Artykuł metodologiczny

Identyfikacja i izolacja progenitorów erytroidalnych jednostek tworzących pęknięcia i kolonii z tkanki myszy za pomocą cytometrii przepływowej

3.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64373

⸱

4 listopada 2022

 ,  ,  , 
1Department of Molecular, Cell and Cancer Biology, UMASS Chan Medical School

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy nowatorską metodę cytometrii przepływowej do prospektywnej izolacji wczesnych prekursorów erytroidalnych (BFU-e) i erytroidalnych tworzących kolonie (CFU-e) bezpośrednio ze świeżego szpiku kostnego i śledziony myszy. Protokół ten, opracowany na podstawie danych transkryptomicznych pojedynczych komórek, jest pierwszym, który izoluje wszystkie erytroidalne komórki progenitorowe tkanki o wysokiej czystości.

Streszczenie

Wczesne progenitory erytroidalne były pierwotnie definiowane na podstawie ich potencjału do tworzenia kolonii in vitro i klasyfikowane jako "jednostki" pękające i tworzące kolonie, znane jako BFU-e i CFU-e. Do niedawna metody bezpośredniej prospektywnej i całkowitej izolacji czystych komórek progenitorowych BFU-e i CFU-e ze świeżo wyizolowanego dorosłego szpiku kostnego myszy nie były dostępne. Aby wypełnić tę lukę, przeanalizowano zestaw danych sekwencyjnych RNA-seq (scRNAseq) pojedynczej komórki szpiku kostnego myszy pod kątem ekspresji genów kodujących markery powierzchniowe komórki. Analiza ta została połączona z testami losu komórek, co pozwoliło na opracowanie nowatorskiego podejścia do cytometrii przepływowej, które identyfikuje i umożliwia izolację kompletnych i czystych podzbiorów progenitorów BFU-e i CFU-e w szpiku kostnym lub śledzionie myszy. Podejście to identyfikuje również inne podzbiory progenitorowe, w tym podzbiory wzbogacone o bazofile/komórki tuczne i potencjały megakariocytarne. Metoda polega na znakowaniu świeżych komórek szpiku kostnego lub śledziony przeciwciałami skierowanymi przeciwko Kit i CD55. Przodkowie, którzy wyrażają oba te markery, są następnie dzieleni na pięć głównych populacji. Populacja 1 (P1 lub CFU-e, Kit+ CD55+ CD49fśredni/niski, CD105średni/wysoki, CD71 średni/wysoki) zawiera wszystkie progenitory CFU-e i może być dalej podzielony na P1-low (CD71med CD150high) i P1-hi (CD71high, CD150low), odpowiadające odpowiednio wczesnemu i późnemu CFU-e; Populacja 2 (P2 lub BFU-e, Kit+ CD55+ CD49fmed/low CD105med/high CD71low CD150high) zawiera wszystkie progenitory BFU-e; Populacja P3 (P3, Kit+ CD55+ CD49fśredni/wysoki CD105med/niski CD150niski CD41niski) jest wzbogacona o progenitory bazofilów/komórek tucznych; Populacja 4 (P4, Kit+, CD55+, CD49f, med/high CD105med/low CD150,high CD41+) jest wzbogacona o progenitorów megakariocytarnych; i Populacja 5 (P5, Kit + CD55 + CD49fmed / wysoki CD105med / niski CD150wysoki CD41-) zawiera progenitorów z erytroidalnym, bazofilowym / mastocznym i megakariocytarnym potencjałem (EBMP) oraz wielopotencjalnymi progenitorami (MPP) z erytroidalnymi / megakariocytarnymi / bazofilami. To nowatorskie podejście pozwala na większą precyzję podczas analizy erytroidalnych i innych krwiotwórczych komórek progenitorowych, a także pozwala na odniesienie się do informacji transkryptomicznych dla każdej populacji zdefiniowanej cytometrycznie przepływowo.

Wprowadzenie

Erytropoezę można podzielić na dwie główne fazy: wczesną erytropoezę i różnicowanie końcówek erytroidalnych (Rysunek 1)1,2,3. We wczesnej erytropoezie hematopoetyczne komórki macierzyste angażują się w linię erytroidalną i dają początek wczesnym erytroidalnym przodkom, które zostały po raz pierwszy zidentyfikowane w latach siedemdziesiątych XX wieku na podstawie ich potencjału tworzenia kolonii w półstałym podłożu 4,5,6,7,8,9. Ogólnie rzecz biorąc, progenitorzy erytroidalni dzielą się na dwie kategorie: wcześniejsze progenitory, z których każdy powoduje "wybuch" (duże skupisko mniejszych skupisk komórek erytroidalnych), nazwane "erytroidą jednostki tworzącej wybuchy" lub BFU-e4,5,6; i ich potomstwo, z których każde tworzy pojedyncze, małe skupisko komórek erytroidalnych lub kolonię, nazwane "erytroidalną jednostką tworzącą kolonię" lub CFU-e7,8,9. BFU-e i CFU-e nie wykazują jeszcze ekspresji terminalnych genów erytroidalnych i nie są morfologicznie rozpoznawalne. Po kilku samoodnawiających się lub rozszerzających się podziałach komórkowych, CFU-e przechodzi przełącznik transkrypcyjny, w którym indukowane są geny erytroidalne, takie jak globiny, przechodząc w ten sposób w erytroidalne różnicowanie końcowe (ETD)1,10. Podczas ETD erytroblasty przechodzą od trzech do pięciu podziałów komórek dojrzewających przed wyłuszczeniem, tworząc retikulocyty, które dojrzewają do czerwonych krwinek.

