołkowym. Ustaw sprzęt do żelu i elektroforezy, używając 1x bufora TBE do napełnienia zbiorników.
      2. Załadować próbkę(i) RNA do żelu PAGE: Załadować do żelu jedną wygaszoną reakcję o pojemności 200 μl na pas. Na osobnym torze załaduj 2x ULB barwnikami śledzącymi: cyjanolem ksylenem i błękitem bromofenolowym, które migrują w żelu odpowiednio w ilości 106 nukleotydów i 26 nukleotydów15. Pozostaw pusty pas między każdą próbką, aby uniknąć potencjalnego zanieczyszczenia w kolejnych krokach.
      3. Uruchom żel PAGE: Aby oddzielić 95-nt Spinach2 i 49-nt Brokuły od odpowiednich skróconych produktów, uruchom żel przez 1,5-2 godziny przy 25 W, w którym to momencie niebieski barwnik bromofenolowy będzie migrował ~5/6 długości żelu.
      4. Wizualizacja próbki RNA w żelu PAGE: Zdemontuj szklane płytki wokół żelu i przykryj żel folią po obu stronach, oznaczając pasy na owijce. Wizualizuj pasma RNA w ciemnym pomieszczeniu za pomocą cieniowania UV, umieszczając opakowany żel na fluorescencyjnej płytce TLC w świetle UV. Szybko obrysuj krawędzią pasm RNA odpowiadających produktowi markerem i wyłącz lampę UV, aby zminimalizować uszkodzenia spowodowane ekspozycją na promieniowanie UV.
      5. Wyciąć i wyekstrahować próbkę (próbki) RNA z żelu PAGE: Za pomocą świeżej żyletki do każdej próbki wyciąć pożądane pasma produktu, pokroić w kostkę ~1 mm i dodać kawałki żelu do probówki mikrowirówkowej o pojemności 2 ml z 500 μl buforu do namaczania w celu ekstrakcji RNA na rotatorze przez 2 godziny w temperaturze pokojowej (RT) lub przez noc w temperaturze 4 °C.
        UWAGA: Opcjonalny punkt pauzy: próbka może być przechowywana w temperaturze -20 °C.
      6. Wytrącić RNA
        1. Aby oddzielić kawałki żelu od wyekstrahowanego RNA w buforze, należy odwirować próbkę o masie 13 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C, a następnie za pomocą pipety z wąską końcówką wyekstrahować supernatant i załadować go do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 2 ml.
        2. Aby wytrącić RNA, dodaj 1,5 ml lodowatego etanolu i 1 μl glikogenu 20 mg/ml, odwiruj i przechowuj przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze -20 °C lub -80 °C.
          UWAGA: Opcjonalny punkt pauzy: RNA może być przechowywane w temperaturze -20 °C przez kilka miesięcy.
      7. Zbieranie osadu RNA: Wytrącony RNA osadzać przez odwirowanie w temperaturze 13 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant i pozostawić pozostały etanol do odparowania na wolnym powietrzu (~1 h) przed ponownym zawieszeniem osadu w 30 μl ddH2O lub 1x bufor TE.
        UWAGA: W wyniku tego procesu zazwyczaj uzyskuje się końcowe stężenie RNA ~10 μM.
        UWAGA: Opcjonalny punkt pauzy: próbka RNA może być przechowywana w temperaturze -20 °C przez kilka miesięcy.
    2. Określ podstawowe stężenia RNA.
      1. Przygotować podwielokrotność RNA do reakcji hydrolizy.
        1. Aby wykonać ten test, najpierw użyj spektrofotometru nano UV/Vis, aby oznaczyć A260 w podstawowej próbce RNA i wykonać rozcieńczoną podwielokrotność próbki do ~10 jednostek absorbancji (AU) w ddH2O.
        2. Przygotować następującą reakcję w 0,5 ml probówki do PCR: 16 μL ddH2O + 2 μL 10x buforu Na2CO3 + 2 μL podwielokrotności RNA rozcieńczonej do ~10 AU. Inkubować reakcję przez 90 minut w temperaturze 95 °C, a następnie pozostawić do ostygnięcia do temperatury pokojowej.
      2. Określić stężenie RNA za pomocą absorbancji nukleotydów: Zmierzyć A260 tej próbki za pomocą nanospektrofotometru UV/Vis i obliczyć stężenie RNA, korzystając z następującego wzoru:
        figure-protocol-1
        gdzie c to stężenie RNA, b to długość ścieżki, i to specyficzny nukleotyd (A, C, G lub U), ni to częstość nukleotydu i w sekwencji RNA, a εi to molowy współczynnik ekstynkcji nukleotydu i. Aby określić pierwotne stężenie RNA, pomnóż c przez współczynnik rozcieńczenia.
        UWAGA: Opcjonalny punkt pauzy: RNA może być przechowywany w temperaturze -20 °C przez kilka miesięcy.
  4. Przeprowadzanie testu kinetyki czytnika płytek in vitro
    1. Skonfiguruj program renaturacji RNA: Utwórz następujący protokół termocyklera, wybierając Utwórz nowy program > Dodaj nową fazę > Dodaj nowy krok wiele razy, aby dodać każdy z poniższych kroków przed naciśnięciem przycisku Zapisz:
      70 °C przez 3 min
      65 °C dla 45 s
      60 °C dla 45 s
      55 °C dla 45 s
      50 °C dla 45 s
      45 °C dla 45 s
      40 °C dla 45 s
      35 °C dla 45 s
      30 °C przez 45 s
    2. Renatura RNA: Aby zrenaturyzować RNA szpinaku2 i brokułów, przygotuj 2 μM zapasy każdego RNA w ddH2O w cienkościennej probówce PCR o pojemności 0,5 ml, a następnie dodaj równą objętość 2x buforu renaturacyjnego (80 mM HEPES, pH 7,5 [KOH], 250 mM KCl, 6 mM MgCl2), aby uzyskać 1 μM roztwory RNA. Dodaj probówki do termocyklera, otwórz zapisany program renaturyzacji i naciśnij Uruchom.
