Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Mechanika (poro-)elastycznych kurczliwych sieci aktomyozyny jako modelowy układ cytoszkieletu komórkowego

1.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64377

⸱

10 marca 2023

 ,  ,  , 
1Department of Chemical Engineering, Ben Gurion University of the Negev, 2Department of Chemical Engineering, Ilse Kats Institute for Nanoscale Science and Technology, Ben Gurion University of the Negev

W tym artykule

Podsumowanie

W tej pracy zastosowano podejście do rekonstytucji in vitro do badania poroselastyczności żeli z aktomiozyną w kontrolowanych warunkach. Określa się ilościowo dynamikę żelu aktomiozyny i wbudowanego rozpuszczalnika, za pomocą której wykazano porosprężystość sieci. Omawiamy również wyzwania eksperymentalne, typowe pułapki i znaczenie dla mechaniki cytoszkieletu komórkowego.

Streszczenie

Komórki mogą aktywnie zmieniać swoje kształty i stawać się ruchliwe, co zależy od ich zdolności do aktywnej reorganizacji swojej wewnętrznej struktury. Cecha ta przypisuje się mechanicznym i dynamicznym właściwościom cytoszkieletu komórkowego, w szczególności cytoszkieletu aktomiozyny, który jest aktywnym żelem polarnych włókien aktynowych, silników miozyny i białek pomocniczych, które wykazują wewnętrzne właściwości skurczowe. Zwykle przyjęty pogląd jest taki, że cytoszkielet zachowuje się jak materiał lepkosprężysty. Jednak model ten nie zawsze może wyjaśnić wyniki eksperymentalne, które są bardziej zgodne z obrazem opisującym cytoszkielet jako poroelastyczny materiał aktywny - elastyczną sieć osadzoną w cytozolu. Gradienty kurczliwości generowane przez silniki miozyny napędzają przepływ cytozolu przez pory żelu, co sugeruje, że mechanika cytoszkieletu i cytozolu jest ściśle sprzężona. Jedną z głównych cech porosprężystości jest dyfuzyjne rozluźnienie naprężeń w sieci, charakteryzujące się efektywną stałą dyfuzji, która zależy od modułu sprężystości żelu, porowatości i lepkości cytozolu (rozpuszczalnika). Ponieważ komórki mają wiele sposobów regulowania swojej struktury i właściwości materiałowych, nasza obecna wiedza na temat sprzężenia mechaniki cytoszkieletu i dynamiki przepływu cytozolu pozostaje słabo poznana. W tym przypadku zastosowano podejście oparte na rekonstytucji in vitro w celu scharakteryzowania właściwości materiałowych poroelastycznych żeli aktomiozyny jako systemu modelowego dla cytoszkieletu komórkowego. Skurcz żelu jest napędzany przez kurczliwość ruchową miozyny, co prowadzi do pojawienia się przepływu penetrującego rozpuszczalnika. W artykule opisano, jak przygotować te żele i przeprowadzić eksperymenty. Omawiamy również, jak mierzyć i analizować przepływ rozpuszczalnika i kurczenie się żelu zarówno w skali lokalnej, jak i globalnej. Podano różne relacje skalowania używane do kwantyfikacji danych. Na koniec omówiono wyzwania eksperymentalne i typowe pułapki, w tym ich znaczenie dla mechaniki cytoszkieletu komórkowego.

Wprowadzenie

Żywe komórki mają unikalne właściwości mechaniczne. Oprócz zdolności do pasywnego reagowania na przyłożone siły, są one również zdolne do aktywnego generowania sił w odpowiedzi na bodźce zewnętrzne1. Te cechy, które są niezbędne dla różnych procesów komórkowych, zwłaszcza podczas ruchliwości komórek, przypisuje się przede wszystkim mechanicznym i dynamicznym właściwościom cytoszkieletu komórkowego, zwłaszcza cytoszkieletu aktomiozyny, który jest aktywnym żelem polarnych włókien aktynowych, silników molekularnych miozyny i białek pomocniczych. Te sieci aktomiozyny wykazują wewnętrzne właściwości samoorganizacji i kurczenia się napędzane przez białka motoryczne miozyny, które sieciują włókna aktynowe i aktywnie generują naprężenia mechaniczne w sieci napędzanej hydrolizą ATP2.