Erytroblasty podczas końcowego różnicowania były pierwotnie klasyfikowane na podstawie ich morfologii na proerytroblasty, bazofilne, polichromatyczne i ortochromatyczne. Pojawienie się cytometrii przepływowej umożliwiło ich prospektywne sortowanie i izolację na podstawie wielkości komórek (mierzonej za pomocą rozproszenia do przodu, FSC) i dwóch markerów powierzchni komórek, CD71 i Ter11911,12,13 (Rysunek 1). To i podobne podejścia do cytometrii przepływowej 14 zrewolucjonizowały badania molekularnych i komórkowych aspektów ETD, umożliwiając specyficzną dla rozwoju analizę erytroblastów in vivo i in vitro10,15,16,17,18,19,20. Podejście CD71/Ter119 jest obecnie rutynowo stosowane w analizie prekursorów erytroidów.

Do niedawna podobne, dostępne podejście cytometryczne do bezpośredniej, wysokiej czystości prospektywnej izolacji CFU-e i BFU-e z tkanek myszy umykało badaczom. Zamiast tego badacze zastosowali strategie cytometrii przepływowej, które izolują tylko część tych komórek progenitorowych, często w obecności komórek nieerytroidalnych, które współoczyszczają się w tych samych podzbiorach cytometrii przepływowej21. W związku z tym badania BFU-e i CFU-e ograniczyły się do systemów różnicowania in vitro, które wyprowadzają i amplifikują BFU-e i CFU-e z wcześniejszych komórek progenitorowych szpiku kostnego. Możliwe jest następnie zastosowanie strategii cytometrii przepływowej, które odróżniają CFU-e od BFU-e w tych kulturach wzbogaconych w erytroidalne pregentory22,23. Alternatywne podejście wykorzystuje płodowe CFU-e i BFU-e, które są wysoce wzbogacone w frakcję Ter119-ujemną wątroby płodu myszy w połowie ciąży10,24,25. Żadne z tych podejść nie pozwala jednak na badanie dorosłych BFU-e i CFU-e w ich stanie fizjologicznym in vivo. Skala wyzwania może być doceniona, gdy przypomnimy sobie, że na podstawie testów tworzenia kolonii komórki te są obecne w dorosłym szpiku kostnym z częstością odpowiednio zaledwie 0,025% i 0,3%6.

Opisany tutaj protokół to nowatorskie podejście cytometryczne oparte na analizie transkryptomicznej pojedynczych komórek świeżo pobranych komórek szpiku kostnego myszy Kit+ (Kit jest wyrażany przez wszystkie wczesne populacje progenitorowe szpiku kostnego)1. Nasze podejście zawiera pewne markery powierzchni komórek, które były już używane przez Pronk i wsp.21,26. Transkryptomy jednokomórkowe wykorzystano do określenia kombinacji markerów powierzchni komórek, które identyfikują erytroidalne i inne wczesne komórki progenitorowe hematopoetyczne (Figura 2). W szczególności frakcja CD55 + komórek Kit+ ujemnych pod względem linii (Lin) może być podzielona na pięć populacji, z których trzy dają ciągłe segmenty trajektorii erytroidalnej (Figura 2). Tożsamość transkryptomiczna każdej z tych populacji została potwierdzona przez sortowanie, a następnie scRNAseq i projekcję posortowanych transkryptomów jednokomórkowych z powrotem na oryginalną mapę transkryptomiczną (ekspresję genów w każdej z pięciu populacji i cały zestaw danych szpiku kostnego można zbadać w https://kleintools.hms.harvard.edu/paper_websites/tusi_et_al/index.html)1. Potencjał losu komórki każdej z populacji został potwierdzony za pomocą tradycyjnych testów tworzenia kolonii (Rysunek 2), a także nowatorskiego, wysokoprzepustowego testu losu pojedynczej komórki1,27. Analizy te pokazują, że nowatorskie podejście oparte na cytometrii przepływowej pozwala na izolację o wysokiej czystości wszystkich komórek progenitorowych BFU-e i CFU-e świeżego dorosłego szpiku kostnego i śledziony. W szczególności populacja 1 (P1) zawiera tylko CFU-e i żadnych innych komórek progenitorowych układu krwiotwórczego, a populacja 2 (P2) zawiera wszystkie komórki progenitorowe BFU-e szpiku kostnego i niewielką liczbę CFU-e, ale żadnych innych komórek progenitorowych1. Poniższy szczegółowy protokół jest dodatkowo zilustrowany przykładowym eksperymentem na myszach, którym wstrzyknięto sól fizjologiczną lub hormon stymulujący erytropoezę erytropoetynę (Epo).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z protokołami na zwierzętach A-1586 i 202200017 zatwierdzone przez University of Massachusetts Chan Medical School Institutional Animal Care and Use Committee.

