Artykuł metodologiczny

Izolacja wektorów terapii genowej nowej generacji poprzez inżynierię, kodowanie kreskowe i badania przesiewowe wariantów kapsydu wirusa związanego z adenowirusem (AAV)

DOI:

10.3791/64389

⸱

18 października 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Infectious Diseases/Virology, Section Viral Vector Technologies, Medical Faculty, University of Heidelberg, 2BioQuant Center, BQ0030, University of Heidelberg, 3Cluster of Excellence CellNetworks, 4German Center for Infection Research (DZIF), 5German Center for Cardiovascular Research (DZHK)

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

AAV generowanie biblioteki wyświetlania peptydów i późniejsza walidacja poprzez kodowanie kreskowe kandydatów o nowych właściwościach do tworzenia AAV nowej generacji.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wektory dostarczania genów pochodzące z wirusa związanego z adenowirusem (AAV) są jednym z najbardziej obiecujących narzędzi do leczenia chorób genetycznych, czego dowodem są zachęcające dane kliniczne i zatwierdzenie kilku terapii genowych AAV. Dwa główne powody sukcesu wektorów AAV to (i) wcześniejsza izolacja różnych naturalnie występujących serotypów wirusowych o odrębnych właściwościach oraz (ii) późniejsze opracowanie potężnych technologii inżynierii molekularnej i ponownego wykorzystania w wysokiej przepustowości. Potencjał tych technik dodatkowo zwiększają niedawno wdrożone strategie kodowania kreskowego wybranych kapsydów AAV na poziomie DNA i RNA, co pozwala na ich kompleksową i równoległą stratyfikację in vivo we wszystkich głównych narządach i typach komórek u jednego zwierzęcia. W tym miejscu przedstawiamy podstawowy rurociąg obejmujący ten zestaw uzupełniających się ścieżek, wykorzystując wyświetlacz peptydów AAV do reprezentowania różnorodnego arsenału dostępnych technologii inżynieryjnych kapsydu. W związku z tym najpierw opisujemy kluczowe etapy generowania biblioteki wyświetlania peptydów AAV w celu selekcji in vivo kandydatów o pożądanych właściwościach, a następnie pokazujemy, jak kodować kreskowo najciekawsze warianty kapsydu do wtórnych badań przesiewowych in vivo. Następnie przedstawimy przykładową metodologię tworzenia bibliotek do sekwencjonowania nowej generacji (NGS), w tym wzmacniania kodów kreskowych i ligacji adapterów, a na koniec omówimy najważniejsze kroki podczas analizy danych NGS. Ponieważ przedstawione tutaj protokoły są wszechstronne i można je dostosować, naukowcy mogą je łatwo wykorzystać do wzbogacenia optymalnych wariantów kapsydu AAV w swoim ulubionym modelu choroby i do zastosowań w terapii genowej.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Terapia transferu genów polega na wprowadzeniu materiału genetycznego do komórek w celu naprawy, wymiany lub zmiany komórkowego materiału genetycznego w celu zapobiegania, leczenia, leczenia lub łagodzenia choroby. Transfer genów, zarówno in vivo, jak i ex vivo, opiera się na różnych systemach dostarczania, niewirusowych i wirusowych. Wirusy ewoluowały w sposób naturalny, aby skutecznie transdukować swoje komórki docelowe i mogą być wykorzystywane jako wektory dostarczania. Spośród różnych typów wektorów wirusowych stosowanych w terapii genowej, wirusy związane z adenowirusami są coraz częściej stosowane, ze względu na ich brak chorobotwórczości, bezpieczeństwo, niską immunogenność, a co najważniejsze, ich zdolność do podtrzymywania długotrwałej, nieintegrującej ekspresji1,2,3. Terapia genowa AAV przyniosła znaczące osiągnięcia w ciągu ostatniej dekady; Trzy terapie zostały zatwierdzone przez Europejską Agencję Leków i Amerykańską Agencję ds. Żywności i Leków do stosowania u ludzi3,4. Prowadzonych jest również kilka badań klinicznych mających na celu leczenie różnych chorób, takich jak hemofilia, choroby mięśni, serca i neurologiczne, jak omówiono w innym miejscu3. Pomimo dziesięcioleci postępu, dziedzina terapii genowej doświadczyła serii niepowodzeń w ostatnich latach4, przede wszystkim zgonów w badaniach klinicznych5, które zostały wstrzymane z powodu toksyczności ograniczającej dawkę, szczególnie dla tkanek masywnych, takich jak mięśnie, lub trudno dostępnych, takich jak brain6.

Wektory AAV obecnie używane w badaniach klinicznych należą do naturalnych serotypów z kilkoma wyjątkami1. Inżynieria AAV daje możliwość opracowania wektorów o doskonałej specyficzności i wydajności narządów lub komórek. W ciągu ostatnich dwóch dekad z powodzeniem zastosowano kilka podejść, takich jak wyświetlanie peptydów, zamiana pętli, tasowanie DNA kapsydu, podatny na błędy PCR i projektowanie celowane, w celu wygenerowania indywidualnych wariantów AAV lub ich bibliotek o różnych właściwościach7. Są one następnie poddawane wielu rundom ukierunkowanej ewolucji, aby wybrać warianty w nich o pożądanych właściwościach, zgodnie z przeglądem w innym miejscu1,3. Spośród wszystkich strategii ewolucji kapsydu, biblioteki AAV z wyświetlaczem peptydów są najczęściej stosowane, ze względu na pewne unikalne właściwości: są stosunkowo łatwe do wygenerowania i mogą osiągnąć wysoką różnorodność i sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości, co pozwala śledzić ich ewolucję.

Pierwsze udane biblioteki AAV do wprowadzania peptydów zostały opisane prawie 20 lat temu. W jednym z pierwszych, Perabo i wsp.8 skonstruowali bibliotekę zmodyfikowanych kapsydów AAV2, w której pula losowo generowanych oligonukleotydów została umieszczona w plazmidzie w pozycji odpowiadającej aminokwasowi 587 białka kapsydu VP1, w trzykrotnej osi wystającej z kapsydu. Wykorzystując koinfekcję adenowirusem, biblioteka AAV ewoluowała przez wiele rund selekcji, a końcowe warianty ponownie ukierunkowane okazały się zdolne do transdukcji linii komórkowych opornych na leczenie do rodzicielskiego AAV28. Wkrótce potem Müller i in.9 wprowadzili dwuetapowy system tworzenia bibliotek, co stanowiło znaczące ulepszenie protokołu. Początkowo biblioteka plazmidów, wraz z plazmidem pomocniczym adenowirusa, jest używana do wytworzenia biblioteki AAV, która zawiera chimeryczne kapsydy. Ta biblioteka wahadłowców AAV służy do infekowania komórek przy niskiej wielokrotności infekcji (MOI), w celu wprowadzenia jednego genomu wirusa na komórkę. Koinfekcja adenowirusem zapewnia produkcję AAV o pasującym genomie i capsid9. Około dekadę później Dalkara10 wykorzystał ewolucję ukierunkowaną in vivo do stworzenia wariantu 7m8. Ten wariant ma insercję 10 aminokwasów (LALGETTRPA), z których trzy działają jako łączniki i skutecznie celuje w zewnętrzną siatkówkę po wstrzyknięciu doszklistkowym10. Ten zmodyfikowany kapsyd jest wyjątkową historią sukcesu, ponieważ jest to jeden z niewielu zmodyfikowanych kapsydów, które do tej pory trafiły do kliniki11.

Dziedzina doświadczyła drugiego impulsu wraz z wprowadzeniem technik sekwencjonowania nowej generacji (NGS). Dwie publikacje z Adachi et al.12 w 2014 r. oraz z Marsic et al.13 w 2015 r., pokazały moc NGS w śledzeniu dystrybucji bibliotek kapsydów AAV z kodami kreskowymi z dużą dokładnością. Kilka lat później NGS regionów oznaczonych kodem kreskowym został dostosowany do regionu insercji peptydu, aby podążać za ewolucją kapsydu. Körbelin i wsp.14 przeprowadzili badanie przesiewowe pod kontrolą NGS w celu zidentyfikowania kapsydu opartego na AAV2 ukierunkowanego na płuca. Analiza NGS pomogła obliczyć trzy wyniki oceny: wynik wzbogacenia między rundami selekcji, ogólny wynik swoistości w celu określenia swoistości tkankowej i wreszcie łączny wynik14. W tym samym roku Gradinaru lab15 opublikował system ukierunkowanej ewolucji AAV oparty na rekombinacji Cre (CREATE), który ułatwia selekcję specyficzną dla typu komórki. W tym systemie biblioteka kapsydów zawiera przełącznik odwracalny Cre, ponieważ sygnał polyA jest otoczony przez dwa miejsca loxP. Biblioteka AAV jest następnie wstrzykiwana myszom Cre, gdzie sygnał poliA jest odwracany tylko w komórkach Cre +, zapewniając matrycę do wiązania startera odwrotnego PCR ze starterem do przodu w genie kapsydu. Ten wysoce specyficzny ratunek PCR umożliwił identyfikację AAV-PHP. Wariant B, który może przekroczyć barierę krew-mózg15. System ten został następnie rozwinięty w M-CREATE (Multiplexed-CREATE), w którym NGS i generowanie bibliotek syntetycznych zostały zintegrowane w pipeline16.

