Artykuł metodologiczny

Wysoce skuteczne celowanie genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w embrionalnych komórkach macierzystych w celu opracowania modeli myszy zmanipulowanych genami

DOI:

10.3791/64385

⸱

24 sierpnia 2022

 ,  , 
1Laboratory of Reproductive Systems Biology, Center for Experimental Medicine and Systems Biology, The Institute of Medical Science, The University of Tokyo, 2Research Institute for Microbial Diseases, Osaka University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół rozwoju genetycznie modyfikowanych modeli myszy przy użyciu embrionalnych komórek macierzystych, szczególnie dla dużych DNA knock-in (KI). Protokół ten jest dostrojony przy użyciu edycji genomu CRISPR/Cas9, co skutkuje znacznie lepszą wydajnością KI w porównaniu z konwencjonalną metodą celowania w linearyzowane DNA za pośrednictwem rekombinacji homologicznej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

System CRISPR/Cas9 umożliwił rozwój genetycznie modyfikowanych myszy poprzez bezpośrednią edycję genomu przy użyciu zapłodnionych zygot. Jednakże, chociaż skuteczność w rozwoju myszy z nokautem genowym poprzez indukcję małej mutacji indel byłaby wystarczająca, wydajność edycji genomu zarodka w celu uzyskania dużego rozmiaru DNA knock-in (KI) jest nadal niska. Dlatego, w przeciwieństwie do metody bezpośredniego KI w zarodkach, celowanie w geny za pomocą embrionalnych komórek macierzystych (ESC), a następnie wstrzyknięcie zarodka w celu rozwinięcia myszy chimery nadal ma kilka zalet (np. celowanie o wysokiej przepustowości in vitro, manipulacja wieloma allelami oraz manipulacja genami Cre i flox może być przeprowadzona w krótkim czasie). Ponadto szczepy z trudnymi w obsłudze zarodkami in vitro, takie jak BALB/c, mogą być również wykorzystywane do celowania w ESC. Protokół ten opisuje zoptymalizowaną metodę dla KI o dużych rozmiarach DNA (kilka kb) w ESC poprzez zastosowanie edycji genomu za pośrednictwem CRISPR/Cas9, a następnie produkcji myszy chimery w celu opracowania modeli myszy manipulowanych genami.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Produkcja genetycznie modyfikowanych myszy i analiza ich fenotypu pozwala nam zrozumieć konkretne funkcje genów w szczegółach, in vivo. Odkryto wiele ważnych odkryć przy użyciu zmodyfikowanych genetycznie modeli zwierzęcych w dziedzinie nauk przyrodniczych. Co więcej, od czasu doniesień o technologii edycji genomu przy użyciu CRISPR/Cas91, badania z wykorzystaniem genetycznie zmodyfikowanych myszy szybko rozprzestrzeniły się na wiele laboratoriów2,3. Edycja genomu mysich zygot za pomocą CRISPR/Cas9 osiągnęła akceptowalną wydajność w opracowywaniu krótkich modyfikacji DNA, takich jak nokaut genów zorientowany na mutacje indel4, wymiana pojedynczego nukleotydu lub krótka insercja peptydu przy użyciu jednoniciowych oligonukleotydów (ssODN) jako dawców knock-in (KI)5. Z drugiej strony, KI dużych fragmentów DNA przekształcanych w zygoty przez edycję genomu pozostaje na niskim poziomie wydajności w porównaniu z modyfikacją DNA o krótkich rozmiarach6,7. Ponadto trudno jest wykorzystać szczepy myszy, takie jak BALB/c, który jest ważnym szczepem dla określonych obszarów badań, takich jak immunologia, do edycji genomu na podstawie zygoty, ponieważ ich zarodki przedimplantacyjne są podatne na manipulacje in vitro.

Innym sposobem na rozwój genetycznie modyfikowanych modeli myszy jest użycie techniki celowania w embrionalne komórki macierzyste (ESC), a następnie wstrzyknięcie ESC do zarodka preimplantacyjnego w celu wytworzenia chimer8,9,10, która jest nadal rutynowo stosowana jako metoda konwencjonalna. Chociaż szybkość pozyskiwania w celu uzyskania dokładnych klonów KI-ESC nie jest zbyt wysoka w konwencjonalnych metodach celowania w ESC, celowanie ESC oferuje pewne korzyści w porównaniu z edycją genomu zygoty, szczególnie w przypadku długiego DNA KI. Na przykład, wydajność KI długich fragmentów DNA (> kilka kb) w genomie zygoty jest mniej oczywista6,7, a do rozwinięcia choćby jednej linii myszy KI potrzeba wielu zygot, co jest niepożądane w obecnej perspektywie eksperymentów na zwierzętach. W przeciwieństwie do edycji genomu zygoty, długie DNA kierowane do ESC, a następnie produkcja chimery wymaga znacznie mniej zarodków niż edycja genomu zygoty. Ponadto, mimo że zarodki preimplantacyjne z BALB/c są podatne na manipulację in vitro, ich ESC mogą być utrzymywane i przetwarzane in vitro11 jako inne kompetentne ESC tła 129 lub F1, a zatem mające zastosowanie do produkcji chimer. Jednakże, mimo że wektor celujący zawiera homologiczne ramiona 5' i 3' oraz kasety genów oporności na leki do selekcji pozytywnej lub negatywnej, konwencjonalna wydajność KI ESC jest na ogół niewystarczająca ze względu na wysoką częstotliwość losowej integracji genomowej8,10, Dlatego wymagana jest ulepszona metoda z precyzyjną skutecznością celowania w ESC. Niedawno informowaliśmy o dostrojonej metodzie ESC KI wykorzystującej edycję genomu opartą na CRISPR/Cas9 w celu osiągnięcia wyższej wydajności KI niż konwencjonalne metody celowania11. Opisana przez nas metoda opiera się na tej procedurze, która umożliwia uzyskanie długich DNA (> od kilku do 10 kb) KI do ESC z akceptowalną wydajnością do rutynowych prac bez selekcji leków; W ten sposób procedura budowy wektora byłaby znacznie łatwiejsza i wymagałaby krótszego okresu, lub okres hodowli komórkowej również stałby się znacznie krótszy

