Wysoce skuteczne celowanie genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w embrionalnych komórkach macierzystych w celu opracowania modeli myszy zmanipulowanych genami

Produkcja genetycznie modyfikowanych myszy i analiza ich fenotypu pozwala nam zrozumieć konkretne funkcje genów w szczegółach, in vivo. Odkryto wiele ważnych odkryć przy użyciu zmodyfikowanych genetycznie modeli zwierzęcych w dziedzinie nauk przyrodniczych. Co więcej, od czasu doniesień o technologii edycji genomu przy użyciu CRISPR/Cas9¹, badania z wykorzystaniem genetycznie zmodyfikowanych myszy szybko rozprzestrzeniły się na wiele laboratoriów^2,3. Edycja genomu mysich zygot za pomocą CRISPR/Cas9 osiągnęła akceptowalną wydajność w opracowywaniu krótkich modyfikacji DNA, takich jak nokaut genów zorientowany na mutacje indel⁴, wymiana pojedynczego nukleotydu lub krótka insercja peptydu przy użyciu jednoniciowych oligonukleotydów (ssODN) jako dawców knock-in (KI)⁵. Z drugiej strony, KI dużych fragmentów DNA przekształcanych w zygoty przez edycję genomu pozostaje na niskim poziomie wydajności w porównaniu z modyfikacją DNA o krótkich rozmiarach^6,7. Ponadto trudno jest wykorzystać szczepy myszy, takie jak BALB/c, który jest ważnym szczepem dla określonych obszarów badań, takich jak immunologia, do edycji genomu na podstawie zygoty, ponieważ ich zarodki przedimplantacyjne są podatne na manipulacje in vitro.

Innym sposobem na rozwój genetycznie modyfikowanych modeli myszy jest użycie techniki celowania w embrionalne komórki macierzyste (ESC), a następnie wstrzyknięcie ESC do zarodka preimplantacyjnego w celu wytworzenia chimer^8,9^,10, która jest nadal rutynowo stosowana jako metoda konwencjonalna. Chociaż szybkość pozyskiwania w celu uzyskania dokładnych klonów KI-ESC nie jest zbyt wysoka w konwencjonalnych metodach celowania w ESC, celowanie ESC oferuje pewne korzyści w porównaniu z edycją genomu zygoty, szczególnie w przypadku długiego DNA KI. Na przykład, wydajność KI długich fragmentów DNA (> kilka kb) w genomie zygoty jest mniej oczywista^6,7, a do rozwinięcia choćby jednej linii myszy KI potrzeba wielu zygot, co jest niepożądane w obecnej perspektywie eksperymentów na zwierzętach. W przeciwieństwie do edycji genomu zygoty, długie DNA kierowane do ESC, a następnie produkcja chimery wymaga znacznie mniej zarodków niż edycja genomu zygoty. Ponadto, mimo że zarodki preimplantacyjne z BALB/c są podatne na manipulację in vitro, ich ESC mogą być utrzymywane i przetwarzane in vitro¹¹ jako inne kompetentne ESC tła 129 lub F1, a zatem mające zastosowanie do produkcji chimer. Jednakże, mimo że wektor celujący zawiera homologiczne ramiona 5' i 3' oraz kasety genów oporności na leki do selekcji pozytywnej lub negatywnej, konwencjonalna wydajność KI ESC jest na ogół niewystarczająca ze względu na wysoką częstotliwość losowej integracji genomowej^8,10, Dlatego wymagana jest ulepszona metoda z precyzyjną skutecznością celowania w ESC. Niedawno informowaliśmy o dostrojonej metodzie ESC KI wykorzystującej edycję genomu opartą na CRISPR/Cas9 w celu osiągnięcia wyższej wydajności KI niż konwencjonalne metody celowania¹¹. Opisana przez nas metoda opiera się na tej procedurze, która umożliwia uzyskanie długich DNA (> od kilku do 10 kb) KI do ESC z akceptowalną wydajnością do rutynowych prac bez selekcji leków; W ten sposób procedura budowy wektora byłaby znacznie łatwiejsza i wymagałaby krótszego okresu, lub okres hodowli komórkowej również stałby się znacznie krótszy

Wszystkie eksperymenty na myszach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Uniwersytetu Tokijskiego (numer zatwierdzenia PA17-63) oraz Uniwersytet w Osace (numer zatwierdzenia Biken-AP-H30-01) i przeprowadzone zgodnie z ich wytycznymi, jak również wytycznymi ARRIVE (https://arriveguidelines.org).