UWAGA: Dwa protokoły są tutaj szczegółowo opisane: pierwszy, analiza cytometryczna przepływu (sekcja 1), a następnie korekty protokołu dla sortowania metodą cytometrii przepływowej (sekcja 2). Poniższy protokół wykorzystuje cytometr/sorter przepływowy z 10 kanałami. Przykładowa konfiguracja znajduje się w tabeli 1, o której mowa w kroku 1.14.5. Możliwe jest również uruchomienie tego protokołu z tylko dziewięcioma kanałami; zob. legenda w tabeli 2.

1. Analiza metodą cytometrii przepływowej

  1. Poddaj eutanazji dorosłe (>6 tygodni) myszy Balb/C lub C57BL6 przy użyciu odpowiedniej metody zatwierdzonej przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania (np. wdychanie CO2 , a następnie zwichnięcie szyjki macicy). Do analizy metodą cytometrii przepływowej wystarczy szpik kostny (BM) od jednej myszy. W przypadku sortowania liczba myszy zależy od dalszych aplikacji. Wydajność komórek dla każdej populacji podano poniżej (krok 2.3.3).
  2. Pobieranie tkanek:
    1. Przygotować 5 ml probówek do sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) zawierających 3 ml zimnego (4 °C) buforu barwiącego ("SB5": sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), 0,2% albuminy surowicy bydlęcej (BSA), 0,08% glukozy, 5 mM EDTA) na lodzie. Użyj tego, aby umieścić pobrane tkanki.
    2. Przygotuj osobne probówki dla każdej tkanki wyciętej z każdej myszy. Nie pobieraj tkanek od wielu myszy.
    3. Zbierz obie kości udowe i obie piszczele. Usuń wszystkie mięśnie z kości przed umieszczeniem ich w tubie z SB5.
    4. Wypreparuj śledzionę przez nacięcie po lewej stronie brzucha.
  3. Ekstrakcja komórek szpiku kostnego:
    1. Umieść świeżo wypreparowane kości udowe i piszczelowe bezpośrednio w zimnym buforze do barwienia (SB5) i trzymaj probówki na lodzie, aż będą gotowe do ekstrakcji szpiku kostnego (BM). Umieść czysty wysterylizowany moździerz na lodzie w wiadrze. Przenieś kości do zaprawy wraz z SB5 z probówki.
    2. Odetnij około 1 mm końców każdej kości nożyczkami do preparowania, tak aby otwór kości stał się widoczny.
    3. Za pomocą igły 26 G i strzykawki o pojemności 3 ml wypełnionej SB5 należy wypłukać szpik kostny i zebrać go do moździerza. Powtórz proces 3-5 razy, używając za każdym razem świeżego bufora, aż kości staną się bezbarwne.
    4. Przefiltruj przepłukany szpik przez filtr siatkowy o wielkości 100 μm i zbierz komórki w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml umieszczonej na lodzie.
    5. Użyj moździerza i tłuczka, aby zmiażdżyć zaczerwienione kości w 5-10 ml SB5. Przefiltrować mieszaninę zmiażdżonych kości i buforu przez sitko o wielkości 100 μm i połączyć komórki z komórkami zebranymi w kroku 1.3.4.
  4. Ekstrakcja komórek śledziony:
    1. Ustaw filtr siatkowy 100 μm na pustej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml umieszczonej na lodzie. Umieść pojedynczą śledzionę na filtrze siatkowym.
    2. Dodaj 0,5-1 ml SB5 do śledziony, aby upewnić się, że nie wyschnie.
    3. Używając gumowej strony tłoka strzykawki o pojemności 3 ml lub 5 ml, rozetrzyj śledzionę przez siatkę. Dodaj więcej SB5, po 5 ml na raz i kontynuuj zacieranie, aż wszystkie komórki zostaną zebrane w probówce.
  5. Od tego momentu szpik kostny i komórki śledziony są traktowane w ten sam sposób.
  6. Wirować komórki w temperaturze 900 x g, 4 °C przez 10 min. Zassać supernatant za pomocą zestawu do aspiracji próżniowej.
  7. Aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową, należy ponownie zawiesić komórki w 2 ml SB5 i pipetować w górę i w dół 50 razy za pomocą P1000 z końcówką z dużym otworem (patrz Tabela materiałów). Mają one szerokie otwory na końcówki, aby zapobiec uszkodzeniom delikatnych komórek.
  8. Aby policzyć komórki, należy ponownie zawiesić, pipetując w górę i w dół 20 razy. Rozcieńczyć komórki w stosunku 1:100 w SB5. Zmieszać 10 μl rozcieńczonych komórek z 10 μl błękitu trypanowego i policzyć na hemocytometrze i/lub liczniku komórek.
  9. Wirować komórki w temperaturze 900 x g, 4 °C przez 10 minut. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w temperaturze 33 x 106 żywych komórek/ml w SB5.
  10. Przygotować koktajl Lin-FITC, mieszając równe objętości każdego przeciwciała z tabeli 3.