Ulepszona, oparta na RNA wersja tego systemu z laboratorium Maguire'a17, iTransduce, umożliwia selekcję na poziomie DNA kapsydów, które funkcjonalnie przekształcają komórki i wyrażają ich genomy. Genom wirusa w bibliotece wyświetlającej peptydy składa się z genu Cre pod kontrolą wszechobecnego promotora i genu kapsydu pod kontrolą promotora p41. Biblioteka jest wstrzykiwana myszom, które mają kasetę loxP-STOP-loxP przed tdTomato. Komórki transdukowane wariantami AAV, które wyrażają genom wirusa, a tym samym Cre wyrażają tdTomato i, w połączeniu z markerami komórkowymi, można sortować i wybierać17. Podobnie, Nonnenmacher et al.18 i Tabebordbar et al.19 umieścili bibliotekę genów kapsydu pod kontrolą specyficznych tkankowo promotorów. Po wstrzyknięciu w różne modele zwierzęce, wirusowe RNA użyto do wyizolowania wariantów kapsydu.

Alternatywnym podejściem jest użycie kodów kreskowych do oznaczania bibliotek capsid. Björklund lab20 wykorzystał to podejście do bibliotek kapsydu do wstawiania peptydów z kodami kreskowymi i opracował racjonalną ewolucję wektorów AAV z kodami kreskowymi (BRAVE). W jednym plazmidzie kaseta Rep2Cap jest klonowana obok transgenu z odwróconym zakończeniem (ITR), eksprymującego żółte białko fluorescencyjne (YFP), oznaczonego kodem kreskowym. Wykorzystując miejsca loxP między końcem nakrętki a początkiem kodu kreskowego, rekombinacja Cre in vitro generuje fragment wystarczająco mały dla NGS, umożliwiając w ten sposób powiązanie insercji peptydu z unikalnym kodem kreskowym (tabela przeglądowa, LUT). Produkcja AAV odbywa się przy użyciu biblioteki plazmidów, a kody kreskowe wyrażone w mRNA są badane przesiewowo po zastosowaniu in vivo, ponownie za pomocą NGS20. Gdy biblioteki kapsydu zawierają warianty całego genu kapsydu (tj. biblioteki przetasowane), należy zastosować sekwencjonowanie z długim odczytem. Kilka grup użyło kodów kreskowych do oznaczania tych różnorodnych bibliotek, co umożliwia NGS większą głębokość odczytu. Kay lab21 oznaczył bardzo zróżnicowane biblioteki tasowania kapsydów z kodami kreskowymi poniżej sygnału poliA czapeczki. W pierwszym kroku wygenerowano bibliotekę plazmidów z kodami kreskowymi, a następnie sklonowano do niej bibliotekę genów kapsydu. Następnie użyto kombinacji MiSeq (krótki odczyt, wyższa głębokość odczytu) i PacBio (długi odczyt, mniejsza głębokość odczytu) NGS, a także sekwencjonowania Sangera, aby wygenerować ich klasę LUT21. W 2019 roku Ogden i jego koledzy z Church lab22 określili przydatność kapsydu AAV2 do wielu funkcji za pomocą bibliotek, które miały pojedyncze mutacje punktowe, insercje i delecje w każdej pozycji, co ostatecznie umożliwiło projektowanie sterowane maszynowo. W celu wygenerowania biblioteki zsyntetyzowano mniejsze fragmenty genu kapsydu, oznaczono kodem kreskowym, zsekwencjonowano nową generację, a następnie sklonowano do pełnego genu kapsydu. Dane NGS zostały wykorzystane do wygenerowania tablicy LUT. Biblioteka została następnie prześwietlona przy użyciu samych kodów kreskowych i sekwencjonowania krótkiego odczytu, co z kolei pozwala na większą głębokość odczytu22.

Biblioteki z kodami kreskowymi były głównie używane do badania puli znanych, naturalnych i zmodyfikowanych wariantów po kilku rundach selekcji bibliotek kapsydu lub niezależnie od badania ewolucji kapsydu. Zaletą takich bibliotek jest możliwość badania przesiewowego wielu kapsydów, przy jednoczesnym zmniejszeniu liczby zwierząt i zminimalizowaniu zmienności między zwierzętami. Pierwsze badania, które wprowadziły tę technologię do dziedziny AAV, zostały opublikowane prawie dekadę temu. Nakai lab12 oznaczył 191 podwójnych mutantów alaniny pokrywających aminokwasy od 356 do 736 na VP1 z AAV9 parą 12-nukleotydowych kodów kreskowych. Korzystając z NGS, biblioteka została przebadana in vivo pod kątem wiązania galaktozy i innych właściwości12. Marsic i współpracownicy nakreślili biodystrybucję wariantów AAV, korzystając również z podwójnej analizy linkowej 1 rok później13. W nowszym badaniu na naczelnych porównano biodystrybucję w ośrodkowym układzie nerwowym 29 kapsydów przy użyciu różnych dróg dostarczania23. Nasze laboratorium opublikowało niedawno ekrany biblioteki AAV z kodami kreskowymi dla 183 wariantów, które zawierały naturalne i zmodyfikowane AAV. Te badania przesiewowe na poziomie DNA i RNA doprowadziły do identyfikacji wysoce miotropowego wariantu AAV 24 u myszy, a także innych wykazujących wysoką swoistość typu komórkowego w mózgu myszy 25.

Tutaj opisujemy metodologię użytą w tej pracy i rozszerzamy ją o badania przesiewowe bibliotek wyświetlania peptydów AAV. Obejmuje to generowanie bibliotek wyświetlania peptydów AAV2, metodę cyfrowego kropelkowego PCR (dd-PCR) do oznaczania ilościowego, a na koniec potok NGS do analizy wariantów AAV, częściowo oparty na pracy Weinmanna i współpracowników24. Na koniec przedstawiono opis generowania bibliotek AAV z kodami kreskowymi oraz potoku NGS wykorzystanego w tej samej publikacji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie biblioteki losowego 7-merowego peptydu AAV2

UWAGA: Aby przygotować bibliotekę losowych peptydów AAV2, zsyntetyzuj zdegenerowane oligonukleotydy jako jednoniciowe DNA, przekształć je w dwuniciowe DNA, trawij, podwiązuj do plazmidu akceptorowego i elektroporatuj.

