Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Izolacja wektorów terapii genowej nowej generacji poprzez inżynierię, kodowanie kreskowe i badania przesiewowe wariantów kapsydu wirusa związanego z adenowirusem (AAV)

5.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64389

⸱

18 października 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Infectious Diseases/Virology, Section Viral Vector Technologies, Medical Faculty, University of Heidelberg, 2BioQuant Center, BQ0030, University of Heidelberg, 3Cluster of Excellence CellNetworks, 4German Center for Infection Research (DZIF), 5German Center for Cardiovascular Research (DZHK)

W tym artykule

Podsumowanie

AAV generowanie biblioteki wyświetlania peptydów i późniejsza walidacja poprzez kodowanie kreskowe kandydatów o nowych właściwościach do tworzenia AAV nowej generacji.

Streszczenie

Wektory dostarczania genów pochodzące z wirusa związanego z adenowirusem (AAV) są jednym z najbardziej obiecujących narzędzi do leczenia chorób genetycznych, czego dowodem są zachęcające dane kliniczne i zatwierdzenie kilku terapii genowych AAV. Dwa główne powody sukcesu wektorów AAV to (i) wcześniejsza izolacja różnych naturalnie występujących serotypów wirusowych o odrębnych właściwościach oraz (ii) późniejsze opracowanie potężnych technologii inżynierii molekularnej i ponownego wykorzystania w wysokiej przepustowości. Potencjał tych technik dodatkowo zwiększają niedawno wdrożone strategie kodowania kreskowego wybranych kapsydów AAV na poziomie DNA i RNA, co pozwala na ich kompleksową i równoległą stratyfikację in vivo we wszystkich głównych narządach i typach komórek u jednego zwierzęcia. W tym miejscu przedstawiamy podstawowy rurociąg obejmujący ten zestaw uzupełniających się ścieżek, wykorzystując wyświetlacz peptydów AAV do reprezentowania różnorodnego arsenału dostępnych technologii inżynieryjnych kapsydu. W związku z tym najpierw opisujemy kluczowe etapy generowania biblioteki wyświetlania peptydów AAV w celu selekcji in vivo kandydatów o pożądanych właściwościach, a następnie pokazujemy, jak kodować kreskowo najciekawsze warianty kapsydu do wtórnych badań przesiewowych in vivo. Następnie przedstawimy przykładową metodologię tworzenia bibliotek do sekwencjonowania nowej generacji (NGS), w tym wzmacniania kodów kreskowych i ligacji adapterów, a na koniec omówimy najważniejsze kroki podczas analizy danych NGS. Ponieważ przedstawione tutaj protokoły są wszechstronne i można je dostosować, naukowcy mogą je łatwo wykorzystać do wzbogacenia optymalnych wariantów kapsydu AAV w swoim ulubionym modelu choroby i do zastosowań w terapii genowej.

Wprowadzenie

Terapia transferu genów polega na wprowadzeniu materiału genetycznego do komórek w celu naprawy, wymiany lub zmiany komórkowego materiału genetycznego w celu zapobiegania, leczenia, leczenia lub łagodzenia choroby. Transfer genów, zarówno in vivo, jak i ex vivo, opiera się na różnych systemach dostarczania, niewirusowych i wirusowych. Wirusy ewoluowały w sposób naturalny, aby skutecznie transdukować swoje komórki docelowe i mogą być wykorzystywane jako wektory dostarczania. Spośród różnych typów wektorów wirusowych stosowanych w terapii genowej, wirusy związane z adenowirusami są coraz częściej stosowane, ze względu na ich brak chorobotwórczości, bezpieczeństwo, niską immunogenność, a co najważniejsze, ich zdolność do podtrzymywania długotrwałej, nieintegrującej ekspresji1,2,3. Terapia genowa AAV przyniosła znaczące osiągnięcia w ciągu ostatniej dekady; Trzy terapie zostały zatwierdzone przez Europejską Agencję Leków i Amerykańską Agencję ds. Żywności i Leków do stosowania u ludzi3,4. Prowadzonych jest również kilka badań klinicznych mających na celu leczenie różnych chorób, takich jak hemofilia, choroby mięśni, serca i neurologiczne, jak omówiono w innym miejscu3. Pomimo dziesięcioleci postępu, dziedzina terapii genowej doświadczyła serii niepowodzeń w ostatnich latach4, przede wszystkim zgonów w badaniach klinicznych5, które zostały wstrzymane z powodu toksyczności ograniczającej dawkę, szczególnie dla tkanek masywnych, takich jak mięśnie, lub trudno dostępnych, takich jak brain6.

Wektory AAV obecnie używane w badaniach klinicznych należą do naturalnych serotypów z kilkoma wyjątkami1. Inżynieria AAV daje możliwość opracowania wektorów o doskonałej specyficzności i wydajności narządów lub komórek. W ciągu ostatnich dwóch dekad z powodzeniem zastosowano kilka podejść, takich jak wyświetlanie peptydów, zamiana pętli, tasowanie DNA kapsydu, podatny na błędy PCR i projektowanie celowane, w celu wygenerowania indywidualnych wariantów AAV lub ich bibliotek o różnych właściwościach7. Są one następnie poddawane wielu rundom ukierunkowanej ewolucji, aby wybrać warianty w nich o pożądanych właściwościach, zgodnie z przeglądem w innym miejscu1,3. Spośród wszystkich strategii ewolucji kapsydu, biblioteki AAV z wyświetlaczem peptydów są najczęściej stosowane, ze względu na pewne unikalne właściwości: są stosunkowo łatwe do wygenerowania i mogą osiągnąć wysoką różnorodność i sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości, co pozwala śledzić ich ewolucję.

Pierwsze udane biblioteki AAV do wprowadzania peptydów zostały opisane prawie 20 lat temu. W jednym z pierwszych, Perabo i wsp.8 skonstruowali bibliotekę zmodyfikowanych kapsydów AAV2, w której pula losowo generowanych oligonukleotydów została umieszczona w plazmidzie w pozycji odpowiadającej aminokwasowi 587 białka kapsydu VP1, w trzykrotnej osi wystającej z kapsydu. Wykorzystując koinfekcję adenowirusem, biblioteka AAV ewoluowała przez wiele rund selekcji, a końcowe warianty ponownie ukierunkowane okazały się zdolne do transdukcji linii komórkowych opornych na leczenie do rodzicielskiego AAV28. Wkrótce potem Müller i in.9 wprowadzili dwuetapowy system tworzenia bibliotek, co stanowiło znaczące ulepszenie protokołu. Początkowo biblioteka plazmidów, wraz z plazmidem pomocniczym adenowirusa, jest używana do wytworzenia biblioteki AAV, która zawiera chimeryczne kapsydy. Ta biblioteka wahadłowców AAV służy do infekowania komórek przy niskiej wielokrotności infekcji (MOI), w celu wprowadzenia jednego genomu wirusa na komórkę. Koinfekcja adenowirusem zapewnia produkcję AAV o pasującym genomie i capsid9. Około dekadę później Dalkara10 wykorzystał ewolucję ukierunkowaną in vivo do stworzenia wariantu 7m8. Ten wariant ma insercję 10 aminokwasów (LALGETTRPA), z których trzy działają jako łączniki i skutecznie celuje w zewnętrzną siatkówkę po wstrzyknięciu doszklistkowym10. Ten zmodyfikowany kapsyd jest wyjątkową historią sukcesu, ponieważ jest to jeden z niewielu zmodyfikowanych kapsydów, które do tej pory trafiły do kliniki11.