.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty na myszach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Uniwersytetu Tokijskiego (numer zatwierdzenia PA17-63) oraz Uniwersytet w Osace (numer zatwierdzenia Biken-AP-H30-01) i przeprowadzone zgodnie z ich wytycznymi, jak również wytycznymi ARRIVE (https://arriveguidelines.org).

1. Konstruowanie wektorów docelowych

  1. Amplifikuj kasetę KI (tutaj CreERT, matryca DNA do PCR pochodzi z komercyjnej firmy zajmującej się syntezą genów) i około 1 kb fragment ramion o homologii 5' lub 3' metodą PCR. W przypadku klonowania DNA (krok 1.3) dodaj 15-merowe sekwencje nakładające się na siebie na końcu 5' każdego startera PCR. Oczyść fragmenty DNA PCR za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym, a następnie ekstrakcji fragmentu DNA za pomocą zestawu do oczyszczania DNA.
  2. Linearyzuj plazmid szkieletowy (np. pUC19 lub pBS) za pomocą odpowiedniego enzymu restrykcyjnego(-ych), który w unikalny sposób trawi gdzieś w miejscu wielokrotnego klonowania w celu klonowania. Następnie oczyść strawiony plazmid za pomocą zestawu do oczyszczania DNA.
  3. Sklonuj jednocześnie każdy fragment PCR (np. ramię 5'-homologii, ramię 3'-homologii) i sekwencję KI do strawionego plazmidu za pomocą zestawu do klonowania DNA zgodnie z instrukcjami producenta.
  4. Przekształć właściwe komórki za pomocą skonstruowanego plazmidu (krok 1.3) przez ogrzewanie w temperaturze 42 °C przez 1 minutę w łaźni wodnej, a następnie wysiać je na płytce LB zawierającej odpowiednie stężenie antybiotyków, takich jak ampicylina lub kanamycyna. Hoduj je przez noc, aby uzyskać odporne klony.
  5. Pobrać kilka (od czterech do ośmiu) pojedynczych kolonii za pomocą końcówek do pipet o pojemności 200 μl i przenieść końcówki do 3 ml płynnego LB zawierającego odpowiednie antybiotyki (100 μg/ml ampicyliny lub 20 μl/ml kanamycyny) i hodować przez noc w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem.
  6. Oczyść plazmid następnego dnia za pomocą komercyjnego zestawu do oczyszczania plazmidu bez endotoksyn zgodnie z instrukcjami producenta. Potwierdź sklonowaną sekwencję w plazmidzie za pomocą sekwencjonowania Sangera. Dostosuj stężenie plazmidu do 1 μg DNA/μL za pomocą wody wolnej od nukleaz. Użyj plazmidu jako wektora docelowego genu.

2. Przygotowanie mysiego fibroblastu embrionalnego (MEF) jako komórek zasilających dla ESC

  1. Uśmierc 8-10-tygodniowe ciężarne samice myszy ICR (14,5 dnia po stosunku) przez zwichnięcie szyjki macicy. Dobrze wytrzyj brzuch, używając 70% (v/v) etanolu do sterylizacji, przetnij brzuch za pomocą nożyczek orbitalnych i kleszczy i odzyskaj macicę zawierającą płód.
  2. Umieścić macicę w naczyniu o średnicy 100 mm zawierającym 10 ml fosforanowej surowicy bydlęcej (PBS) zawierającej 100 μg/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny. Usuń łożyska i tkanki pozazarodkowe z płodów za pomocą nożyczek orbitalnych i kleszczy. Zmielić płody za pomocą nożyczek orbitalnych i przenieść roztwór PBS zawierający rozdrobnione komórki płodu do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
  3. Wirować przy 280 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant przez aspirację. Dodać 10 ml 0,25% (w/v) roztworu trypsyny-EDTA, dobrze wymieszać pipetując, a następnie inkubować przez 10 minut w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej do trawienia trypsyny.
  4. Dodać 20 ml pożywki MEF (DMEM zawierającej 10% (v/v) płodowej surowicy bydlęcej, 100 j./ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny) w celu zatrzymania reakcji enzymatycznej, dobrze wymieszać przez delikatną inwersję i odwirować przy 280 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant przez aspirację, dodać 10 ml pożywki MEF, i dobrze wymieszać pipetowaniem.
  5. Wysiewaj zawiesinę komórek w kilku nowych szalkach o średnicy 100 mm (przygotuj taką samą liczbę szalek jak liczba płodów z 10 ml pożywki MEF na jedną szalkę o średnicy 100 mm). Zmień podłoże 4 do 5 godzin po wysiewie, aby usunąć nieprzyłączone komórki i pozwól dołączonemu MEF rosnąć. Przejdź przez komórki, gdy osiągną ~80% konfluencji, używając trypsyny.
  6. Umieścić szalki hodowlane zawierające rozmnażający się MEF w pożywce MEF, około 12-15 dni po wysiewie, w urządzeniu do naświetlania promieniami rentgenowskimi. Wystaw MEF za pomocą promieniowania rentgenowskiego 50 Gy (łącznie), aby zatrzymać cykl komórkowy zgodnie z instrukcją producenta.
  7. Trypsynizować napromieniowany MEF, dodając 2 ml 0,25% trypsyny-EDTA na jedną 100-milimetrową szalkę przez 5 minut w temperaturze 37 °C, a następnie dodać 4 ml pożywki MEF, aby zatrzymać trawienie trypsyny i zebrać zawiesinę komórkową do nowej probówki o pojemności 50 ml.
  8. Przemyć MEF świeżą pożywką MEF przez odwirowanie przy 280 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, policzyć liczbę komórek za pomocą licznika komórek z barwieniem błękitem trypanowym i zamrozić je w temperaturze 1,6 x 106 komórek/probówkę w pożywce do zamrażania komórek. Przechowywać do czasu użycia; Komórki mogą być stabilnie przechowywane w ciekłym azocie przez kilka lat.