      UWAGA: Jeśli termocykler nie jest dostępny, RNA można zamiast tego inkubować w bloku grzewczym o temperaturze 70 °C przez 3 minuty, a następnie pozostawić do powolnego schładzania do temperatury pokojowej na stole.
    3. Przygotować bufor reakcyjny wiązania: Aby przygotować bufor do jednej reakcji wiązania aptamer-barwnik, należy przygotować mieszankę wzorcową zawierającą składniki buforu (69,5 μl ddH2O + 4 μL 1 M HEPES, pH 7,5 [KOH] + 6,2 μL z 2 M KCl + 0,3 μL z 1 M MgCl2). W zależności od tego, ile próbek i kontrprób jest potrzebnych, należy pomnożyć te wartości przez liczbę próbek plus jeden. Ogólnie rzecz biorąc, trzy powtórzenia na próbkę RNA są zadowalające.
    4. Przygotuj czytnik płytek.
      1. Skonfiguruj program wtryskiwacza czytnika płytek: Na czytniku płytek fluorescencyjnych wybierz Temp i ustaw żądaną temperaturę na 37 °C, upewniając się, że temperatura zrównoważyła się z tą wartością na długo przed rozpoczęciem eksperymentów kinetycznych. Otwórz oprogramowanie czytnika płytek, wybierz Ustawienia > Widok akwizycji i wprowadź następujący program do pomiarów kinetycznych:
        >Pętla: Dla każdej studzienki
        Ustawienie podstawowe: 60 odczytów linii bazowej
        Ustawienia SmartInject: wstrzyknięcie 10 μL (które nastąpi po odczytaniu wartości bazowej)
        Fluorescencja (lub FL) odczytuje:
        Wzbudzenie: 448 nm (szerokość pasma: 9 nm)
        Emisja: 506 nm (szerokość pasma: 15 nm)
        Kartridż: MONO (s/n 3297)
        Czas:
        Całkowity czas czytania: 10 min
        Interwał odczytu: 0,5 s
        PMT i optyka: 6 błysków na odczyt
        Pętla: Następna studnia
      2. Przygotuj wtryskiwacz
        1. Umyj i zassaj wtryskiwacz: Aby przygotować wtryskiwacz czytnika płytek, najpierw wybierz opcję Wstrzyknij na czytniku płytek, zgodnie z zaleceniami dostarcz płytkę do odbioru odpadów, a następnie wybierz Mycie i wyczyść rurkę iniekcyjną zgodnie z instrukcjami na czytniku płytek o objętości 1 ml ddH2O, 75% etanolu w ddH2O, a następnie ddH2O. Następnie wybierz Aspirat, pozwalając wtryskiwaczowi na wyrzucenie nadmiaru płynu.
        2. Zalać wtryskiwacz: Po wyjściu do poprzedniego ekranu wybierz Prime, aby zalać wtryskiwacz dwiema objętościami liganda o pojemności 260 μl do wstrzyknięcia, aby zapewnić dodanie czystego, skoncentrowanego liganda do próbek podczas eksperymentów - w tym przypadku zalać 100 μM DFHBI w ddH2O.
    5. Wykonaj eksperymenty kinetyki in vitro: Aby przeprowadzić jeden eksperyment kinetyczny, najpierw dodaj 80 μl wcześniej przygotowanej głównej mieszanki buforu wiążącego do jednego dołka 96-dołkowej płytki z przezroczystym dnem, a następnie 10 μl zrenaturyzowanego RNA. Pozostawić tę płytkę i roztwór DFHBI we wtryskiwaczu do zrównoważenia do 37 °C przez 15 minut w czytniku płytek.
    6. W ustawieniach oprogramowania czytnika płytek w obszarze Obszar odczytu wybierz studnię do analizy, a następnie na karcie Narzędzia główne wybierz opcję Uruchom, aby wykonać opisany wcześniej program kinetyczny. Powtarzaj ten proces, aż wszystkie eksperymenty zostaną zakończone.
      UWAGA: Niezwykle ważne jest, że eksperymenty kinetyczne powinny być wykonywane pojedynczo, aby upewnić się, że kinetyka RNA jest mierzona w identycznych warunkach między kontrpróbami i próbkami.
    7. Umyć wtryskiwacz: Aby usunąć pozostały roztwór DFHBI z rurki iniekcyjnej, umyj rurkę iniekcyjną zgodnie z opisem w kroku 1.4.4.2.1 objętością 1 ml ddH2O, 75% etanolu w ddH2O, a następnie ddH2O.
      UWAGA: Opcjonalny punkt pauzy.
  5. Analiza kinetyki in vitro aptamerów fluorogennego RNA.
    1. Wprowadzanie danych do oprogramowania analitycznego: Eksportuj dane eksperymentalne jako arkusz kalkulacyjny, aby łatwo skopiować dane do przetworzenia. W oprogramowaniu analitycznym utwórz nową tabelę danych w formacie XY. W kolumnie X wprowadź każdy punkt czasowy odczytu, gdzie t = 0 to czas wstrzyknięcia DFHBI. W kolumnie Y wprowadź średnie wartości fluorescencji między powtórzeniami w odpowiednim punkcie czasu, zaczynając od t = 0.