Przeprowadzono liczne badania eksperymentalne i teoretyczne w celu zbadania właściwości materiału cytoszkieletu3. Powszechnie przyjęty pogląd jest taki, że cytoszkielet zachowuje się jak materiał lepkosprężysty4. Oznacza to, że w krótkich skalach czasowych cytoszkielet zachowuje się jak materiał elastyczny, a w długich skalach czasowych zachowuje się jak lepki płyn ze względu na sieciujące białka i odłączanie motoryczne miozyny (i ponowne przyłączanie), co pozwala sieci na dynamiczny obrót. Jednak w wielu sytuacjach model lepkosprężysty nie jest w stanie opisać wyników eksperymentalnych, które są bardziej spójne z obrazem opisującym cytoszkielet i, bardziej ogólnie, cytoplazmę komórki opisywaną jako poroelastyczny materiał aktywny5,6. Dwie główne cechy charakteryzują tego typu materiały. (i) Pierwszą główną cechą jest generowanie przepływu penetrującego cytozolu ("rozpuszczalnika") przez pory żelu przez gradienty kurczliwości napędzane przez silniki miozyny, co leży u podstaw procesów takich jak pęcherzyki komórkowe7, motility8 i oscylacje kształtu komórki9. Pojawienie się takich przepływów cytozolowych może być miejscowe, w przypadku pęcherzyków, lub globalne, jak w ruchliwości komórek. W tym drugim przypadku naprężenia kurczliwe działające na tył komórki napędzają przepływ płynu cytozolowego w kierunku przodu komórki, co uzupełnia pulę białka potrzebną do złożenia lamellipodiów8. (ii) Drugą główną cechą jest to, że relaksacja naprężeń jest dyfuzyjna i charakteryzuje się efektywną stałą dyfuzji, która zależy od modułu sprężystości żelu, porowatości żelu i lepkości rozpuszczalnika5. Stała dyfuzji poroelastycznej określa, jak szybko system reaguje na przyłożone naprężenie. Wyższe stałe dyfuzji odpowiadają szybszej redystrybucji naprężeń. To z kolei określa, ile czasu zajmuje redystrybucja wewnątrzkomórkowego płynu cytozolowego w komórce po zastosowanym naprężeniu mechanicznym, czy to zewnętrznym, czy wewnętrznym, takim jak aktywne naprężenia kurczliwe generowane przez silniki miozyny. Przykłady te pokazują zatem, że mechanika cytoszkieletu i cytozolu jest ściśle ze sobą sprzężona i nie może być traktowana oddzielnie3.

Ponieważ komórki mogą regulować swoje właściwości mechaniczne na różne sposoby, wzajemne oddziaływanie między mechaniką sieci a dynamiką przepływu płynów pozostaje słabo poznane. Skutecznym alternatywnym podejściem jest użycie systemów odtworzonych in vitro, które pozwalają na pełną kontrolę nad różnymi mikroskopijnymi składnikami i parametrami systemu, co sprawia, że te systemy modelowe są optymalne do analizy fizycznej10,11. Podejście to zostało z powodzeniem zastosowane do zbadania wpływu składu białek i geometrii systemu na ruchliwość opartą na aktynie12,13,14,15,16,17,18, wzorzec 2D sieci aktomiozyny19,20,21,22, oraz wzajemne oddziaływanie między kurczliwością sieci a dynamiką przepływu płynów w poroelastycznych żelach z aktomiozyny, na czym skupia się ten artykuł23.

W tym manuskrypcie omówiono przygotowanie kurczliwych elastycznych sieci aktomiozyny o kontrolowanych wymiarach i właściwościach materiału na podstawie pracy Ideses et al.23. Dynamika żelu kurczącego się i odsączonego rozpuszczalnika jest analizowana i określana ilościowo, dzięki czemu wykazano, że te żele z aktomiozyną można opisać jako poroelastyczny materiał aktywny. Badanie wpływu lepkości rozpuszczalnika na dyfuzyjność naprężeń dodatkowo potwierdza poroelastyczną naturę tych sieci. Podano różne relacje skalowania używane do kwantyfikacji danych. Na koniec omówiono również wyzwania eksperymentalne, typowe pułapki i znaczenie wyników eksperymentalnych dla cytoszkieletu komórkowego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Obróbka powierzchni szkła i pasywacja:

UWAGA: Ta sekcja zawiera trzy główne kroki (zobacz Rysunek 1): (i) czyszczenie i hydrofilizacja, (ii) silanizacja, oraz (iii) pasywacja powierzchni.