3. Przygotowanie mieszaniny Cas9-RNP-DNA

  1. Rozpuścić tracrRNA i crisprRNA w buforze rozcieńczającym (każde stężenie RNA przy 200 μM) przez pipetowanie. Zmieszać roztwór tracrRNA, roztwór crisprRNA i bufor rozcieńczający (stosunek objętości w stosunku 2:2:5) poprzez delikatne stukanie i wyżarzanie każdego RNA za pomocą termocyklera w temperaturze 95 °C przez 10 minut, a następnie cykle obniżania temperatury 1 °C/min, aż temperatura osiągnie 4 °C.
    UWAGA: Sekwencja gRNA została zaprojektowana przy użyciu CRISPOR, http://crispor.tefor.net.
  2. Inkubować wyżarzone RNA, nukleazę Cas9 o stężeniu 10 μg/μl i bufor do elektroporacji zmieszane w stosunku objętościowym 5:3:2 w temperaturze 37 °C przez 20 minut, aby utworzyć kompleks Cas9-RNP. W rutynowej pracy wymieszaj i inkubuj 1,25 μl wyżarzonego RNA, 0,75 μl nukleazy Cas9 i 0,5 μl buforu elektroporacyjnego do edycji genomu jednego locus.
  3. Wymieszaj następujące materiały w probówce o pojemności 1,5 ml: 10 μl buforu do elektroporacji, 1 μl kompleksu Cas9-RNP (krok 3.2) i 1 μl okrągłego wektora celowniczego (1 μg/μL, krok 1.6). Całkowita ilość mieszaniny Cas9-RNP-DNA wynosi 12 μL. Mieszaninę Cas9-RNP-DNA należy przechowywać na lodzie do momentu elektroporacji.
    UWAGA: Aby zapobiec ponownemu rozszczepieniu gRNA po KI, zaprojektuj gRNA w pozycji, w której sekwencja rozpoznawania gRNA jest podzielona przez integrację donora KI. Jeśli gRNA nie może być zaprojektowane w takim miejscu, do plazmidu dawcy KI włącza się kilka cichych mutacji nukleotydowych, w wyniku których sekwencja aminokwasów się nie zmienia.

4. Celowanie genowe ESC

  1. Aby przygotować pokryte żelatyną szalki do hodowli komórkowych, należy dodać 0,1% (w/v) roztwór żelatyny o objętości 2 ml na szalkę 60 mm, 500 μl na płytkę 24-dołkową, 100 μl na płytkę 96-dołkową i inkubować przez 2 godziny w wilgotnym inkubatorze. Usuń roztwór żelatyny, przemyj dwukrotnie tą samą ilością PBS i przechowuj w temperaturze pokojowej do momentu użycia.
  2. Rozmrażać mitotycznie inaktywowany zamrożony wywar MEF (etap 2.2) w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 1 minutę i umieścić MEF na pokrytym żelatyną szalku o średnicy 60 mm (jedna zamrożona tubka MEF zawierająca 1,6 x 106 komórek na dwie szalki o średnicy 60 mm, etap 2.2) na 1 dzień przed wysiewem ESC.
  3. Rozmrozić zamrożoną probówkę z ESC (przechowywaną w ilości 2 x 105 ESC/probówkę; liczenie komórek przeprowadzono przy użyciu licznika komórek) w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 1 minutę i umieścić 1 x 105 ESC na naczyniu o średnicy 60 mm zawierającym wstępnie zasiew MEF (krok 4.1).
  4. Hodowla w 4 ml pożywki hodowlanej ESC (ESCM, zmodyfikowana pożywka na bazie DMEM z 15% (v/v) płodową surowicą bydlęcą, 2 mM substratu L-glutaminy, 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny, 0,1 mM 2-merkaptoetanolu, czynnika hamującego białaczkę i t2i (0,2 μM PD0325901 i 3 μM CHIR99021), która utrzymuje pluripotencję ESC11) w temperaturze 37 °C z 5% CO2 do momentu, gdy ESC osiągnie 50% do 70% konfluencji.
    UWAGA: Używamy trzech różnych linii ESC: JM8. A3 z B6N, V6.5 z B6-129 F1 i opracowany przez nas BALB/c ESC. Te same protokoły KI w tym manuskrypcie są używane dla wszystkich linii ESC.
  5. Umyj hodowlę ESC 4 ml PBS, a następnie potraktuj 800 μl 0,25% roztworu trypsyny-EDTA przez 5 minut w temperaturze 37 °C w celu roztrawienia. Dodać 1 ml ESCM, aby dezaktywować trypsynę i dysocjować ESC na pojedyncze komórki przez pipetowanie.
  6. Odwirować roztwór zawierający ESC przez 5 minut przy 280 x g, wyrzucić supernatant, ponownie zawiesić ESC w świeżym 1 ml ESCM i policzyć liczbę komórek za pomocą licznika komórek z barwieniem błękitem trypanowym. Przenieść 1 x 105 ESC do nowej probówki o pojemności 1,5 ml i przemyć je trzykrotnie PBS przez odwirowanie w temperaturze 500 x g, 4 °C.
  7. Zawiesić osad ESC w 12 μl mieszaniny Cas9-RNP-DNA (krok 3.3) i dobrze wymieszać przez delikatne pipetowanie, aby uniknąć bulgotania. Podać ponownie zawieszony ESC do elektroporacji. System elektroporacji wykorzystuje pojedynczy impuls o napięciu 1400 V i czasie 30 ms do transdukcji Cas9-RNP-DNA (Rysunek 1).
  8. Wyhodować elektroporowane ESC w 60-milimetrowej szalce zawierającej 4 ml ESCM z mitotycznie inaktywowanym MEF (sekcja 4.2). Zmieniaj podłoże codziennie.
  9. Przemyć ESC 4 ml PBS 3 do 5 dni po elektroporacji, a następnie potraktować 800 μl 0,25% trypsyny-EDTA i hodować w temperaturze 37 °C przez 5 minut w wilgotnym inkubatorze w celu roztrawienia. Dodać 2 ml ESCM, aby zatrzymać trawienie trypsyny i odwirować mieszaninę komórek przy 280 x g przez 5 minut.
  10. Odrzucić supernatant, ponownie zawiesić ESC w 1 ml świeżego ESCM i policzyć stężenie komórek za pomocą licznika komórek z barwieniem błękitem trypanowym. Przechodzić przez ESC w odległości 1 x 103 ESC na 60 mm szalkę zawierającą ESCM i podajnik MEF. Zmieniaj pożywkę codziennie, aż kolonia się zregeneruje.
    UWAGA: Powodem, dla którego ESC jest przekazywany raz przed pobraniem, było to, że edycja genomu może nadal zachodzić po podziale ESC, więc pierwsza kolonia nie zawsze jest klonem w wielu przypadkach. Dlatego pierwsze przejście ESC przed pobraniem kolonii jest niezbędnym krokiem do pobrania pojedynczych klonów.

