A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Research Article
Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.
W tej pracy zastosowano podejście do rekonstytucji in vitro do badania poroselastyczności żeli z aktomiozyną w kontrolowanych warunkach. Określa się ilościowo dynamikę żelu aktomiozyny i wbudowanego rozpuszczalnika, za pomocą której wykazano porosprężystość sieci. Omawiamy również wyzwania eksperymentalne, typowe pułapki i znaczenie dla mechaniki cytoszkieletu komórkowego.
Komórki mogą aktywnie zmieniać swoje kształty i stawać się ruchliwe, co zależy od ich zdolności do aktywnej reorganizacji swojej wewnętrznej struktury. Cecha ta przypisuje się mechanicznym i dynamicznym właściwościom cytoszkieletu komórkowego, w szczególności cytoszkieletu aktomiozyny, który jest aktywnym żelem polarnych włókien aktynowych, silników miozyny i białek pomocniczych, które wykazują wewnętrzne właściwości skurczowe. Zwykle przyjęty pogląd jest taki, że cytoszkielet zachowuje się jak materiał lepkosprężysty. Jednak model ten nie zawsze może wyjaśnić wyniki eksperymentalne, które są bardziej zgodne z obrazem opisującym cytoszkielet jako poroelastyczny materiał aktywny - elastyczną sieć osadzoną w cytozolu. Gradienty kurczliwości generowane przez silniki miozyny napędzają przepływ cytozolu przez pory żelu, co sugeruje, że mechanika cytoszkieletu i cytozolu jest ściśle sprzężona. Jedną z głównych cech porosprężystości jest dyfuzyjne rozluźnienie naprężeń w sieci, charakteryzujące się efektywną stałą dyfuzji, która zależy od modułu sprężystości żelu, porowatości i lepkości cytozolu (rozpuszczalnika). Ponieważ komórki mają wiele sposobów regulowania swojej struktury i właściwości materiałowych, nasza obecna wiedza na temat sprzężenia mechaniki cytoszkieletu i dynamiki przepływu cytozolu pozostaje słabo poznana. W tym przypadku zastosowano podejście oparte na rekonstytucji in vitro w celu scharakteryzowania właściwości materiałowych poroelastycznych żeli aktomiozyny jako systemu modelowego dla cytoszkieletu komórkowego. Skurcz żelu jest napędzany przez kurczliwość ruchową miozyny, co prowadzi do pojawienia się przepływu penetrującego rozpuszczalnika. W artykule opisano, jak przygotować te żele i przeprowadzić eksperymenty. Omawiamy również, jak mierzyć i analizować przepływ rozpuszczalnika i kurczenie się żelu zarówno w skali lokalnej, jak i globalnej. Podano różne relacje skalowania używane do kwantyfikacji danych. Na koniec omówiono wyzwania eksperymentalne i typowe pułapki, w tym ich znaczenie dla mechaniki cytoszkieletu komórkowego.
Żywe komórki mają unikalne właściwości mechaniczne. Oprócz zdolności do pasywnego reagowania na przyłożone siły, są one również zdolne do aktywnego generowania sił w odpowiedzi na bodźce zewnętrzne1. Te cechy, które są niezbędne dla różnych procesów komórkowych, zwłaszcza podczas ruchliwości komórek, przypisuje się przede wszystkim mechanicznym i dynamicznym właściwościom cytoszkieletu komórkowego, zwłaszcza cytoszkieletu aktomiozyny, który jest aktywnym żelem polarnych włókien aktynowych, silników molekularnych miozyny i białek pomocniczych. Te sieci aktomiozyny wykazują wewnętrzne właściwości samoorganizacji i kurczenia się napędzane przez białka motoryczne miozyny, które sieciują włókna aktynowe i aktywnie generują naprężenia mechaniczne w sieci napędzanej hydrolizą ATP2.
Przeprowadzono liczne badania eksperymentalne i teoretyczne w celu zbadania właściwości materiału cytoszkieletu3. Powszechnie przyjęty pogląd jest taki, że cytoszkielet zachowuje się jak materiał lepkosprężysty4. Oznacza to, że w krótkich skalach czasowych cytoszkielet zachowuje się jak materiał elastyczny, a w długich skalach czasowych zachowuje się jak lepki płyn ze względu na sieciujące białka i odłączanie motoryczne miozyny (i ponowne przyłączanie), co pozwala sieci na dynamiczny obrót. Jednak w wielu sytuacjach model lepkosprężysty nie jest w stanie opisać wyników eksperymentalnych, które są bardziej spójne z obrazem opisującym cytoszkielet i, bardziej ogólnie, cytoplazmę komórki opisywaną jako poroelastyczny materiał aktywny5,6. Dwie główne cechy charakteryzują tego typu materiały. (i) Pierwszą główną cechą jest generowanie przepływu penetrującego cytozolu ("rozpuszczalnika") przez pory żelu przez gradienty kurczliwości napędzane przez silniki miozyny, co leży u podstaw procesów takich jak pęcherzyki komórkowe7, motility8 i oscylacje kształtu komórki9. Pojawienie się takich przepływów cytozolowych może być miejscowe, w przypadku pęcherzyków, lub globalne, jak w ruchliwości komórek. W tym drugim przypadku naprężenia kurczliwe działające na tył komórki napędzają przepływ płynu cytozolowego w kierunku przodu komórki, co uzupełnia pulę białka potrzebną do złożenia lamellipodiów8. (ii) Drugą główną cechą jest to, że relaksacja naprężeń jest dyfuzyjna i charakteryzuje się efektywną stałą dyfuzji, która zależy od modułu sprężystości żelu, porowatości żelu i lepkości rozpuszczalnika5. Stała dyfuzji poroelastycznej określa, jak szybko system reaguje na przyłożone naprężenie. Wyższe stałe dyfuzji odpowiadają szybszej redystrybucji naprężeń. To z kolei określa, ile czasu zajmuje redystrybucja wewnątrzkomórkowego płynu cytozolowego w komórce po zastosowanym naprężeniu mechanicznym, czy to zewnętrznym, czy wewnętrznym, takim jak aktywne naprężenia kurczliwe generowane przez silniki miozyny. Przykłady te pokazują zatem, że mechanika cytoszkieletu i cytozolu jest ściśle ze sobą sprzężona i nie może być traktowana oddzielnie3.