Dziedzina doświadczyła drugiego impulsu wraz z wprowadzeniem technik sekwencjonowania nowej generacji (NGS). Dwie publikacje z Adachi et al.12 w 2014 r. oraz z Marsic et al.13 w 2015 r., pokazały moc NGS w śledzeniu dystrybucji bibliotek kapsydów AAV z kodami kreskowymi z dużą dokładnością. Kilka lat później NGS regionów oznaczonych kodem kreskowym został dostosowany do regionu insercji peptydu, aby podążać za ewolucją kapsydu. Körbelin i wsp.14 przeprowadzili badanie przesiewowe pod kontrolą NGS w celu zidentyfikowania kapsydu opartego na AAV2 ukierunkowanego na płuca. Analiza NGS pomogła obliczyć trzy wyniki oceny: wynik wzbogacenia między rundami selekcji, ogólny wynik swoistości w celu określenia swoistości tkankowej i wreszcie łączny wynik14. W tym samym roku Gradinaru lab15 opublikował system ukierunkowanej ewolucji AAV oparty na rekombinacji Cre (CREATE), który ułatwia selekcję specyficzną dla typu komórki. W tym systemie biblioteka kapsydów zawiera przełącznik odwracalny Cre, ponieważ sygnał polyA jest otoczony przez dwa miejsca loxP. Biblioteka AAV jest następnie wstrzykiwana myszom Cre, gdzie sygnał poliA jest odwracany tylko w komórkach Cre +, zapewniając matrycę do wiązania startera odwrotnego PCR ze starterem do przodu w genie kapsydu. Ten wysoce specyficzny ratunek PCR umożliwił identyfikację AAV-PHP. Wariant B, który może przekroczyć barierę krew-mózg15. System ten został następnie rozwinięty w M-CREATE (Multiplexed-CREATE), w którym NGS i generowanie bibliotek syntetycznych zostały zintegrowane w pipeline16.

Ulepszona, oparta na RNA wersja tego systemu z laboratorium Maguire'a17, iTransduce, umożliwia selekcję na poziomie DNA kapsydów, które funkcjonalnie przekształcają komórki i wyrażają ich genomy. Genom wirusa w bibliotece wyświetlającej peptydy składa się z genu Cre pod kontrolą wszechobecnego promotora i genu kapsydu pod kontrolą promotora p41. Biblioteka jest wstrzykiwana myszom, które mają kasetę loxP-STOP-loxP przed tdTomato. Komórki transdukowane wariantami AAV, które wyrażają genom wirusa, a tym samym Cre wyrażają tdTomato i, w połączeniu z markerami komórkowymi, można sortować i wybierać17. Podobnie, Nonnenmacher et al.18 i Tabebordbar et al.19 umieścili bibliotekę genów kapsydu pod kontrolą specyficznych tkankowo promotorów. Po wstrzyknięciu w różne modele zwierzęce, wirusowe RNA użyto do wyizolowania wariantów kapsydu.

Alternatywnym podejściem jest użycie kodów kreskowych do oznaczania bibliotek capsid. Björklund lab20 wykorzystał to podejście do bibliotek kapsydu do wstawiania peptydów z kodami kreskowymi i opracował racjonalną ewolucję wektorów AAV z kodami kreskowymi (BRAVE). W jednym plazmidzie kaseta Rep2Cap jest klonowana obok transgenu z odwróconym zakończeniem (ITR), eksprymującego żółte białko fluorescencyjne (YFP), oznaczonego kodem kreskowym. Wykorzystując miejsca loxP między końcem nakrętki a początkiem kodu kreskowego, rekombinacja Cre in vitro generuje fragment wystarczająco mały dla NGS, umożliwiając w ten sposób powiązanie insercji peptydu z unikalnym kodem kreskowym (tabela przeglądowa, LUT). Produkcja AAV odbywa się przy użyciu biblioteki plazmidów, a kody kreskowe wyrażone w mRNA są badane przesiewowo po zastosowaniu in vivo, ponownie za pomocą NGS20. Gdy biblioteki kapsydu zawierają warianty całego genu kapsydu (tj. biblioteki przetasowane), należy zastosować sekwencjonowanie z długim odczytem. Kilka grup użyło kodów kreskowych do oznaczania tych różnorodnych bibliotek, co umożliwia NGS większą głębokość odczytu. Kay lab21 oznaczył bardzo zróżnicowane biblioteki tasowania kapsydów z kodami kreskowymi poniżej sygnału poliA czapeczki. W pierwszym kroku wygenerowano bibliotekę plazmidów z kodami kreskowymi, a następnie sklonowano do niej bibliotekę genów kapsydu. Następnie użyto kombinacji MiSeq (krótki odczyt, wyższa głębokość odczytu) i PacBio (długi odczyt, mniejsza głębokość odczytu) NGS, a także sekwencjonowania Sangera, aby wygenerować ich klasę LUT21. W 2019 roku Ogden i jego koledzy z Church lab22 określili przydatność kapsydu AAV2 do wielu funkcji za pomocą bibliotek, które miały pojedyncze mutacje punktowe, insercje i delecje w każdej pozycji, co ostatecznie umożliwiło projektowanie sterowane maszynowo. W celu wygenerowania biblioteki zsyntetyzowano mniejsze fragmenty genu kapsydu, oznaczono kodem kreskowym, zsekwencjonowano nową generację, a następnie sklonowano do pełnego genu kapsydu. Dane NGS zostały wykorzystane do wygenerowania tablicy LUT. Biblioteka została następnie prześwietlona przy użyciu samych kodów kreskowych i sekwencjonowania krótkiego odczytu, co z kolei pozwala na większą głębokość odczytu22.

Biblioteki z kodami kreskowymi były głównie używane do badania puli znanych, naturalnych i zmodyfikowanych wariantów po kilku rundach selekcji bibliotek kapsydu lub niezależnie od badania ewolucji kapsydu. Zaletą takich bibliotek jest możliwość badania przesiewowego wielu kapsydów, przy jednoczesnym zmniejszeniu liczby zwierząt i zminimalizowaniu zmienności między zwierzętami. Pierwsze badania, które wprowadziły tę technologię do dziedziny AAV, zostały opublikowane prawie dekadę temu. Nakai lab12 oznaczył 191 podwójnych mutantów alaniny pokrywających aminokwasy od 356 do 736 na VP1 z AAV9 parą 12-nukleotydowych kodów kreskowych. Korzystając z NGS, biblioteka została przebadana in vivo pod kątem wiązania galaktozy i innych właściwości12. Marsic i współpracownicy nakreślili biodystrybucję wariantów AAV, korzystając również z podwójnej analizy linkowej 1 rok później13. W nowszym badaniu na naczelnych porównano biodystrybucję w ośrodkowym układzie nerwowym 29 kapsydów przy użyciu różnych dróg dostarczania23. Nasze laboratorium opublikowało niedawno ekrany biblioteki AAV z kodami kreskowymi dla 183 wariantów, które zawierały naturalne i zmodyfikowane AAV. Te badania przesiewowe na poziomie DNA i RNA doprowadziły do identyfikacji wysoce miotropowego wariantu AAV 24 u myszy, a także innych wykazujących wysoką swoistość typu komórkowego w mózgu myszy 25.