    2. Normalizuj i twórz wykresy danych: Aby znormalizować wartości fluorescencji, kliknij Analizuj przetwarzanie danych > > Normalizuj, a następnie kliknij OK. Wybierz, aby użyć najmniejszych i największych wartości zestawu danych do normalizacji, aby przedstawić wyniki jako ułamki i wyświetlić wykres wyników, a następnie kliknij przycisk OK. Aby utworzyć wykres znormalizowanej uśrednionej fluorescencji w czasie, kliknij ikonę Normalizuj [nazwa zestawu danych] i wybierz opcję Rodzina wykresów: XY z tylko punktami.
      UWAGA: Słupki błędów mogą być przydatne w przypadkach, gdy na wykresie znajduje się niewielka liczba punktów czasowych. Jeśli jest to wymagane, wybierając tabelę danych w formacie XY, wybierz opcję w obszarze "Y", aby wprowadzić wartości replikacji w kolumnach obok siebie. Sporządzenie wykresu tabeli wynikowej z wybranymi opcjami domyślnymi spowoduje utworzenie wykresu ze słupkami błędów.
    3. Wykonaj dopasowanie krzywej, aby uzyskać parametry kinetyczne: Aby dopasować krzywą do danych kinetycznych, kliknij Analizuj > Analizuj dane i wybierz Regresja nieliniowa (dopasowanie krzywej) na karcie Analizy XY. Na karcie Model kliknij pozycję Wykładnicze > dwufazowe asocjacje, aby dopasować dane kinetyki do następującego równania asocjacji dwufazowej:
      figure-protocol-2
      gdzie Y jest fluorescencją w czasie X, Y0 jest fluorescencją przy t = 0, KFast i KSlow są odpowiednio stałymi szybkości szybkiego i wolnego, a SpanFast i SpanSlow są zakresami włączania fluorescencji uwzględnionymi odpowiednio przez szybkie i wolne tempo (patrz reprezentatywne wyniki, Rysunek 1). Kliknij zakładkę Nonlin Fit, aby wyświetlić stałe szybkości, wartości t1/2 i wartości PercentFast.
      UWAGA: Aby uzyskać odchylenie standardowe dla wszystkich tych wartości, poszczególne powtórzenia eksperymentu z czytnikiem płytek mogą być przetwarzane w taki sam sposób, jak opisano powyżej.

2. Eksperyment z kinetyką komórkową

  1. Przygotowanie szczepów E. coli
    1. Przekształć BL21 Star (DE3) komórki E. coli za pomocą ~100 ng tRNA-Spinach2 pET31b konstrukować zgodnie z protokołem producenta.
      UWAGA: Konstrukt plazmidu jest dostępny w handlu (Plazmid #79783).
    2. Umieść komórki na płytkach z agarem LB zawierającym karbenicylinę (Carb: 50 mg / ml) i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 12-16 godzin. Komórki zawierające plazmidy będą rosły jako kolonie na płytce.
      UWAGA: Opcjonalny punkt pauzy: Przekształcone ogniwa gwiazdowe BL21 na płytkach można przechowywać w temperaturze 4 °C zawinięte w parafilm przez 1 tydzień.
  2. Wzrost komórek i indukowanie ekspresji aptameru fluorogennego RNA
    1. Zaszczepić 2 ml kultury pożywki nieindukującej (NI) zawierającej karbenicylinę (Carb: 50 mg / ml) pojedynczą kolonią przekształconych komórek BL21 Star. Powtórzyć tę czynność dla co najmniej trzech kontrprób biologicznych. Inkubować kultury w temperaturze 37 °C w inkubatorze/wytrząsarce przy 250 obr./min przez 22–24 h.
      UWAGA: Opcjonalny punkt pauzy: Komórki wyhodowane w pożywce NI zachowują plazmid i mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C przez 1 tydzień.
    2. Po wzroście w pożywce NI rozcieńczyć kulturę 100x w świeżych 3 ml pożywki autoindukcyjnej ZYP-5052 (AI) zawierającej karbenicylinę (Carb: 50 mg / ml). Hodować komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze/wytrząsarce z prędkością 250 obr./min przez 16-18 godzin w celu wywołania ekspresji.
      UWAGA: Typowy OD600 dla kultur będzie wynosił od 2,0 do 3,3 po 18 godzinach wzrostu. Optymalny zakres gęstości komórek wynosi od 2,5 do 3,0.
  3. Przeprowadzanie eksperymentu z kinetyką komórkową
    1. Ustaw cytometr przepływowy.
      1. Włącz cytometr przepływowy i komputer podłączony do przyrządu. Po zalogowaniu się do oprogramowania cytometru przepływowego, w zakładce Instrument kliknij ikonę uruchamiania. Postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie oprogramowania, aby zapewnić prawidłową inicjalizację oprzyrządowania.
        UWAGA: Niektóre cytometry przepływowe nazywają sekwencję startową przyrządu Priming. Upewnij się, że postępujesz zgodnie z protokołem producenta dla cytometru przepływowego, który będzie używany w eksperymencie.
      2. Przeprowadź test wydajności (jeśli dotyczy). Na karcie Menu główne kliknij Test wydajności. W probówce hodowlanej dodaj trzy krople kulek śledzących wydajność producenta do 3 ml płynu do ustawiania ostrości.