  11. Przygotuj komórki do kontrolek pojedynczego koloru i kontrolek "Fluorescencja minus jeden" (FMO). Etapy 1.11-1.12 należy przeprowadzić równolegle z przygotowaniem i barwieniem komórek próbki w kroku 1.14 (próbki do analizy metodą cytometrii przepływowej) i/lub kroku 2.1 (sortowanie metodą cytometrii przepływowej).
    1. Przygotować komórki do niebarwionej kontroli komórek, przenosząc 50 μl (1,6 x 106 komórek) zawiesiny komórek do probówki FACS na lodzie. Przygotuj komórki do każdej pojedynczej kontroli koloru (11 probówek), przenosząc 50 μl (1,6 x 106 komórek) zawiesiny komórek do probówki FACS na lodzie.
    2. Przygotuj kontrole FMO dla następujących kolorów (Kit, CD41, CD150, CD49f [cztery probówki]), przenosząc 300 μl (10 x 106 komórek) zawiesiny komórek do oddzielnej probówki FACS na lodzie.
    3. Wirować komórki w temperaturze 900 x g, 4 °C przez 10 minut i odessać supernatant.
  12. Barwienie przeciwciałami FMO i jednokolorowych kontroli
    1. Wybarwić FMO w temperaturze 33 x 106 komórek/ml (w całkowitej objętości 300 μl) w probówkach FACS. Dla każdej kontroli dodaj wszystkie przeciwciała z wyjątkiem przeciwciała o nazwie FMO. Na przykład w przypadku Kit FMO należy pominąć przeciwciało Kit. Dla każdego przeciwciała należy zastosować rozcieńczenie i końcowe stężenie jak w tabeli 2.
    2. Wybarwić jednokolorowe kontrolki w proporcji 20 x 106 komórek/ml (w całkowitej objętości 50 μl) w probówkach FACS; dla każdej próby kontrolnej dodać pojedyncze przeciwciało o stężeniu wymienionym w tabeli 2.
    3. Wirować każdą rurkę kontrolną przez 2-3 s przy 3 000 obr./min (obroty na minutę), a następnie inkubować w temperaturze 4 °C, kołysząc się przez 2,5 godziny w ciemności, chroniąc przed światłem. Kołysz probówkami z osią obrotu równoległą do długości rurki, między kątem około 10° a 60° od poziomu, tak aby zawartość nie dotykała nakrętki.
    4. Przemyć komórki SB5: Uzupełnić objętość zawiesiny komórek do 4 ml za pomocą SB5. Odwirować komórki w temperaturze 900 x g, w temperaturze 4 °C przez 10 minut i odessać supernatant.
  13. Ponowne wywieszanie komórek:
    1. Ponownie zawiesić niebarwione i wszystkie pojedyncze kontrolki koloru (z wyjątkiem kontroli DAPI) w 300 μl SB5 i przefiltrować przez siatkę filtracyjną 40 μm do nowej probówki FACS.
    2. Przygotuj roztwór DAPI/SB5, rozcieńczając zapas DAPI (1 mg/ml w 100% etanolu) w stosunku 1:10 000 w SB5.
    3. Ponownie zawiesić FMO w 1,8 ml DAPI/SB5 i przefiltrować przez siatkę filtracyjną 40 μm do nowej probówki FACS
    4. Ponownie zawiesić jednokolorową kontrolę DAPI w 300 μl DAPI/SB5 i przefiltrować przez siatkę filtracyjną 40 μm do nowej probówki FACS o pojemności 4 ml.
  14. Przygotowanie próbki: Jeśli komórki są przygotowywane do analizy metodą cytometrii przepływowej, przejdź do kroku 1.14. Jeśli przygotowujesz komórki do sortowania, przejdź do kroku 2.1.
  15. Wybarwić próbki do analizy cytometrycznej przepływowej o masie 33 x 106 komórek/ml w całkowitej objętości 300 μl (10 x 106 komórek) w probówkach FACS:
    1. Przygotować główną mieszankę przeciwciał. Oznaczyć objętość mieszanki wzorcowej na podstawie liczby próbek, przy czym na próbkę przypada 300 μl. Przygotować mieszaninę wzorcową, rozcieńczając wszystkie przeciwciała wymienione w tabeli 2 we wskazanym rozcieńczeniu w SB5. IgG królika w mieszance głównej służy jako blok Fc.
    2. Wiruj każdą probówkę przez 2-3 s przy 3 000 obr./min, a następnie inkubuj w temperaturze 4 °C, kołysząc się przez 2,5 godziny w ciemności, chroniąc przed światłem.
    3. Przemyć komórki SB5: Uzupełnić objętość zawiesiny komórek do 4 ml za pomocą SB5. Odwirować komórki w temperaturze 900 x g, w temperaturze 4 °C przez 10 minut i odessać supernatant.
    4. Zawiesić próbki do analizy metodą cytometrii przepływowej w 1,8 ml DAPI/SB5, jak przygotowano w kroku 1.12.5.2 i przefiltrować przez siatkę filtracyjną 40 μm do probówki FACS.
    5. Analizować próbki na cytometrze z 10 kanałami, aby pomieścić koniugaty przeciwciał w tabeli 2 i barwnik żywotności DAPI. Przykładowa konfiguracja kanału znajduje się w Tabeli 1. Możliwe jest również korzystanie tylko z dziewięciu kanałów; zob. legenda w tabeli 2.
    6. Podczas analizy danych cytometrii przepływowej należy stosować standardowe podejścia do kompensacji spektralnej za pomocą jednokolorowych kontroli i kontroli FMO, jak opisano w kroku 2.4.