5. Genotypowanie PCR docelowych ESC

  1. Odessać ESCM z szalki hodowlanej ESC 5 do 7 dni po pierwszym pasażu (krok 4.9) i dodać 4 ml PBS. Pobrać pojedyncze kolonie ESC z 5 μl PBS za pomocą pipety 20 μl pod mikroskopem stereoskopowym (powiększenie od 30x do 40x). Umieść poszczególne kolonie w studzience z okrągłodenną 96-dołkową płytką zawierającą 15 μl 0,25% roztworu trypsyny-EDTA.
  2. Trzymaj 96-dołkową płytkę na lodzie, aż 48 pojedynczych kolonii zostanie zebranych. Inkubować 96-dołkową płytkę przez 5 minut w inkubatorze o temperaturze 37 °C, wilgotnym 5%CO2, a następnie dodać 80 μl ESCM, aby zatrzymać trawienie trypsyny i dysocjować kolonie ESC na pojedyncze komórki przez pipetowanie.
    UWAGA: Ponieważ skuteczność KI tej metody wynosi zwykle 10%-50%, rutynowo wybieramy 48 klonów i najpierw przeprowadzamy genotypowanie przy użyciu 24 z nich. Jeśli w tym momencie nie można uzyskać wielu klonów KI, przeprowadzamy dalsze badania przesiewowe pod kątem KI, używając pozostałych 24 klonów.
  3. Przenieść 40 μl zawiesiny ESC (etap 5) na pokrytą żelatyną, niezawierającą podawania 96-dołkową płytkę zawierającą 50 μl ESCM na basenik w celu genotypowania PCR. Pozostałe 60 μl zawiesiny ESC przenieść do studzienki na 24-dołkowej płytce pokrytej żelatyną, która zawiera 500 μl ESCM i podajnika MEF, w celu wytworzenia zamrożonego materiału ESC.
  4. Umieść indywidualne klony ESC hodowane na płytce 24-dołkowej (krok 5.3), aż osiągną zlewność od 60% do 80%. Odzyskaj pojedyncze klony ESC przez trypsynizację, jak wspomniano powyżej, zbierz komórki w nowej probówce o pojemności 1,5 ml i odwiruj przy 280 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant, ponownie zawiesić komórki w 500 μl pożywki do zamrażania komórek i zamrozić je w głębokim zamrażaniu o temperaturze -80 °C.
  5. W przypadku genotypowania PCR klony ESC hoduje się na 96-dołkowej płytce wolnej od karmowania (krok 5.3), aż ESC osiągnie więcej niż 90% konfluencji. Usunąć ESCM z każdej studzienki przez aspirację i przemyć dwukrotnie 100 μl PBS.
  6. Odessać PBS i dodać 100 μl buforu do lizy zawierającego proteinazę K, dobrze wymieszać i przenieść lizat ESC do nowej probówki o pojemności 1,5 ml. Podgrzewać lizat ESC w temperaturze 65 °C przez co najmniej 1 godzinę w komorze grzewczej. Ekstrahować i oczyszczać genomowe DNA przy użyciu konwencjonalnej metody oczyszczania DNA fenolowo-chloroformowego, a następnie wytrącać etanol.
  7. Rozpuścić wytrącone DNA w 20 μl wody wolnej od DNaz i oznaczyć czystość i stężenie DNA za pomocą spektrofotometru. Wykonaj genomowy PCR przy użyciu zestawów starterów specyficznych dla locus w celu amplifikacji regionu docelowego. Następnie sprawdź sekwencję i wybierz klony ESC z żądanymi sekwencjami KI.