Tutaj opisujemy metodologię użytą w tej pracy i rozszerzamy ją o badania przesiewowe bibliotek wyświetlania peptydów AAV. Obejmuje to generowanie bibliotek wyświetlania peptydów AAV2, metodę cyfrowego kropelkowego PCR (dd-PCR) do oznaczania ilościowego, a na koniec potok NGS do analizy wariantów AAV, częściowo oparty na pracy Weinmanna i współpracowników24. Na koniec przedstawiono opis generowania bibliotek AAV z kodami kreskowymi oraz potoku NGS wykorzystanego w tej samej publikacji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie biblioteki ekspozycji losowych peptydów 7-mer AAV2

UWAGA: W celu przygotowania biblioteki ekspresji losowych peptydów AAV2 należy zsyntetyzować zdegenerowane oligonukleotydy jako jednoniciowe DNA, przekształcić je w dwuniciowe DNA, przeprowadzić trawienie, ligację z plazmidem akceptorem, a następnie elektroporację.

  1. Projektowanie zdegenerowanych oligonukleotydów
    1. Zamów zdegenerowane oligonukleotydy, unikając stronniczości kodonów (codon bias). W oligonukleotydzie 5' CAGTCGGCCAG AG W GGC (X01)7 GCCCAGGCGGCTGACGAG 3', X01 odpowiada 20 kodonom, z których każdy koduje jeden z 20 aminokwasów. W może być A lub T, tworząc kodony AGA lub AGT, które kodują aminokwasy argininę (R) lub serynę (S).
    2. Zamów starter do amplifikacji: 5' CTCGTCAGCCGCCTGG 3' (szczegóły patrz: Rysunek 1). Daje to następujący insert białkowy: R/S G X7. Różnorodność teoretyczną oblicza się następująco: 1 x 2 x 207 = 2,56 x 109 unikalnych wariantów.
      UWAGA: Należy zauważyć, że różnorodność ta może być ograniczona przez wydajność transformacji.
  2. Synteza drugiej nici
    1. Resuspenduj oba oligonukleotydy (zdegenerowane oligonukleotydy i starter do amplifikacji) do końcowego stężenia 100 µM w buforze TE.
      1. Dla reakcji PCR przygotuj mieszaninę o objętości 50 µL zawierającą 1 µL każdego startera, 10 µL buforu, 1,5 µL DMSO, 0,5 µL dNTP (10 mM), 0,5 µL polimerazy Hi-fidelity Hot Start Polymerase II oraz 35,5 µL wody wolnej od nukleaz.
      2. Przenieś reakcję do termocyklera i przeprowadź etap preinkubacji przez 10 s w 98 °C, a następnie trzy cykle: 10 s w 98 °C, 30 s w 59 °C i 10 s w 72 °C, potem 5 min w 72 °C i końcowy etap chłodzenia.
    2. Oczyść produkt reakcji za pomocą zestawu do usuwania nukleotydów i eluuj w 100 µL wody wolnej od nukleaz.
    3. Potwierdź wydajność syntezy drugiej nici za pomocą analizy na Bioanalyzerze (patrz: Rysunek 2). Przeanalizuj wielkość i czystość dwuniciowego insertu, ładując 1 µL reakcji na chip mikrofluidyczny z zestawu DNA 1000 Reagents zgodnie z instrukcjami producenta. Zestaw ten jest zoptymalizowany do pomiaru wielkości i stężenia dwuniciowych fragmentów DNA z zakresu 25-1 000 bp.
  3. Trawienie insertu i wektora plazmidowego
    1. Straw 85 µL oczyszczonego insertu za pomocą 10 µL buforu 10x i 5 µL enzymu BglI w końcowej objętości reakcji 100 µL (szczegóły patrz: Rysunek 1). Inkubuj przez noc w 37 °C. Oczyść za pomocą zestawu do usuwania nukleotydów, eluuj w 50 µL wody wolnej od nukleaz i określ ilość, używając trybu „Oligo DNA” w spektrofotometrze.
    2. Straw 10 µg kompetentnego do replikacji plazmidu AAV (pRep2Cap2_PIS)26 (wirulowy genom flankowany ITR) za pomocą 20 µL buforu 10x i 10 µL enzymu SfiI w końcowej objętości reakcji 200 µL (szczegóły patrz: Rysunek 1). Inkubuj przez noc w 50 °C. Oczyść wektor na 1% żelu agarozy za pomocą zestawu do ekstrakcji z żelu, a następnie przeprowadź dodatkowy etap oczyszczania za pomocą zestawu do oczyszczania DNA. Określ stężenie w spektrofotometrze.
  4. Ligacja insertu do wektora
    1. Zliguj 955 ng wektora plazmidowego z 45 ng insertu, dodając 2 µL buforu i 2 µL ligazy w reakcji ligacji o objętości 20 µL. Inkubuj przez noc w 16 °C, a następnie przez 10 min w 70 °C, aby termicznie inaktywować ligazę.
  5. Transformacja, obliczanie złożoności i przygotowanie biblioteki plazmidowej
    1. Oczyść reakcję za pomocą zestawu do oczyszczania DNA zgodnie z instrukcjami producenta. Eluuj produkt w około 80% początkowej objętości wody wolnej od nukleaz i przechowuj na lodzie do późniejszej transformacji.
    2. Przeprowadź transformację komórek elektrokompetentnych: rozmroź jedną fiolkę komórek elektrokompetentnych na lodzie przez 10 min. Następnie dodaj 1-2 µL oczyszczonej reakcji ligacji do 30 µL (jedna fiolka) komórek elektrokompetentnych i wymieszaj, delikatnie opukując fiolkę. Następnie ostrożnie pipetuj mieszaninę komórek i DNA do schłodzonej kuwety do elektroporacji z przerwą 1 mm, nie wprowadzając pęcherzyków powietrza.
    3. Przeprowadź elektroporację przy następujących ustawieniach: 1800 V, 600 Ω i 10 µF. W ciągu 10 s od impulsu elektroporacji dodaj do kuwety 970 µL uprzednio ogrzanej pożywki regeneracyjnej (dostarczanej z komórkami elektrokompetentnymi) i wymieszaj pipetowaniem. Na koniec przenieś komórki do probówki do mikrocentryfugi i inkubuj przez 1 h w 37 °C przy 250 rpm. Aby uzyskać pożądaną różnorodność, przeprowadź 10-100 reakcji, a po inkubacji połącz wszystkie reakcje w jednej probówce.
    4. Oblicz różnorodność, rozcieńczając 10 µL połączonych transformacji 10-, 100- lub 1 000-krotnie w PBS i wysiewając 100 µL na płyty z agarem odżywczym zawierającym odpowiedni antybiotyk (75 mg/mL ampicyliny). Inkubuj płyty z agarem przez noc w 37 °C, a następnie policz kolonie na płytach.
    5. Oblicz teoretyczną różnorodność w następujący sposób:
      Teoretyczna maksymalna różnorodność = 10 x czynnik rozcieńczenia x liczba kolonii x liczba reakcji elektroporacji.
      ​UWAGA: Aby potwierdzić jakość biblioteki, zsekwencjonuj co najmniej 20 kolonii metodą sekwencjonowania Sangera. Większość klonów powinna zawierać insert, a wszystkie powinny być unikalne.
    6. Zaszczep 400-1 000 mL pożywki LB zawierającej odpowiedni antybiotyk pozostałością połączonych transformacji i inkubuj przez noc w 37 °C przy 180 rpm.
  6. Przygotowanie biblioteki plazmidowej
    1. Z hodowli nocnej przygotuj stok glicerolowy (wymieszaj równe objętości hodowli bakteryjnej i 50% roztworu glicerolu w wodzie wolnej od nukleaz i zamroź w -80 °C) oraz oczyść bibliotekę plazmidową za pomocą zestawu do maxi-preparacji plazmidów.
  7. Produkcja wirusowej biblioteki AAV
    1. Przygotuj bibliotekę wirusową zgodnie z wcześniejszym opisem27. Transfekuj bibliotekę plazmidową (pRep2Cap2_PI, insert peptydowy) wraz z plazmidem adeno-pomocniczym do komórek HEK293T, używając odczynnika do transfekcji, takiego jak polietylenoimina (PEI).
    2. Zbierz komórki po 3 dniach i poddaj je trzem cyklom zamrażania i rozmrażania. Oczyść lizat wirusowy za pomocą ultrawirowania w gradiencie chlorku cezu, a następnie przeprowadź wymianę buforu na PBS i na koniec skoncentruj cząstki wirusowe.
  8. Miareczkowanie wektora AAV za pomocą dd-PCR
    1. Wykonaj rozcieńczenia seryjne 2 µL stoku wektora AAV w 198 µL wody wolnej od nukleaz, aby uzyskać końcowe rozcieńczenie 1:106. Za każdym razem mieszaj dokładnie za pomocą pipety 200 µL. Dodaj jedną kontrolę bez matrycy (NTC) jako kontrolę negatywną.
      UWAGA: Można przetestować dodatkowe rozcieńczenia niższe lub wyższe (1:105-1:107).
    2. Przygotuj 20-krotny miks starter-sonda. Do probówki wirówkowej 1,5 mL dodaj po 3,6 µL każdego ze starterów 100 µM (forward i reverse, Rep2 oraz ITR), po 1 µL sond dd-PCR 100 µM (Rep2 i ITR) oraz 3,6 µL wody wolnej od nukleaz.
      UWAGA: Bibliotekę AAV mierzy się za pomocą zestawu starter-sonda ukierunkowanego na transgen (Rep2) wykrywanego sondą znakowaną FAM oraz zestawu starter-sonda ukierunkowanego na ITR wykrywanego sondą znakowaną HEX.
    3. Przygotuj reakcję PCR o objętości 22 µL, dodając 5,5 µL próbki, 1,1 µL 20-krotnego miksu starter-sonda, 11 µL dd-PCR supermix dla sond (bez dUTP) i 4,4 µL wody wolnej od nukleaz. Daje to stężenia odpowiednio 900 nM dla starterów i 250 nM dla sondy.