  1. Projektowanie zdegenerowanych oligonukleotydów
    1. Uporządkuj zdegenerowane oligonukleotydy i unikaj stronniczości kodonów. W oligonukleotydzie 5' CAGTCGGCCAG AG W GGC (X01)7 GCCCAGGCGGCTGACGAG 3', X01 odpowiada 20 kodonom, z których każdy koduje jeden z 20 aminokwasów. W może być A lub T, wytwarzając kodony AGA lub AGT, które kodują aminokwasy argininę (R) lub serynę (S).
    2. Zamów podkład wzmacniający: 5' CTCGTCAGCCGCCTGG 3' (zobacz Rysunek 1, aby uzyskać szczegółowe informacje). W ten sposób powstaje następująca wstawka białkowa: R/S G X7. Różnorodność teoretyczną oblicza się w następujący sposób: 1 x 2 x 207 = 2,56 x 109 unikalnych wariantów.
      UWAGA: Należy zauważyć, że ta różnorodność może być ograniczona przez efektywność transformacji.
  2. Synteza drugiej nici
    1. Zawiesić oba oligonukleotydy (zdegenerowane oligonukleotydy i starter amplifikacyjny) do końcowego stężenia 100 μM z buforem TE.
      1. W przypadku reakcji PCR należy przeprowadzić reakcję 50 μl z 1 μl każdego startera, 10 μl buforu, 1,5 μl DMSO, 0,5 μl dNTP (10 mM), 0,5 μl polimerazy Hi-fidelity Hot Start II i 35,5 μl wody wolnej od nukleaz.
      2. Przenieść reakcję do termocyklera i przeprowadzić etap wstępnej inkubacji przez 10 s w temperaturze 98 °C, następnie trzy cykle po 10 s w temperaturze 98 °C, 30 s w temperaturze 59 °C i 10 s w temperaturze 72 °C, następnie 5 minut w temperaturze 72 °C i końcowy etap chłodzenia.
    2. Oczyść reakcję za pomocą zestawu do usuwania nukleotydów i eluuj w 100 μl wody wolnej od nukleaz
      3. .
    3. Potwierdź skuteczność syntezy drugiej nici poprzez analizę na bioanalizatorze (patrz Rysunek 2). Przeanalizuj wielkość i czystość wkładki dwuniciowej, ładując 1 μl reakcji do chipa mikroprzepływowego z zestawu odczynników DNA 1000 zgodnie z instrukcjami producenta. Ten zestaw jest zoptymalizowany do pomiaru wielkości i stężenia dwuniciowych fragmentów DNA w zakresie 25-1,000 bps.
  3. Trawienie wstawki i wektora plazmidu
    1. Wytrawić 85 μl oczyszczonej wstawki z 10 μl 10x buforu i 5 μl enzymu BglI w końcowej objętości reakcyjnej 100 μl (patrz Rysunek 1, aby uzyskać szczegółowe informacje). Inkubować w temperaturze 37 °C przez noc. Oczyść za pomocą zestawu do usuwania nukleotydów, eluuj w 50 μl wody wolnej od nukleaz i oznacz ilościowo za pomocą typu "Oligo DNA" w spektrofotometrze.
    2. Strawić 10 μg kompetentnego do replikacji plazmidu AAV (pRep2Cap2_PIS)26 (ITR-flanked virus genome) z 20 μl buforu 10x i 10 μl enzymu SfiI w końcowej objętości reakcyjnej 200 μl (patrz Rysunek 1, aby uzyskać szczegółowe informacje). Inkubować w temperaturze 50 °C przez noc. Oczyść wektor na 1% żelu agarozowym za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu, a następnie wykonaj dodatkowy etap oczyszczania za pomocą zestawu do oczyszczania DNA. Określić ilościowo stężenie w spektrofotometrze.
  4. Podwiązanie wkładki do wektora
    1. Zligować 955 ng wektora plazmidowego z 45 ng insertu z 2 μl buforu i 2 μl ligazy w reakcji ligacji 20 μl. Inkubować w temperaturze 16 °C przez noc, a następnie przez 10 minut w temperaturze 70 °C w celu inaktywacji ligazy w stanie termicznym.
  5. Transformacja, obliczanie złożoności i przygotowanie biblioteki plazmidów
    1. Oczyść reakcję za pomocą zestawu do oczyszczania DNA zgodnie z instrukcjami producenta. Eluuj reakcję w około 80% początkowej objętości wody wolnej od nukleaz i przechowuj na lodzie do późniejszej transformacji.
    2. Transformacja komórek elektrokompetentnych: rozmrażanie jednej fiolki komórek elektrokompetentnych na lodzie przez 10 minut. Następnie dodać 1-2 μl oczyszczonej reakcji ligacji do 30 μl (jedna fiolka) elektrokompetentnych komórek i wymieszać, delikatnie stukając. Następnie ostrożnie odpipetuj mieszaninę komórka/DNA do wstępnie schłodzonej kuwety do elektroporacji o szczelinie 1 mm bez wprowadzania pęcherzyków powietrza.
    3. Elektroporować przy użyciu następujących ustawień: 1800 V, 600 Ω i 10 μF. W ciągu 10 s od impulsu elektroporacyjnego dodać 970 μl wstępnie podgrzanego podłoża regeneracyjnego (dostarczonego z elektrokompetentnymi ogniwami) do kuwety i wymieszać przez pipetowanie. Na koniec przenieść komórki do probówki z mikrowirówką i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C przy 250 obr./min. Aby osiągnąć pożądaną różnorodność, wykonaj 10-100 reakcji, a po inkubacji zbierz wszystkie reakcje w jednej probówce.
    4. Obliczyć różnorodność, rozcieńczając 10 μl połączonych przemian 10-, 100- lub 1000-krotnie w PBS i rozprowadzić 100 μl na płytkach agarowych zawierających odpowiedni antybiotyk (75 mg/ml ampicyliny). Inkubować płytki agarowe przez noc w temperaturze 37 °C, a następnie policzyć kolonie na płytkach agarowych.
    5. Oblicz teoretyczną różnorodność w następujący sposób:
      Teoretyczna maksymalna różnorodność = 10 x współczynnik rozcieńczenia x liczba kolonii x liczba reakcji elektroporacji.
      UWAGA: Aby potwierdzić jakość biblioteki, zsekwencjonuj co najmniej 20 kolonii za pomocą sekwencjonowania Sangera. Większość klonów powinna zawierać wstawkę, a wszystkie powinny być unikalne.
    6. Zaszczepić 400-1000 ml pożywki LB zawierającej odpowiedni antybiotyk z resztą połączonych przemian i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C, 180 obr./min.
  6. Przygotowanie biblioteki plazmidów
    1. Z nocnej hodowli przygotować bulion glicerolowy (zmieszać równe objętości kultury bakteryjnej i 50% roztworu glicerolu w wodzie wolnej od nukleaz i zamrozić w temperaturze -80 °C) i oczyścić bibliotekę plazmidów za pomocą zestawu maxi do plazmidu.
  7. Produkcja biblioteki wirusów AAV
    1. Przygotuj bibliotekę wirusową zgodnie z wcześniejszym opisem27. Transfekować bibliotekę plazmidów (pRep2Cap2_PI, insert peptydowy) wraz z plazmidem adeno-pomocniczym do HEK293T komórek za pomocą odczynnika do transfekcji, takiego jak polietyleniminę (PEI).
    2. Zbierz komórki po 3 dniach i poddaj je trzem cyklom zamrażania i rozmrażania. Oczyść lizat wirusa za pomocą ultrawirowania gradientowego chlorku cezu, a następnie wymiany buforu do PBS, a na koniec zagęścić cząsteczki wirusa.
  8. Miareczkowanie wektorowe AAV za pomocą dd-PCR
    1. Seryjnie rozcieńczyć 2 μl wektora AAV w 198 μl wody wolnej od nukleaz, aby uzyskać końcowe rozcieńczenie 1:106. Za każdym razem dokładnie wymieszać za pomocą pipety o pojemności 200 μl. Dodać jedną kontrolę bez szablonu (NTC) jako kontrolę ujemną.
      UWAGA: Można oznaczyć dodatkowe niższe lub wyższe rozcieńczenia (1:105-1:107).
    2. Przygotuj 20-krotną mieszankę startera i sondy. Dodać 3,6 μl każdego ze 100 μM starterów (do przodu i do tyłu, Rep2 i ITR), po 1 μl każdej ze 100 μM sond dd-PCR (Rep2 i ITR) i 3,6 μl wody wolnej od nukleaz do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml.
      UWAGA: Biblioteka AAV jest mierzona przy użyciu zestawu starter-sonda ukierunkowana na transgen (Rep2) wykrytego za pomocą sondy znakowanej FAM oraz zestawu starter-sonda ukierunkowanego na ITR wykrytego za pomocą sondy znakowanej HEX.
    3. Przygotuj 22 μl reakcji PCR, dodając 5,5 μl próbki, 1,1 μl 20x mieszanki starter-sonda, 11 μl dd-PCR supermix do sond (bez dUTP) i 4,4 μl wody wolnej od nukleaz. Daje to stężenia 900 nM i 250 nM odpowiednio dla starterów i sondy.
    4. Wytworzyć kropelki za pomocą generatora kropel, przenieść reakcję na 96-dołkową płytkę, umieścić płytkę w termocyklerze i przeprowadzić etap denaturacji przez 10 minut w temperaturze 94 °C, a następnie 40 cykli po 30 s w temperaturze 94 °C i 1 minutę w temperaturze 58 °C. Następnie dezaktywuj polimerazę termicznie przez 10 minut w temperaturze 98 °C i dodaj ostatni etap chłodzenia. Odczytaj reakcje w czytniku kropelkowym i przejdź do analizy28.