1. Konstruowanie wektorów docelowych

1. Amplifikuj kasetę KI (tutaj CreERT, matryca DNA do PCR pochodzi z komercyjnej firmy zajmującej się syntezą genów) i około 1 kb fragment ramion o homologii 5' lub 3' metodą PCR. W przypadku klonowania DNA (krok 1.3) dodaj 15-merowe sekwencje nakładające się na siebie na końcu 5' każdego startera PCR. Oczyść fragmenty DNA PCR za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym, a następnie ekstrakcji fragmentu DNA za pomocą zestawu do oczyszczania DNA.
2. Linearyzuj plazmid szkieletowy (np. pUC19 lub pBS) za pomocą odpowiedniego enzymu restrykcyjnego(-ych), który w unikalny sposób trawi gdzieś w miejscu wielokrotnego klonowania w celu klonowania. Następnie oczyść strawiony plazmid za pomocą zestawu do oczyszczania DNA.
3. Sklonuj jednocześnie każdy fragment PCR (np. ramię 5'-homologii, ramię 3'-homologii) i sekwencję KI do strawionego plazmidu za pomocą zestawu do klonowania DNA zgodnie z instrukcjami producenta.
4. Przekształć właściwe komórki za pomocą skonstruowanego plazmidu (krok 1.3) przez ogrzewanie w temperaturze 42 °C przez 1 minutę w łaźni wodnej, a następnie wysiać je na płytce LB zawierającej odpowiednie stężenie antybiotyków, takich jak ampicylina lub kanamycyna. Hoduj je przez noc, aby uzyskać odporne klony.
5. Pobrać kilka (od czterech do ośmiu) pojedynczych kolonii za pomocą końcówek do pipet o pojemności 200 μl i przenieść końcówki do 3 ml płynnego LB zawierającego odpowiednie antybiotyki (100 μg/ml ampicyliny lub 20 μl/ml kanamycyny) i hodować przez noc w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem.
6. Oczyść plazmid następnego dnia za pomocą komercyjnego zestawu do oczyszczania plazmidu bez endotoksyn zgodnie z instrukcjami producenta. Potwierdź sklonowaną sekwencję w plazmidzie za pomocą sekwencjonowania Sangera. Dostosuj stężenie plazmidu do 1 μg DNA/μL za pomocą wody wolnej od nukleaz. Użyj plazmidu jako wektora docelowego genu.