    4. Wygeneruj kropelki za pomocą generatora kropelek, przenieś reakcję na płytkę 96-dołkową, umieść płytkę w termocyklerze i przeprowadź etap denaturacji przez 10 min w 94 °C, a następnie 40 cykli: 30 s w 94 °C i 1 min w 58 °C. Następnie inaktywuj polimerazę termicznie przez 10 min w 98 °C i dodaj końcowy etap chłodzenia. Odczytaj reakcje w czytniku kropelek i przystąp do analizy28.
    5. Otwórz zapisany plik płytki dd-PCR za pomocą oprogramowania do analizy. Użyj narzędzia progowego (threshold tool) w zakładce 1D Amplitude (amplituda fluorescencji względem liczby zdarzeń), aby oddzielić kropelki negatywne i pozytywne dla każdego kanału, używając NTC jako wskazówki, a następnie wyeksportuj dane do pliku csv.
    6. Aby obliczyć stężenie wektora, najpierw oblicz czynnik korekcji CF za pomocą wzoru:
      figure-protocol-1
      CF określa proporcję kropelek pozytywnych dla transgenu [Positives], które są pozytywne zarówno dla transgenu, jak i ITR [Ch1+ Ch2+], aby zapewnić wykrycie funkcjonalnych cząstek wektora. Końcowe stężenie wektora c można teraz obliczyć za pomocą następującego równania:
      figure-protocol-2
      DF to czynnik rozcieńczenia (1:105-1:107 ustalony wcześniej). Liczba kopii na reakcję 20 µL/dołek odpowiada 5 µL rozcieńczonej próbki. Współczynnik 1 000 koryguje skalę do VG/mL (genom wirusowy/mL). Przykładowy wynik miareczkowania przedstawiono w Tabeli 1 i na Rysunku 3.
  9. Analiza wirusowej biblioteki AAV metodą NGS
    1. Amplifikuj 96-nukleotydowy fragment insercji peptydowej, przygotowując reakcję PCR o objętości 20 µL z użyciem zestawu polimerazy z funkcją korekty (2x; patrz: Rysunek 4). Do reakcji dodaj 1 µL stoku AAV zawierającego 1 x 108 vg, 0,5 µL każdego startera 100 µM (NGS_forward i NGS_reverse) oraz 10 µL miksu enzymatycznego. Doprowadź końcową objętość do 20 µL wodą wolną od nukleaz.
    2. Przenieś reakcję do termocyklera i przeprowadź etap denaturacji przez 3 min w 98 °C, a następnie 30-35 cykli: 10 s w 98 °C, 10 s w 59 °C i 20 s w 72 °C, a następnie 5 min w 72 °C i końcowy etap chłodzenia.
    3. Oczyść próbki za pomocą zestawu do oczyszczania PCR. Określ stężenie w spektrofotometrze i przeprowadź elektroforezę na 3% żelu agarozy, aby zweryfikować czystość i wielkość fragmentu.
    4. Przetwórz fragmenty PCR za pomocą zestawu do systemów bibliotecznych dla próbek o niskiej złożoności zgodnie z instrukcjami producenta w celu przygotowania biblioteki NGS. Przeprowadź reakcję naprawy końców z 30 ng fragmentu PCR, a następnie ligację adapterów i amplifikację PCR przez 10 cykli. Do oczyszczania reakcji użyj zestawu do oczyszczania PCR.
    5. Przeanalizuj produkty końcowe na Bioanalyzerze, aby zweryfikować wielkość i czystość, używając zestawu odczynników DNA zgodnie z instrukcjami producenta.
    6. Określ ilość amplikonów za pomocą fluorometru i połącz je. Ponownie określ ilość końcowej połączonej biblioteki NGS na fluorometrze (zgodnie z instrukcjami producenta) i zweryfikuj jakość na Bioanalyzerze.
    7. Zsekwencjonuj biblioteki NGS w trybie single-end (SE), używając zestawu high output 75-cyklowego, z długością odczytu 84 i indeksem 1 o długości 8.
      UWAGA: Sekwencjonowanie przykładów w tym artykule zostało wykonane w placówce GeneCore EMBL w Heidelbergu (http://www.genecore.embl.de/).
    8. Przeanalizuj dane z sekwencjonowania NGS za pomocą Python 3 i biopython. Pliki można znaleźć pod adresem https://github.com/grimmlabs/AAV_GrimmLab_JoVE2022 (alternatywnie pod https://doi.org/10.5281/zenodo.7032215). Analiza NGS składa się z dwóch etapów. 
      1. W pierwszym etapie przeszukaj pliki sekwencji w poszukiwaniu sekwencji spełniających określone kryteria (obecność sekwencji rozpoznawczych flankujących miejsce insercji) (patrz: Rysunek 4, etap 1.9.8.5.). Jest to realizowane za pomocą skryptu (Script#1) i pliku konfiguracyjnego dostarczającego niezbędne informacje. Po zidentyfikowaniu poprawnej sekwencji program wyodrębnia ją i zapisuje w pliku wyjściowym, który jest plikiem txt o tej samej nazwie co plik sekwencjonowania.
      2. Drugim etapem jest analiza plików wyjściowych. Sekwencje w bibliotece zaczynają się od dowolnego z sześciu nukleotydów (AGWggc, W = A/T) w dziewięcioaminokwasowym insercie. Na podstawie tej sekwencji startowej peptyd jest translacyjny. Generuje to pliki wyjściowe zawierające warianty peptydowe (PVs).
      3. Przygotuj dwa foldery: Script oraz Data. Do folderu Data skopiuj pliki skompresowane formatem gzip wynikające z sekwencjonowania. Do folderu Script skopiuj następujące pliki: plik Python: Script#1_DetectionExtraction_JoVE_Py3.py; plik Python: Script#2_PV_extraction_and_ranking_Py3.py; plik konfiguracyjny: Barcode_Script_JoVE.conf oraz plik tabeli wyszukiwania (LUT): Zuordnung.txt.
      4. Przed uruchomieniem skryptów edytuj następujące pliki w folderze Script. Otwórz plik „Zuordnung.txt” i dodaj w dwóch kolumnach rozdzielonych tabulatorem nazwy plików gzip (kolumna 1) oraz pożądane końcowe nazwy (kolumna 2; wartości rozdzielone tabulatorem).
        UWAGA: Przykładowe pliki txt znajdują się w folderze GitHub „PV_analysis_script”. Pliki dostarczone w folderze GitHub są przygotowane do analizy trzech przykładowych danych z powyższej biblioteki: xaa.txt.gz, xab.txt.gz i xac.txt.gz. Dostarczone są również pliki wyjściowe.
      5. Zmień następujące zmienne w pliku konfiguracyjnym „Barcode_Script_JoVE.conf”:
        my_dir = "~/Data/"
        filename_sample_file = "~/Script/Zuordnung.txt"
        Zmienne specyficzne dla sekwencji: BCV_size = 27, BCVleft = TCCAGGGCCAG, BCVright = GCCCAGG, BCVloc = 30, BCVmargin = 8, BCVleft_revcomp = GCCGCCTGGGC, BCVright_revcomp = CTGGCCC oraz BCVloc_revcomp = 41 (szczegóły patrz: Rysunek 4).
      6. Użyj następującej komendy, aby wywołać wykrywanie i ekstrakcję sekwencji wariantów:
        >python3 ~/Script#1_DetectionExtraction_JoVE_Py3.py ~/Barcode_Script_JoVE.conf
        UWAGA: Wynikiem są pliki txt z wyodrębnionymi sekwencjami DNA i ich liczbą odczytów. Nagłówek tego pliku zawiera dane statystyczne (tj. całkowitą liczbę odczytów i odczyty wyodrębnione). Dane te są przenoszone do kolejnych plików. Te dane txt są plikami wejściowymi dla Script#2, w którym sekwencje DNA są translacyjne, rankingowane i analizowane.
      7. Wykonaj ekstrakcję i analizę PV za pomocą następującej komendy:
        >python3 ~/Script#2_PV_extraction_and_ranking_Py3.py ~/Barcode_Script_JoVE.conf
      8. Przeanalizuj tekstowe pliki wyjściowe Script#2. Pliki wyjściowe Script#2 są nazywane zgodnie z drugą kolumną LUT w „Zuordnung.txt” z rozszerzeniami zależnymi od rodzaju analizy.
        ​UWAGA: Upewnij się, że trzy pliki wyjściowe zawierają dane statystyczne w pierwszych wierszach („# of Valid PV reads”, „# of Invalid PV reads” oraz „# of unique PV reads”), pierwszą kolumnę z indeksem każdej sekwencji DNA z wejściowych plików txt (wynik Script#1) oraz następujące kolumny: (1) „…analyzed_all.csv”: „Sample:” (sekwencja DNA), „#” (liczba odczytów), „Frw or Rev” (odczyt forward lub reverse) oraz „PVs” (translacyjna sekwencja peptydowa). Sekwencje nieprawidłowe mają „NA” oraz „not valid” w dwóch ostatnich kolumnach. (2) „…analyzed_validSeq.csv”: tak samo jak poprzedni plik, odfiltrowany pod kątem poprawnych sekwencji. (3) „…analyzed_PV.csv”: „PVs” (translacyjna sekwencja peptydowa), „#” (liczba odczytów) oraz „count” (liczby frw i rev z poprzednich plików są połączone, a wartość count wynosi 1 lub 2).
      9. Wizualizuj pliki wyjściowe za pomocą dostępnego oprogramowania w zależności od potrzeb użytkownika.