  1. Czyszczenie i hydrofilizacja
    1. Użyj roztworu Piranha do czyszczenia powierzchni szklanych.
      UWAGA: Roztwór piranii jest mieszaniną 30%H2O2i 70% H2SO4 (Tabela materiałów). Jego głównym celem jest usunięcie zanieczyszczeń organicznych z powierzchni szkiełek nakrywkowych i odsłonięcie grup OH na powierzchni szkła. W ten sposób szklana powierzchnia staje się hydrofilowa.
    2. Umieść 10-12 #1.5 (22 mm x 22 mm) szklanych szkiełek nakrywkowych (tabela materiałów) w domowym uchwycie z politetrafluoroetylenu (powierzchnia podstawy: 5.5 cm x 5.5 cm). Przenieść uchwyt z politetrafluoroetylenu do zlewki o pojemności 400 ml (tabela materiałów) i inkubować go z 300 ml roztworu piranii przez 2 godziny. Wykonaj ten krok na lodzie i w kapturze chemicznym.
      UWAGA: Kij z politetrafluoroetylenu przykręcony do podstawy uchwytu ma 12 cm długości, jest dłuższy niż zlewka (11 cm), co pozwala na bezpieczne przenoszenie/wyciąganie uchwytu do/z roztworu Piranha. Ponieważ roztwór Piranha może być nadal wysoce reaktywny i bardzo gorący, konieczne jest zatrzymanie reakcji. Najprostszym sposobem na zatrzymanie reakcji jest wlanie roztworu Piranha do (kranowej) wody, aby uzyskać (co najmniej) 50-krotne rozcieńczenie. Roztwór można następnie bezpiecznie wyrzucić. Nigdy nie przechowuj zużytego roztworu Piranha w zamkniętej szklanej butelce – może to skończyć się eksplozją butelki.
    3. Przenieś uchwyt z politetrafluoroetylenu do czystej zlewki wypełnionej świeżą, podwójnie destylowaną wodą (DDW), aby zmyć nadmiar piranii z szkiełek nakrywkowych.
    4. Przenieść zlewkę do łaźni sonikacyjnej (Tabela materiałów) i poddać sonizacji przy 80 Hz z pełną mocą przez 10 minut w temperaturze 25 °C. Powtórz ten krok jeszcze dwa razy ze świeżym DDW. Za każdym razem używaj świeżego DDW.
  2. Silanizacja
    1. Przenieść uchwyt do czystej zlewki (400 ml) wypełnionej 300 ml czystego metanolu (tabela materiałów), a następnie do łaźni sonikacyjnej (tabela materiałów). Sonikować przy 80 Hz z pełną mocą przez 30 minut w temperaturze 25 °C.
    2. Po sonikacji przenieść posiadacza do roztworu silanu przygotowanego przy użyciu 15 ml DDW, 3,1 ml kwasu octowego (tabela materiałów), 340 ml metanolu i 7,6 ml silanu ((3-merkaptopropylo) trimetoksysilanu) (tabela materiałów). Uszczelnij zlewkę parafilmem i przechowuj ją w lodówce w temperaturze 4 °C przez noc.
      UWAGA: Przygotowanie i obchodzenie się z roztworem silanu musi odbywać się w okapie chemicznym. Po etapie silanizacji zużyty roztwór silanu (odpad) należy umieścić w dedykowanej szklanej butelce w kapturze chemicznym.
    3. Następnego dnia przenieś uchwyt do czystej zlewki wypełnionej 300 ml czystego metanolu na 15 s. Następnie przenieść uchwyt do czystej zlewki, nie wcześniej niż przed wysuszeniem dna uchwytu z politetrafluoroetylenu w celu usunięcia nadmiaru metanolu. Przenieść zlewkę do suszarki (tabela materiałów) w celu wysuszenia szklanych szkiełek nakrywkowych przez 5 minut w temperaturze 120 °C.
  3. Pasywacja powierzchni za pomocą obojętnego polimeru
    1. Uzyskać pasywację powierzchni poprzez inkubację szklanych szkiełek nakrywkowych z obojętnym polimerem (tabela materiałów). Do każdego eksperymentu weź dwa szkiełka nakrywkowe i umieść je na szalce Petriego pokrytej warstwą parafilmu wstępnie oczyszczoną etanolem (EtOH) (DDW/EtOH: 30/70 obj./obj.) (Tabela materiałów).
    2. Inkubować każde szkiełko nakrywkowe z 1 ml maleimidu glikolu metoksypolietylenowego o masie cząsteczkowej 4 mg·mL−1 5 kDa (mPEG-mal, Mw = 5 kDa) (tabela materiałów) w 1 x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) (tabela materiałów) przez 1 godzinę w temperaturze 22 °C.
      UWAGA: Umieszczenie szkiełek nakrywkowych na hydrofobowej warstwie parafilmu ogranicza hydrofilowy roztwór polimeru PEG do powierzchni szklanego szkiełka nakrywkowego. Czas inkubacji ma kluczowe znaczenie dla osiągnięcia optymalnej pasywacji. Czas inkubacji wynosi od 45 minut do 2 godzin. Powyżej tego czasu inkubacji powierzchnia szklanych szkiełek nakrywkowych może ulec zniszczeniu, co prowadzi do adhezji białek i utraty przezroczystości.
    3. Pod koniec procesu inkubacji przepłukać każde szkiełko nakrywkowe 5 ml DDW i wysuszyć strumieniemN2 (gazu). Nie suszyć szkiełek nakrywkowych w próżni. Ponieważ szkiełka nakrywkowe muszą być mokre po pasywacji, natychmiast nałóż 1 ml 10 mM Tris na pegylowane powierzchnie. Szkiełka nakrywkowe należy zużyć w ciągu 2 godzin
      UWAGA: Poszczególne kroki należy wykonywać w komorze z przepływem laminarnym, aby zapobiec zanieczyszczeniu powierzchni szkła.