      3. Umieść probówkę hodowlaną w podnośniku probówki na próbkę i podnieś podnośnik. Przed kliknięciem przycisku Uruchom test wydajności upewnij się, że partia # rurki koralików śledzących jest taka sama, jak wskazana na ekranie konfiguracji testu wydajności. Kliknij przycisk Test wydajności, aby uruchomić test.
      4. Skonfiguruj oprogramowanie cytometru przepływowego do tego eksperymentu z następującymi parametrami akwizycji dla fluorescencji pojedynczej komórki:
        Laser wzbudzenia: 488 nm
        Kanał emisji: GFP (zwany również FITC)
        Objętość akwizycji: 40 μL (przy całkowitej objętości pobierania 90 μL)
        Natężenie przepływu: 200 μl / min
        Liczba komórek dla każdego pomiaru: 30 000
        Ustawienia instrumentu:
        Napięcie:
        FSC: 480 V
        SSC: 400 V
        BL1: 540 V
        BL2: 392 V
        BL3: 422 V
    2. Skonfiguruj pliki eksperymentalne.
      1. Utwórz nowy plik eksperymentu na karcie Eksplorator eksperymentów, klikając prawym przyciskiem myszy nazwę użytkownika cytometru przepływowego. Wybierz pozycję Nowy eksperyment w oknie rozwijanym. Gdy na ekranie komputera pojawi się nowe okno, wybierz przycisk OK.
      2. W nowym pliku eksperymentu kliknij prawym przyciskiem myszy folder "Grupa" i wybierz Dodaj nową probówkę z próbką. Oznacz probówki z próbkami dla każdego określonego punktu czasowego i powtórz, klikając prawym przyciskiem myszy Próbka i wybierając Zmień nazwę z menu rozwijanego. Powtórz ten krok dla całkowitej liczby powtórzeń i punktów czasowych dla zamierzonego przebiegu badania.
    3. Przygotuj roztwór rozcieńczonych komórek: Do nowej probówki hodowlanej dodaj 1,5 ml 1x roztworu PBS. Następnie dodaj 3 μl indukowanych komórek w pożywce AI do 1x roztworu PBS, aby uzyskać rozcieńczony roztwór komórek. Powtórz ten krok dla każdej kontrpróby biologicznej w różnych probówkach hodowlanych.
    4. Zmierz fluorescencję tła komórek: Przed dodaniem barwnika wykonaj odczyty każdej probówki z repliki biologicznej zawierającej komórki w 1x roztworze PBS. Dzieje się tak, aby mierzyć fluorescencyjne tło komórek, aby zaobserwować, jak fałd włącza się z czasem po dodaniu barwnika.
      1. Aby dokonać odczytu, umieść probówkę hodowlaną w podnośniku probówki z próbką i podnieś podnośnik ręcznie do igły do wstrzykiwania próbki. Wybierz odpowiedni plik przykładowy na karcie Panel kolekcji i kliknij przycisk Nagraj.
      2. Po zakończeniu cyklu należy ręcznie opuścić podnośnik probówki z próbką za pomocą probówki hodowlanej. Spowoduje to zainicjowanie etapu płukania, który przepłucze układ fluidyczny i zminimalizuje przenoszenie między każdą próbką repliki biologicznej. Dane zostaną automatycznie zapisane na komputerze po zakończeniu uruchamiania.
      3. Powtórzyć czynności opisane w ppkt 2.3.4 w celu zmierzenia komórkowego tła fluorescencyjnego dla co najmniej trzech kontrprób biologicznych. Aby przejść do następnego przykładowego pliku, wybierz następny przykładowy plik, klikając ikonę strzałki w prawo obok nazwy probówki z próbką pod ikoną Rekord.
    5. Zmierz fluorescencję w punktach czasowych dla komórek za pomocą barwnika.
      1. Dodaj 1,4 μl skoncentrowanego barwnika (50 mM DFHBI-1T w DMSO) do 1x roztworu PBS z komórkami, aby uzyskać końcowe stężenie 50 μM DFBHI-1T. Następnie zabezpiecz pokrywę probówki hodowlanej, a następnie odwróć probówki hodowlane 3x-5x, aby równomiernie wymieszać roztwór przed wykonaniem pierwszego odczytu punktu czasowego.
        UWAGA: Całkowity procent DMSO w probówkach hodowlanych dla E. coli nie powinien przekraczać 10%, ponieważ może to wpłynąć na żywotność komórek16.
      2. Zdejmij pokrywkę i umieść probówkę hodowlaną w podnośniku probówki do próbki. Podnieś uchwyt ręcznie do igły do wstrzykiwania próbki i pod odpowiednim plikiem próbki kliknij ikonę Rekord. Dodatkowo rozpocznij odliczanie, naciskając przycisk Start, aby rozpocząć eksperyment.
      3. Po zakończeniu biegu opuścić podnośnik rurowy ręcznie i powtórzyć kroki 2.3.5.1-2.3.5.2. (z uruchomionym timerem) poprzez dodanie 1,4 μl stężonego DFHBI-1T, odwrócenie probówek hodowlanych i dokonanie odczytów dla wszystkich pozostałych kontrprób biologicznych. Te pierwsze zapisy będą odczytami uzyskanymi po 0 minutach dla wszystkich kontrprób biologicznych. Zrób to pojedynczo dla każdej repliki biologicznej.
        UWAGA: Zanotuj czas, w którym naciśnięta jest rejestracja rekordowej cytometrii przepływowej. Trzymaj się tego czasu, rozłożając się w czasie o punkty czasowe w trakcie eksperymentu.