2. Przygotowanie mysiego fibroblastu embrionalnego (MEF) jako komórek zasilających dla ESC

1. Uśmierc 8-10-tygodniowe ciężarne samice myszy ICR (14,5 dnia po stosunku) przez zwichnięcie szyjki macicy. Dobrze wytrzyj brzuch, używając 70% (v/v) etanolu do sterylizacji, przetnij brzuch za pomocą nożyczek orbitalnych i kleszczy i odzyskaj macicę zawierającą płód.
2. Umieścić macicę w naczyniu o średnicy 100 mm zawierającym 10 ml fosforanowej surowicy bydlęcej (PBS) zawierającej 100 μg/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny. Usuń łożyska i tkanki pozazarodkowe z płodów za pomocą nożyczek orbitalnych i kleszczy. Zmielić płody za pomocą nożyczek orbitalnych i przenieść roztwór PBS zawierający rozdrobnione komórki płodu do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
3. Wirować przy 280 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant przez aspirację. Dodać 10 ml 0,25% (w/v) roztworu trypsyny-EDTA, dobrze wymieszać pipetując, a następnie inkubować przez 10 minut w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej do trawienia trypsyny.
4. Dodać 20 ml pożywki MEF (DMEM zawierającej 10% (v/v) płodowej surowicy bydlęcej, 100 j./ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny) w celu zatrzymania reakcji enzymatycznej, dobrze wymieszać przez delikatną inwersję i odwirować przy 280 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant przez aspirację, dodać 10 ml pożywki MEF, i dobrze wymieszać pipetowaniem.
5. Wysiewaj zawiesinę komórek w kilku nowych szalkach o średnicy 100 mm (przygotuj taką samą liczbę szalek jak liczba płodów z 10 ml pożywki MEF na jedną szalkę o średnicy 100 mm). Zmień podłoże 4 do 5 godzin po wysiewie, aby usunąć nieprzyłączone komórki i pozwól dołączonemu MEF rosnąć. Przejdź przez komórki, gdy osiągną ~80% konfluencji, używając trypsyny.
6. Umieścić szalki hodowlane zawierające rozmnażający się MEF w pożywce MEF, około 12-15 dni po wysiewie, w urządzeniu do naświetlania promieniami rentgenowskimi. Wystaw MEF za pomocą promieniowania rentgenowskiego 50 Gy (łącznie), aby zatrzymać cykl komórkowy zgodnie z instrukcją producenta.
7. Trypsynizować napromieniowany MEF, dodając 2 ml 0,25% trypsyny-EDTA na jedną 100-milimetrową szalkę przez 5 minut w temperaturze 37 °C, a następnie dodać 4 ml pożywki MEF, aby zatrzymać trawienie trypsyny i zebrać zawiesinę komórkową do nowej probówki o pojemności 50 ml.
8. Przemyć MEF świeżą pożywką MEF przez odwirowanie przy 280 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, policzyć liczbę komórek za pomocą licznika komórek z barwieniem błękitem trypanowym i zamrozić je w temperaturze 1,6 x 10⁶ komórek/probówkę w pożywce do zamrażania komórek. Przechowywać do czasu użycia; Komórki mogą być stabilnie przechowywane w ciekłym azocie przez kilka lat.

3. Przygotowanie mieszaniny Cas9-RNP-DNA

1. Rozpuścić tracrRNA i crisprRNA w buforze rozcieńczającym (każde stężenie RNA przy 200 μM) przez pipetowanie. Zmieszać roztwór tracrRNA, roztwór crisprRNA i bufor rozcieńczający (stosunek objętości w stosunku 2:2:5) poprzez delikatne stukanie i wyżarzanie każdego RNA za pomocą termocyklera w temperaturze 95 °C przez 10 minut, a następnie cykle obniżania temperatury 1 °C/min, aż temperatura osiągnie 4 °C.
   UWAGA: Sekwencja gRNA została zaprojektowana przy użyciu CRISPOR, http://crispor.tefor.net.
2. Inkubować wyżarzone RNA, nukleazę Cas9 o stężeniu 10 μg/μl i bufor do elektroporacji zmieszane w stosunku objętościowym 5:3:2 w temperaturze 37 °C przez 20 minut, aby utworzyć kompleks Cas9-RNP. W rutynowej pracy wymieszaj i inkubuj 1,25 μl wyżarzonego RNA, 0,75 μl nukleazy Cas9 i 0,5 μl buforu elektroporacyjnego do edycji genomu jednego locus.
3. Wymieszaj następujące materiały w probówce o pojemności 1,5 ml: 10 μl buforu do elektroporacji, 1 μl kompleksu Cas9-RNP (krok 3.2) i 1 μl okrągłego wektora celowniczego (1 μg/μL, krok 1.6). Całkowita ilość mieszaniny Cas9-RNP-DNA wynosi 12 μL. Mieszaninę Cas9-RNP-DNA należy przechowywać na lodzie do momentu elektroporacji.
   UWAGA: Aby zapobiec ponownemu rozszczepieniu gRNA po KI, zaprojektuj gRNA w pozycji, w której sekwencja rozpoznawania gRNA jest podzielona przez integrację donora KI. Jeśli gRNA nie może być zaprojektowane w takim miejscu, do plazmidu dawcy KI włącza się kilka cichych mutacji nukleotydowych, w wyniku których sekwencja aminokwasów się nie zmienia.