    5. Otwórz zapisany plik płytki dd-PCR za pomocą oprogramowania analitycznego. Użyj narzędzia progowego na karcie Amplituda 1D (amplituda fluorescencji a liczba zdarzenia), aby oddzielić ujemne i dodatnie kropelki dla każdego kanału, używając NTC jako przewodnika, i wyeksportować dane do pliku csv.
    6. Aby obliczyć stężenie wektora, najpierw oblicz współczynnik korygujący CF za pomocą wzoru:
      figure-protocol-1
      CF określa proporcję kropel dodatnich dla transgenu [Dodatnie], które są dodatnie zarówno dla transgenu, jak i ITR [Ch1 + Ch2 +], aby zapewnić wykrycie funkcjonalnych cząstek wektorowych. Końcowe stężenie wektorowe c można teraz obliczyć za pomocą następującego równania:
      figure-protocol-2
      DF jest współczynnikiem rozcieńczenia (1:105-1:107, jak określono wcześniej). Kopie na 20 μl/dołek reakcji odpowiadają 5 μl rozcieńczonej próbki. Czynnik 1,000 koryguje skalę do VG/mL (genom wirusa/ml). Przykładowy wynik miareczkowania przedstawiono w tabeli 1 i Rysunek 3.
  9. Analiza biblioteki wirusa AAV przez NGS
    1. Amplifikuj fragment insercji peptydu 96-nukleotydowego, przeprowadzając reakcję PCR o objętości 20 μl przy użyciu zestawu polimerazy do korekty odczytu (2x; patrz Rysunek 4). Dodać 1 μl podstawowego AAV zawierającego 1 x 108 vg, po 0,5 μl każdego ze 100 μM startera (NGS_forward i NGS_reverse) oraz 10 μl mieszaniny enzymów do reakcji. Dostosuj końcową objętość do 20 μl wodą bez nukleaz
      2. .
    2. Przenieść reakcję do termocyklera i przeprowadzić etap denaturacji przez 3 minuty w temperaturze 98 °C, a następnie 30-35 cykli po 10 s w temperaturze 98 °C, 10 s w temperaturze 59 °C i 20 s w temperaturze 72 °C, a następnie 5 minut w temperaturze 72 °C i końcowy etap chłodzenia.
    3. Oczyść próbki za pomocą zestawu do oczyszczania PCR. Określ ilościowo stężenie w spektrofotometrze i uruchom 3% żel agarozowy, aby sprawdzić czystość i wielkość fragmentu.
    4. Przetwarzaj fragmenty PCR za pomocą systemu bibliotecznego dla zestawu próbek o niskiej złożoności zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi przygotowania biblioteki NGS. Przeprowadzić końcową reakcję naprawczą z 30 ng fragmentu PCR, a następnie ligację adaptorową i amplifikację PCR przez 10 cykli. Do oczyszczania reakcji należy użyć zestawu do oczyszczania PCR.
    5. Przetwarzaj produkty końcowe na bioanalizatorze w celu sprawdzenia wielkości i czystości, używając zestawu odczynników DNA zgodnie z instrukcjami producenta.
    6. Określ ilościowo amplikony za pomocą fluorometru i połącz je. Ponownie określ ilościowo ostateczną pulę biblioteki NGS na fluorometrze (zgodnie z instrukcjami producenta) i zweryfikuj jakość na bioanalizatorze.
    7. Sekwencjonuj biblioteki NGS w trybie pojedynczym końca (SE), używając zestawu o wysokiej wydajności 75 cykli, o długości odczytu 84 i indeksie 1 8,
      UWAGA: Sekwencjonowanie przykładów w tym artykule zostało przeprowadzone w zakładzie GeneCore firmy EMBL Heidelberg (http://www.genecore.embl.de/).
    8. Analizuj dane sekwencjonowania NGS za pomocą Python 3 i biopython. Pliki można znaleźć pod adresem https://github.com/grimmlabs/AAV_GrimmLab_JoVE2022 (alternatywnie pod adresem https://doi.org/10.5281/zenodo.7032215). Analiza NGS składa się z dwóch etapów.
      1. W pierwszym kroku przeszukaj pliki sekwencji pod kątem sekwencji, które spełniają określone kryteria (obecność sekwencji rozpoznających po bokach miejsca insercji) (patrz Rysunek 4, krok 1.9.8.5.). Odbywa się to za pomocą skryptu (Script#1) i pliku konfiguracyjnego, który dostarcza potrzebnych informacji. Po zidentyfikowaniu prawidłowej sekwencji program wyodrębnia i zapisuje sekwencję w pliku wyjściowym, który jest plikiem txt o tej samej nazwie co plik sekwencjonowania.
      2. Drugim krokiem jest analiza plików wyjściowych. Sekwencje w bibliotece rozpoczynają się od dowolnego z sześciu nukleotydów (AGWggc, W = A/T) w dziewięcioaminokwasowej wstawce. Na podstawie tej sekwencji początkowej peptyd ulega translacji. Spowoduje to wygenerowanie plików wyjściowych, które zawierają warianty peptydów (PV).
      3. Przygotuj dwa foldery: Skrypt i Dane. Do folderu Dane skopiuj pliki skompresowane w formacie gzip powstałe w wyniku sekwencjonowania. Do folderu Script skopiuj następujące pliki, plik Python: Script#1_DetectionExtraction_JoVE_Py3.py; Plik Pythona: Script#2_PV_extraction_and_ranking_Py3.py; Plik konfiguracyjny: Barcode_Script_JoVE.conf; i plik tabeli przeglądowej (LUT): Zuordnung.txt.
      4. Przed uruchomieniem skryptów edytuj następujące pliki w folderze Skrypt. Otwórz plik "Zuordnung.txt" i dodaj dwie kolumny oddzielone tabulatorami, nazwy plików gzip (kolumna 1) i żądaną nazwę końcową (kolumna 2; wartości rozdzielane tabulatorami).
        UWAGA: Przykładowe pliki txt znajdują się w folderze "PV_analysis_script" w usłudze GitHub. Pliki znajdujące się w folderze GitHub są przygotowane do analizy trzech przykładowych danych z powyższej biblioteki: xaa.txt.gz, xab.txt.gz i xac.txt.gz. Dostarczane są również pliki wyjściowe.
      5. Zmień następujące zmienne w pliku konfiguracyjnym "Barcode_Script_JoVE.conf":
        my_dir = "~/Dane/"
        filename_sample_file = "~/Skrypt/Zuordnung.txt"
        Zmienne specyficzne dla sekwencji: BCV_size = 27, BCVleft = TCCAGGGCCAG, BCVright = GCCCAGG, BCVloc = 30,BCV margin = 8, BCVleft_revcomp = GCCGCCTGGGC, BCVright_revcomp = CTGGCCC i BCVloc_revcomp = 41 (patrz Rysunek 4, aby uzyskać szczegółowe informacje).
      6. Użyj następującego polecenia, aby wywołać wykrywanie i wyodrębnianie sekwencji wariantów:
        >python3 ~/Script#1_DetectionExtraction_JoVE_Py3.py ~/Barcode_Script_JoVE.conf
        UWAGA: Wyjściem są pliki txt z wyekstrahowanymi sekwencjami DNA i ich liczbą odczytów. Nagłówek tego pliku zawiera dane statystyczne (tj. łączną liczbę odczytów i wyodrębnionych odczytów). Dane te są przenoszone do kolejnych plików. Te dane txt są plikami wejściowymi dla skryptu #2, w którym sekwencje DNA są tłumaczone, klasyfikowane i analizowane.
      7. Wykonaj ekstrakcję i analizę fotowoltaiki za pomocą następującego polecenia:
        >python3 ~/Script#2_PV_extraction_and_ranking_Py3.py ~/Barcode_Script_JoVE.conf
      8. Przeanalizuj tekstowe pliki wyjściowe skryptu #2. Pliki wyjściowe skryptu #2 są nazwane za pomocą drugiej kolumny LUT w "Zuordnung.txt" z rozszerzeniami opartymi na typie analizy.
        UWAGA: Upewnij się, że trzy pliki wyjściowe zawierają dane statystyczne w pierwszych wierszach ("# prawidłowych odczytów PV", "# odczytów nieprawidłowych PV" i "# unikalnych odczytów PV"), pierwszą kolumnę z indeksem każdej sekwencji DNA z wejściowych plików txt (dane wyjściowe skryptu#1) oraz następujące kolumny: (1) "...analyzed_all.csv": "Próbka:" (sekwencja DNA), "#" (liczba odczytów), "Frw lub Rev" (odczyt do przodu lub do tyłu) oraz "PVs" (translowana sekwencja peptydowa). Nieprawidłowe sekwencje mają "NA" i "nieprawidłowe" w ostatnich dwóch kolumnach. (2) "...analyzed_validSeq.csv": taki sam jak poprzedni plik, przefiltrowany pod kątem prawidłowych sekwencji. (3) "...analyzed_PV.csv": "PVs" (przetłumaczona sekwencja peptydów), "#" (liczba odczytów) i "count" (liczby frw i rev w poprzednich plikach są łączone i liczba jest podawana jako 1 lub 2).
      9. Wizualizuj pliki wyjściowe za pomocą dostępnego oprogramowania w zależności od potrzeb użytkownika.