Ponieważ komórki mogą regulować swoje właściwości mechaniczne na różne sposoby, wzajemne oddziaływanie między mechaniką sieci a dynamiką przepływu płynów pozostaje słabo poznane. Skutecznym alternatywnym podejściem jest użycie systemów odtworzonych in vitro, które pozwalają na pełną kontrolę nad różnymi mikroskopijnymi składnikami i parametrami systemu, co sprawia, że te systemy modelowe są optymalne do analizy fizycznej10,11. Podejście to zostało z powodzeniem zastosowane do zbadania wpływu składu białek i geometrii systemu na ruchliwość opartą na aktynie12,13,14,15,16,17,18, wzorzec 2D sieci aktomiozyny19,20,21,22, oraz wzajemne oddziaływanie między kurczliwością sieci a dynamiką przepływu płynów w poroelastycznych żelach z aktomiozyny, na czym skupia się ten artykuł23.
W tym manuskrypcie omówiono przygotowanie kurczliwych elastycznych sieci aktomiozyny o kontrolowanych wymiarach i właściwościach materiału na podstawie pracy Ideses et al.23. Dynamika żelu kurczącego się i odsączonego rozpuszczalnika jest analizowana i określana ilościowo, dzięki czemu wykazano, że te żele z aktomiozyną można opisać jako poroelastyczny materiał aktywny. Badanie wpływu lepkości rozpuszczalnika na dyfuzyjność naprężeń dodatkowo potwierdza poroelastyczną naturę tych sieci. Podano różne relacje skalowania używane do kwantyfikacji danych. Na koniec omówiono również wyzwania eksperymentalne, typowe pułapki i znaczenie wyników eksperymentalnych dla cytoszkieletu komórkowego.
1. Obróbka powierzchni szkła i pasywacja:
UWAGA: Ta sekcja zawiera trzy główne kroki (zobacz Rysunek 1): (i) czyszczenie i hydrofilizacja, (ii) silanizacja, oraz (iii) pasywacja powierzchni.
2. Oczyszczanie białka
3. Przygotowanie próbki
UWAGA: Polimeryzuj monomery aktyny w obecności dużych agregatów silników miozyny II i silnego pasywnego sieciera sieciującego faszynę, aby wytworzyć makroskopowo kurczliwe elastyczne sieci aktomiozyny19,23. Dodanie kulek fluorescencyjnych do roztworu pozwala na śledzenie przepływu rozpuszczalnika podczas skurczu żelu.
4. Przeprowadzanie eksperymentu
5. Techniki mikroskopowe
W każdym eksperymencie używa się dwóch szklanych szkiełek nakrywkowych. Szkiełka nakrywkowe są czyszczone i pasywowane polimerami PEG. Pasywacja jest niezbędna do zapobiegania przywieraniu rozpuszczonych białek do powierzchni szkła na wczesnych etapach eksperymentalnych oraz do zminimalizowania interakcji sieci kurczącej się ze szklanymi ściankami. Brak dobrej pasywacji może prowadzić do nieefektywnego skurczu, a w skrajnych przypadkach może nawet zahamować tworzenie sieci aktyny.
Rysunek 1 opisuje trzy główne etapy procedury obróbki powierzchni. Kroki te obejmują: (i) czyszczenie powierzchni i hydrofilizację przy użyciu roztworu Piranha, który usuwa zanieczyszczenia organiczne z powierzchni szkiełek nakrywkowych i odsłania grupy OH na powierzchni szkła; (ii) silanizacja powierzchniowa za pomocą (3-merkaptopropylo)trimetoksysilanu, która ma na celu kowalencyjne związanie silanu z powierzchnią szkła, gdzie każda cząsteczka silanu kończy się grupą SH; (iii) pasywacja polimerami PEG (mPEG-mal, 5 kDa) - na tym etapie grupa maleimidowa polimeru PEG oddziałuje kowalencyjnie z grupą SH na (3-merkaptopropylo)trimetoksysilanie, w wyniku czego na powierzchni szkła powstaje monowarstwa PEG.