      4. Kontynuuj odczytywanie, podnosząc probówki hodowlane w podnośniku probówki do próbki do igły do wstrzykiwania próbki, wybierając odpowiedni plik próbki, klikając przycisk Nagraj i ręcznie opuszczając podnośnik po zakończeniu każdego przebiegu. Zrób to dla wszystkich dodatkowych punktów czasowych i replik biologicznych, które są testowane. Powtarzaj kroki, aż eksperyment zostanie zakończony.
        UWAGA: Trzymaj próbki z dala od światła, aby uniknąć fotowybielania DFHBI-1T w roztworze, przykrywając próbki folią aluminiową.
    6. Zmierz fluorescencję w punktach czasowych dla komórek bez barwnika (kontrola).
      1. Uruchom odpowiednie protokoły czyszczenia cytometru przepływowego przed ponownym powtórzeniem eksperymentu z kontrolami ujemnymi zgodnie z protokołem producenta. Ma to na celu zminimalizowanie przeniesienia z poprzedniego eksperymentu do eksperymentu analizy punktów czasowych kontroli. Poniżej znajdują się kroki wykonywane dla cytometru przepływowego między eksperymentami:
        1. Umieść ręcznie pustą probówkę hodowlaną w podnośniku rurowym, podnieś uchwyt probówki i kliknij ikonę Odblokuj w zakładce Instrument. Spowoduje to uruchomienie płukania wstecznego w systemie fluidics w celu usunięcia wszelkich lepkich próbek. Opuść uchwyt probówki ręcznie i wyjmij rurkę po zakończeniu sekwencji odblokowywania.
        2. Za pomocą nowej probówki hodowlanej dodać 3 ml 10% roztworu wybielacza, umieścić probówkę hodowlaną w uchwycie probówki i ręcznie podnieść uchwyt do igły do wstrzykiwania próbki. Dodatkowo umieścić czystą 96-dołkową płytkę w automatycznym samplerze, jeśli ma to zastosowanie do cytometru przepływowego.
        3. Kliknij ikonę Sanitize SIP/Sanitize Autosampler SIP, aby uruchomić sekwencję czyszczenia z 10% wybielaczem w całym systemie fluidics. Opuść uchwyt probówki, aby zakończyć sekwencję czyszczenia.
      2. Ustaw przykładowe pliki dla przebiegu analizy punktu czasu kontrolnego, postępując zgodnie ze wskazówkami w kroku 2.3.3.
      3. W nowej probówce hodowlanej przygotuj rozcieńczony roztwór komórek w 1,5 ml 1x roztworu PBS. Dodaj 3 μl komórek indukowanych w pożywce AI do roztworu 1x PBS, aby uzyskać rozcieńczony roztwór komórek. Powtórzyć ten krok dla każdej kontrpróby biologicznej.
      4. Dodawać pojedynczo 1,4 μl DMSO do probówki hodowlanej do roztworu 1x PBS z komórkami i testować te same punkty czasowe. Zabezpiecz pokrywę probówki hodowlanej, a następnie odwróć probówki hodowlane 3x-5x, aby równomiernie wymieszać roztwór przed wykonaniem pierwszego odczytu punktu czasowego. Rób to pojedynczo dla każdej kontrpróby biologicznej.
      5. Postępuj zgodnie z tym samym protokołem do analizy komórek kontrolnych, jak w przypadku komórek z barwnikiem, wykonując kroki 2.3.5.2-2.3.5.4.
    7. Wyłącz cytometr przepływowy: Postępuj zgodnie z protokołem producenta, aby prawidłowo wyłączyć oprzyrządowanie. W przypadku cytometru przepływowego przyrząd jest przygotowany do wyłączenia w następujący sposób:
      1. Wykonaj protokół wstępnego czyszczenia cytometru przepływowego, wykonując czynności 2.3.6.1.1-2.3.6.1.3.
      2. Zastąp probówkę hodowlaną 10% roztworem wybielacza probówką hodowlaną z 3 ml płynu do ustawiania ostrości. Podnieś ręcznie uchwyt rurki i pod ikoną Wyłącz kliknij menu rozwijane i wybierz Dokładny.
        UWAGA: Opcjonalny punkt pauzy.
  4. Analiza danych z cytometrii przepływowej
    1. Wyeksportuj wszystkie pliki FCS do analizy. Otwórz pliki FCS za pomocą oprogramowania do analizy cytometrii przepływowej.
    2. Korzystając z jednego z plików FCS tylko w komórce, wygeneruj bramkę z wykresu punktowego rozproszenia do przodu (FSC) i rozrzutu bocznego (SSC) (FSC-Area/SSC-Area), używając obu osi logarytmu, aby wykluczyć wszelkie sygnały z zanieczyszczeń. Aby utworzyć tę bramkę, kliknij ikonę AutoGate w oprogramowaniu do analizy cytometrii przepływowej i nazwij ją Gate 1. Zastosuj tę samą bramkę do wszystkich próbek testowanych na karcie Wszystkie próbki w obszarze roboczym przetwarzania danych. Spowoduje to, że bramka 1 pod wszystkimi przetwarzanymi plikami FCS będzie się
      3. znajdować.
    3. Utwórz nowy plik podzestawu z plikiem FCS tylko komórka używanym w kroku 2.4.2, klikając go dwukrotnie. Zmień ustawienia osi na FSC-Area/FSC-Height, przy czym obie używają osi logarytmicznej. Kliknij ikonę AutoGate w oprogramowaniu do analizy cytometrii przepływowej, aby wygenerować owalną bramkę, nazywając ją Gate 2. Zastosować tę bramkę jako podzbiór pod przesuwką ustawioną w kroku 2.4.2 do wszystkich badanych próbek. Spowoduje to, że wszystkie próbki będą miały bramkę 1 > bramkę 2 skojarzoną z każdym plikiem FCS.