4. Celowanie genowe ESC

1. Aby przygotować pokryte żelatyną szalki do hodowli komórkowych, należy dodać 0,1% (w/v) roztwór żelatyny o objętości 2 ml na szalkę 60 mm, 500 μl na płytkę 24-dołkową, 100 μl na płytkę 96-dołkową i inkubować przez 2 godziny w wilgotnym inkubatorze. Usuń roztwór żelatyny, przemyj dwukrotnie tą samą ilością PBS i przechowuj w temperaturze pokojowej do momentu użycia.
2. Rozmrażać mitotycznie inaktywowany zamrożony wywar MEF (etap 2.2) w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 1 minutę i umieścić MEF na pokrytym żelatyną szalku o średnicy 60 mm (jedna zamrożona tubka MEF zawierająca 1,6 x 10⁶ komórek na dwie szalki o średnicy 60 mm, etap 2.2) na 1 dzień przed wysiewem ESC.
3. Rozmrozić zamrożoną probówkę z ESC (przechowywaną w ilości 2 x 10⁵ ESC/probówkę; liczenie komórek przeprowadzono przy użyciu licznika komórek) w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 1 minutę i umieścić 1 x 10⁵ ESC na naczyniu o średnicy 60 mm zawierającym wstępnie zasiew MEF (krok 4.1).
4. Hodowla w 4 ml pożywki hodowlanej ESC (ESCM, zmodyfikowana pożywka na bazie DMEM z 15% (v/v) płodową surowicą bydlęcą, 2 mM substratu L-glutaminy, 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny, 0,1 mM 2-merkaptoetanolu, czynnika hamującego białaczkę i t2i (0,2 μM PD0325901 i 3 μM CHIR99021), która utrzymuje pluripotencję ESC¹¹) w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ do momentu, gdy ESC osiągnie 50% do 70% konfluencji.
   UWAGA: Używamy trzech różnych linii ESC: JM8. A3 z B6N, V6.5 z B6-129 F1 i opracowany przez nas BALB/c ESC. Te same protokoły KI w tym manuskrypcie są używane dla wszystkich linii ESC.
5. Umyj hodowlę ESC 4 ml PBS, a następnie potraktuj 800 μl 0,25% roztworu trypsyny-EDTA przez 5 minut w temperaturze 37 °C w celu roztrawienia. Dodać 1 ml ESCM, aby dezaktywować trypsynę i dysocjować ESC na pojedyncze komórki przez pipetowanie.
6. Odwirować roztwór zawierający ESC przez 5 minut przy 280 x g, wyrzucić supernatant, ponownie zawiesić ESC w świeżym 1 ml ESCM i policzyć liczbę komórek za pomocą licznika komórek z barwieniem błękitem trypanowym. Przenieść 1 x 10⁵ ESC do nowej probówki o pojemności 1,5 ml i przemyć je trzykrotnie PBS przez odwirowanie w temperaturze 500 x g, 4 °C.
7. Zawiesić osad ESC w 12 μl mieszaniny Cas9-RNP-DNA (krok 3.3) i dobrze wymieszać przez delikatne pipetowanie, aby uniknąć bulgotania. Podać ponownie zawieszony ESC do elektroporacji. System elektroporacji wykorzystuje pojedynczy impuls o napięciu 1400 V i czasie 30 ms do transdukcji Cas9-RNP-DNA (Rysunek 1).
8. Wyhodować elektroporowane ESC w 60-milimetrowej szalce zawierającej 4 ml ESCM z mitotycznie inaktywowanym MEF (sekcja 4.2). Zmieniaj podłoże codziennie.
9. Przemyć ESC 4 ml PBS 3 do 5 dni po elektroporacji, a następnie potraktować 800 μl 0,25% trypsyny-EDTA i hodować w temperaturze 37 °C przez 5 minut w wilgotnym inkubatorze w celu roztrawienia. Dodać 2 ml ESCM, aby zatrzymać trawienie trypsyny i odwirować mieszaninę komórek przy 280 x g przez 5 minut.
10. Odrzucić supernatant, ponownie zawiesić ESC w 1 ml świeżego ESCM i policzyć stężenie komórek za pomocą licznika komórek z barwieniem błękitem trypanowym. Przechodzić przez ESC w odległości 1 x 10³ ESC na 60 mm szalkę zawierającą ESCM i podajnik MEF. Zmieniaj pożywkę codziennie, aż kolonia się zregeneruje.
    UWAGA: Powodem, dla którego ESC jest przekazywany raz przed pobraniem, było to, że edycja genomu może nadal zachodzić po podziale ESC, więc pierwsza kolonia nie zawsze jest klonem w wielu przypadkach. Dlatego pierwsze przejście ESC przed pobraniem kolonii jest niezbędnym krokiem do pobrania pojedynczych klonów.