2. Oczyszczanie białka

  1. Oczyść G-aktynę z acetonu w proszku z mięśni szkieletowych królika za pomocą metody filtracji żelowej24.
    1. Oczyszczanie aktyny trwa 1 tydzień. Oczyszczoną G-aktynę należy przechowywać w buforze G (5 mM Tris pH 7,8, 0,01% NaN3, 0,1 mM CaCl2, 0,2 mM ATP i 1 mM DTT) i przechowywać ją na lodzie. Roztwór należy zużyć w ciągu 2 tygodni.
      UWAGA: Wymieniaj lód co kilka dni.
    2. Oznacz aktynę barwnikiem fluorescencyjnym modyfikowanym maleimidem16 (Tabela materiałów). Oczyść faszynę GST w oparciu o metodę Ono et al.25. Błyskawiczne zamrożenie obu białek w cieczyN2 i przechowywanie w temperaturze -80 °C.
  2. Użyj standardowego protokołu, aby oczyścić miozynę II z mięśni szkieletowych królika26. Oczyszczony bufor zapasowy miozyny II (dimery) zawiera 10 mM Tris pH 7,4, 0,5 M KCl i 35% w/v sacharozy. Błyskawiczne zamrożenie miozyny w cieczy N2 i przechowywanie w temperaturze -80 °C.
    UWAGA: Wysokie stężenie KCl utrzymuje silniki miozyny w postaci dimerycznej, podczas gdy wysoki procent sacharozy zapewnia, że aktywność silników nie jest utrudniona po zamrożeniu. Używaj dedykowanej pipety do pracy z lepkimi płynami podczas pracy z roztworami podstawowymi miozyny II (tabela materiałów).
    1. Oznacz dimery miozyny II barwnikiem fluorescencyjnym (Tabela materiałów) na parach zmodyfikowanych reszt cysteiny19,27. W tym celu użyj mutanta RLC A żołądka kurzego26. Błyskawiczne zamrożenie znakowanej miozyny II w cieczy N2 i przechowywanie w temperaturze -80 °C.
      UWAGA: Ta procedura znakowania zapewnia, że znakowana miozyna jest aktywna jako natywne białko miozyny II.
  3. Użyj spektrofotometru UV-Vis (tabela materiałów), aby zmierzyć absorbancję podstawowych roztworów białkowych i wydedukuj stężenia białek zgodnie z prawem Beera-Lamberta, używając następujących współczynników ekstynkcji: G-aktyna (ε290 = 26 460 M−1·cm−1), GST-faszyna (ε280 = 99 330 M−1·cm−1), dimer miozyny II (ε280 = 268 800 M−1·cm−1) i mutant RLC A (ε280 = 3,960 M−1·cm−1)19.

3. Przygotowanie próbki

UWAGA: Polimeryzuj monomery aktyny w obecności dużych agregatów silników miozyny II i silnego pasywnego sieciera sieciującego faszynę, aby wytworzyć makroskopowo kurczliwe elastyczne sieci aktomiozyny19,23. Dodanie kulek fluorescencyjnych do roztworu pozwala na śledzenie przepływu rozpuszczalnika podczas skurczu żelu.