Do leczenia i silanizacji Piranha, 10-12 szklanych szkiełek nakrywkowych #1.5 (22 mm x 22 mm) umieszcza się w uchwycie z politetrafluoroetylenu (Rysunek 2A), a następnie przenosi się je do zlewki o pojemności 400 ml. Na etapie pasywacji dwa szklane szkiełka nakrywkowe są przenoszone na pokrytą parafolią szalkę Petriego (Rysunek 2B). Umieszczenie szkiełek nakrywkowych na hydrofobowej warstwie parafilmu zapewnia, że hydrofilowy roztwór polimeru PEG pozostaje zamknięty na powierzchni szkła przez cały czas inkubacji. Każde szkiełko nakrywkowe inkubuje się z 1 ml 4 mg·mL−1 5 kDa mPEG-mal w 1x PBS przez 1 godzinę w temperaturze 22 °C (Rysunek 2B). Dla tego polimeru PEG o masie cząsteczkowej i stężeniu, pasywacja szkła prowadzi do powstania monowarstwy PEG, w której każdy polimer PEG ma konformację podobną do grzyba29. Pod koniec procesu inkubacji każde szkiełko nakrywkowe przepłukuje się 5 ml DDW i suszy strumieniemN2 (gazu). Jeśli szkiełka nakrywkowe nie zostaną natychmiast zużyte, należy nałożyć 1 ml 10 mM Tris na pegylowane powierzchnie, aby utrzymać mokre powierzchnie szkiełek nakrywkowych. Szkiełka nakrywkowe suszy się strumieniemN2 (gaz) tuż przed rozpoczęciem eksperymentu. Lepiej jest zużyć szkiełka nakrywkowe w ciągu 2 godzin.
Makroskopowo kurczliwe elastyczne sieci aktomiozyny powstają przez zmieszanie 5 μM G-aktyny z 16,7 nM miozyny, która jest dodawana w postaci dużych agregatów (~150 dimerów/agregatów miozyny) i 280 nM silnej sieciującej faszyny. Roztwór zawiera 1 mM ATP, który jest utrzymywany na stałym poziomie za pomocą systemu regenerującego ATP i roztworu zapobiegającego wybielaniu (szczegóły w sekcji protokołu). Aby przeanalizować przepływ penetrującego rozpuszczalnika, do roztworu aktomiozyny dodaje się kulki fluorescencyjne.
Eksperymenty są przeprowadzane w domowej roboty uchwycie na próbki, który pasuje do wymiarów standardowego stolika mikroskopowego (Rysunek 3). Natłuszczony przekładka parafilmu o grubości h (~150 μm) umieszcza się na jednym z dwóch szkiełek nakrywkowych pasywowanych PEG, a następnie szkiełko nakrywkowe umieszcza się w uchwycie na próbkę (Rysunek 3A). Następnie roztwór aktomiozyny przygotowuje się na lodzie w probówce mikrowirówkowej, wprowadzając różne mikroskopijne składniki, dodając na końcu G-aktynę, agregaty miozyny, a następnie EGTA, która wyzwala polimeryzację aktyny. Roztwór musi być dobrze wymieszany - to ustala czas rozpoczęcia eksperymentów (t = 0). Natychmiast 1,1 μl tego roztworu umieszcza się na szkiełku nakrywkowym (Rysunek 3B), na nim umieszcza się drugie pasywowane PEG szkiełko nakrywkowe (Rysunek 3C), a uchwyt przykręca się, aby ograniczyć spadek między nimi (Rysunek 3D). Dla tej objętości kropli i typu przekładki średnica kropli wynosi około 3 000 μm, ale naukowcy nie powinni polegać na tych szacunkowych wartościach. Rzeczywista grubość i średnica kropli powinna być zawsze mierzona bezpośrednio na podstawie obrazów mikroskopowych. Do pomiaru grubości należy użyć mikroskopu konfokalnego.
Uchwyt na próbkę jest umieszczany na mikroskopie i rozpoczyna się akwizycja. Mikroskop powinien być przygotowany z wyprzedzeniem, aby skrócić czas do rozpoczęcia akwizycji do minimum. Rozpoczęcie obrazowania próbki zajmuje zwykle 1-2 minuty. Próbki są wzbudzane przy długości fali 488 i/lub 561 nm i obrazowane za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego sterowanego przez dedykowane oprogramowanie. Obrazy powinny być rejestrowane z szybkością 100 ms na klatkę (lub mniej) w trybie przesyłania strumieniowego za pomocą kamery EMCCD. Aby jednocześnie zobrazować sieć aktynową i agregaty motoryczne miozyny lub kulki fluorescencyjne w roztworze, należy zastosować system podwójnej emisji. Intensywność lampy fluorescencyjnej powinna być utrzymywana na jak najniższym poziomie, aby uniknąć nasycenia sygnału w zaawansowanych stadiach kurczenia się sieci.
A 2.5x/0.075 Plan-NEOFLUAR obiektyw służy do scharakteryzowania dynamiki skurczu bocznego żelu oraz kierunkowości i prędkości przepływu płynu na skali długości żelu. Są to obrazy o niskiej rozdzielczości, które są przydatne do śledzenia zmian promienia żelu w czasie, z których można wywnioskować radialną (boczną) prędkość skurczu żelu. Aby określić strukturę i porowatość sieci, lokalizację agregatów motorycznych miozyny w sieci oraz ruch poszczególnych kulek fluorescencyjnych przez pory żelu, należy zastosować obiektywy o większym powiększeniu (np. obiektyw UPlanFL 10x/0,3 Ph1). Można również stosować większe powiększenia, ale kosztem zmniejszonego pola widzenia, które jest bardziej znaczące, jeśli stosowany jest tryb obrazowania dwukolorowego. Dane z mikroskopii fluorescencyjnej (2D) powinny być uzupełnione obrazowaniem konfokalnym kurczącego się żelu w 3D, aby scharakteryzować dynamikę skurczu zarówno w kierunku bocznym, jak i pionowym. Mikroskopia konfokalna służy do pomiaru odstępów między dwoma szkiełkami nakrywkowymi - odległość ta określa początkową grubość żelu. Dodatkowo grubość żelu powinna być mierzona na końcu eksperymentu, gdy zostanie osiągnięty stan stabilny mechanicznie.