2. Losowy wybór biblioteki wyświetlania 7-merowych peptydów AAV2

  1. Użyj biblioteki AAV po kwantyfikacji i kontroli jakości (sekcja 1) do ukierunkowanej ewolucji w wybranym modelu, aby iteracyjnie wybierać kandydatów o pożądanych właściwościach (patrz Rysunek 5)16,18,21.
    UWAGA: Kandydaci ci są następnie wykorzystywani do generowania biblioteki kodów kreskowych, jak opisano poniżej w sekcji 3.

3. Przygotowanie i analiza biblioteki kapsydów AAV z kodami kreskowymi

UWAGA: Po zidentyfikowaniu zestawu potencjalnie specyficznych i skutecznych kapsydów AAV na ekranie wyświetlania peptydów, sprawdź funkcjonalność zidentyfikowanych sekwencji peptydowych i porównaj je z zestawem powszechnie używanych lub dobrze opisanych referencyjnych wariantów kapsydu AAV. Aby to zrobić, sekwencja capsid jest wstawiana do konstrukcji pomocniczej Rep/Cap bez ITR.

  1. Produkcja biblioteki AAV z kodami kreskowymi
    1. Przeprowadź rekombinowaną produkcję AAV dla każdego wariantu kapsydu przy użyciu systemu trójplazmidowego, jak opisano wcześniej24.
      UWAGA: Aby rozróżnić różne warianty kapsydu, plazmid transgenu reporterowego z flankami ITR zawiera unikalny kod kreskowy o długości 15 nukleotydów. Kod kreskowy znajduje się w 3' UTR (nietranslowanym obszarze) między wzmocnionym białkiem żółtej fluorescencji (EYFP) a sygnałem poliA (patrz Rysunek 6A). Ekspresja EYFP jest napędzana przez silny wszechobecny promotor wirusa cytomegalii (CMV), który zapewnia wystarczające poziomy transkryptów RNA.
    2. Zaprojektuj kody kreskowe o długości 15 nukleotydów z homopolimerami zawierającymi mniej niż trzy nukleotydy, zawartość GC <65%29 i odległość Hamminga większą niż cztery nukleotydy24.
    3. Wyprodukuj każdy kapsyd osobno w połączeniu z plazmidem transgenowym zawierającym unikalny kod kreskowy. W ten sposób każdy wariant capsidu jest oznaczany odrębnym kodem kreskowym, który umożliwia jego specyficzne śledzenie (patrz Rysunek 6B).
  2. Miareczkowanie wektorowe AAV za pomocą dd-PCR
    1. Przeprowadzić miareczkowanie AAV zgodnie z wcześniejszym opisem w sekcji 1.8, zastępując parę starterów Rep2 parą starterów YFP.
    2. Określ ilościowo poszczególne produkcje AAV i zsumuj równe ilości każdej produkcji, aby wygenerować ostateczną bibliotekę kodów kreskowych.
    3. Ponownie określ ilościowo ostateczną bibliotekę, aby sprawdzić końcowe stężenie i jakość (patrz Rysunek 7).
  3. Biblioteka kodów kreskowych AAV w aplikacji vivo
    1. Zastosuj bibliotekę AAV z kodami kreskowymi systemowo do wybranego systemu modelu (np. systemowo w myszach24).
    2. Zbierz tkanki ON- i OFF-target (tj. wątrobę, płuca, serce, przeponę, mięśnie gładkie, dwunastnicę, trzustkę, okrężnicę, bicepsa, jajniki, żołądek, ucho wewnętrzne, nerki, aortę brzuszną, aortę piersiową, mózg, brązowy i biały tłuszcz oraz śledzionę) lub typy komórek na podstawie eksperymentu. Zamrozić je w temperaturze -80 °C, wyekstrahować DNA/RNA i zastosować analizę ilościową NGS, jak opisano w następnym rozdziale.
  4. Ekstrakcja DNA/RNA
    1. Wyodrębnij DNA i RNA z interesujących tkanek za pomocą zestawu DNA/RNA Mini Kit.
    2. Umieść mały kawałek tkanki będącej przedmiotem zainteresowania (1 mm3, około 5 mg) w probówce reakcyjnej o pojemności 2 ml.
    3. Dodać 350 μl buforu do lizy zmieszanego z β-merkaptoetanolem (1%) i stalowymi kulkami o średnicy 5 mm do tkanki (próbki należy obsługiwać z β-merkaptoetanolem pod wyciągiem).
    4. Homogenizować tkankę w lizerze tkankowym przez 45 s przy 40 Hz.
    5. Dodać 10 μl proteinazy K (10 mg/ml) i inkubować przez 15 minut w temperaturze 55 °C, wstrząsając z prędkością 400 obr./min.
    6. Wirować przy 20 000 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej, zebrać supernatant i postępować zgodnie z protokołem producenta zestawu DNA/RNA.
    7. Podziel etap mycia na dwa etapy, z 350 μl buforu do płukania na każdym etapie. Pomiędzy tymi etapami płukania trawić pozostałości DNA na kolumnie za pomocą DNazy I wolnej od RNaz. Dodać 80 μl roztworu DNazy I, przygotowanego zgodnie z instrukcją producenta, do kolumny i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
    8. Eluować RNA/DNA z kolumny wodą wolną od nukleaz. Przechowywać wyizolowany RNA w temperaturze -80 °C, a gDNA w temperaturze -20 °C.
  5. Synteza cDNA
    1. Poddaj próbki RNA kolejnej rundzie obróbki DNazą I przez 15-30 minut (w celu całkowitego usunięcia zanieczyszczającego DNA z próbek RNA) przed reakcją odwrotnej transkrypcji. Dodać 1 μl roztworu DNazy I, 4 μl buforu (dostarczonego z zestawem) i wodę wolną od nukleaz do końcowej objętości 40 μl do 212 ng RNA. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej i podgrzewać, dezaktywować w temperaturze 70 °C przez 10 minut.
    2. Zsyntetyzuj cDNA, używając 150 ng RNA za pomocą zestawu zgodnie z instrukcjami producenta. Należy uwzględnić kontrole bez odwrotnej transkryptazy, aby upewnić się, że w próbce nie ma zanieczyszczającego wirusowego DNA. cDNA jest przechowywane w temperaturze -20 °C.
      UWAGA: Ilość wejściowego RNA dla optymalnej odwrotnej transkrypcji może się różnić w zależności od typu tkanki i oczekiwanej wydajności transdukcji w danej tkance.
  6. Analiza biblioteki wirusa AAV (in-vivo) za pomocą NGS
    1. Aby osiągnąć dużą głębokość sekwencjonowania przy niskich kosztach, należy wykonać NGS za pomocą sekwencjonowania Illumina, jak opisano wcześniej (sekcja 1.9). Wzmocnij sekwencję kodów kreskowych, a następnie podlifikuj adaptery sekwencjonowania do wzmacniacza.
    2. Ze względu na krótki czas odczytu i ligację adapterów sekwencjonowania po obu stronach wzmacniacza, podczas projektowania należy sprawdzić, czy amplikon jest wystarczająco mały, aby zapewnić obecność sekwencji kodu kreskowego w odczycie NGS. Do sekwencjonowania kodów kreskowych w genomach wirusa i transkryptów wirusowych, amplikon PCR jest zaprojektowany tak, aby miał długość 113 pz (patrz Rysunek 8).
    3. Wzmocnij region z kodem kreskowym za pomocą starterów BC-seq do przodu i BC-seq do tyłu. Przygotuj następującą reakcję PCR: 0,5 μl polimerazy DNA Hi-fidelity, 10 μl buforu 5x, 0,25 μl każdego startera 100 μM (BC-seq fw/BC-seq rv) i 1 μl 10 mM dNTP. Użyj 25 ng cDNA lub DNA/reakcji jako matrycy i dostosuj końcową objętość do 50 μl wodą wolną od nukleaz.
    4. Przygotuj master-mix PCR pod czystym kapturem PCR, aby uniknąć zanieczyszczenia. Stosować następujące warunki cyklu: 30 s w temperaturze 98 °C, następnie 40 cykli w temperaturze 98 °C przez 10 s i 72 °C przez 20 s oraz końcowy 5-minutowy krok w temperaturze 72 °C.
    5. Uwzględnij kontrole PCR w celu potwierdzenia braku zanieczyszczającego DNA w głównej mieszance PCR. W przypadku próbek cDNA uwzględnij kontrole bez odwrotnej transkryptazy. Na koniec dołącz próbkę do biblioteki wejściowej AAV. Informacje te zostaną wykorzystane do wygenerowania pliku Normalization_Variant.txt używanego w analizie.
    6. Sprawdzić wielkość fragmentu PCR każdej próbki za pomocą elektroforezy żelowej przed oczyszczaniem PCR. To ostatnie osiąga się poprzez zastosowanie dostępnych na rynku kulek magnetycznych lub kolumnowych systemów oczyszczania DNA (patrz tabela materiałów).
    7. Przygotuj bibliotekę NGS za pomocą systemu bibliotecznego dla próbek o niskiej złożoności zgodnie z instrukcjami producenta, jak opisano wcześniej w sekcji 1.9.
    8. Określić stężenie DNA za pomocą zestawu dsDNA HS Kit i przeanalizować jakość biblioteki zgodnie z wcześniejszym opisem (sekcja 1.9.6), a następnie połączyć dane. Określ ilościowo zebraną bibliotekę na fluorometrze i oceń jakość na bioanalizatorze.