2. Selekcja biblioteki ekspozycji losowych peptydów 7-mer AAV2

  1. Użyć biblioteki AAV po kwantyfikacji i kontroli jakości (sekcja 1) do ewolucji kierowanej w wybranym modelu w celu iteracyjnej selekcji kandydatów o pożądanych właściwościach (patrz Rysunek 5)16,18,21.
    ​UWAGA: Kandydaci ci są następnie wykorzystywani do generowania biblioteki z kodami kreskowymi, zgodnie z opisem w sekcji 3.

3. Przygotowanie i analiza biblioteki kapsydów AAV z kodami kreskowymi

UWAGA: Po zidentyfikowaniu zestawu potencjalnie specyficznych i wydajnych kapsydów AAV w badaniu przesiewowym z wykorzystaniem ekspozycji peptydów, należy zweryfikować funkcjonalność zidentyfikowanych sekwencji peptydowych i porównać je z zestawem powszechnie stosowanych lub dobrze opisanych referencyjnych wariantów kapsydów AAV. W tym celu sekwencję kapsydu wprowadza się do pomocniczego konstruktu Rep/Cap bez sekwencji ITR.

  1. Produkcja biblioteki AAV z kodami kreskowymi
    1. Przeprowadzić produkcję rekombinowanego AAV dla każdego wariantu kapsydu z wykorzystaniem systemu trzech plazmidów, zgodnie z wcześniejszym opisem24.
      UWAGA: Aby rozróżnić poszczególne warianty kapsydu, plazmid z transgenem reporterowym flankowanym sekwencjami ITR zawiera unikalny kod kreskowy o długości 15 nukleotydów. Kod kreskowy znajduje się w obszarze 3' UTR (nieprzetłumaczony region) pomiędzy ulepszonym żółtym białkiem fluorescencyjnym (EYFP) a sygnałem polyA (patrz Rysunek 6A). Ekspresja EYFP jest sterowana przez silny, powszechny promotor cytomegalowirusa (CMV), który zapewnia wystarczające poziomy transkryptów RNA.
    2. Zaprojektuj kody kreskowe o długości 15 nukleotydów, zawierające homopolimery o długości mniejszej niż trzy nukleotydy oraz zawartość GC na poziomie <65%29or odległość Hamminga większą niż cztery nukleotydy24.
    3. Wytwarzaj każdy kapsyd osobno w połączeniu z plazmidem transgenowym zawierającym unikalny kod kreskowy. W ten sposób każdy wariant kapsydu zostaje oznakowany odrębnym kodem kreskowym, co umożliwia jego specyficzne śledzenie (patrz Rysunek 6B).
  2. Miareczkowanie wektorów AAV z wykorzystaniem dd-PCR
    1. Przeprowadź miareczkowanie AAV zgodnie z opisem w sekcji 1.8, zastępując parę starterów Rep2 parą starterów YFP.
    2. Ilościowo określ produkcję poszczególnych wariantów AAV, a następnie połącz równe ilości każdej z tych produkcji, aby utworzyć końcową bibliotekę z kodami kreskowymi.
    3. Ponownie zmierz ilość końcowej biblioteki, aby sprawdzić jej końcowe stężenie i jakość (patrz Rysunek 7).
  3. Biblioteka AAV z kodami kreskowymi in vivo zastosowanie
    1. Podaj systemowo bibliotekę AAV z kodami kreskowymi do wybranego modelu badawczego (np. systemowo u myszy)24).
    2. Pobrać tkanki docelowe (ON-target) oraz niedocelowe (OFF-target) (tj. wątrobę, płuca, serce, przeponę, mięśnie gładkie, dwunastnicę, trzustkę, jelito grube, mięsień dwugłowy ramienia, jajniki, żołądek, ucho wewnętrzne, nerki, aortę brzuszną, aortę piersiową, mózg, tłuszcz brunatny i biały oraz śledzionę) lub typy komórek, w zależności od eksperymentu. Zamrozić je w temperaturze -80 °C, wyizolować DNA/RNA i przeprowadzić analizę ilościową metodą NGS, zgodnie z opisem w następnej sekcji.
  4. Ekstrakcja DNA/RNA
    1. Wyizoluj DNA i RNA z wybranych tkanek, korzystając z zestawu DNA/RNA Mini Kit.
    2. Umieść niewielki fragment badanego tkanki (1 mm3, około 5 mg) do probówki reakcyjnej o pojemności 2 ml.
    3. Dodaj 350 µL buforu lizującego zmieszanego z β-merkaptoetanol (1%) oraz stalowe kulki o średnicy 5 mm do tkanki (próbki należy obchodzić się z β-merkaptoetanol pod wyciągiem).
    4. Unhomogenizować tkankę w homogenizatorze tissueLyser przez 45 s przy częstotliwości 40 Hz.
    5. Dodaj 10 µL proteinazy K (10 mg/mL) i inkubować przez 15 min w 55 °C przy wytrząsaniu z prędkością 400 obr./min.
    6. Wiruj przy 20 000 x g przez 3 min w temperaturze pokojowej, zebrać nadsącz i kontynuować zgodnie z protokołem producenta zestawu do izolacji DNA/RNA.
    7. Podziel etap płukania na dwa kroki za pomocą 350 µL buforu do płukania w każdym kroku. Pomiędzy tymi etapami płukania przeprowadź trawienie resztkowego DNA na kolumnie za pomocą DNazy I wolnej od RNaz. Dodaj 80 µL roztworu DNazy I, przygotowanego zgodnie z instrukcją producenta, na kolumnę i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 min.
    8. Eluuj RNA/DNA z kolumny wodą wolną od nukleaz. Przechowuj wyizolowane RNA w temperaturze -80 °C oraz gDNA w temperaturze -20 °C.
  5. synteza cDNA
    1. Przed reakcją odwrotnej transkrypcji poddaj próbki RNA kolejnej rundzie traktowania DNazą I przez 15–30 min (w celu całkowitego usunięcia zanieczyszczeń DNA z próbek RNA). Dodaj 1 µL roztworu DNazy I, 4 µL buforu (dołączonego do zestawu) oraz wody wolnej od nukleaz do końcowej objętości 40 µL do 212 ng RNA. Inkubować przez 30 min w temperaturze pokojowej, a następnie przeprowadzić inaktywację termiczną w 70 °C przez 10 min.
    2. Zsyntetyzować cDNA, wykorzystując 150 ng RNA za pomocą zestawu zgodnie z instrukcjami producenta. Należy uwzględnić kontrole bez odwrotnej transkryptazy, aby zapewnić brak zanieczyszczającego wirusowego DNA w próbce. cDNA przechowuje się w temperaturze -20 °C.
      UWAGA: Ilość RNA wejściowego zapewniająca optymalną transkrypcję odwrotną może się różnić w zależności od rodzaju tkanki oraz oczekiwanej wydajności transdukcji w danej tkance.
  6. Analiza biblioteki wirusowej AAV (in vivo) metodą NGS