Kilka kryteriów musi być spełnionych, aby pokazać, że sieci aktomiozyny zachowują się jak materiał poroelastyczny: (i) sieć nie ulega przebudowie, co oznaczałoby, że zachowuje się jak materiał elastyczny (Rysunek 4), (ii) przepływ wody (rozpuszczalnika) przez pory żelu jest napędzany przez kurczliwość miozyny (Rysunek 5), oraz (iii) relaksacja naprężeń sprężystych charakteryzuje się efektywną stałą dyfuzji, D ~ κ/γ, który zależy od efektywnego modułu sprężystości żelu, κ, oraz efektywnej stałej tarcia, γ, która odpowiada za tarcie między poruszającym się rozpuszczalnikiem a porami żelu (Rysunek 6). Poniżej omawiamy każde kryterium z osobna i pokazujemy, w jaki sposób są one spełnione w obecnym systemie.
Cel (i)
Po pierwsze, struktura i porowatość żelu powinny zostać przeanalizowane, a następnie należy określić, czy sieć dynamicznie się przebudowuje. Schematyczne przedstawienie sieci aktomiozyny przedstawiono w Rysunek 4A. Tworzenie sieci rozpoczyna się od spontanicznego zarodkowania i polimeryzacji włókien aktynowych, które następnie łączą się w wiązki (Rysunek 4B). Sieć następnie aktywnie samoorganizuje się w makroskopowo izotropową, wzajemnie połączoną sieć wiązek aktyny, która dynamicznie zgrubia się z czasem i ostatecznie kurczy się. Samoorganizacja i kurczenie się sieci są napędzane przez agregaty miozyny, które głównie lokalizują się w punktach przecięcia wiązek włókien (Rysunek 4C). Agregaty miozyny pozostają przyłączone do sieci poprzez skurcz żelu, z czego można wywnioskować, że te żele aktomiozyny zachowują się jak elastyczne materiały aktywne (Rysunek 4C). Co więcej, w tych żelach aktomiozyny skurcz jest regulowany przez przesuwanie się włókien, jak wywnioskowano, porównując odległości wiązek włókien od końca do końca, ldługości od końca do końca i długości konturów, lcont (Rysunek 4D,E). Kontrastuje to ze skurczem luźnych wiązek aktyny usieciowanych przez α-aktyninę, które są zdominowane przez wyboczenie filamentu aktynowego29.
Porowatość żelu charakteryzuje się wielkością porów żelu, przez które przepływa przepływ rozpuszczalnika. W przypadku oczyszczonych sieci aktynowych rozmiar oczek, który określa odległość między sieciami poprzecznymi w żelu (w tym przypadku agregaty miozyny), zapewnia również dobre oszacowanie wielkości porów żelu. Rozmiar siatki można wyodrębnić bezpośrednio z obrazów fluorescencyjnych (2D) i jest oceniany na podstawie średniej geometrycznej odległości między parami przeciwstawnych wiązek aktyny w porach żelowych (Rysunek 4B). Ponieważ sieć jest izotropowa aż do początku skurczu, średnie rozmiary oczek w kierunku pionowym (tj. w poprzek grubości) i bocznym (wzdłuż promienia) są takie same, ξ0,
= ξ0,ll = ξ0 (= 67 μm). Ponieważ wiązki aktyny pozostają proste podczas skurczu, rozmiary siatki i porów kurczą się proporcjonalnie do zmian grubości i średnicy żelu. Dla obecnego systemu eksperymentalnego, skurcz w płaszczyźnie (promieniowy) rozpoczyna się po praktycznie zakończeniu skurczu pionowego (nie pokazano), tak że skurcz promieniowy przebiega przy stałej grubości żelu mniejszej niż grubość początkowa o współczynnik ~0,3. W rezultacie, podczas gdy rozmiar oczka w płaszczyźnie skurczu, ξll (t) = r(t)/R, zmniejsza się podczas skurczu promieniowego, gdzie r(t) jest promieniem żelu w czasie t, średni rozmiar oczka w kierunku prostopadłym jest stały, ξ = 20μm23. Te wartości rozmiarów siatki/porów są używane do oceny modułu sprężystości żelu, κ i współczynnika tarcia γ, jak opisano poniżej (Cel [iii], Rysunek 6).