    4. Utwórz kolejny plik podzbioru z obiema bramkami ustawionymi w kroku 2.4.2 i kroku 2.4.3 zastosowanymi, klikając dwukrotnie bramkę 2. Zmień ustawienia osi na Obszar FSC/Histogram. Zastosuj tę bramkę histogramu jako podzbiór do wszystkich badanych próbek, w wyniku czego wszystkie próbki będą miały bramkę 1 > bramkę 2 > bramkę 2 skojarzoną z każdym plikiem FCS.
      UWAGA: Nazwy histogramów można zmienić z >bramki 2 na histogram, aby pomóc w przeniesieniu histogramów do okna układu, a także w celu lepszej organizacji przetwarzania danych.
    5. Aby przeanalizować wartości średniej intensywności fluorescencji (MFI), otwórz okno układu. Kliknij i przeciągnij bramki histogramu dla każdego punktu czasowego do okna układu.
    6. Wykonaj analizę statystyczną dla "∑ Średniej: BL1-A" (GFP) dla każdej badanej próby, aby wyświetlić wyniki MIF w oknie układu.
    7. Obliczyć odchylenie standardowe dla wartości MIF na analizę punktu czasowego dla co najmniej trzech niezależnych kontrprób biologicznych.
    8. Zapisz histogramy i wartości MFI dla każdego punktu czasowego, eksportując okno układu jako plik PDF.
      UWAGA: Opcjonalny punkt pauzy.
  5. Dane z wykresu cytometrii przepływowej
    1. Otwórz plik PDF zawierający histogramy i wartości MIF dla każdego punktu czasowego. Wartości MIF zostaną skopiowane do oprogramowania do analizy danych. W oprogramowaniu do tworzenia wykresów danych utwórz nową tabelę danych w formacie XY.
      1. Wybierz tę opcję, aby utworzyć tabelę XY z wybranymi następującymi:
        Tabela danych: Wprowadź lub zaimportuj dane do nowej tabeli
        Opcje:
        X: Czasy, które upłynęły
        Y: Wprowadź (od trzech do czterech) replikowanych wartości w podkolumnach obok siebie
      2. Oznacz na osi X wszystkie punkty czasu dla przebiegów eksperymentu i kontroli.
      3. W grupie A wprowadź wartości MFI dla wszystkich kontrprób biologicznych do każdego punktu czasowego analizy fluorescencji komórek z dodatkiem barwnika.
      4. W grupie B wprowadź wartości MFI dla wszystkich kontrprób biologicznych do każdego punktu czasowego w celu analizy komórek bez dodatku barwnika (DMSO).
      5. Aby zobaczyć wyniki, kliknij [Wstaw nazwę zestawu danych] w zakładce Wykresy. Spowoduje to wyświetlenie punktów danych jako średnich, ze słupkami błędów reprezentującymi odchylenie standardowe (s.d.) w każdym punkcie czasu. Oś X reprezentuje czas, który upłynął, a oś Y reprezentuje wartości MIF.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kinetyka in vitro
Sekwencje matryc DNA i starterów, które są kupowane jako syntetyczne oligonukleotydy, są pokazane w Tabeli 2, a receptury odczynników są pokazane w Pliku Uzupełniającym 1. Amplifikacja PCR służy do zwiększenia ilości matrycy DNA za pomocą promotora T7, który jest wymagany do późniejszej reakcji transkrypcji in vitro (IVT). Ponadto amplifikacja PCR może być stosowana do dwóch celów w tej samej reakcji: do wygenerowa...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W przypadku eksperymentu kinetyki in vitro ten sam ogólny protokół można zmodyfikować w celu pomiaru kinetyki in vitro biosensora fluorescencyjnego opartego na RNA, zawierającego zarówno domenę wiążącą ligand, jak i fluoroforową8. W takim przypadku RNA powinno być inkubowane z fluoroforem przed pomiarami po wstrzyknięciu liganda w celu uzyskania kinetyki odpowiedzi liganda. Jeśli zaobserwuje się dużą zmienność między kontrpróbami, można rozwiązać problem, sprawdzając, czy każda p...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez następujące granty dla MCH: NSF-BSF 1815508 i NIH R01 GM124589. MRM był częściowo wspierany przez grant szkoleniowy NIH T32 GM122740.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
AgaroseThermo Fischer ScientificBP160500
Aparatura do elektroforezy w żelu agarozowymThermo Fischer ScientificB1A-BP
Alpha D-(+)-laktoza monohydratThermo Fischer Scientific18-600-440
Bursztynowe probówki do mikrowirówek 1,5 mlThermo Fischer Scientific22431021
Nadsiarczan amonu (APS)Sigma-AldrichA3678
Siarczan amonu ((NH4)2SO4)Sigma-AldrichA4418
Attune NxT Cytometr przepływowyThermo Fischer ScientificA24861
Attune 1x płyn do ustawiania ostrościThermo Fischer ScientificA24904
Attune Shutdown SolutionThermo Fischer ScientificA24975