6. Przygotowanie ośmiokomórkowego zarodka i mikroiniekcja ESC

  1. Wstrzyknąć 5 j.m. surowicy ciężarnej klaczy gonadotropiny (PMSG) dootrzewnowo dorosłym samicom ICR. Po 48 godzinach wstrzyknąć 5 j.m. ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej (hCG) tym samym samicom, a następnie połączyć samice leczone hormonem z samcami ICR. Sprawdź czop kopulacyjny w pochwie następnego dnia (dzień embrionalny 0,5, ED0,5).
    UWAGA: Aby ocenić chimeryzm na podstawie proporcji koloru sierści, użyj blastocysty ze szczepu ICR jako biorcy dla ESC, który ma tło w kolorze czarnym lub agouti, lub blastocysty ze szczepu C57BL/6 jako biorcę dla ESC, który ma tło albinosa.
  2. Zbierz jajowód w ED1,5 i umieść go w kroplach buforowanej pożywki HEPES (FHM). Odzyskaj zarodki w stadium dwukomórkowym lub czterokomórkowym, przepłukując jajowód FHM za pomocą igły płuczącej wprowadzonej do lejka.
  3. Umyj pobrane zarodki, przenosząc je do kilku świeżych kropli FHM za pomocą pipety doustnej. Hodowlę zarodków w 50 μl KSOM upuścić na 35-milimetrowe naczynie do hodowli komórkowej pokryte olejem mineralnym w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 1 dzień, aż do osiągnięcia stadium ośmiokomórkowego lub moruli (ED2,5).
  4. Jeżeli zarodki nie zostaną wykorzystane w następnym dniu pobrania, należy je zamrozić przez witryfikację zgodnie z protokołem CARD (http://card.medic.kumamoto-u.ac.jp/card/english/sigen/manual/ebvitri.html) i przechowywać w ciekłym azocie do czasu wykorzystania.
  5. Przygotuj szklane pipety do przetrzymywania zarodków (średnica zewnętrzna 80-100 μm) i iniekcji ESC (średnica około 13 μm) za pomocą ściągacza i mikrokuźni.
  6. Zintegrować pipetę podtrzymującą, która zawiera FHM, z uchwytem kapilarnym podłączonym do mikrowtryskiwacza i ustawionym po lewej stronie mikromanipulatora. Podłącz pipetę iniekcyjną do innego mikrowstrzykiwacza i ustaw ją po prawej stronie. Ustaw obie pipety prosto w polu view mikroskopu.
  7. Dozuj 5 μl kropli 12% (w/v) poliwinylopirolidonu (PVP) w pożywce FHM i 5 μl kropli FHM na tę samą pokrywkę naczynia o średnicy 60 mm obok siebie i przykryj krople olejem mineralnym. Przenieść zarodki w kropli 5 μl FHM i dodać 1-5 μl zawiesiny ESC do kropli FHM zawierającej zarodki.
    UWAGA: Pozostaw zawiesinę ESC i MEF na 30 minut w naczyniu hodowlanym 4 ml ESM na 60 mm przed przygotowaniem kropli. Ponieważ MEF-y przyklejają się do dna szybciej niż ESC, ta 30-minutowa inkubacja pozwala na koncentrację nieprzyłączonych komórek ES w supernatancie.
  8. Umyć wnętrze pipety iniekcyjnej PVP, a następnie przejść do kropli zawierającej zarodki i ESC.
  9. Pobrać w pipecie iniekcyjnej trzy pojedyncze dublety ECS, które właśnie zakończyły podział komórek (sześć komórek). Trzymać zarodek w stadium ośmiokomórkowym lub w stadium moruli, który zakończył zagęszczenie, za pomocą pipety do trzymania przez aspirację. Zrób otwór w osłonie przejrzystej za pomocą impulsu piezoelektrycznego (intensywność: 3; prędkość: 3). Wyrzuć sześciokomórkowy ESC do wnętrza osłonki przejrzystej i wyciągnij pipetę z zarodków.
  10. Delikatnie umyć zarodki, którym wstrzyknięto ESC, kilkoma kroplami KSOM za pomocą pipety doustnej i inkubować je w nowej kropli KSOM o pojemności 50 μl pokrytej olejem mineralnym w temperaturze 37 °C, 5% CO2 , aż zarodki rozwiną się do stadium blastocysty.
  11. Przenieś 10 blastocyst wstrzykniętych przez ESC do każdego rogu macicy samic myszy w ciąży (2,5 dnia po stosunku, 20 blastocyst na głowę).
  12. Po porodzie matki zastępczej wybierz co najmniej dwie męskie chimery o najwyższym współczynniku chimeryzmu (70% lub więcej, co potwierdza kolor sierści), a następnie połącz je z odpowiednimi samicami szczepu, aby uzyskać heterozygotyczne KI F1.
  13. Hoduj indywidualne myszy KI z odpowiednimi partnerami, aby uzyskać myszy o pożądanym genotypie (genotypach) lub tle genetycznym odpowiednim do badań.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Skupiliśmy się na konkretnych genach w ESC, a następnie na produkcji chimer, aby rozwinąć produkcję myszy manipulowaną genami, zgodnie z naszym poprzednim manuskryptem11. Genotypowanie ESC (opisane w punkcie 4) jest rutynowo przeprowadzane metodą PCR przy użyciu starterów. Startery są zaprojektowane na sekwencjach genomowych poza ramionami homologii i specyficznych sekwencjach we fragmencie DNA KI (Figura 2A). W takim przypadku nie dochodzi do amplifikacji allelu typu dzikiego, podczas gdy amplikon PCR o określonej wielkości jest wykrywany tylko wtedy, gdy docelowe egzogenne DNA ma wartość KI w locus docelowym. Reprezentatywne wyniki genotypowania PCR są pokazane w Rysunek 2B. Dziewięć z 22 klonów (40,9%) wykazało w tym przypadku pasmo specyficzne dla KI. Trzy reprezentatywne wyniki kierowania, w tym wynik pokazany w Rysunek 2, przedstawiono w tabeli 1. Wyniki te wskazują, że przedstawiona tutaj metoda jest skuteczna i odtwarzalna dla genu KI bez konieczności wyboru leków.