Cel (ii)
Ten cel polega na wykazaniu, że przepływ rozpuszczalnika na zewnątrz jest generowany przez kurczliwość miozyny. Aby śledzić przepływ rozpuszczalnika, do roztworu aktomiozyny dodaje się kulki fluorescencyjne. Koraliki są pasywowane w celu zmniejszenia interakcji między ruchomymi kulkami a siecią aktomiozyny. Ogólnie rzecz biorąc, 1 μl kulek (tabela materiałów) inkubuje się z 5 μm G-aktyną przez 20 minut w temperaturze pokojowej, a nadmiar G-aktyny usuwa się przez odwirowanie (tabela materiałów, szczegółowe informacje znajdują się w sekcji protokołu). Ten krok powtarza się z 10 mg·mL-1 BSA (tabela materiałów). Kulki dodaje się do roztworu białkowego w końcowym rozcieńczeniu 1:10 000 v/v. Ponieważ celem jest umożliwienie kulkom swobodnego poruszania się po porach żelu, ważne jest, aby dostosować średnice kulek do wielkości porów żelu, tak aby ich stosunek wielkości wynosił zawsze <<1. W związku z tym kulki o średnicy 2300 nm są używane do analizy początkowych i pośrednich etapów skurczu (Rysunek 5A,B), gdy średnia wielkość porów jest większa niż 15 μm, a koraliki o średnicy 200 nm są używane, gdy rozmiar porów jest mniejszy (Rysunek 5D-G). Pozycja środka masy koralików jest wyodrębniana za każdym razem, t, (x(t),y(t))koralik, przy użyciu standardowego algorytmu śledzenia cząstek (Tabela materiałów), z którego uzyskuje się trajektorię (Rysunek 5B) i lokalną prędkość koralików, 
, można wywnioskować. Kulki, a tym samym penetrujący rozpuszczalnik, poruszają się średnio w kierunku promieniowym na zewnątrz (Rysunek 5A,B), podczas gdy żel kurczy się do wewnątrz, jak pokazano na podstawie analizy prędkości obrazu cząstek (PIV) (patrz zielone strzałki w Rysunek 6A). Ten ruch radialny można dalej rozwinąć, wyodrębniając prędkość radialną lokalnych kulek, νr, która jest obliczana przez rzutowanie lokalnej prędkości koralików na kierunek radialny zdefiniowany przez wektor jedności, 
, łącząc środek żelu (x0, y0) i pozycję środka masy kulki w czasie t: 
gdzie 
Dane pokazują, że gdy kulki poruszają się na zewnątrz od środka żelu, ich prędkości początkowo rosną, a następnie zwalniają, gdy zbliżają się do granicy żelu (Rysunek 5C). Warto zauważyć, że prędkość kulki może być 20 razy większa niż prędkość promieniowego skurczu żelu (niebieska krzywa w Rysunek 5C). Wypełnione kółka oznaczają czas, w którym kulki opuszczają żel. Koraliki nadal poruszają się po wyjściu z granicy żelu przez pewien czas. Ruch ten nie może wynikać z efektów bezwładności, ponieważ liczba Reynoldsa wynosi <10-4. Prędkość kulki promieniowej zmniejsza się wraz z upływem czasu, wraz ze spadkiem skurczu żelu; Warto zauważyć, że gdy prędkość skurczu promieniowego żelu znacznie się zmniejszyła, prędkość kulek ulega znacznym wahaniom.
Aby sprawdzić, czy te fluktuacje wynikają z porowatej struktury aktomiozyny, sieć śledzi ruch kulek w wyższej rozdzielczości przestrzennej, co jest możliwe, gdy kurczenie się żelu znacznie spowolniło (Rysunek 5D-F). Trajektoria kulek jest rzeczywiście kręta (Rysunek 5D,E), ze znacznymi wahaniami lokalnej prędkości kulek, co odzwierciedla porowatą strukturę żelu - to znaczy, że prędkość lokalna jest najszybsza w pobliżu środka porów i najwolniejsza w pobliżu wiązki aktyny (Rysunek 5F).
Na koniec, obliczenie funkcji korelacji prędkości żelu z prędkością rozpuszczalnika pokazuje, że lokalnie przepływ płynu jest skierowany odwrotnie niż żel kurczący się. Używając lokalnych jasnych punktów w żelu jako markerów odniesienia, można obliczyć ich położenie środka masy dla każdego punktu czasowego, t, (x(t),y(t))żelu, a lokalną prędkość żelu można wyprowadzić: 
. Następnie, dla każdego koralika i pobliskiego punktu w żelu, obliczana jest lokalna korelacja par prędkość kulki i prędkości żelu, aby wyodrębnić kąt θ między dwoma wektorami: 
, where 
oraz 
to lokalne prędkości (wielkość) odpowiednio koralika i żelu. Dane pokazują, że niezależnie od położenia kulki w porach żelu, lokalnie, przepływ płynu jest kierowany w przeciwnym kierunku w stosunku do żelu (Rysunek 5G). Ogólnie rzecz biorąc, wyniki pokazują, że przepływ płynu na zewnątrz jest generowany przez kurczliwość miozyny, zgodnie z oczekiwaniami dla poroelastycznego materiału aktywnego3,7,23,30.
Cel (iii)
Ten cel polega na wykazaniu, że relaksacja naprężeń charakteryzuje się efektywną stałą dyfuzji poroelastycznej, D, która zależy od modułu sprężystości sieci, porowatości i lepkości rozpuszczalnika. Po pierwsze, określa się ilościowo prędkość poprzeczną (w płaszczyźnie) kurczącego się żelu (Rysunek 6A). Po pierwsze, obrazy fluorescencyjne są binaryzowane, a obszar rzutowany żelem w każdym punkcie czasowym t, A (t) jest ekstrahowany. Następnie obliczany jest promień żelu, 
(Rysunek 6B). Na tej podstawie wyprowadza się radialną prędkość skurczu w punkcie czasowym t, 
, jest wyprowadzane, co opisuje prędkość krawędzi żelu (Rysunek 6C). Prędkość krawędziowa pokazuje typowy profil ewolucji czasowej charakteryzujący się początkową fazą liniową, w której prędkość krawędzi wzrasta ze stałą szybkością, 
, aż do osiągnięcia maksymalnej prędkości, νmax, w czasie tmax. Prędkość następnie maleje wykładniczo z charakterystycznym czasem relaksacji, τ, aż do osiągnięcia stanu stabilnego mechanicznie (Rysunek 6C). r max to promień żelu na początku tej fazy relaksacji.