2. Korekty protokołu dla sortowania metodą cytometrii przepływowej

  1. Przygotowanie lin-
    1. Połącz wszystkie wyekstrahowane komórki z tej samej tkanki (BM lub śledziony) od 10 myszy w probówce o pojemności 50 ml. Zawiesić każdą próbkę zbiorczą, pipetując za pomocą P1000 z końcówką z dużym otworem.
    2. Wirować komórki w temperaturze 900 x g, 4 °C przez 10 minut i odessać supernatant.
    3. Przygotować jednokolorowe i FMO kontrole zgodnie z opisem w sekcji 1 przy użyciu niewzbogaconych komórek.
    4. Wzbogacić komórki Lin do sortowania za pomocą magnetycznego wzbogacania kulek w komórki Lin:
    5. Ponownie zawiesić komórki w 1 x 108 komórek/ml za pomocą SB5 i przenieść je do probówki o pojemności 15 ml. Dodać normalną surowicę szczura i biotynylowane przeciwciała wymienione w tabeli 4 i inkubować z kołysaniem w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę.
    6. Odwirować komórki w temperaturze 900 x g, 4 °C przez 10 minut i odessać supernatant. Ponownie zawiesić komórki w 15 ml zimnego SB5.
    7. Odwirować komórki w temperaturze 900 x g, 4 °C przez 10 minut i odessać supernatant. Ponownie zawiesić komórki w temperaturze 1 x 108 komórek/ml w zimnym SB5 i trzymać je na lodzie.
    8. Wiruj magnetyczne nanokulki z prędkością 3,000 obr./min przez 5-10 s. Weź 1 ml nanokulek magnetycznych na każde 10 ml komórek.
    9. Umyj nanokulki w probówce FACS o pojemności 5 ml. Uzupełnić objętość do 4 ml za pomocą SB5, wirować w temperaturze 900 x g, 4 °C przez 5 minut i odessać supernatant.
    10. Zawiesić nanokulki w 500 μl SB5 i wymieszać z komórkami przygotowanymi w kroku 2.1.7. Inkubować w temperaturze 4 °C z kołysaniem przez 15 min.
    11. Odwirować komórki w temperaturze 900 x g, 4 °C przez 10 minut i odessać supernatant. Ponownie zawiesić komórki przy 1 x 108 komórkach/ml za pomocą SB5.
    12. Umieścić rurkę na magnesie w temperaturze 4 °C na 5 minut.
    13. Ostrożnie wlać supernatant do nowej probówki o pojemności 15 ml.
    14. Umieścić probówkę zawierającą supernatant z kroku 2.1.13 na magnesie w temperaturze 4 °C na 5 minut. Ostrożnie wlać supernatant do nowej probówki o pojemności 15 ml.
    15. Odwirować komórki z supernatantu w kroku 2.1.14 w temperaturze 900 x g, w temperaturze 4 °C przez 10 minut i odessać supernatant.
    16. Ponownie zawiesić komórki wzbogacone w Lin w 1 ml SB5.
    17. Rozcieńczyć 10 μl komórek w stosunku 1:100 w SB5. Zmieszać 10 μl rozcieńczonych komórek z 10 μl błękitu trypanowego i policzyć na hemocytometrze i/lub liczniku komórek.
    18. Opierając się na liczbie komórek w kroku 2.1.17, ponownie zawieś komórki wzbogacone w Lin przy 33 x 106 komórek/ml.
  2. Barwienie wzbogaconych komórek:
    1. Wybarwić wzbogacone próbki komórek w proporcji 33 x 106 komórek/ml w probówkach FACS, dodając wszystkie przeciwciała wymienione w tabeli 2. Wiruj każdą probówkę przez 2-3 s przy 3 000 obr./min, a następnie inkubuj w temperaturze 4 °C, kołysząc się przez 2,5 godziny w ciemności, chroniąc przed światłem.
    2. Umyj komórki SB5: Uzupełnić objętość probówek FACS do 4 ml za pomocą SB5. Wirować komórki w temperaturze 900 x g, 4°C przez 10 minut i usunąć supernatant.