ESC jest pobierany w pipecie do iniekcji, następnie wykonuje się otwór w osłonie przezroczystej za pomocą plusa piezoelektrycznego, a ESC jest uwalniany między komórkami embrionalnymi (Rysunek 3). Technicznie rzecz biorąc, ten protokół wstrzykiwania ESC do ośmiokomórkowego zarodka lub stadium moruli jest podobny do protokołu wstrzykiwania ESC do blastocysty powszechnie stosowanej w wielu obiektach myszy. Reprezentatywne myszy chimeryczne są pokazane w Rysunek 4. Do oceny chimeryzmu koloru sierści wykorzystano zarodek ze szczepu ICR (albinos, białe włosy) jako biorcę B6 lub B6-129 F1 ESC, a zarodki B6 wykorzystano jako biorcę ESC BALB/c (Ryc. 4).

figure-results-1
Rysunek 1: Schemat integracji kolistego plazmidu za pośrednictwem rybonukleoproteiny (RNP) za pośrednictwem CRISPR/Cas9 do specyficznego locus genomu ESC. Elektroporacja wprowadza plazmid kołowy jako wektor celowania do ESC z Cas9-RNP. Skróty: GOI = gen zainteresowania, HA = ramię homologiczne. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Analizy genomiczne PCR do badań przesiewowych KI docelowych klonów ESC. (A) Startery PCR specyficzne dla KI są projektowane na sekwencjach genomowych poza ramionami homologii (do przodu) i w specyficznych sekwencjach we fragmencie DNA KI (na odwrót). (B) Reprezentatywne wyniki genotypowania PCR. Jako kontrolę negatywną wykorzystano genom typu dzikiego. Skróty: GOI = gen zainteresowania, HA = ramię homologiczne. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Reprezentatywne obrazy wstrzyknięcia zarodka w stadium ośmiokomórkowym. (A) Do mikroiniekcji pobiera się trzy dublety ESC (sześć komórek, groty strzałek). (B) Otwór w osłonie przejrzystej jest wytwarzany za pomocą impulsu piezoelektrycznego, a ESC są wydalane pomiędzy każdym blastomerem. Pokazany pasek skali to 50 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Reprezentatywne obrazy myszy chimera. (A,B) ESC wywodzący się z C57BL/6N (JM8. A3, włosy Agouti; A) lub B6-129 F1 (włosy Agouti; B) są wstrzykiwane do zarodków ICR (albinosy, białe włosy), a następnie przenoszone są do matek zastępczych. (C) ESC pochodzący z BALB/c (albinos, białe włosy) jest wstrzykiwany do zarodków C57BL/6J (czarne włosy), a następnie przenoszony do matek zastępczych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

szt. . szt. szt. . szt. szt. TGL
Identyfikator projektuChoromosomDługość 5'HA (bp)Długość 3'HA (bp)Wielkość płytki (bp)Liczba analizowanych klonówLiczba klonów KISprawność (%)Uwagi
Czynnik chłodniczy R26-CC*Chr6965Numer katalogowy 1006Numer katalogowy 532123cyfra arabska8,7 proc-
Czynnik chłodniczy R4-03*Rozdział 81000997Numer katalogowy: 307022 Rozdział 22627,3 proc-
Zobacz materiał P4-01*Chr1510001000Numer katalogowy 256922 Rozdział 22940,9%Pokazane w Rysunek 2

Tabela 1: Efektywność KI w trzech niezależnych loci genomowych w ESC. *Te projekty nie zostały do tej pory opublikowane. Nazwa tych genów zostanie w przyszłości ujawniona w niezależnych manuskryptach.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celowanie genowe w ESC, po którym następuje produkcja chimer, było konwencjonalnie stosowane do rozwoju myszy manipulowanych genami. Niemniej jednak skuteczność knock-in genu pozostaje niska, mimo że wektor celowania zawiera długie (zwykle > kilka kb) ramiona homologii z pozytywnymi lub ujemnymi kasetami genów selekcji leków. Nasz protokół wprowadził dostrojoną metodę ESC KI długiego egzogennego DNA przy użyciu kolistego plazmidu bez żadnych kaset selekcyjnych jako wektora docelowego, któremu towarzyszy edycja genomu za pośrednictwem Cas9-RNP z akceptowalną wydajnością dla rutynowych prac. W związku z tym protokół ten może pomóc w znacznym skróceniu czasu potrzebnego na produkcję genetycznie zmodyfikowanych myszy chimerycznych w porównaniu z konwencjonalnym celowaniem w ESC.