Dla materiału poroelastycznego, czas relaksacji 
, gdzie 
jest efektywną stałą dyfuzji poroelastycznej, κ jest efektywnym elastycznym żelem moduł, a γ to efektywna stała tarcia, która odpowiada za ruch roztworu wodnego przez pory żelu aktynowego. Moduł sprężystości ma jednostki energii na jednostkę objętości i jest odwrotnie proporcjonalny do objętości komórki elementarnej w żelu, określonej przez odległość między sieciami lub rozmiar siatki, tak że 
. Współczynnik tarcia, γ, zależy od fasety porów prostopadłej do przepływu rozpuszczalnika. W przypadku skurczu żelu w płaszczyźnie odpowiednim aspektem porów jest 
, a co za tym idzie, współczynnik tarcia 
, gdzie η oznacza lepkość rozpuszczalnika31,32. Ogólnie rzecz biorąc, otrzymujemy następującą zależność: 
, gdzie odpowiedni rozmiar porów w płaszczyźnie 
jest obliczany na tmax. W sumie otrzymujemy 
, co oznacza, że czas relaksacji powinien skalować się liniowo wraz z lepkością rozpuszczalnika23.
Aby sprawdzić, czy ta zależność jest przestrzegana, eksperymenty są powtarzane z różnymi ilościami glicerolu. Stosowanie glicerolu jest korzystne, ponieważ nie oczekuje się, że wpłynie on na aktywność białek, w szczególności silników miozyny. Ponadto korelacje między lepkością roztworów woda-glicerol a ilością dodanego glicerolu są dostępne w literaturze28. Korelacje te pokazują, że wzrost procentu wagowego glicerolu od 0% do 34% prowadzi do proporcjonalnego wzrostu lepkości roztworu woda-glicerol z ηω do 2,76ηω, gdzie ηω jest lepkością wody w temperaturze 20 °C. W tym zakresie glicerolu i dla tej samej początkowej średnicy kropli, 2R = 2 800 μm, wzrost lepkości wydłuża czas trwania faz polimeryzacji i samoorganizacji sieci, chociaż przyspieszenie liniowe i maksymalna prędkość promieniowa skurczu (νmax) pozostają rażąco niezmienione. Dowody te sugerują, że zarówno reorganizacja sieci (porowatość), jak i aktywność miozyny nie mają wpływu lepkość roztworu23, a wpływ lepkości rozpuszczalnika powinien być zasadniczo odzwierciedlony w czasie potrzebnym do rozluźnienia naprężeń sprężystych. Rzeczywiście, czas relaksacji pokazuje liniową zależność od lepkości roztworu (Rysunek 6D), co sugeruje, że wyprowadzona powyżej zależność skalowania jest przestrzegana, co dodatkowo potwierdza poroelastyczną naturę układu.
Rysunek 1: Schematyczny opis trzech głównych etapów procedury obróbki powierzchni szkła nakrywkowego. (i) Czyszczenie powierzchni szkła (obróbka Piranha) i hydrofilizacja, (ii) silanizacja powierzchni oraz (iii) pasywacja za pomocą mPEG-mal. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.
Rysunek 2: Pasywacja szkiełek nakrywkowych. (A) Czyszczenie i silanizację piranii przeprowadza się w zlewce o pojemności 400 ml przy użyciu domowej roboty uchwytu z politetrafluoroetylenu składającego się z 12 liniowych rowków. (B) Pasywację powierzchniową przeprowadza się na pokrytej parafilmem szalce Petriego. Każde szkiełko nakrywkowe inkubuje się z 1 ml 5 kDa mPEG-mal w stężeniu 4 mg·mL−1 w 1x PBS (tabela materiałów) przez 1 godzinę w temperaturze 22 °C. Hydrofobowa warstwa parafilmu zapewnia, że hydrofilowy roztwór polimeru PEG pozostaje zamknięty na powierzchni szkła przez cały czas inkubacji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.
Rysunek 3: Przeprowadzanie eksperymentu - domowy uchwyt na próbki. Eksperymenty są przeprowadzane w domowym uchwycie na próbki, który pasuje do wymiarów standardowego stolika mikroskopowego. (A) Natłuszczoną przekładkę parafilmu o grubości h (~150 μm) umieszcza się na szkiełku nakrywkowym pasywowanym PEG, a następnie szkiełko nakrywkowe umieszcza się w uchwycie próbki. (B) Roztwór aktomiozyny przygotowuje się na lodzie w probówce Eppendorfa, a 1,1 μl tego roztworu umieszcza się na szkiełku nakrywkowym; następnie (C) na nim umieszcza się drugie szkiełko nakrywkowe pasywowane PEG, a następnie (D) przykręca się uchwyt próbki, aby zatrzymać kroplę, która przyjmuje kształt przypominający dysk. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.
Rysunek 4: Cel porosprężystości (i). Sieć aktomiozyny zachowuje się jak materiał elastyczny. (A) Schematyczne przedstawienie sieci aktomiozyny. (B) Tworzenie sieci aktomyozyny. Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej pokazują, że filamenty aktyny spontanicznie zarodkują i polimeryzują w izotropową połączoną sieć, która z czasem grubieje i ostatecznie kurczy się makroskopowo. Porowatość sieci charakteryzuje się rozmiarem siatki sieci, ξ (podwójna strzałka). (C-E) Skurcz sieci aktomyozyny jest napędzany przez przesuwanie się wiązki włókien aktynowych. (C) Kurczenie się sieci rozpoczyna się na obrzeżach żelu ("P") i rozchodzi się do wewnątrz do masy żelu. Białe strzałki pokazują kierunek skurczu. Środek żelu jest oznaczony literą "C". Obrazy fluorescencyjne pokazują, że agregaty motoryczne miozyny (561 nm, czerwone kropki) są osadzone w sieci aktynowej (488 nm, kolor zielony) i pozostają do niej przyłączone przez cały okres skurczu sieci. (D) Wiązki włókien aktynowych pozostają proste podczas kurczenia się sieci. Stosunek długości konturu, lcont, do odległości od końca do końca, lod końca do końca, w funkcji czasu. (E) Rozkład stosunku długości konturu do odległości od końca do końca przy t = 316 s (kolor czerwony) i t = 327 s (w paski, szary). Wstawka: długość konturu (niebieska) i odległość od końca do końca (biała) typowej wiązki. Warunki: (B,C,E[wstawka]): Obrazy są uzyskiwane za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego z kamerą EMCCD i obiektywem powietrznym 10x/0,3 Ph1 UPlanFL w trybie zwykłym (B) oraz w trybie podwójnego obrazowania po nałożeniu obrazu (C,E[wstawka]). Podziałka wynosi (B,C) 100 μm i (E[wstawka]) 50 μm. Ten rysunek został zreprodukowany za zgodą Ideses et al.23. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.