  1. Roztwór białkowy ("aktomiozyna")
    1. Z wyjątkiem G-aktyny, białka należy przechowywać w temperaturze -80°C w małych porcjach i rozmrozić w temperaturze 37°C przed użyciem. Całkowita objętość roztworu aktomiozyny wynosi 40 μl.
    2. Przygotować roztwór, mieszając 10 mM Tris pH 7,4, 2 mM MgCl2, 25 mM KCl, 1 mM ATP, system regenerujący ATP (0,5 mg·mL−1 kinaza kreatynowa i 5 mM fosforan kreatyny), 200 μM EGTA (chelaty jony Ca2+), roztwór przeciwwybielający (0,1 mg·mL−1 oksydazy glukozowej, 0,018 mg·mL−1 katalaza i 5 mg·mL−1 glukozy), 5 μM G-aktyna, 280 nM GST-faszyna i 1,67 nM miozyna II. Zawartość procentowa znakowanej G-aktyny wynosi 5% (procent molowy).
      UWAGA: Użyj niskiego procentu znakowanej G-aktyny, aby uniknąć nasycenia sygnału fluorescencyjnego w zaawansowanych stadiach skurczu żelu.
  2. Przygotowanie agregatów motorycznych miozyny II
    1. Dodaj silniki miozyny do roztworu białkowego w postaci agregatów. Aby utworzyć duże agregaty miozyny (150 dimerów miozyny/agregat), rozcieńczyć roztwór podstawowy miozyny 10 mM Tris pH 7,4, aby osiągnąć końcowe stężenie 25 mM KCl.
    2. Rozcieńczony roztwór miozyny należy przechowywać przez 10 minut w temperaturze pokojowej (RT), a następnie przenieść go do lodu do czasu użycia. Silniki są w pełni aktywne do 2 godzin.
  3. Pomiar przepływu rozpuszczalnika
    1. Aby śledzić przepływ rozpuszczalnika przez pory żelu, dodaj kulki fluorescencyjne do roztworu aktomiozyny. Zmniejsz interakcję między kulkami a siecią aktomiozyny poprzez pasywację kulek. Praktycznie należy inkubować 1 μl kulek (tabela materiałów) z 5 μM G-aktyną przez 20 minut w temperaturze pokojowej, a następnie usunąć nadmiar G-aktyny przez odwirowanie (tabela materiałów) (warunki: 6 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C).
    2. Powtórz ten krok z albuminą surowicy bydlęcej (BSA) o stężeniu 10 mg·mL−1 (tabela materiałów), aby zablokować (ewentualnie) pozostałą niepokrytą powierzchnię. W eksperymentach należy stosować kulki w końcowym rozcieńczeniu 1:10 000 obj.
      UWAGA: Ważne jest, aby dostosować średnicę kulek do wielkości porów żelu tak, aby stosunek wielkości koralików do porów wynosił <1 na wszystkich etapach.
  4. Wpływ lepkości roztworu
    1. Kontrolować lepkość roztworu, dodając glicerol (tabela materiałów) do roztworu aktomiozyny. Dodanie glicerolu w procentach wagowych w zakresie od 0% do 34% powoduje odpowiedni wzrost lepkości roztworu od ηω do 2,76 ηω, gdzie ηω jest lepkością wody w temperaturze 20 °C28.
      UWAGA: Podczas pracy z glicerolem konieczne jest użycie dedykowanej pipety do pracy z lepkim płynem (tabela materiałów).

4. Przeprowadzanie eksperymentu

  1. Domowa obsługa uchwytu na próbki
    1. Weź jedno z pasywowanych PEG szkiełek nakrywkowych, umieść na nim natłuszczoną przekładkę z parafilmu i umieść ją w uchwycie na próbkę.
      UWAGA: Przekładkę parafilmu można wymienić na dowolną przekładkę.
  2. Przygotowanie roztworu aktomiozyny
    1. Przygotować roztwór aktomiozyny na lodzie w probówce mikrowirówkowej, łącząc różne mikroskopijne składniki, dodając agregaty motoryczne miozyny II i dodając EGTA na końcu. Dobrze wymieszaj roztwór. Dodanie EGTA inicjuje polimeryzację sieci aktomiozyny, która wyznacza czas rozpoczęcia eksperymentu.
  3. Umieścić 1,1 μl tego roztworu na szkiełku nakrywkowym zamontowanym na uchwytu, a następnie umieścić drugie szkiełko nakrywkowe na wierzchu. Przykręć uchwyt, aby uszczelnić próbkę. Proces ten lekko ściska kroplę, która przyjmuje kształt przypominający dysk. Średnice kropli wahają się od 2 800 do 3 000 μm.
  4. Umieść uchwyt na próbkę na mikroskopie i rozpocznij akwizycję. Przygotuj mikroskop z wyprzedzeniem, aby skrócić początkowy czas akwizycji. Zwykle zajmuje to 1-2 minuty po wymieszaniu, aby rozpocząć obrazowanie próbki.