    3. Zawiesić próbki do analizy metodą cytometrii przepływowej w 4-6 ml DAPI/SB5, jak przygotowano w kroku 1.12.5.2 i przefiltrować przez siatkę filtracyjną 40 μm do nowej probówki FACS o pojemności 4 ml.
  3. Sortowanie próbek:
    1. Sortuj próbki za pomocą dużej dyszy i niskiego ciśnienia, aby zmaksymalizować wydajność CFU-e, ponieważ ogniwa CFU-e łatwo ulegają uszkodzeniu pod wysokim ciśnieniem. W przypadku cytometru przepływowego używanego w tym badaniu należy użyć dyszy 14 psi i 100 μm lub 12 psi z dyszą 130 μm. Skonfiguruj bramki sortowania zgodnie z opisem w kroku 2.4 poniżej.
    2. Przygotować bufor do pobrania: Dodać 20% płodowej surowicy bydlęcej do PBS.
    3. Aby sprawdzić czystość posortowanych populacji, należy ponownie uruchomić małą porcję z każdej posortowanej populacji w buforze zawierającym DAPI, zgodnie z opisem w kroku 1.12.5.2.
      UWAGA: Zazwyczaj BM z łącznie 10 myszy (około 1 x 109 komórek) daje co najmniej 50 000-100 000 komórek dla każdej z populacji P1-hi, P1-low i P2 o żywotności około 70%.
  4. Użyj strategii bramkowania pokazanej w Rysunek 3 do analizy lub ustawienia bramek sortowania.
    1. Użyj parametru rozproszenia do przodu (FSC), aby usunąć zanieczyszczenia na podstawie rozmiaru. Użyj histogramu wysokości FSC w stosunku do obszaru FSC, aby wykluczyć agregacje komórek i wybrać pojedyncze komórki; Powtórz z histogramem wysokości rozrzutu bocznego (SSC) w funkcji obszaru SSC.
    2. Wyklucz martwe komórki, bramkując komórki, które są dodatnie dla barwnika DNA DAPI, dla których żywe komórki są nieprzepuszczalne.
    3. Wybierz komórki Lin-Ter119-Kit+, a spośród nich wybierz subpopulację, która wykazuje ekspresję CD55.
    4. Podziel komórki Lin-Ter119-Kit + CD55 + na dwie główne populacje, P6 i P7, w oparciu o ekspresję CD49f i CD105.
    5. Opierając się na ekspresji CD150 i CD41, podziel P6 dalej na P3 (progenitorzy bazofili lub komórek tucznych), P4 (progenitorzy megakariocytarni) i P5 (EBMP i MPP z odchyleniem erytroidalnym).
    6. Opierając się na ekspresji CD150 i CD71, podziel P7 dalej na P2 (BFU-e), wczesny CFU-e (P1-niski) i późny CFU-e (P1-hi).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Protokół opisuje podejście cytometryczne do identyfikacji BFU-es i CFU-es w świeżo pobranych komórkach szpiku kostnego i śledziony. Zaczyna się od zebrania świeżego BM i śledziony od myszy i natychmiastowego umieszczenia tkanki na lodzie. Wszystkie zabiegi przeprowadza się na zimno, aby zachować żywotność komórek. Komórki są znakowane "liniowym" koktajlem przeciwciał, który pozwala na wykluczenie wszystkich komórek wyrażających markery zróżnicowanych linii krwi (koktajl FITC-Lin, tabela 3, w przypadku an...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Możliwość prospektywnego izolowania progenitorów BFU-e i CFU-e bezpośrednio ze świeżej tkanki o wysokiej czystości wcześniej wymykała się badaczom. Nasze nowatorskie podejście, zweryfikowane za pomocą testów scRNAseq i losu komórki 1,27, oferuje teraz narzędzia do tego celu.