    1. Aby uzyskać wysoką głębokość sekwencjonowania przy niskich kosztach, należy przeprowadzić NGS poprzez Sekwencjonowanie metodą Illumina zgodnie z wcześniejszym opisem (rozdział 1.9). Należy przeprowadzić amplifikację sekwencji kodów kreskowych, a następnie ligować adaptory sekwencyjne do amplikonu.
    2. Ze względu na krótką długość odczytów oraz ligację adapterów sekwencjonujących po obu stronach amplikonu, podczas projektowania należy upewnić się, że amplikon jest wystarczająco krótki, aby zapewnić obecność sekwencji kodowej (barcode) w odczycie NGS. W przypadku sekwencjonowania kodów kreskowych w genomach wirusowych i transkryptach wirusowych, amplikon PCR jest projektowany na długość 113 bp (patrz Rysunek 8).
    3. Należy przeprowadzić amplifikację regionu z kodem kreskowym za pomocą starterów BC-seq forward oraz BC-seq reverse. Przygotować następującą reakcję PCR: 0.5 µL polimerazy DNA o wysokiej wierności, 10 µL buforu 5x, 0.25 µL z każdego 100 µM starter (BC-seq fw/BC-seq rv) oraz 1 µl 10 mM dNTP. Jako matrycę należy wykorzystać 25 ng cDNA lub DNA na reakcję, a następnie doprowadzić końcową objętość do 50 µL wodą wolną od nukleaz.
    4. Przygotować mieszaninę PCR (master-mix) pod czystym dygestorium do PCR, aby uniknąć kontaminacji. Zastosować następujące warunki cykli: 30 s w temperaturze 98 °C, a następnie 40 cykli w temperaturze 98 °C przez 10 s i 72 °C przez 20 s, a w ostatnim kroku przez 5 min w temperaturze 72 °C.
    5. Należy uwzględnić kontrole PCR w celu potwierdzenia braku kontaminacji DNA w mieszaninie PCR (master-mix). W przypadku próbek cDNA należy zastosować kontrole bez odwrotnej transkryptazy. Na koniec należy dołączyć próbkę z biblioteką wejściową AAV. Informacje te zostaną wykorzystane do wygenerowania pliku Normalization_Variant.txt używanego w analizie.
    6. Przed oczyszczaniem produktów PCR należy zweryfikować wielkość fragmentu PCR każdej próbki za pomocą elektroforezy żelowej. Oczyszczanie przeprowadza się z wykorzystaniem komercyjnie dostępnych kulek magnetycznych lub systemów oczyszczania DNA opartych na kolumienkach (patrz Tabela materiałów).
    7. Przygotować bibliotekę NGS, korzystając z systemu przygotowywania bibliotek dla próbek o niskiej złożoności zgodnie z instrukcjami producenta, jak opisano wcześniej w sekcji 1.9.
    8. Oznaczenie stężenia DNA poprzez zestawu dsDNA HS Kit i przeanalizować jakość biblioteki zgodnie z wcześniejszym opisem (sekcja 1.9.6), a następnie przeprowadzić pooling. Ilość zpoolowanej biblioteki należy określić za pomocą fluorometru, a jej jakość ocenić na analizatorze Bioanalyzer.
    9. Przeprowadzić sekwencjonowanie NGS zgodnie z opisem w sekcji 1.9.7.
    10. Ilościowo określ za pomocą qPCR liczbę kopii transgenu (genomów wirusowych) oraz genu housekeepingowego, aby ocenić rozkład połączonej biblioteki pomiędzy tkankami lub organami na poziomie DNA.
    11. Przygotuj 30 µL reakcję qPCR w następujący sposób, aby określić liczbę kopii EYFP (transgenu) oraz GAPDH (dehydrogenazy gliceraldo-3-fosforanu, genu referencyjnego):
      1. Przygotuj 60-krotny (60x) mieszaninę starterów i sondy dla EYFP (1.5 µM YFP_fw, 1.5 µM YFP_rv i 0.6 µM sonda YFP; patrz Tabela materiałów). Należy użyć mieszaniny starterów i sond GAPDH (patrz Tabela materiałów) w celu oznaczenia liczby kopii genu referencyjnego. Reakcję przygotować w lodzie.
      2. Przygotuj mieszaninę PCR (master mix) (15 µL, patrz Tabela materiałów) i dodać 60-krotny roztwór mieszaniny starterów i sond (0.5 µL) dla wszystkich próbek i standardów (w celu obliczenia liczby kopii dla standardów należy skorzystać z następującego linku: http://cels.uri.edu/gsc/cndna.html). Przygotować reakcję w lodzie.
      3. Transfer 15.5 µL mieszaniny master mix do płytki 96-dołkowej, a następnie dodać 14.5 µL próbki (przy całkowitym stężeniu DNA wynoszącym 75 ng) lub standardu do odpowiedniej studzienki. Płytkę 96-dołkową szczelnie zamknąć folią, wymieszać w wstrząsarku typu vortex i krótko odwirować.
      4. Transfer 10 µL każdej próbki do płytki 384-dołkowej w duplikacie. Płytkę należy uszczelnić folią i wirować z prędkością 800 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C.
      5. Inkubować mieszaninę reakcyjną w termocyklerze, rozpoczynając od temperatury 50 °C przez 2 min, a następnie wstępny etap aktywacji trwający 10 min w 95 °CPrzeprowadź 40 cykli denaturacji w temperaturze 95 °C przez 15 s oraz przyłączanie/elongację w temperaturze 60 °C przez 1 min24.
      6. Aby uzyskać liczbę genomów diploidalnych (dg), należy wykorzystać liczbę kopii GAPDH i podzielić ją przez dwa. Następnie należy podzielić liczbę kopii EYFP przez liczbę dg, co pozwoli wyznaczyć liczbę genomów wektora na genom diploidalny (vg/dg). Wartość tę należy wykorzystać do utworzenia pliku Normalization_Organ.txt na potrzeby analizy bioinformatycznej.
    12. Przeprowadź analizę danych z sekwencjonowania NGS zgodnie z metodą Weinmanna i wsp.24z wykorzystaniem niestandardowego kodu w języku Python3 (https://github.com/grimmlabs/AAV_GrimmLab_JoVE2022). Przepływ pracy obejmuje wykrywanie sekwencji kodów kreskowych na podstawie sekwencji flankujących, ich długość i lokalizację (Script#1_BarcodeDetection.py), a także analizę wzbogacenia kodów kreskowych i ich rozkładu w zbiorze tkanek (Script#2_BarcodeAnalysis.py).
      1. Wykryj kody kreskowe i przypisz je do wariantów AAV. Umieść dane z sekwencjonowania w formie zarchiwizowanych plików fastq w jednym katalogu (np. "Dane do analizy"). Plik z danymi sekwencjonowania dla biblioteki wejściowej znajduje się w tym katalogu i jest wykorzystywany wyłącznie do obliczenia proporcji kapsydów w bibliotece wejściowej.