    9. Przeprowadzić sekwencjonowanie NGS zgodnie z opisem w sekcji 1.9.7.
    10. Określ ilościowo za pomocą qPCR liczbę kopii transgenu (genomy wirusa) i gen porządkowy, aby ocenić rozkład połączonej biblioteki między tkankami lub narządami na DNA.
    11. Ustawić 30 μl reakcji qPCR w następujący sposób, aby określić liczbę kopii EYFP (transgen) i GAPDH (dehydrogenaza 3-fosforanowa gliceryny, gen porządkowy):
      1. Przygotuj 60-krotną mieszankę starter/sonda dla EYFP (1,5 μM YFP_fw, 1,5 μM YFP_rv i 0,6 μM YFP_probe; patrz Tabela materiałów). Użyj mieszanki startera i sondy GAPDH (patrz tabela materiałów), aby określić liczbę kopii genu gospodyni domowej. Ustaw reakcję na lodzie.
      2. Przygotuj główną mieszankę PCR (15 μl, patrz tabela materiałów) i dodaj 60x mieszaninę starter/sonda (0,5 μl) dla wszystkich próbek i wzorców (aby obliczyć liczbę kopii wzorców, skorzystaj z poniższego linku: http://cels.uri.edu/gsc/cndna.html). Ustaw reakcję na lodzie.
      3. Przenieść 15,5 μl mieszanki wzorcowej do płytki 96-dołkowej i dodać 14,5 μl próbki (75 ng całkowitego stężenia DNA) lub wzorca do odpowiedniego dołka. Uszczelnij 96-dołkową płytkę folią, odwiruj i krótko odwiruj.
      4. Przenieść 10 μl każdej próbki do płytki 384-dołkowej w dwóch egzemplarzach. Uszczelnić płytkę folią i wirować w temperaturze 800 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
      5. Inkubować mieszaninę reakcyjną w termocyklerze, stosując temperaturę początkową 50 °C przez 2 minuty, a następnie wstępny etap aktywacji trwający 10 minut w temperaturze 95 °C. Wykonać 40 cykli denaturacji w temperaturze 95 °C przez 15 s i wyżarzania/przedłużania w temperaturze 60 °C przez 1 minutę24.
      6. Aby uzyskać liczbę genomów diploidalnych (dg), użyj liczby kopii GAPDH i podziel przez dwa. Następnie weź wartość liczby kopii EYFP i podziel przez liczbę dg, co daje genomy wektorowe na genom diploidalny (vg/dg). Wartość ta służy do generowania pliku Normalization_Organ.txt do analizy bioinformatycznej.
    12. Przeprowadź analizę danych sekwencjonowania NGS, takich jak Weinmann et al.24, używając niestandardowego kodu w języku Python3 (https://github.com/grimmlabs/AAV_GrimmLab_JoVE2022). Przepływ pracy obejmuje wykrywanie sekwencji kodów kreskowych kierowanych przez sekwencje flankujące, ich długość i lokalizację (Script#1_BarcodeDetection.py), a także analizę wzbogacania i dystrybucji kodów kreskowych w zestawie tkanek (Script#2_BarcodeAnalysis.py).
      1. Wykrywaj kody kreskowe i przypisuj je do wariantów AAV. Umieść dane sekwencjonowania jako zarchiwizowane pliki fastq w jednym katalogu (np. "Data_to_analyze"). Plik danych sekwencjonowania dla biblioteki wejściowej jest zawarty w tym katalogu i używany tylko do obliczania proporcji kapsydu w bibliotece wejściowej.
      2. Przed wykonaniem skryptu utwórz dwa pliki tekstowe rozdzielane tabulatorami: plik wariantów kapsydu (patrz przykładowy plik "Variants.txt") z sekwencjami kodów kreskowych przypisanymi do nazw wariantów kapsydu AAV oraz plik zanieczyszczeń (patrz "Contaminations.txt") z sekwencjami kodów kreskowych, które pochodzą z możliwego zanieczyszczenia (inne kody kreskowe dostępne w laboratorium, przyczyniające się do zanieczyszczenia).
      3. Na koniec edytuj plik konfiguracyjny "Barcode_Script.conf", aby zawierał następujące informacje: ścieżkę do folderu z danymi sekwencjonowania (np. "Data_to_analyze"), sekwencję obszarów bocznych kodów kreskowych, ich położenie i rozmiar okna do wykrywania kodów kreskowych (podobnie jak w 1.9.8.5, patrz Rysunek 8).
      4. Użyj następującego polecenia, aby wywołać wykrywanie kodów kreskowych z podanymi ścieżkami do plików Script#1_BarcodeDetection.py i konfiguracyjnych:
        >python3 ~/Script#1_BarcodeDetection.py ~/Barcode_Script.conf
        UWAGA: Wynikiem Script#1_BarcodeDetection.py wykonania są pliki tekstowe z liczbą odczytów dla wariantu capsid, a także całkowitą liczbą odczytów odzyskanych z surowych danych.
      5. Oceń rozkład kapsydów AAV z kodami kreskowymi wśród tkanek lub narządów, wykonując Script#2_BarcodeAnalysis.py razem z następującymi plikami txt:
        1. W pliku "Zuordnung.txt" przypisz nazwę do każdego pliku txt uzyskanego z przebiegu wykrywania kodów kreskowych do nazwy tkanki/narządu: nazwy plików txt w pierwszej kolumnie i odpowiadające im nazwy tkanek/narządów w przypisaniu rozdzielanym tabulatorami.
          UWAGA: Dla przykładu sprawdź w folderze "Example" (https://github.com/grimmlabs/AAV_GrimmLab_JoVE2022). Warto zauważyć, że nazwa tkanki/narządu może zawierać znaki określające pomiar cDNA lub gDNA oraz liczbę replikacji biologicznej (M1, M2 itp.).
        2. Utwórz plik tekstowy "organs.txt" z listą nazw narządów ON- i OFF-docelowych, które odpowiadają nazwom podanym w pliku przyporządkowania "Zuordnung.txt" (patrz folder "Przykład": https://github.com/grimmlabs/AAV_GrimmLab_JoVE2022).
        3. Utwórz pliki tekstowe rozdzielane tabulatorami "Normalization_Organ.txt" i "Normalization_Variant.txt" ze znormalizowanymi wartościami dla wszystkich wariantów kapsydu i wszystkich narządów/tkanek. W pierwszej kolumnie pliku "Normalization_Organ.txt" należy wpisać nazwy podane dla każdego narządu (jak w pliku przyporządkowania "Zuordnung.txt"), a w drugiej kolumnie wartości normalizacji dla odpowiednich tkanek, wygenerowane w sekcji 3.6.11.
        4. Wypełnij pierwszą kolumnę pliku "Normalization_Variant.txt" listą nazw capsid, a drugą kolumnę znormalizowanymi wartościami liczby odczytów dla każdego capsid w bibliotece puli (normalizację można obliczyć na podstawie pliku wyjściowego txt dla biblioteki wejściowej wynikającego z pierwszego skryptu).
        5. Edytuj plik konfiguracyjny, określając pełne ścieżki do wszystkich dodatkowych plików wymienionych powyżej. Wykonaj Script#2_BarcodeAnalysis.py jako:
          >python3 /Script#2_BarcodeAnalysis.py ~/Barcode_Script.conf
          UWAGA: Skrypt analizy kodów kreskowych generuje kilka plików: pliki tekstowe z wartościami względnego stężenia (RC) rozkładu kapsydu w różnych tkankach w oparciu o wiele kroków normalizacji opisanych wcześniej oraz plik arkusza kalkulacyjnego, który łączy dane z pliku tekstowego w scalone dane macierzy. Te ostatnie mogą być wykorzystywane do analizy i wizualizacji skupień.
        6. Wizualizacja danych i przeprowadzenie analizy skupień danych matrycowych w celu rozróżnienia właściwości kapsydu i oceny ich podobieństwa na podstawie profili RC w różnych tkankach. Użyj dodatkowego skryptu PCA_heatmap_plot. R umieszczone w repozytorium:
          >Rscript --wanilia ~/PCA. R ~/relativeconcentration.xls
          UWAGA: Skrypt pobiera pliki relativeconcentration.xls jako dane wejściowe i generuje dwa wykresy hierarchicznej mapy cieplnej klastra i analizy głównych składowych (PCA).
        7. Aby zmodyfikować wykresy (osie mapy cieplnej, główne składniki PCA) lub parametry png (kolor, rozmiar, etykietowanie), otwórz skrypt języka R i postępuj zgodnie z instrukcjami podanymi w sekcjach z komentarzami.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Generacja biblioteki wyświetlania peptydów AAV2. Jako pierwszy krok w kierunku wyboru zmodyfikowanych AAV opisano generowanie biblioteki plazmidowej. Wkładka peptydowa jest wytwarzana przy użyciu zdegenerowanych starterów. Zmniejszenie kombinacji kodonów w kodonach od 64 do 20 ma zalety w postaci wyeliminowania kodonów stop i ułatwienia analizy NGS, poprzez zmniejszenie różnorodności bibliotek na poziomie DNA, ale nie na poziomie białka. Wstawka oligonukleotydowa jest kupowana jako jednoniciowy DNA (