Rysunek 5: Cel poroelastyczności (ii). Przepływ rozpuszczalnika na zewnątrz jest generowany przez kurczliwość silnika miozyny. (A) Obrazowanie żelu w małym powiększeniu w pośrednich stadiach skurczu: jednoczesne obrazowanie fluorescencyjne kurczącej się sieci aktynowej (488 nm, po lewej) i kulki fluorescencyjne o długości 2300 nm dodane do roztworu (561 nm, po prawej) w funkcji czasu. Okręgi oznaczają pozycje czterech koralików. Strzałki wyznaczają globalny kierunek ruchu ściegu. (B) Przedstawione są trajektorie dziewięciu wybranych koralików. Strzałki wyznaczają globalny kierunek promieniowy ruchu koralików. Krzyżyk w kółku oznacza środek żelu (x0,y0) (C) lokalną prędkość kulki promieniowej νr (otwarte okręgi) i (radialną) prędkość krawędzi żelu (niebieskie kropki) w funkcji czasu. Wypełnione okręgi wskazują czas, w którym dany koralik wychodzi poza granicę żelu. (D-F) Rozwiązywanie porowatości sieci i ruchu rozpuszczalnika przez pory żelu w zaawansowanych stadiach skurczu. (D) Obrazy epifluorescencyjne żelu kurczącego się i kulki fluorescencyjne o średnicy 200 nm dodane do roztworu. Zarówno aktyna, jak i kulki są wzbudzane przy długości fali 488 nm. Czerwone kółka podążają za położeniem koralika z czasem. Szara linia oznacza granicę żelu. (E) Trajektoria koralika pokazana w (D). W pokazanym polu żel kurczy się średnio w kierunku dołu. Współrzędne są mierzone względem początku układu współrzędnych kamery. (F) Lokalna prędkość kulki odzwierciedla porowatą strukturę żelu. Góra: Lokalna prędkość ściegu (otwarte okręgi), lokalna prędkość żelu (szare kółka) i prędkość krawędzi żelu (niebieskie kółka) w funkcji czasu. Dół: Migawki pokazują położenie ściegu w wybranych czasach. Koralik jest oznaczony czerwonym kółkiem. Przerywana linia oznacza czas, w którym koralik wychodzi z żelu. (G) Rozkład kątów między miejscowym żelem a lokalnymi prędkościami kulek. Warunki: Obrazy są pozyskiwane w odwróconym mikroskopie fluorescencyjnym z kamerą EMCCD i (A) obiektywem Plan-NEOFLUAR 2,5x/0,075 oraz (D,F) obiektywem 10x/0,3 Ph1 UPlanFL. Podziałki wynoszą (A) 400 μm, (D) 100 μm, (F) i 50 μm. Ten rysunek został zreprodukowany za zgodą Ideses et al.23. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.
Rysunek 6: Cel porosprężystości (iii). Relaksacja naprężeń charakteryzuje się efektywną stałą dyfuzji poroelastycznej. (A) Obrazy fluorescencyjne z widokiem z góry kurczącego się żelu aktomiozyny w małym powiększeniu od czasu mieszania do stanu ustalonego. Pole prędkości (zielone strzałki) jest wyodrębniane z analizy PIV. Obrazy są rejestrowane za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego z kamerą EMCCD i obiektywem Plan-NEOFLUAR 2,5x/0,075. Długość fali wzbudzenia wynosi 488 nm (aktyna). Podziałka skali wynosi 500 μm. (B) promień żelu i (C) promieniowa prędkość skurczu, 
(tj. prędkość krawędzi żelu w funkcji czasu). a oznacza przyspieszenie, vmax oznacza prędkość maksymalną, a τ to charakterystyczny czas relaksacji. (D) Sieci aktomiozyny zachowują się jak poroelastyczny materiał aktywny. 
i lepkość rozpuszczalnika, η, w porównaniu z procentem wagowym glicerolu (wt%). Ilości są znormalizowane do ich wartości przy 0% wag. glicerolu. Początkowy promień żelu wynosi R = 1 400 μm. Słupki błędów są odchyleniami standardowymi wartości eksperymentalnych. Ten rysunek został zreprodukowany za zgodą Ideses et al.23. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
W tej pracy zastosowano podejście do rekonstytucji in vitro do badania poroselastyczności żeli z aktomiozyną w kontrolowanych warunkach. Określa się ilościowo dynamikę żelu aktomiozyny i wbudowanego rozpuszczalnika, za pomocą której wykazano porosprężystość sieci. Omawiamy również wyzwania eksperymentalne, typowe pułapki i znaczenie dla mechaniki cytoszkieletu komórkowego.