5. Techniki mikroskopowe

  1. Zobrazuj próbki za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego (Tabela materiałów) sterowanego przez dedykowane oprogramowanie (Tabela materiałów).
    1. Użyj małych powiększeń obiektywu Plan-NEOFLUAR (tabela materiałów) 2,5x/0,075, aby uwidocznić cały obszar żelu i śledzić jego makroskopowe kurczenie się w czasie.
    2. Użyj obiektywu 10x/0,3 Ph1 UPlanFL (tabela materiałów), aby scharakteryzować porowatość i strukturę sieci oraz śledzić samoorganizację i kurczenie się sieci w czasie.
      UWAGA: Ten cel jest również przydatny do lokalizacji agregatów motorycznych miozyny II w sieci i śledzenia ruchu kulek fluorescencyjnych przez pory żelu. Większe powiększenia mogą być stosowane kosztem zmniejszonego pola widzenia, co jest jeszcze bardziej znaczące w trybie obrazowania dwukolorowego (Table of Materials).
  2. Wzbudzić próbki przy długości fali 488 nm (aktyna/kulki fluorescencyjne) i 561 nm (agregaty motoryczne miozyny/kulki fluorescencyjne). Rejestruj obrazy z prędkością 100 ms na klatkę za pomocą dedykowanego oprogramowania (Tabela materiałów) w trybie strumieniowym za pomocą kamery EMCCD (Table of Materials) z urządzeniem do zwielokrotniania elektronów (EMCCD).
    UWAGA: Intensywność lampy fluorescencyjnej (tabela materiałów) powinna być utrzymywana na najniższej możliwej wartości, aby uniknąć nasycenia sygnału podczas kurczenia się sieci.
  3. Jednoczesne obrazowanie dwukolorowe
    1. Użyj tego trybu do dwóch celów: (i) wykrywania lokalizacji agregatów motorycznych miozyny w sieci aktynowej oraz (i) charakteryzowania przepływu rozpuszczalnika na zewnątrz wewnątrz i na zewnątrz podczas skurczu sieci.
    2. Wzbudzić silniki aktyny i miozyny II odpowiednio przy 488 nm i 561 nm i zarejestrować obrazy jednocześnie na kamerze EMCCD (Tabela materiałów) za pomocą aparatury z podwójną emisją (Tabela materiałów). Użyj tego samego systemu obrazowania, aby jednocześnie obrazować żel aktynowy (488 nm) i kulki fluorescencyjne (561 nm).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W każdym eksperymencie wykorzystuje się dwie szklane lamelle. Lamelle szklane są czyszczone i pasywowane polimerami PEG. Pasywacja jest niezbędna, aby zapobiec przyleganiu rozpuszczonych białek do szklanych powierzchni w początkowych etapach eksperymentu oraz aby zminimalizować oddziaływanie kurczącej się sieci ze ściankami szklanymi. Brak skutecznej pasywacji może prowadzić do nieefektywnego skurczu, a w skrajnych przypadkach może nawet hamować tworzenie sieci aktynowej.