W tym protokole użyliśmy CRISPR/Cas9-RNP do wywołania specyficznych dla miejsca pęknięć dwuniciowych w genomie, a jako wektor celowy użyto kolistego plazmidu zamiast linearyzowanego. Zlinearyzowane plazmidy są konwencjonalnie stosowane jako wektor celujący dla genu KI ze względu na ich zwiększoną skuteczność integracji genomowej 8,9,10. Jednak wiele integracji genomowych jest niespecyficznych, mimo że wektor zawiera homologiczne ramiona9. Z drugiej strony, plazmidy kołowe są rzadko używane jako wektory docelowe ze względu na ich trudną do zintegrowania cechę z genomemESC12 lub fibroblastów13. W związku z tym możliwe jest, że zastosowanie kolistego plazmidu jako wektora docelowego, któremu towarzyszy edycja genomu za pośrednictwem CRISPR/Cas9, minimalizuje niespecyficzną integrację losową, ale maksymalizuje integrację specyficzną dla miejsca z genomem ESC. Warto zauważyć, że wydajność indukcji zerwania dwuniciowego przez CRISPR/Cas9 jest dość ważna14, dlatego konieczne byłoby użycie gRNA, które indukuje zerwanie dwuniciowe z wysoką wydajnością. Należy rozważyć przeprojektowanie gRNA, gdy wydajność KI jest zbyt niska. W przypadku pokazanym na rysunku 2 40,9% klonów ESC wykazywało pasmo specyficzne dla KI. W rzeczywistości, jako główne laboratorium instytutu, rutynowo przeprowadzamy celowanie genów za pomocą ESC metodą opisaną tutaj i osiągnęliśmy wydajność KI na poziomie 10%-50% dla sekwencji 1-2 kb, takich jak Cre, CreERT lub reportery fluorescencyjne, chociaż istnieją pewne różnice w zależności od locus genu. Najdłuższe sekwencje DNA, które udało nam się uzyskać metodą KI, to około 11,2 kb do locus Rosa26, a wydajność wyniosła 12,2% (pięć kolonii KI na 41 analizowanych kolonii).

Warto również zauważyć, że protokół ten wykorzystuje zarodki ośmiokomórkowe lub w stadium moruli jako biorców do mikroiniekcji ESC, ale nie zarodki w stadium blastocysty. Chociaż w tym artykule nie przeprowadziliśmy eksperymentów porównawczych, kilka doniesień wykazało, że wstrzyknięcie ESC do zarodków w stadium ośmiokomórkowym lub w stadium moruli znacznie poprawia efektywność wkładu ESC do chimerycznego potomstwa w porównaniu z wstrzyknięciem ESC do blastocyst 15,16,17,18 . Rzeczywiście, wstrzyknięcia ESC różnych linii ESC, w tym C57BL/6, B6-129 F1 i BALB/c, często powodowały rozwój chimery o wysokim kolorze sierści u niektórych, ale nie wszystkich, potomstwa (patrz Rysunek 4). Ograniczeniem tej metody jest to, że EKM wstrzyknięte do zarodka preimplantacyjnego nie zawsze mogły przyczyniać się do powstania komórek rozrodczych w chimerze19,20. Przenoszenie EKM do linii zarodkowej zależałoby od jakości każdego klonu ESC19. Dlatego korzystne byłoby opracowanie wielu linii klonów ESC jako kopii zapasowej dla stabilnej produkcji myszy chimerycznych. Podsumowując, przedstawione tutaj protokoły wykorzystują proste wektory celowania, które obejmują tylko każde ramię homologiczne i gen będący przedmiotem zainteresowania dla KI bez żadnej kasety lekoopornej. W związku z tym konstrukcja wektora byłaby znacznie łatwiejsza, a okres hodowli mógłby zostać skrócony w porównaniu z konwencjonalną techniką celowania ESC. Pomogłoby to w szybkiej i łatwej produkcji różnych typów genetycznie modyfikowanych myszy do przyszłej analizy w naukach przyrodniczych.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają żadnych sprzecznych interesów, które mogliby ujawnić.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Saki Nishioce z Uniwersytetu w Osace, Biotechnology Research and Development (organizacja non-profit) oraz Mio Kikuchi i Reiko Sakamoto z Instytutu Nauk Medycznych, Uniwersytetu Tokijskiego, za ich doskonałą pomoc techniczną. Prace te były wspierane przez: Ministerstwo Edukacji, Kultury, Sportu, Nauki i Technologii (MEXT)/Japońskie Towarzystwo Promocji Nauki (JSPS) granty KAKENHI dla MI (JP19H05750, JP21H05033) i MO (20H03162); grant Core Research for Evolutional Science and Technology (CREST), grant Japońskiej Agencji ds. Nauki i Technologii (JST) dla MI (JPMJCR21N1 ); Narodowy Instytut Zdrowia Dziecka i Rozwoju Człowieka im. Eunice Kennedy Shriver do MI (R01HD088412); Fundacji Billa i Melindy Gatesów dla MI (grant Grand Challenges Explorations INV-001902); oraz grant na wspólny projekt badawczy Instytutu Badawczego Chorób Mikrobiologicznych Uniwersytetu w Osace dla MI i MO.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
BALB / c ESC-ESC opracowany ze szczepu BALB / c
BambankerNippon GeneticsCS-02-001Pożywka do zamrażania komórek. Sekcja 2.6 i gdzie indziej
Cas9 Nuclease V3IDT1081059Sekcja 3.2 i gdzie indziej.
CHIR99021FUJIFILM Wako038-23101Sekcja 4.3
Fragment genu CreERTGeneWizSekcja 1.1.
CRISPR-Cas9 crisprRNAIDTcrisprRNA. Sekcja 3.1 i inne miejsca.
CRISPR-Cas9 tracrRNAIDT1072534tracrRNA. Sekcja 3.1 i inne miejsca.
DMEMNacalai08458-45MEF średni. Sekcja 2.3 i gdzie indziej
Bufor dupleksowyIDT1072534Bufor rozcieńczający RNA. Sekcja 3.1 i inne miejsca.
Zestaw do ekstrakcji żelem/PCR FastGeneNippon GeneticsFG-91302sekcja 1.1 i 1.2.
GlutaMaxThermo Fisher35-050-061Podłoże L-glutatime
hCGASKA Sekcja Zdrowia6.1.
Zestaw do klonowania In-Fusion HD Zestaw do klonowaniaClontech639648. Sekcja 1.3 i inne
JM8. A3 ESCEuMMCR-ESCopracowany z C57BL/6N szczepu
Knock-out DMEMThermo Fisher10829018sekcji 4.3 i innych, zmodyfikowanych pożywek komercyjnych na bazie DMEM.
KSOMMerckMR-121-DSekcja 6.3 i 6.9.
Czynnik hamujący białaczkęFUJIFILM Wako125-05603Sekcja 4.3. Dostawca nie dostarcza żadnych danych dotyczących stężenia jednostkowego. Zastosowano 1,000-krotne rozcieńczenie w tym protokole.
System elektroporacji neonowejThermo FisherMPK5000sekcja 3.2, 4.5 i inne. System zawiera bufor elektroporacyjny, który został również użyty w sekcji 3.2.
NucleoSpin Plasmid Transfekcja klasyTakaraU0490BSekcja 1.6.
PD0325901FUJIFILM Wako162-25291Sekcja 4.3
PMSGASKA ZdrowieSekcja 6.1.
Bufor do lizy ogonaNacalai06169-95Sekcja 5.5.
Trypsin-EDTANacalai32777-15Sekcja 2.2 i gdzie indziej
V6.5 ESC-szczepu B6J-129 F1
HitachiMBR-1618R-BESekcja 2.6.
Zwierząt DNA miejsca zwierząt ESC opracowany na podstawie urządzenia do napromieniania rentgenowskiego