Chcielibyśmy podziękować Dinie Aranovich za oczyszczenie i etykietowanie białek. G.L. jest wdzięczny izraelskiemu Ministerstwu Nauki, Technologii i Przestrzeni za stypendium doktoranckie Jabotinsky'ego. A.B.G. jest wdzięczny Izraelskiej Fundacji Naukowej (grant 2101/20) oraz Ministerstwu Nauki i Technologii - Państwo Izrael (grant 3-17491) za wsparcie finansowe.
| (3-merkaptopropylo)trimetoksysilan | Sigma-Aldrich Company | 175617 | Przechowywany w atmosferze argonu w temperaturze 4 &; C |
| Kwas octowy | Bio-Lab ltd | 1070521 | |
| Alexa-Fluor 488 | Invitrogene | A10254 | Rozcieńczony DMSO, przechowywany w atmosferze argonu w temperaturze -20 &; C |
| Alexa-Fluor 647 | Invitrogene | A20347 | Rozcieńczony DMSO, przechowywany w atmosferze argonu w temperaturze -20 & stopni; C |
| BSA | Sigma -Aldrich Company | A3059 | Przechowywany w temperaturze 4 & stopni; C |
| Catalase | Sigma -Aldrich Company | C9322 | Butelka zapasowa jest przechowywana w suchej atmosferze (żel krzemionkowy) w temperaturze -20 &; C |
| Szkiełka nakrywkowe | Mezel-glaser | CG2222-1.5 | Przechowywane w miliQ-wodzie po zabiegu Piranha i stosowane w ciągu 3 tygodni |
| Kinaza kreatynowa | Roche Life Science Products | 10736988001 | Przygotowane na świeżo w buforze glicyny, przechowywane na lodzie i zużyte w ciągu 3 dni. Butelka bulionowa jest przechowywana w suchej atmosferze (żel krzemionkowy) w temperaturze 4 stopni; C |
| Fosforan kreatyny | Roche Life Science Products | 10621714001 | Po rozpuszczeniu należy przechowywać w temperaturze -20 & stopni; C i zużyć w ciągu 3 miesięcy. Butelka bulionowa jest przechowywana w atmosferze argonu i przechowywana w temperaturze 4 & stopni; C |
| DTT | Roche Life Science Products | 10708984001 | Po rozpuszczeniu należy przechowywać w temperaturze -20 ° C i zużyte w ciągu 3 miesięcy |
| System jednoczesnego obrazowania w podwójnym widoku | Fotometria | DV2-CUBE | EGTA MP Biomedicals 195174 Kamera EM-CCD Andor Technology Ltd DV 887 EM-CCD|
| Kamera Fotometria Evolve Delta Ethanol Bio-Lab Ltd 525050300 Lampa fluorescencyjna Rapp Optoelektroniczna Fluoresbrite | |||
| YG | Microspheres Polysciences | 17151-10 | o średnicy 200 nm |
| Glukoza | ICN Biomedicals Inc | 194024 | Po rozpuszczeniu należy przechowywać w temperaturze -20 & stopni; C i zużyć w ciągu 3 miesięcy. |
| Oksydaza glukozowa | Sigma-Aldrich Company | G7141 | przechowywana w -20 ° C i zużyć w ciągu 3 miesięcy. Proszek wyjściowy jest przechowywany w atmosferze argonu i utrzymywany w temperaturze -20 ° C |
| Glycerol | ICN Biomedicals Inc | 800687 | |
| Glycine | MP Biomedicals | 808822 | |
| Nadtlenek wodoru | Sigma-Aldrich Company | 216763 | przechowywany w temperaturze 4 stopni; C |
| KCl | EMD Millipore Corp. | 529552 | |
| Metanol | Bio-Lab ltd | 1368052100 | |
| MgCl2 | EMD Millipore Corp. | 442615 | |
| Mikroskop | Leica Microsystems | DMI3000 | |
| mPEG-mal | Nanocs | PG1-ML-5k | Mw = 5000 Da. Podzielone wagowo na małe partie. Przechowywany w atmosferze argonu w temperaturze -20 & deg; C |
| Mikrosfery Nilu czerwone | Spherotech | FP-2056-2 | Średnica 2300 nm |
| Obiektyw (10x) | Leica Niemcy | HC PL AP0 | UPlanFL Przysłona numeryczna = 0,3 |
| Obiektyw (2,5x) | Leica Niemcy | 506304 | Plan-NEOFLUAR Apertura numeryczna = 0,075 |
| Piec | WTC Spoiwo | ||
| Parafilm | Amcor | PM-996 | |
| PBS Bufor | Sigma-Aldrich Company | P4417 | |
| Sterownik migawki | Vincet Associates | VMM D1 | |
| Żel krzemionkowy | Merck | 1.01907.5000 | |
| Sonicator | Elma | Elmasonic P | |
| Kwas siarkowy | Odczynniki Carlo Erba | 410301 | |
| DV2 Dwukanałowy system obrazowania symultanicznego | Fotometria | ||
| TRIS | MP Biomedicals | 819620 | |
| Spektrofotometr UV-VIS | Pharmacia | Ultraspec 2100 pro | |
| MICROMAN E | Gilson | FD10001 | 1– 10 uL |
| MATLAB R2017b | Kwantyfikacja danych MathWorks | ||
| MetaMorph | Urządzeniamolekularne Oprogramowanie | sterujące systemu obrazowania optycznego; kwantyfikacja danych (analiza śledzenia cząstek, rozmiar siatki sieci) |