...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym przypadku zastosowano podejście in vitro w celu scharakteryzowania mechaniki poroelastycznych żeli aktomiozyny jako modelowego układu cytoszkieletu komórkowego i, bardziej ogólnie, cytoplazmy komórkowej, która, jak wykazano, zachowuje się jak materiał poroelastyczny 3,5. Reologia cytoszkieletu komórkowego (cytoplazmy) została scharakteryzowana przez stałą dyfuzji poroelastycznej, która określa, ile czasu zajmuje redystrybucja wewnątrzkomórkowego pł...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować Dinie Aranovich za oczyszczenie i etykietowanie białek. G.L. jest wdzięczny izraelskiemu Ministerstwu Nauki, Technologii i Przestrzeni za stypendium doktoranckie Jabotinsky'ego. A.B.G. jest wdzięczny Izraelskiej Fundacji Naukowej (grant 2101/20) oraz Ministerstwu Nauki i Technologii - Państwo Izrael (grant 3-17491) za wsparcie finansowe.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
(3-merkaptopropylo)trimetoksysilanSigma-Aldrich Company175617Przechowywany w atmosferze argonu w temperaturze 4 &; C 
Kwas octowyBio-Lab ltd1070521
Alexa-Fluor 488InvitrogeneA10254Rozcieńczony DMSO, przechowywany w atmosferze argonu w temperaturze -20 &; C 
Alexa-Fluor 647InvitrogeneA20347Rozcieńczony DMSO, przechowywany w atmosferze argonu w temperaturze -20 & stopni; C 
BSASigma -Aldrich CompanyA3059Przechowywany w temperaturze 4 & stopni; C 
CatalaseSigma -Aldrich CompanyC9322Butelka zapasowa jest przechowywana w suchej atmosferze (żel krzemionkowy) w temperaturze -20 &; C
Szkiełka nakrywkoweMezel-glaserCG2222-1.5Przechowywane w miliQ-wodzie po zabiegu Piranha i stosowane w ciągu 3 tygodni
Kinaza kreatynowaRoche Life Science Products10736988001Przygotowane na świeżo w buforze glicyny, przechowywane na lodzie i zużyte w ciągu 3 dni. Butelka bulionowa jest przechowywana w suchej atmosferze (żel krzemionkowy) w temperaturze 4 stopni; C
Fosforan kreatynyRoche Life Science Products10621714001Po rozpuszczeniu należy przechowywać w temperaturze -20 & stopni; C i zużyć w ciągu 3 miesięcy. Butelka bulionowa jest przechowywana w atmosferze argonu i przechowywana w temperaturze 4 & stopni; C
DTTRoche Life Science Products10708984001Po rozpuszczeniu należy przechowywać w temperaturze -20 ° C i zużyte w ciągu 3 miesięcy
System jednoczesnego obrazowania w podwójnym widoku FotometriaDV2-CUBE
YGMicrospheres Polysciences17151-10o średnicy 200 nm
GlukozaICN Biomedicals Inc194024Po rozpuszczeniu należy przechowywać w temperaturze -20 & stopni; C i zużyć w ciągu 3 miesięcy.
Oksydaza glukozowaSigma-Aldrich CompanyG7141przechowywana w -20 ° C i zużyć w ciągu 3 miesięcy. Proszek wyjściowy jest przechowywany w atmosferze argonu i utrzymywany w temperaturze -20 ° C
GlycerolICN Biomedicals Inc800687
GlycineMP Biomedicals808822
Nadtlenek wodoruSigma-Aldrich Company216763przechowywany w temperaturze 4 stopni; C 
KClEMD Millipore Corp.
MetanolBio-Lab ltd1368052100
MgCl2EMD Millipore Corp.
MikroskopLeica MicrosystemsDMI3000
mPEG-malNanocsPG1-ML-5k Mw = 5000 Da. Podzielone wagowo na małe partie. Przechowywany w atmosferze argonu w temperaturze -20 & deg; C
Mikrosfery Nilu czerwoneSpherotechFP-2056-2 Średnica 2300 nm
Obiektyw (10x)Leica NiemcyHC PL AP0UPlanFL Przysłona numeryczna = 0,3
Obiektyw (2,5x)Leica Niemcy506304  Plan-NEOFLUAR Apertura numeryczna = 0,075
PiecWTC Spoiwo
ParafilmAmcorPM-996
PBS BuforSigma-Aldrich CompanyP4417
Sterownik migawkiVincet AssociatesVMM D1
Żel krzemionkowyMerck1.01907.5000
SonicatorElmaElmasonic P
Kwas siarkowyOdczynniki Carlo Erba410301
DV2 Dwukanałowy system obrazowania symultanicznegoFotometria
TRISMP Biomedicals819620
Spektrofotometr UV-VISPharmaciaUltraspec 2100 pro
MICROMAN EGilsonFD100011– 10 uL
MATLAB R2017bKwantyfikacja danych MathWorks 
MetaMorph molekularne Oprogramowaniesterujące systemu obrazowania optycznego; kwantyfikacja danych (analiza śledzenia cząstek, rozmiar siatki sieci)
EGTA MP Biomedicals 195174 Kamera EM-CCD Andor Technology Ltd DV 887 EM-CCD Kamera Fotometria Evolve Delta Ethanol Bio-Lab Ltd 525050300 Lampa fluorescencyjna Rapp Optoelektroniczna Fluoresbrite 529552442615Urządzenia