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  2. Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
  3. Yang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).
  4. Oji, A., et al. CRISPR/Cas9 mediated genome editing in ES cells and its application for chimeric analysis in mice. Scientific Reports. 6, 31666(2016).
  5. Kaneko, T., Mashimo, T. Simple genome editing of rodent intact embryos by electroporation. PLoS One. 10 (11), 0142755(2015).
  6. Chen, F., et al. High-frequency genome editing using ssDNA oligonucleotides with zinc-finger nucleases. Nature Methods. 8 (9), 753-755 (2011).
  7. Hashimoto, M., Yamashita, Y., Takemoto, T. Electroporation of Cas9 protein/sgRNA into early pronuclear zygotes generates non-mosaic mutants in the mouse. Developmental Biology. 418 (1), 1-9 (2016).
  8. Mansour, S. L., Thomas, K. R., Capecchi, M. R. Disruption of the proto-oncogene int-2 in mouse embryo-derived stem cells: a general strategy for targeting mutations to non-selectable genes. Nature. 336 (6197), 348-352 (1988).
  9. Johnson, R. S., et al. Targeting of nonexpressed genes in embryonic stem cells via homologous recombination. Science. 245 (4923), 1234-1236 (1989).
  10. Hasty, P., Ramires-Solis, R., Krumlauf, R., Bradley, A. Introduction of a subtle mutation into the Hox-2.6 locus in embryonic stem cells. Nature. 350 (6315), 243-246 (1991).
  11. Ozawa, M., Emori, C., Ikawa, M. Gene targeting in mouse embryonic stem cells via CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein (RNP) mediated genome editing. Genome Editing in Animals - Methods and Protocols 2nd edition. Hatada, I. , (2022).
  12. Yagi, M., et al. Derivation of ground-state female ES cells maintaining gamete-derived DNA methylation. Nature. 548 (7666), 224-227 (2017).
  13. Gassmann, M., Donoho, G., Berg, P. Maintenance of an extrachromosomal plasmid vector in mouse embryonic stem cells. Proceedings of National Academy of Sciences. 92 (5), 1292-1296 (1995).
  14. Okita, K., Nakagawa, M., Hyenjong, H., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation of mouse induced pluripotent stem cells without viral vectors. Science. 322 (5903), 949-953 (2008).
  15. Poueymirou, W. T., et al. F0 generation mice fully derived from gene-targeted embryonic stem cells allowing immediate phenotypic analyses. Nature Biotechnology. 25 (1), 91-99 (2007).
  16. Hu, M., et al. Efficient production of chimeric mice from embryonic stem cells injected into 4- to 8-cell and blastocyst embryos. Journal of Animal Science and Biotechnology. 4 (1), 1-7 (2013).
  17. Guo, J., et al. Contribution of Mouse Embryonic Stem Cells and Induced Pluripotent Stem Cells to Chimeras through Injection and Coculture of Embryos. Stem Cells International. 2014, 409021(2014).
  18. Bodai, Z., Bishop, A. L., Gantz, V. M., Komor, A. C. Targeting double-strand break indel byproducts with secondary guide RNAs improves Cas9 HDR-mediated genome editing efficiencies. Nature Communications. 13 (1), 2351(2022).
  19. Kobayashi, T., Goto, T., Oikawa, M., Sanbo, M., Yoshida, F., Terada, R., Niizeki, N., Kajitani, N., Kazuki, K., Kazuki, Y., Hochi, S., Nakauchi, H., Surani, A., Hirabayashi, M. Blastocyst complementation using Prdm14-deficient rats enables efficient germline transmission and generation of functional mouse spermatids in rats. Nature Communications. 12 (1), 1328(2021).
  20. Miura, K., Matoba, S., Hirose, M., Ogura, A. Generation of chimeric mice with spermatozoa fully derived from embryonic stem cells using a triple-target CRISPR method for Nanos3. Biology of Reproduction. 104 (1), 223-233 (2021).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Gene Knock InGenome EditingElectroporationPCR GenotypingChimera MiceCell Culture

Powiązane artykuły