5. Genotypowanie PCR docelowych ESC

1. Odessać ESCM z szalki hodowlanej ESC 5 do 7 dni po pierwszym pasażu (krok 4.9) i dodać 4 ml PBS. Pobrać pojedyncze kolonie ESC z 5 μl PBS za pomocą pipety 20 μl pod mikroskopem stereoskopowym (powiększenie od 30x do 40x). Umieść poszczególne kolonie w studzience z okrągłodenną 96-dołkową płytką zawierającą 15 μl 0,25% roztworu trypsyny-EDTA.
2. Trzymaj 96-dołkową płytkę na lodzie, aż 48 pojedynczych kolonii zostanie zebranych. Inkubować 96-dołkową płytkę przez 5 minut w inkubatorze o temperaturze 37 °C, wilgotnym 5%_CO2, a następnie dodać 80 μl ESCM, aby zatrzymać trawienie trypsyny i dysocjować kolonie ESC na pojedyncze komórki przez pipetowanie.
   UWAGA: Ponieważ skuteczność KI tej metody wynosi zwykle 10%-50%, rutynowo wybieramy 48 klonów i najpierw przeprowadzamy genotypowanie przy użyciu 24 z nich. Jeśli w tym momencie nie można uzyskać wielu klonów KI, przeprowadzamy dalsze badania przesiewowe pod kątem KI, używając pozostałych 24 klonów.
3. Przenieść 40 μl zawiesiny ESC (etap 5) na pokrytą żelatyną, niezawierającą podawania 96-dołkową płytkę zawierającą 50 μl ESCM na basenik w celu genotypowania PCR. Pozostałe 60 μl zawiesiny ESC przenieść do studzienki na 24-dołkowej płytce pokrytej żelatyną, która zawiera 500 μl ESCM i podajnika MEF, w celu wytworzenia zamrożonego materiału ESC.
4. Umieść indywidualne klony ESC hodowane na płytce 24-dołkowej (krok 5.3), aż osiągną zlewność od 60% do 80%. Odzyskaj pojedyncze klony ESC przez trypsynizację, jak wspomniano powyżej, zbierz komórki w nowej probówce o pojemności 1,5 ml i odwiruj przy 280 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant, ponownie zawiesić komórki w 500 μl pożywki do zamrażania komórek i zamrozić je w głębokim zamrażaniu o temperaturze -80 °C.
5. W przypadku genotypowania PCR klony ESC hoduje się na 96-dołkowej płytce wolnej od karmowania (krok 5.3), aż ESC osiągnie więcej niż 90% konfluencji. Usunąć ESCM z każdej studzienki przez aspirację i przemyć dwukrotnie 100 μl PBS.
6. Odessać PBS i dodać 100 μl buforu do lizy zawierającego proteinazę K, dobrze wymieszać i przenieść lizat ESC do nowej probówki o pojemności 1,5 ml. Podgrzewać lizat ESC w temperaturze 65 °C przez co najmniej 1 godzinę w komorze grzewczej. Ekstrahować i oczyszczać genomowe DNA przy użyciu konwencjonalnej metody oczyszczania DNA fenolowo-chloroformowego, a następnie wytrącać etanol.
7. Rozpuścić wytrącone DNA w 20 μl wody wolnej od DNaz i oznaczyć czystość i stężenie DNA za pomocą spektrofotometru. Wykonaj genomowy PCR przy użyciu zestawów starterów specyficznych dla locus w celu amplifikacji regionu docelowego. Następnie sprawdź sekwencję i wybierz klony ESC z żądanymi sekwencjami KI.