Istnieje kilka kluczowych punktów umożliwiających pomyślne wykonanie zarówno protokołów sortowania, jak i analizy. Po pierwsze, ogniwa muszą być wirowane z prędkoś...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

Ta praca jest wspierana przez granty NIH R01DK130498, R01DK120639 i R01HL141402

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,5 M EDTA, pH 8,0Life Technologies15575020
1000 &mikro; L końcówki z dużymi otworamiUSA sceintific1011-9000
Alexa Fluor 647 anty-mysie przeciwciało CD55 (DAF)BioLegend131806
APC/Cyjanina7 anty-mysie CD117 (c-kit) PrzeciwciałoBioLegend105826
Biotin-CD11bBD Biosciences557395 M1/70 (klon)
Biotyna-CD19BD Biosciences5537841D3 (klon)
Biotyna-CD4BD BiosciencesBDB553045RM4-5 (klon)
Biotyna-CD8aBD BiosciencesBDB55302953-6.7 (klon)
Biotyna-F4/80Biolegend123106BM8 (klon)
Biotyna-Ly-6G i Ly-6CBD Biosciences553125RB6-8C5 (klon)
Biotyna-TER-119BD Biosciences553672TER-119 (klon)
Surowica bydlęca AlbuminaSigma aldritchA1470
Brilliant Violet 421 przeciwciało anty-ludzkie/mysie CD49fBioLegend313624
Brilliant Violet 605 przeciwciało anty-mysie CD41BioLegend133921
Brilliant Violet 650 anty-mysie przeciwciało CD150 (SLAM)BioLegend115931
BUV395 Szczurzy anty-mysz TER-119/Erytroid KomórkiBD Biosciences563827
ChromPure Rabbit IgG, cała cząsteczkaJackson ImmunoResearch Laboratories011-000-003
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)Life TechnologiesD1306
Cyfrowy sprzęt i oprogramowanie DIVA dla LSR IIBD Biosciences
FITC przeciwciało przeciw myszom F4/80BioLegend123108
FITC Rat Anti-CD11bBD Biosciences557396
FITC Rat Anti-Mouse CD19BD Biosciences553785
FITC Rat Anti-Mouse CD4BD Biosciences553047
FITC Rat Anti-Mouse CD8aBD Biosciences553031
FITC Rat Anti-Mouse Ly-6G i LY-6CBD Biosciences
Oprogramowanie FlowJo FlowJowersja 10Oprogramowanie do analizy cytometru przepływowego
LSR II cyfrowy wieloparametrowy analizator cytometru przepływowegoBD BiosciencesCytometr przepływowy
NewlineNY Masher ręczny ze stali nierdzewnej i Miska, moździerz i zestaw tłuczkówAmazon
Normalna surowica szczuraStem Cell Technologies13551
PE przeciwciało anty-mysie CD105BioLegend120408
PE/cyjaninina 7 przeciwciało anty-mysie CD71BioLegend113812
sól fizjologiczna buforowana fosforanem, 10x roztwórFisher scientificBP3994
Streptawidyna NanokulkiBioLegend480016Koraliki magnetyczne
553127 