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym protokole przedstawiono kroki potrzebne do inżynierii kapsydu AAV z wyświetlaczem peptydów oraz do badań przesiewowych biblioteki AAV z kodami kreskowymi, a także do bioinformatycznej analizy składu biblioteki i wydajności kapsydu. Protokół ten koncentruje się na krokach, które ułatwiają analizę bioinformatyczną tego typu bibliotek, ponieważ większość laboratoriów wirusologicznych pozostaje w tyle w umiejętnościach programowania, aby dopasować się do ich biegłości w technikach biologii molekularnej. Oba typy biblio...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

D.G. jest współzałożycielem AaviGen GmbH. D.G. i K.R. są wynalazcami w oczekującym zgłoszeniu patentowym związanym z generowaniem unikających odporności wariantów kapsydu AAV. Reszta autorów nie ma nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

D.G. bardzo docenia wsparcie ze strony Niemieckiej Fundacji Badawczej (DFG) za pośrednictwem Centrów Badawczych DFG SFB1129 (Projektnummer 240245660) i TRR179 (Projektnummer 272983813), a także przez Niemieckie Centrum Badań nad Infekcjami (DZIF, BMBF; TTU-HIV 04.819).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Podkład amplifikacyjnyELLA Biotech (Monachium, Niemcy)-Synteza drugiej nici wkładki oligonukleotydowej Odczynniki
Agilent DNA 1000Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA)5067-1504Walidacja fragmentów DNA
System Bioanalyzer Agilent 2100Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA)Walidacja fragmentów DNAG2938C
AllPrep DNA/RNA Mini Zestaw Qiagen (Venlo, Holandia)80204Ekstrakcja DNA/RNA
Odczynniki Agilent DNA 1000Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA)5067-1504Przygotowanie biblioteki NGS
System Bioanalyzer Agilent 2100Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA)G2938CPrzygotowanie biblioteki NGS
BC-seq fw: IDT (San Joce, Kalifornia, Kalifornia, Stany Zjednoczone)ATCACTCTCGGCATGGACGAGC Przygotowanie biblioteki NGS
BC-seq rv:   IDT (San Joce, Kalifornia, Kalifornia, Stany Zjednoczone)GGCTGGCAACTAGAAGGCA Przygotowanie biblioteki NGS
β-MercaptoethanolMillipore Sigma (Burlington, MA, USA)44-420-3250MLEkstrakcja DNA/RNA
BglINew England Biolabs (Ipswich, MA, USA)R0143Trawienie dwuniciowej wkładki
C1000 Touch Thermal CyclerBio-Rad (Hercules, CA, USA)1851196Cykler dd-PCR
dNTPS New England Biolabs (Ipswich, MA, USA)N0447SNGS Przygotowanie biblioteki
ddPCR Supermix do sond (bez dUTP)Bio-Rad (Hercules, CA, USA)1863024dd-PCR supermix
Olej do generowania kropelek do sondBio-Rad (Hercules, CA, USA)1863005Olej do generowania kropelek dd-PCR
Wkłady DG8 do generatora kropel QX100 / QX200Bio-Rad (Hercules, CA, USA)1864008Kartridże do generowania kropelek dd-PCR
Uchwyt na kartridże DG8Bio-Rad (Hercules, CA, USA)1863051Uchwyt na kartridże dd-PCR
Generator kropel DG8 UszczelkaBio-Rad (Hercules, CA, USA)1863009Osłona dd-PCR do płytki
ddPCR 96-dołkowe, półosłonoweBio-Rad (Hercules, CA, USA)12001925dd-PCR 96-dołkowa płytka
E.cloni 10G SUPREME Elektrokompetentny OgniwaLucigen (Middleton, WI, USA)60081-1Ogniwa elektrokompetentne
Kuwety do elektroporacji, 1mmBiozym Scientific (Oldendorf, Niemcy)748050Elektroporacja
GAPDH mieszanka startera/sondyThermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)Mm00186825_cnStarter Taqman qPCR
Genepulser XcellBio-Rad (Hercules, CA, USA)1652660
Zestaw do odwrotnej transkrypcji cDNA o dużej pojemnościApplied Biosystems (Waltham, MA, USA)4368814odwrotna transkrypcja cDNA
ITR_fwIDT (San Joce, CA, USA)GGAACCCCTAGTGATGGAGTT (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/)starter dd-PCR
ITR_rvIDT (San Joce, CA, USA)CGGCCTCAGTGAGCGA (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/)starterdd-PCR
ITR_probeIDT (San Joce, CA, USA)Sonda HEX-CACTCCCTCTCTGCGCGCG-BHQ1 (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/)dd-PCR
System Illumina NextSeq 500Illumina Inc (San Diego, CA, USA)Biblioteka SY-415-1001NGS sekwencjonowanie
KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X)*Roche AG (Bazylea, Szwajcaria)KK2600 07958919001przygotowanie próbki NGS
MagnaBot 96 Magnetyczne urządzenie separacyjne PromegaGmbH (Madison, WI, USA)V8151Przygotowanie próbki do biblioteki NGS
Spektrofotometr NanoDrop 2000Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)ND-2000Trawienie wkładki dwuniciowej
NGS_frwSigma-Aldrich (Burlinght, MA, USA)Starter GTT CTG TAT CCA, CCA, ACC NGS
NGS_revSigma-Aldrich (Burlinght, MA, USA)Podkład CGC CTT GTG TGT TGA CATC NGS
NextSeq 500/550 High Output Kit (75 cykli)Illumina Inc (San Diego, CA, USA)FC-404-2005NGS Biblioteka sekwencjonowania
System biblioteki Ovation dla próbek o niskiej złożoności Zestaw NuGEN Technologies, Inc. (San Carlos, CA, USA)9092-256NGS Przygotowanie biblioteki
PX1 Zgrzewarka do płyt Bio-Rad (Hercules, CA, USA)1814000Zgrzewarka do płytek dd-PCR
Zgrzewany folia przebijanaBio-Rad (Hercules, CA, USA)1814040Folia uszczelniająca dd-PCR
Phusion High-Fidelity DNA-PolymeraseThermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)F530SSynteza drugiej nici wkładki oligonukleotydowej
PEI MAX - Liniowy chlorowodorek polietyleniminy klasy transfekcyjnej (MW 40,000)Polysciences, Inc. (Warrington, PA, USA)24765-1GPrzygotowanie biblioteki AAV
ProNex Size-Selective Purification SystemPromega GmbH (Madison, WI, USA)NG2002Przygotowanie próbki dla biblioteki NGS
Polimeraza Phusion Hot Start II Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)F549LNGS Przygotowanie biblioteki
Proteinaza KRoche AG (Bazylea, Szwajcaria)5963117103Ekstrakcja DNA/RNA
pRep2Cap2_PISwektor ITR-Rep2Cap2-ITR. Miejsce insercji peptydów w Cap2 ORF, wyprodukowane/przygotowane w laboratorium 
Generator kropel QX200Bio-Rad (Hercules, CA, USA)1864002Generator kropel dd-PCR
Czytnik kropel QX200Bio-Rad (Hercules, CA, USA)1864003Analiza kropel dd-PCR Zestaw
usuwania nukleotydów QIAquickQiagen (Venlo, Holandia)28306Synteza drugiej nici oczyszczania wkładki oligonukleotydowej
Zestaw do ekstrakcji żelu QIAquickQiagen (Venlo, Holandia)28704Oczyszczanie wektorów plazmidowych
QIAGEN Plasmid Maxi KitQiagen (Venlo, Holandia)12162Biblioteka plazmidów Przygotowanie DNA
Zestaw do oczyszczania Qiaquick PCRQiagen (Venlo, Holandia)28104Przygotowanie próbki do biblioteki NGS
Fluorometr kubitowyInvitrogen (Waltham, MA, USA)Q32857NGS Przygotowanie biblioteki
Qubit dsDNA HSThermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)Q32851NGS Przygotowanie biblioteki
QuantiFast PCR Master MixQiagen (Venlo, Holandia)1044234Taqman qPCR
rep_fwIDT (San Joce, CA, USA)AAGTCCTCGGCCCAGATAGACstarter dd-PCR
rep_rvIDT (San Joce, CA, USA)CAATCACGGCGCACATGTstarter dd-PCR
rep_probeIDT (San Joce, CA, USA)FAM-TGATCGTCACCTCCAACA-BHQ1sonda dd-PCR
Wolna od RNaz DNazaQiagen (Venlo, Holandia)79254Ekstrakcja DNA/RNA
SfiINew England Biolabs (Ipswich, MA, USA)R0123Trawienie wektora
5 mm, stal KoralikiQiagen (Venlo, Holandia)69989Ekstrakcja DNA/RNA
TRIMER-OLIGONUKLEOTYDYELLA Biotech (Monachium, Niemcy)-Zdegenerowany oligonukleotyd
T4 LigazaNew England Biolabs (Ipswich, MA, USA)M0202LLigacja biblioteki plazmidów
TissueLyserLTQiagen (Venlo, Holandia)Ekstrakcja DNA/RNA85600
YFP_fwIDT (San Joce, CA, USA)GAGCGCACCATCTTCTTCAAGstarter dd-PCR
YFP_rvIDT (San Joce, CA, USA)Starter dd-PCR TGTCGCCCTCGAACTTCAC
YFP_probeIDT (San Joce, CA, USA)FAM-ACGACGGCAACTACA-BHQ1sonda dd-PCR
Zymo DNA Clean & Concentrator-5 (Capped)Badania Zymo (Irvine, CA, USA)D4013Oczyszczanie wektorów i ligacji
do elektroporacji do