6. Przygotowanie ośmiokomórkowego zarodka i mikroiniekcja ESC

1. Wstrzyknąć 5 j.m. surowicy ciężarnej klaczy gonadotropiny (PMSG) dootrzewnowo dorosłym samicom ICR. Po 48 godzinach wstrzyknąć 5 j.m. ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej (hCG) tym samym samicom, a następnie połączyć samice leczone hormonem z samcami ICR. Sprawdź czop kopulacyjny w pochwie następnego dnia (dzień embrionalny 0,5, ED0,5).
   UWAGA: Aby ocenić chimeryzm na podstawie proporcji koloru sierści, użyj blastocysty ze szczepu ICR jako biorcy dla ESC, który ma tło w kolorze czarnym lub agouti, lub blastocysty ze szczepu C57BL/6 jako biorcę dla ESC, który ma tło albinosa.
2. Zbierz jajowód w ED1,5 i umieść go w kroplach buforowanej pożywki HEPES (FHM). Odzyskaj zarodki w stadium dwukomórkowym lub czterokomórkowym, przepłukując jajowód FHM za pomocą igły płuczącej wprowadzonej do lejka.
3. Umyj pobrane zarodki, przenosząc je do kilku świeżych kropli FHM za pomocą pipety doustnej. Hodowlę zarodków w 50 μl KSOM upuścić na 35-milimetrowe naczynie do hodowli komórkowej pokryte olejem mineralnym w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO_{2 przez} 1 dzień, aż do osiągnięcia stadium ośmiokomórkowego lub moruli (ED2,5).
4. Jeżeli zarodki nie zostaną wykorzystane w następnym dniu pobrania, należy je zamrozić przez witryfikację zgodnie z protokołem CARD (http://card.medic.kumamoto-u.ac.jp/card/english/sigen/manual/ebvitri.html) i przechowywać w ciekłym azocie do czasu wykorzystania.
5. Przygotuj szklane pipety do przetrzymywania zarodków (średnica zewnętrzna 80-100 μm) i iniekcji ESC (średnica około 13 μm) za pomocą ściągacza i mikrokuźni.
6. Zintegrować pipetę podtrzymującą, która zawiera FHM, z uchwytem kapilarnym podłączonym do mikrowtryskiwacza i ustawionym po lewej stronie mikromanipulatora. Podłącz pipetę iniekcyjną do innego mikrowstrzykiwacza i ustaw ją po prawej stronie. Ustaw obie pipety prosto w polu view mikroskopu.
7. Dozuj 5 μl kropli 12% (w/v) poliwinylopirolidonu (PVP) w pożywce FHM i 5 μl kropli FHM na tę samą pokrywkę naczynia o średnicy 60 mm obok siebie i przykryj krople olejem mineralnym. Przenieść zarodki w kropli 5 μl FHM i dodać 1-5 μl zawiesiny ESC do kropli FHM zawierającej zarodki.
   UWAGA: Pozostaw zawiesinę ESC i MEF na 30 minut w naczyniu hodowlanym 4 ml ESM na 60 mm przed przygotowaniem kropli. Ponieważ MEF-y przyklejają się do dna szybciej niż ESC, ta 30-minutowa inkubacja pozwala na koncentrację nieprzyłączonych komórek ES w supernatancie.
8. Umyć wnętrze pipety iniekcyjnej PVP, a następnie przejść do kropli zawierającej zarodki i ESC.
9. Pobrać w pipecie iniekcyjnej trzy pojedyncze dublety ECS, które właśnie zakończyły podział komórek (sześć komórek). Trzymać zarodek w stadium ośmiokomórkowym lub w stadium moruli, który zakończył zagęszczenie, za pomocą pipety do trzymania przez aspirację. Zrób otwór w osłonie przejrzystej za pomocą impulsu piezoelektrycznego (intensywność: 3; prędkość: 3). Wyrzuć sześciokomórkowy ESC do wnętrza osłonki przejrzystej i wyciągnij pipetę z zarodków.
10. Delikatnie umyć zarodki, którym wstrzyknięto ESC, kilkoma kroplami KSOM za pomocą pipety doustnej i inkubować je w nowej kropli KSOM o pojemności 50 μl pokrytej olejem mineralnym w temperaturze 37 °C, 5% CO_{2 ,} aż zarodki rozwiną się do stadium blastocysty.
11. Przenieś 10 blastocyst wstrzykniętych przez ESC do każdego rogu macicy samic myszy w ciąży (2,5 dnia po stosunku, 20 blastocyst na głowę).
12. Po porodzie matki zastępczej wybierz co najmniej dwie męskie chimery o najwyższym współczynniku chimeryzmu (70% lub więcej, co potwierdza kolor sierści), a następnie połącz je z odpowiednimi samicami szczepu, aby uzyskać heterozygotyczne KI F1.
13. Hoduj indywidualne myszy KI z odpowiednimi partnerami, aby uzyskać myszy o pożądanym genotypie (genotypach) lub tle genetycznym odpowiednim do badań.