Bibliografia

  1. Tusi, B. K., et al. Population snapshots predict early haematopoietic and erythroid hierarchies. Nature. 555 (7694), 54-60 (2018).
  2. Socolovsky, M. The role of specialized cell cycles during erythroid lineage development: Insights from single-cell RNA sequencing. International Journal of Hematology. 116 (2), 163-173 (2022).
  3. Hwang, Y., Hidalgo, D., Socolovsky, M. The shifting shape and functional specializations of the cell cycle during lineage development. WIREs Mechanisms of Disease. 13 (2), 1504(2021).
  4. Axelrad, A. A., McLeod, D. L., Shreeve, M. M., Heath, D. S. Properties of Cells that Produce Erythrocytic Colonies In Vitro. Hemopoiesis in Culture. Robinson, W. A. , National Institutes of Health, US Government Printing Office. (1974).
  5. Heath, D. S., Axelrad, A. A., McLeod, D. L., Shreeve, M. M. Separation of the erythropoietin-responsive progenitors BFU-E and CFU-E in mouse bone marrow by unit gravity sedimentation. Blood. 47 (5), 777-792 (1976).
  6. Iscove, N. N., Sieber, F. Erythroid progenitors in mouse bone marrow detected by macroscopic colony formation in culture. Experimental Hematology. 3 (1), 32-43 (1975).
  7. Gregory, C. J., McCulloch, E. A., Till, J. E. Erythropoietic progenitors capable of colony formation in culture: State of differentiation. Journal of Cell Physiology. 81 (3), 411-420 (1973).
  8. Gregory, C. J., Tepperman, A. D., McCulloch, E. A., Till, J. E. Erythropoietic progenitors capable of colony formation in culture: Response of normal and genetically anemic W-W-V mice to manipulations of the erythron. Journal of Cell Physiology. 84 (1), 1-12 (1974).
  9. Gregory, C. J. Erythropoietin sensitivity as a differentiation marker in the hemopoietic system: studies of three erythropoietic colony responses in culture. Journal of Cell Physiology. 89 (2), 289-301 (1976).
  10. Pop, R., et al. A key commitment step in erythropoiesis is synchronized with the cell cycle clock through mutual inhibition between PU.1 and S-phase progression. PLoS Biology. 8 (9), 1000484(2010).
  11. Koulnis, M., et al. Identification and analysis of mouse erythroid progenitors using the CD71/TER119 flow-cytometric assay. Journal of Visualized Experiments. (54), e2809(2011).
  12. Liu, Y., et al. Suppression of Fas-FasL coexpression by erythropoietin mediates erythroblast expansion during the erythropoietic stress response in vivo. Blood. 108 (1), 123-133 (2006).
  13. Socolovsky, M., et al. Ineffective erythropoiesis in Stat5a(-/-)5b(-/-) mice due to decreased survival of early erythroblasts. Blood. 98 (12), 3261-3273 (2001).
  14. Chen, K., et al. Resolving the distinct stages in erythroid differentiation based on dynamic changes in membrane protein expression during erythropoiesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (41), 17413-17418 (2009).
  15. Hwang, Y., Hidalgo, D., Socolovsky, M. The shifting shape and functional specializations of the cell cycle during lineage development. WIREs Mechanisms of Disease. 13 (2), 1504(2020).
  16. Hidalgo, D., et al. EpoR stimulates rapid cycling and larger red cells during mouse and human erythropoiesis. Nature Communications. 12 (1), 7334(2021).
  17. Porpiglia, E., Hidalgo, D., Koulnis, M., Tzafriri, A. R., Socolovsky, M. Stat5 signaling specifies basal versus stress erythropoietic responses through distinct binary and graded dynamic modalities. PLoS Biology. 10 (8), 1001383(2012).
  18. Koulnis, M., et al. Contrasting dynamic responses in vivo of the Bcl-xL and Bim erythropoietic survival pathways. Blood. 119 (5), 1228-1239 (2012).
  19. Shearstone, J. R., et al. Global DNA demethylation during mouse erythropoiesis in vivo. Science. 334 (6057), 799-802 (2011).
  20. Koulnis, M., Liu, Y., Hallstrom, K., Socolovsky, M. Negative autoregulation by Fas stabilizes adult erythropoiesis and accelerates its stress response. PLoS One. 6 (7), 21192(2011).
  21. Pronk, C. J., et al. Elucidation of the phenotypic, functional, and molecular topography of a myeloerythroid progenitor cell hierarchy. Cell Stem Cell. 1 (4), 428-442 (2007).
  22. Dolznig, H., et al. Expansion and differentiation of immature mouse and human hematopoietic progenitors. Methods in Molecular Medicine. 105, 323-344 (2005).
  23. Li, J., et al. Isolation and transcriptome analyses of human erythroid progenitors: BFU-E and CFU-E. Blood. 124 (24), 3636-3645 (2014).
  24. Zhang, J., Socolovsky, M., Gross, A. W., Lodish, H. F. Role of Ras signaling in erythroid differentiation of mouse fetal liver cells: Functional analysis by a flow cytometry-based novel culture system. Blood. 102 (12), 3938-3946 (2003).
  25. Flygare, J., Rayon Estrada, V., Shin, C., Gupta, S., Lodish, H. F. HIF1alpha synergizes with glucocorticoids to promote BFU-E progenitor self-renewal. Blood. 117 (12), 3435-3444 (2011).
  26. Pronk, C. J., Attema, J., Rossi, D. J., Sigvardsson, M., Bryder, D. Deciphering developmental stages of adult myelopoiesis. Cell Cycle. 7 (6), 706-713 (2008).
  27. Khoramian Tusi, B., Socolovsky, M. High-throughput single-cell fate potential assay of murine hematopoietic progenitors in vitro. Experimental Hematology. 60, 21-29 (2018).
  28. Erslev, A. J., Caro, J. Erythropoietin titers in response to anemia or hypoxia. Blood Cells. 13 (1-2), 207-216 (1987).
  29. Koury, M. J., Bondurant, M. C. The molecular mechanism of erythropoietin action. European Journal of Biochemistry. 210 (3), 649-663 (1992).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Izolacja progenitor w erytroidalnychprogenitory BFU Eprogenitory CFU Eszpik kostny myszyzawiesina pojedynczych kom rekmarkery powierzchniowe kom rektest kolonogennyznakowanie przeciwcia amistymulacja erytropoetyn

Powiązane artykuły