      2. Przed uruchomieniem skryptu należy utworzyć dwa pliki tekstowe rozdzielane tabulatorami: plik wariantów kapsydu (patrz plik przykładu "Warianty.txt") z sekwencjami kodów kreskowych przypisanymi do nazw wariantów kapsydu AAV oraz plikiem zanieczyszczeń (patrz "Zanieczyszczenia.txt") z sekwencjami kodów kreskowych pochodzącymi z możliwej kontaminacji (inne kody kreskowe dostępne w laboratorium, przyczyniające się do kontaminacji).
      3. Na koniec edytuj plik konfiguracyjny "Barcode_Script.conf" należy zawrzeć następujące informacje: ścieżkę do folderu z danymi z sekwencjonowania (np. "Dane do analizy"), sekwencje regionów flankujących kody kreskowe, ich położenie oraz rozmiar okna dla detekcji kodów kreskowych (podobnie jak w 1.9.8.5, patrz Rysunek 8).
      4. Użyj poniższego polecenia, aby wywołać detekcję kodów kreskowych, podając ścieżki do pliku Script#1_BarcodeDetection.py oraz plików konfiguracyjnych:
        >python3 ~/Script#1_BarcodeDetection.py ~/Barcode_Script.conf
        UWAGA: Wynikiem uruchomienia skryptu Script#1_BarcodeDetection.py są pliki tekstowe zawierające liczbę odczytów dla każdego wariantu kapsydu oraz całkowitą liczbę odczytów odzyskanych z danych surowych.
      5. Oceń rozkład kapsydów AAV z kodami kreskowymi w tkankach lub narządach, uruchamiając skrypt Script#2_BarcodeAnalysis.py wraz z następującymi plikami txt:
        1. W "Przyporządkowanie.txt" plik, przypisz nazwę każdego pliku txt otrzymanego z procesu detekcji kodów kreskowych do nazwy tkanki/organu: nazwy plików txt w pierwszej kolumnie oraz odpowiadające im nazwy tkanek/organów w przypisaniu rozdzielonym tabulatorami.
          UWAGA: W celu uzyskania przykładu sprawdź w "Przykład" folder (https://github.com/grimmlabs/AAV_GrimmLab_JoVE2022). Należy zauważyć, że nazwa tkanki/organu może zawierać znaki określające pomiar cDNA lub gDNA oraz numer replikatu biologicznego (M1, M2 itd.).
        2. Utwórz "organy.txt" plik tekstowy z listą nazw organów docelowych (ON-target) i poza-docelowych (OFF-target), które odpowiadają nazwom podanym w zadaniu "Przypisanie.txt" plik (patrz "Przykład" folder: https://github.com/grimmlabs/AAV_GrimmLab_JoVE2022).
        3. Utwórz "Normalizacja_Organ.txt" i "Normalizacja_Wariant.txt" pliki tekstowe rozdzielane tabulatorami z znormalizowanymi wartościami dla wszystkich wariantów kapsydu oraz wszystkich organów/tkanek. W pierwszej kolumnie "Normalizacja_Narząd.txt" pliku, wpisz nazwy przypisane do każdego organu (zgodnie z plikiem z zadaniem) "Przyporządkowanie.txt") oraz w drugiej kolumnie wartości normalizacji dla odpowiadających im tkanek, wygenerowane w sekcji 3.6.11.
        4. Wypełnij pierwszą kolumnę "Normalizacja_Wariant.txt" plik zawierający listę nazw kapsydów oraz drugą kolumnę z znormalizowanymi wartościami liczby odczytów dla każdego kapsydu w bibliotece połączonej (normalizację można obliczyć na podstawie pliku wyjściowego txt dla biblioteki wejściowej otrzymanego z pierwszego skryptu).
        5. Edytuj plik konfiguracyjny, określając pełne ścieżki do wszystkich dodatkowych plików wymienionych powyżej. Uruchom skrypt Script#2_BarcodeAnalysis.py w następujący sposób:
          >python3 /Script#2_BarcodeAnalysis.py ~/Barcode_Script.conf
          UWAGA: Skrypt do analizy kodów kreskowych generuje kilka plików: pliki tekstowe z wartościami względnego stężenia (RC) rozkładu kapsydów w różnych tkankach, opracowane na podstawie opisanych wcześniej wielu etapów normalizacji, oraz plik arkusza kalkulacyjnego, który łączy dane z plików tekstowych w zintegrowaną macierz danych. Ten ostatni może zostać wykorzystany do analizy skupień i wizualizacji.
        6. Wizualizuj dane i przeprowadź analizę skupień danych macierzowych, aby wyróżnić właściwości kapsydu i ocenić ich podobieństwa na podstawie profili RC w różnych tkankach. Skorzystaj z dodatkowego skryptu PCA_heatmap_plot.R znajdującego się w repozytorium:
          >Rscript --vanilla ~/PCA.R ~/relativeconcentration.xls
          ​UWAGA: Skrypt przyjmuje jako dane wejściowe pliki relativeconcentration.xls i generuje dwa wykresy: mapę ciepła z klastrowaniem hierarchicznym oraz analizę głównych składowych (PCA).
        7. Aby zmodyfikować wykresy (osie mapy ciepła, główne składowe PCA) lub parametry plików png (kolor, rozmiar, etykietowanie), należy otworzyć skrypt R i postępować zgodnie z instrukcjami zawartymi w sekcjach z komentarzami.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Generowanie biblioteki AAV2 z ekspozycją peptydów. W pierwszym kroku w kierunku selekcji zmodyfikowanych AAV opisano generowanie biblioteki plazmidowej. Wstawka peptydowa jest wytwarzana przy użyciu starterów degenerowanych. Redukcja kombinacji kodonów z 64 do 20 ma na celu wyeliminowanie kodonów stop oraz ułatwienie analizy NGS poprzez zmniejszenie różnorodności biblioteki na poziomie DNA, przy jednoczesnym zachowaniu jej różnorodności na poziomie białka. Oligonukleotydowa wstawka jest zamawiana w formi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym protokole przedstawiono kroki potrzebne do inżynierii kapsydu AAV z wyświetlaczem peptydów oraz do badań przesiewowych biblioteki AAV z kodami kreskowymi, a także do bioinformatycznej analizy składu biblioteki i wydajności kapsydu. Protokół ten koncentruje się na krokach, które ułatwiają analizę bioinformatyczną tego typu bibliotek, ponieważ większość laboratoriów wirusologicznych pozostaje w tyle w umiejętnościach programowania, aby dopasować się do ich biegłości w technikach biologii molekularnej. Oba typy biblio...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