Koraliki śledzące wydajność AttuneThermo Fischer Scientific4449754
Roztwór do mycia AttuneThermo Fischer Scientific  J24974
Kwas borowySigma-AldrichB6768
Błękit bromofenolowySigma-AldrichB0126
Sól disodowa karbenicylinySigma-AldrichC3416
Wybielacz chlorowyAmazonB07J6FJR8D
Corning Costar 96-dołkowa płytkaDaigger ScientificEF86610A
Probówki hodowlane, 12 mm x 75 mm, 5 ml z dołączoną dwupozycyjną nasadkąGlobe Scientific05-402-31
DFHBISigma-AldrichSML1627
DFHBI-1TSigma-AldrichSML2697
D-Glukoza (bezwodna)Acros OrganicsAC410955000
Dimetylosulfotlenek (DMSO)Sigma-AldrichD8418
Ditiotreitol (DTT)Sigma-AldrichDTT-RO
New England BiolabsB7025S
Probówki DNA LoBind (2,0 ml)Eppendorf22431048
dNTP: dATP, dCTP, dGTP, dTTPNew England BiolabsN0446S
EDTA, pH 8,0Gibco, Life TechnologiesAM9260G
Etanol (EtOH)Sigma-AldrichE7023
Końcówki do mikropipet z końcówką filtrującąThermo Fischer ScientificAM12635, AM12648, AM12655, AM12665
Oprogramowanie FlowJoBiosciencesNie dotyczyOprogramowanie FlowJo v10
Czytnik płytek fluorescencyjnych z kontrolą ogrzewaniaVWR10014-924
Zasilacz do elektroforezy żelowejThermo Fischer ScientificEC3000XL2
GlicerolSigma-AldrichG5516
Glikogen AM95010Thermo Fischer ScientificAM95010
Oprogramowanie do analizy GraphPad PrismDotmaticsN/Az licencji Academic Group 
Blok grzewczy Thomas Scientific1159Z11
HEPESSigma-AldrichH-4034
Nieorganiczna pirofosfatazaSigma-AldrichI1643-500UN
Drabina DNA o niskiej masie cząsteczkowejNew England BiolabsN3233LDostarczana z bezpłatną fiolką z barwnikiem ładującym żel, fioletowy (6x), bez SDS (NEB #B7025).
Chlorek magnezu sześciowodny (MgCl2)Sigma-AldrichM2670
Siarczan magnezu (MgSO4)ProbówkiMFCD00011110
(1,5 mL)Mikrowirówka Eppendorf22363204
z regulacją temperaturyMarshall ScientificEP-5415R
MikropipetyGilsonFA10001M, FA10003M, FA10005M, FA10006M Końcówki
do mikropipetSigma-AldrichZ369004, AXYT200CR, AXYT1000CR
Filtr do wody Millipore z jednostką BioPakSigma-AldrichCDUFBI001, ZRQSVR3WW
Wąskie końcówki do pipet do mikropipetDOT ScientificRN005R-LRS
PBS, 10xThermo Fischer Zestaw
Scientific PCRStartery i szablony Qiagen28181
PCRZintegrowane technologie
Termocykler PCR do cienkościennych probówek PCR TermocyklerBio-Rad1851148
PCR do probówek 0,5 mlTechne5PRIME/C
pET31b-T7-Spinach2Plasmid AddgenePlazmid #79783
Polimeraza DNA Phusion High-Fidelity New England BiolabsM0530LZakup enzymu Phusion High-Fideldity jest dostarczany z 5x Phusion HF Buffer, 5x Phusion GC Buffer oraz roztworami MgCl2 i DMSO.
Grzebień żelowy do elektroforezy w żelu poliakrylamidowym, C.B.S. ScientificC.B.S. ScientificVGC-1508
Sprzęt do elektroforezy w żelu poliakrylamidowymC.B.S. ScientificASG-250
Chlorek potasu (KCl)Sigma-AldrichP9333
Fosforan potasu jednozasadowySigma-AldrichP5655
ŻyletkiGenesee Naukowe38-101
rNTP: ATP, CTP, GTP, UTPNew England BiolabsN0450L
SDSSigma-AldrichL3771
Krótkofalowe źródło światła UVThermo Fischer Scientific11758221
Węglan sodu (Na2CO3)Sigma-AldrichS7795
Sód chlorek (NaCl)Sigma-AldrichS7653
Wodorotlenek sodu (NaOH)Sigma-AldrichS8045
Fosforan sodu dwuzasadowy, bezwodnyThermo Fischer ScientificS375-500
SoftMax ProUrządzenia molekularneNie dotyczySoftMax Pro 6.5.1 (oprogramowanie do czytnika płytek) uzyskane na podstawie licencji Academic Group
Sterylne jednostki filtrująceThermo Fischer Scientific09-741-88
SacharozaSigma-AldrichS0389
SYBR Bezpieczne barwienie żelowe DNAThermo Fischer ScientificS33102
Bufor TAE do elektroforezy w żelu agarozowymThermo Fischer ScientificAM9869
Tetrametyloetylenodiamina (TEMED)Sigma-AldrichT9281
BazaTrisSigma-AldrichTRIS-RO
Trypton (granulowany)Thermo Fischer ScientificM0251S
T7 Polimeraza RNANew England BiolabsM0251S
System żelowy Mocznik-PAGE National DiagnosticsEC-833
Fluorescencyjna płytka TLC UVSigma-Aldrich1.05789.0001
Spektrofotometr UV/VisThermo Fischer ScientificND-8000-GL
Mieszalnik wirowyThermo Fischer Scientific2215415
Cyjanol ksylenowySigma-AldrichX4126
Ekstrakt drożdżowy (granulowany)Thermo Fischer ScientificBP9727-2
Barwnik ładujący DNA BD do mikrowirówek Fisher Scientific do czyszczenia BP39920 DNA

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Su, Y., Hammond, M. C. RNA-based fluorescent biosensors for live cell imaging of small molecules and RNAs. Current Opinion in Biotechnology. 63, 157-166 (2020).