Bibliografia

  1. Alberts, B., et al. Genesis, Modulation, and Regeneration of Skeletal Muscle In Molecular Biology of the Cell. 4th edition. , Garland Science. New York. (2002).
  2. Howard, J. Mechanics of Motor Proteins and the Cytoskeleton. , Sinauer Associates. Sunderland, MA. (2001).
  3. Mogilner, A., Manhart, A. Intracellular fluid mechanics: Coupling cytoplasmic flow with active cytoskeletal gel. Annual Review of Fluid Mechanics. 50 (1), 347-370 (2018).
  4. Bausch, A. R., Kroy, K. A bottom-up approach to cell mechanics. Nature Physics. 2 (4), 231-238 (2006).
  5. Moeendarbary, E., et al. The cytoplasm of living cells behaves as a poroelastic material. Nature Materials. 12 (3), 253-261 (2013).
  6. Charras, G. T., Mitchison, T. J., Mahadevan, L. Animal cell hydraulics. Journal of Cell Science. 122 (18), 3233-3241 (2009).
  7. Charras, G. T., Yarrow, J. C., Horton, M. A., Mahadevan, L., Mitchison, T. J. Non-equilibration of hydrostatic pressure in blebbing cells. Nature. 435 (7040), 365-369 (2005).
  8. Keren, K., Yam, P. T., Kinkhabwala, A., Mogilner, A., Theriot, J. A. Intracellular fluid flow in rapidly moving cells. Nature Cell Biology. 11 (10), 1219-1224 (2009).
  9. Paluch, E., Piel, M., Prost, J., Bornens, M., Sykes, C. Cortical actomyosin breakage triggers shape oscillations in cells and cell fragments. Biophysical Journal. 89 (1), 724-733 (2005).
  10. Liu, A. P., Fletcher, D. A. Biology under construction: In vitro reconstitution of cellular function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (9), 644-650 (2009).
  11. Siton-Mendelson, O., Bernheim-Groswasser, A. Toward the reconstitution of synthetic cell motility. Cell Adhesion & Migration. 10 (5), 461-474 (2016).
  12. Bernheim-Groswasser, A., Wiesner, S., Golsteyn, R. M., Carlier, M. -F., Sykes, C. The dynamics of actin-based motility depend on surface parameters. Nature. 417 (6886), 308-311 (2002).
  13. Bieling, P., et al. Force feedback controls motor activity and mechanical properties of self-assembling branched actin networks. Cell. 164 (1-2), 115-127 (2016).
  14. Carvalho, K., et al. Actin polymerization or myosin contraction: two ways to build up cortical tension for symmetry breaking. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 368 (1629), 20130005(2013).
  15. Dayel, M. J., et al. In silico reconstitution of actin-based symmetry breaking and motility. PLoS Biology. 7 (9), e1000201(2009).
  16. Manhart, A., et al. Quantitative regulation of the dynamic steady state of actin networks. eLife. 8, 42413(2019).
  17. Siton, O., et al. Cortactin releases the brakes in actin-based motility by enhancing WASP-VCA detachment from Arp2/3 branches. Current Biology. 21 (24), 2092-2097 (2011).
  18. Pontani, L. -L., et al. Reconstitution of an actin cortex inside a liposome. Biophysical Journal. 96 (1), 192-198 (2009).
  19. Ideses, Y., Sonn-Segev, A., Roichman, Y., Bernheim-Groswasser, A. Myosin II does it all: Assembly, remodeling, and disassembly of actin networks are governed by myosin II activity. Soft Matter. 9 (29), 7127-7137 (2013).
  20. Backouche, F., Haviv, L., Groswasser, D., Bernheim-Groswasser, A. Active gels: Dynamics of patterning and self-organization. Physical Biology. 3 (4), 264(2006).
  21. Alvarado, J., Sheinman, M., Sharma, A., MacKintosh, F. C., Koenderink, G. H. Molecular motors robustly drive active gels to a critically connected state. Nature Physics. 9 (9), 591-597 (2013).
  22. Linsmeier, I., et al. Disordered actomyosin networks are sufficient to produce cooperative and telescopic contractility. Nature Communications. 7 (1), 12615(2016).
  23. Ideses, Y., et al. Spontaneous buckling of contractile poroelastic actomyosin sheets. Nature Communications. 9 (1), 2461(2018).
  24. Spudich, J. A., Watt, S. The regulation of rabbit skeletal muscle contraction: I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin. Journal of Biological Chemistry. 246 (15), 4866-4871 (1971).
  25. Ono, S., et al. Identification of an actin binding region and a protein kinase C phosphorylation site on human fascin. Journal of Biological Chemistry. 272 (4), 2527-2533 (1997).
  26. Margossian, S. S., Lowey, S. Preparation of myosin and its subfragments from rabbit skeletal muscle. In Methods in Enzymology. 85, Academic Press. Cambridge, MA. 55-71 (1982).
  27. Quinlan, M. E., Forkey, J. N., Goldman, Y. E. Orientation of the myosin light chain region by single molecule total internal reflection fluorescence polarization microscopy. Biophysical Journal. 89 (2), 1132-1142 (2005).
  28. Cheng, N. -S. Formula for the viscosity of a glycerol−water mixture. Industrial & Engineering Chemistry Research. 47 (9), 3285-3288 (2008).
  29. Marsh, D., Bartucci, R., Sportelli, L. Lipid membranes with grafted polymers: Physicochemical aspects. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1615 (1-2), 33-59 (2003).
  30. Strychalski, W., Guy, R. D. Intracellular pressure dynamics in blebbing cells. Biophysical Journal. 110 (5), 1168-1179 (2016).
  31. Head, D. A., Levine, A. J., MacKintosh, F. C. Distinct regimes of elastic response and deformation modes of crosslinked cytoskeletal and semiflexible polymer networks. Physical Review E. 68 (6), 061907(2003).
  32. MacKintosh, F. C., Levine, A. J. Nonequilibrium mechanics and dynamics of motor-activated gels. Physical Review Letters. 100 (1), 018104(2008).
  33. Melero, C., et al. Light-induced molecular adsorption of proteins using the PRIMO system for micro-patterning to study cell responses to extracellular matrix proteins. Journal of Visualized Experiments. (152), e60092(2019).
  34. Bendix, P. M., et al. A quantitative analysis of contractility in active cytoskeletal protein networks. Biophysical Journal. 94 (8), 3126-3136 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

żele poroelastycznekurczliwość miozynyprzepływ rozpuszczalnikamikroskopia fluorescencyjnaporowatość siecirelaksacja naprężeńrekonstytucja in vitromoduł sprężystości
Mechanika (poro-)elastycznych kurczliwych sieci aktomyozyny jako modelowy układ cytoszkieletu komórkowego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.