Skupiliśmy się na konkretnych genach w ESC, a następnie na produkcji chimer, aby rozwinąć produkcję myszy manipulowaną genami, zgodnie z naszym poprzednim manuskryptem11. Genotypowanie ESC (opisane w punkcie 4) jest rutynowo przeprowadzane metodą PCR przy użyciu starterów. Startery są zaprojektowane na sekwencjach genomowych poza ramionami homologii i specyficznych sekwencjach we fragmencie DNA KI (Figura 2A). W takim przypadku nie dochodzi do amplifikacji allelu typu dzikiego, podczas gdy amplikon PCR o określonej wielkości jest wykrywany tylko wtedy, gdy docelowe egzogenne DNA ma wartość KI w locus docelowym. Reprezentatywne wyniki genotypowania PCR są pokazane w Rysunek 2B. Dziewięć z 22 klonów (40,9%) wykazało w tym przypadku pasmo specyficzne dla KI. Trzy reprezentatywne wyniki kierowania, w tym wynik pokazany w Rysunek 2, przedstawiono w tabeli 1. Wyniki te wskazują, że przedstawiona tutaj metoda jest skuteczna i odtwarzalna dla genu KI bez konieczności wyboru leków.

ESC jest pobierany w pipecie do iniekcji, następnie wykonuje się otwór w osłonie przezroczystej za pomocą plusa piezoelektrycznego, a ESC jest uwalniany między komórkami embrionalnymi (Rysunek 3). Technicznie rzecz biorąc, ten protokół wstrzykiwania ESC do ośmiokomórkowego zarodka lub stadium moruli jest podobny do protokołu wstrzykiwania ESC do blastocysty powszechnie stosowanej w wielu obiektach myszy. Reprezentatywne myszy chimeryczne są pokazane w Rysunek 4. Do oceny chimeryzmu koloru sierści wykorzystano zarodek ze szczepu ICR (albinos, białe włosy) jako biorcę B6 lub B6-129 F1 ESC, a zarodki B6 wykorzystano jako biorcę ESC BALB/c (Ryc. 4).

Rysunek 1: Schemat integracji kolistego plazmidu za pośrednictwem rybonukleoproteiny (RNP) za pośrednictwem CRISPR/Cas9 do specyficznego locus genomu ESC. Elektroporacja wprowadza plazmid kołowy jako wektor celowania do ESC z Cas9-RNP. Skróty: GOI = gen zainteresowania, HA = ramię homologiczne. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Analizy genomiczne PCR do badań przesiewowych KI docelowych klonów ESC. (A) Startery PCR specyficzne dla KI są projektowane na sekwencjach genomowych poza ramionami homologii (do przodu) i w specyficznych sekwencjach we fragmencie DNA KI (na odwrót). (B) Reprezentatywne wyniki genotypowania PCR. Jako kontrolę negatywną wykorzystano genom typu dzikiego. Skróty: GOI = gen zainteresowania, HA = ramię homologiczne. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Reprezentatywne obrazy wstrzyknięcia zarodka w stadium ośmiokomórkowym. (A) Do mikroiniekcji pobiera się trzy dublety ESC (sześć komórek, groty strzałek). (B) Otwór w osłonie przejrzystej jest wytwarzany za pomocą impulsu piezoelektrycznego, a ESC są wydalane pomiędzy każdym blastomerem. Pokazany pasek skali to 50 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Reprezentatywne obrazy myszy chimera. (A,B) ESC wywodzący się z C57BL/6N (JM8. A3, włosy Agouti; A) lub B6-129 F1 (włosy Agouti; B) są wstrzykiwane do zarodków ICR (albinosy, białe włosy), a następnie przenoszone są do matek zastępczych. (C) ESC pochodzący z BALB/c (albinos, białe włosy) jest wstrzykiwany do zarodków C57BL/6J (czarne włosy), a następnie przenoszony do matek zastępczych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Efektywność KI w trzech niezależnych loci genomowych w ESC. *Te projekty nie zostały do tej pory opublikowane. Nazwa tych genów zostanie w przyszłości ujawniona w niezależnych manuskryptach.

Autorzy nie mają żadnych sprzecznych interesów, które mogliby ujawnić.