  2. Zhang, J., et al. Tandem spinach array for mRNA Imaging in living bacterial cells. Scientific Reports. 5, 17295(2015).
  3. Wang, Z., et al. In spatial complementation of aptamer-mediated recognition enables live-cell imaging of native RNA transcripts in real time. Angewandte Chemie. 57 (4), 972-976 (2018).
  4. Strack, R. L., Disney, M. D., Jaffrey, S. R. A superfolding Spinach2 reveals the dynamic nature of trinucleotide repeat-containing RNA. Nature Methods. 10 (12), 1219-1224 (2013).
  5. Thavarajah, W., et al. Point-of-use detection of environmental fluoride via a cell-free riboswitch-based biosensor. ACS Synthetic Biology. 9 (1), 10-18 (2020).
  6. You, M., Litke, J. L., Jaffrey, S. R. Imaging metabolite dynamics in living cells using a Spinach-based riboswitch. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (21), 2756-2765 (2015).
  7. Kellenberger, C. A., Wilson, S. C., Sales-Lee, J., Hammond, M. C. RNA-based fluorescent biosensors for live cell imaging of second messengers cyclic di-GMP and cyclic AMP-GMP. Journal of the American Chemical Society. 135 (13), 4906-4909 (2013).
  8. Manna, S., Truong, J., Hammond, M. C. Guanidine biosensors enable comparison of cellular turn-on kinetics of riboswitch-based biosensor and reporter. ACS Synthetic Biology. 10 (3), 566-578 (2021).
  9. Bose, D., Su, Y., Marcus, A., Raulet, D. H., Hammond, M. C. An RNA-based fluorescent biosensor for high-throughput analysis of the cGAS-cGAMP-STING pathway. Cell Chemical Biology. 23 (12), 1539-1549 (2016).
  10. Wang, X. C., Wilson, S. C., Hammond, M. C. Next-generation RNA-based fluorescent biosensors enable anaerobic detection of cyclic di-GMP. Nucleic Acids Research. 44 (17), 139(2016).
  11. Paige, J. S., Thinh, N. -D., Wenjiao, S., Jaffrey, S. R. Fluorescence imaging of cellular metabolites with RNA. Science. 335 (6073), 1194(2012).
  12. Paige, J. S., Wu, K. Y., Jaffrey, S. R. RNA mimics of green fluorescent protein. Science. 333 (6042), 642-646 (2011).
  13. Filonov, G. S., Moon, J. D., Svensen, N., Jaffrey, S. R. Broccoli: Rapid selection of an RNA mimic of green fluorescent protein by fluorescence-based selection and directed evolution. Journal of the American Chemical Society. 136 (46), 16299-16308 (2014).
  14. Song, W., Strack, R. L., Svensen, N., Jaffrey, S. R. Plug-and-play fluorophores extend the spectral properties of spinach. Journal of the American Chemical Society. 136 (4), 1198-1201 (2014).
  15. Sambrook, J., Fritsch, E., Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (1989).
  16. Basch, H., Gadebusch, H. H. In vitro antimicrobial activity of dimethylsulfoxide. Applied Microbiology. 16 (12), 1953-1954 (1968).
  17. Kallansrud, G., Ward, B. A comparison of measured and calculated single- and double-stranded oligodeoxynucleotide extinction coefficients. Analytical Biochemistry. 236 (1), 134-138 (1996).
  18. Wilson, S. C., Cohen, D. T., Wang, X. C., Hammond, M. C. A neutral pH thermal hydrolysis method for quantification of structured RNAs. RNA. 20 (7), 1153-1160 (2014).
  19. Szatmári, D., et al. Intracellular ion concentrations and cation-dependent remodelling of bacterial MreB assemblies. Scientific Reports. 10, 12002(2020).
  20. Boulos, L., Prévost, M., Barbeau, B., Coallier, J., Desjardins, R. LIVE/DEAD® BacLightTM: Application of a new rapid staining method for direct enumeration of viable and total bacteria in drinking water. Journal of Microbiological Methods. 37 (1), 77-86 (1999).
  21. Huang, H., et al. A G-quadruplex-containing RNA activates fluorescence in a GFP-like fluorophore. Nature Chemical Biology. 10 (8), 686-691 (2014).
  22. Jeng, S. C. Y., Chan, H. H. Y., Booy, E. P., McKenna, S. A., Unrau, P. J. Fluorophore ligand binding and complex stabilization of the RNA Mango and RNA Spinach aptamers. RNA. 22 (12), 1884-1892 (2016).
  23. Han, K. Y., Leslie, B. J., Fei, J., Zhang, J., Ha, T. Understanding the photophysics of the Spinach-DFHBI RNA aptamer-fluorogen complex to improve live-cell RNA imaging. Journal of the American Chemical Society. 135 (50), 19033-19038 (2013).
  24. Wang, P., et al. Photochemical properties of Spinach and its use in selective imaging. Chemical Science. 4 (7), 2865-2873 (2013).
  25. Dao, N. T., et al. Photophysics of DFHBI bound to RNA aptamer Baby Spinach. Scientific Reports. 11, 7356(2021).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Fluorogenic RNA AptamersTurn On KineticsIn Vitro KineticsCellular KineticsFluorescence ActivationPlate ReaderFlow CytometrySpinach2 AptamerBroccoli AptamerRNA Based Biosensors

Related Articles