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).
  2. Muhuri, M., Levy, D. I., Schulz, M., McCarty, D., Gao, G. Durability of transgene expression after rAAV gene therapy. Molecular Therapy. 30 (4), 1364-1380 (2022).
  3. Li, C., Samulski, R. J. Engineering adeno-associated virus vectors for gene therapy. Nature Reviews Genetics. 21 (4), 255-272 (2020).
  4. Kuzmin, D. A., et al. The clinical landscape for AAV gene therapies. Nature Reviews Drug Discovery. 20 (3), 173-174 (2021).
  5. Mullard, A. Gene therapy community grapples with toxicity issues, as pipeline matures. Nature Reviews Drug Discovery. 20 (11), 804-805 (2021).
  6. Nature Biotechnology. Gene therapy at the crossroads. Nature Biotechnology. 40 (5), 621(2022).
  7. Becker, P., et al. Fantastic AAV Gene Therapy Vectors and How to Find Them-Random Diversification, Rational Design and Machine Learning. Pathogens. 11 (7), 756(2022).
  8. Perabo, L., et al. In vitro selection of viral vectors with modified tropism: the adeno-associated virus display. Molecular Therapy. 8 (1), 151-157 (2003).
  9. Muller, O. J., et al. Random peptide libraries displayed on adeno-associated virus to select for targeted gene therapy vectors. Nature Biotechnology. 21 (9), 1040-1046 (2003).
  10. Dalkara, D., et al. In vivo-directed evolution of a new adeno-associated virus for therapeutic outer retinal gene delivery from the vitreous. Science Translational Medicine. 5 (189), (2013).
  11. Sahel, J. A., et al. Partial recovery of visual function in a blind patient after optogenetic therapy. Nature Medicine. 27 (7), 1223-1229 (2021).
  12. Adachi, K., Enoki, T., Kawano, Y., Veraz, M., Nakai, H. Drawing a high-resolution functional map of adeno-associated virus capsid by massively parallel sequencing. Nature Communications. 5, 3075(2014).
  13. Marsic, D., Mendez-Gomez, H. R., Zolotukhin, S. High-accuracy biodistribution analysis of adeno-associated virus variants by double barcode sequencing. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 2, 15041(2015).
  14. Korbelin, J., et al. Pulmonary targeting of adeno-associated viral vectors by next-generation sequencing-guided screening of random capsid displayed peptide libraries. Molecular Therapy. 24 (6), 1050-1061 (2016).
  15. Deverman, B. E., et al. Cre-dependent selection yields AAV variants for widespread gene transfer to the adult brain. Nature Biotechnology. 34 (2), 204-209 (2016).
  16. Ravindra Kumar, S., et al. Multiplexed Cre-dependent selection yields systemic AAVs for targeting distinct brain cell types. Nature Methods. 17 (5), 541-550 (2020).
  17. Hanlon, K. S., et al. Selection of an efficient AAV vector for robust CNS transgene expression. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 15, 320-332 (2019).
  18. Nonnenmacher, M., et al. Rapid evolution of blood-brain-barrier-penetrating AAV capsids by RNA-driven biopanning. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 20, 366-378 (2021).
  19. Tabebordbar, M., et al. Directed evolution of a family of AAV capsid variants enabling potent muscle-directed gene delivery across species. Cell. 184 (19), 4919-4938 (2021).
  20. Davidsson, M., et al. A systematic capsid evolution approach performed in vivo for the design of AAV vectors with tailored properties and tropism. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (52), 27053-27062 (2019).
  21. Pekrun, K., et al. Using a barcoded AAV capsid library to select for clinically relevant gene therapy vectors. Journal of Clinical Investigation Insight. 4 (22), (2019).
  22. Ogden, P. J., Kelsic, E. D., Sinai, S., Church, G. M. Comprehensive AAV capsid fitness landscape reveals a viral gene and enables machine-guided design. Science. 366 (6469), 1139-1143 (2019).
  23. Kondratov, O., et al. A comprehensive study of a 29-capsid AAV library in a non-human primate central nervous system. Molecular Therapy. 29 (9), 2806-2820 (2021).
  24. Weinmann, J., et al. Identification of a myotropic AAV by massively parallel in vivo evaluation of barcoded capsid variants. Nature Communications. 11 (1), 5432(2020).
  25. Kremer, L. P. M., et al. High throughput screening of novel AAV capsids identifies variants for transduction of adult NSCs within the subventricular zone. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 23, 33-50 (2021).
  26. Borner, K., et al. Pre-arrayed pan-AAV peptide display libraries for rapid single-round screening. Molecular Therapy. 28 (4), 1016-1032 (2020).
  27. Kienle, E., et al. Engineering and evolution of synthetic adeno-associated virus (AAV) gene therapy vectors via DNA family shuffling. Journal of Visualized Experiments. (62), e3819(2012).
  28. Furuta-Hanawa, B., Yamaguchi, T., Uchida, E. Two-dimensional droplet digital PCR as a tool for titration and integrity evaluation of recombinant adeno-associated viral vectors. Human Gene Therapy Methods. 30 (4), 127-136 (2019).
  29. Lyons, E., Sheridan, P., Tremmel, G., Miyano, S., Sugano, S. Large-scale DNA barcode library generation for biomolecule identification in high-throughput screens. Scientific Reports. 7 (1), 13899(2017).
  30. Korbelin, J., et al. Optimization of design and production strategies for novel adeno-associated viral display peptide libraries. Gene Therapy. 24 (8), 470-481 (2017).
  31. Korbelin, J., Trepel, M. How to successfully screen random adeno-associated virus display peptide libraries in vivo. Human Gene Therapy Methods. 28 (3), 109-123 (2017).
  32. Herrmann, A. K., et al. A robust and all-inclusive pipeline for shuffling of adeno-associated viruses. American Chemical Society Synthetic Biology. 8 (1), 194-206 (2019).
  33. Choudhury, S. R., et al. In vivo selection yields AAV-B1 Capsid for central nervous system and muscle gene therapy. Molecular Therapy. 24 (7), 1247-1257 (2016).
  34. Buschmann, T., Bystrykh, L. V. Levenshtein error-correcting barcodes for multiplexed DNA sequencing. BMC Bioinformatics. 14, 272(2013).
  35. Buschmann, T. DNABarcodes: an R package for the systematic construction of DNA sample tags. Bioinformatics. 33 (6), 920-922 (2017).
  36. Li, B., et al. A comprehensive mouse transcriptomic BodyMap across 17 tissues by RNA-seq. Scientific Reports. 7 (1), 4200(2017).
  37. Clarner, P., et al. Development of a one-step RT-ddPCR method to determine the expression and potency of AAV vectors. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 23, 68-77 (2021).
  38. Zolotukhin, S., Vandenberghe, L. H. AAV capsid design: A Goldilocks challenge. Trends in Molecular Medicine. 28 (3), 183-193 (2022).
  39. Brown, D., et al. deep parallel characterization of AAV tropism and AAV-mediated transcriptional changes via single-cell RNA sequencing. Frontiers in Immunology. 12, 730825(2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

AAV Capsid EngineeringGene Therapy VectorsBarcoded AAV VariantsPeptide Display LibraryIn Vivo ScreeningNext Generation SequencingBarcode AnalysisCapsid Variant StratificationTransduction EfficiencyHierarchical Clustering

Powiązane artykuły