D.G. jest współzałożycielem AaviGen GmbH. D.G. i K.R. są wynalazcami w oczekującym zgłoszeniu patentowym związanym z generowaniem unikających odporności wariantów kapsydu AAV. Reszta autorów nie ma nic do ujawnienia.

Podziękowania

D.G. bardzo docenia wsparcie ze strony Niemieckiej Fundacji Badawczej (DFG) za pośrednictwem Centrów Badawczych DFG SFB1129 (Projektnummer 240245660) i TRR179 (Projektnummer 272983813), a także przez Niemieckie Centrum Badań nad Infekcjami (DZIF, BMBF; TTU-HIV 04.819).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Podkład amplifikacyjnyELLA Biotech (Monachium, Niemcy)-Synteza drugiej nici wkładki oligonukleotydowej Odczynniki
Agilent DNA 1000Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA)5067-1504Walidacja fragmentów DNA
System Bioanalyzer Agilent 2100Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA)Walidacja fragmentów DNAG2938C
AllPrep DNA/RNA Mini Zestaw Qiagen (Venlo, Holandia)80204Ekstrakcja DNA/RNA
Odczynniki Agilent DNA 1000Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA)5067-1504Przygotowanie biblioteki NGS
System Bioanalyzer Agilent 2100Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA)G2938CPrzygotowanie biblioteki NGS
BC-seq fw: IDT (San Joce, Kalifornia, Kalifornia, Stany Zjednoczone)ATCACTCTCGGCATGGACGAGC Przygotowanie biblioteki NGS
BC-seq rv:   IDT (San Joce, Kalifornia, Kalifornia, Stany Zjednoczone)GGCTGGCAACTAGAAGGCA Przygotowanie biblioteki NGS
β-MercaptoethanolMillipore Sigma (Burlington, MA, USA)44-420-3250MLEkstrakcja DNA/RNA
BglINew England Biolabs (Ipswich, MA, USA)R0143Trawienie dwuniciowej wkładki
C1000 Touch Thermal CyclerBio-Rad (Hercules, CA, USA)1851196Cykler dd-PCR
dNTPS New England Biolabs (Ipswich, MA, USA)N0447SNGS Przygotowanie biblioteki
ddPCR Supermix do sond (bez dUTP)Bio-Rad (Hercules, CA, USA)1863024dd-PCR supermix
Olej do generowania kropelek do sondBio-Rad (Hercules, CA, USA)1863005Olej do generowania kropelek dd-PCR
Wkłady DG8 do generatora kropel QX100 / QX200Bio-Rad (Hercules, CA, USA)1864008Kartridże do generowania kropelek dd-PCR
Uchwyt na kartridże DG8Bio-Rad (Hercules, CA, USA)1863051Uchwyt na kartridże dd-PCR
Generator kropel DG8 UszczelkaBio-Rad (Hercules, CA, USA)1863009Osłona dd-PCR do płytki
ddPCR 96-dołkowe, półosłonoweBio-Rad (Hercules, CA, USA)12001925dd-PCR 96-dołkowa płytka
E.cloni 10G SUPREME Elektrokompetentny OgniwaLucigen (Middleton, WI, USA)60081-1Ogniwa elektrokompetentne
Kuwety do elektroporacji, 1mmBiozym Scientific (Oldendorf, Niemcy)748050Elektroporacja
GAPDH mieszanka startera/sondyThermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)Mm00186825_cnStarter Taqman qPCR
Genepulser XcellBio-Rad (Hercules, CA, USA)1652660
Zestaw do odwrotnej transkrypcji cDNA o dużej pojemnościApplied Biosystems (Waltham, MA, USA)4368814odwrotna transkrypcja cDNA
ITR_fwIDT (San Joce, CA, USA)GGAACCCCTAGTGATGGAGTT (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/)starter dd-PCR
ITR_rvIDT (San Joce, CA, USA)CGGCCTCAGTGAGCGA (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/)starterdd-PCR
ITR_probeIDT (San Joce, CA, USA)Sonda HEX-CACTCCCTCTCTGCGCGCG-BHQ1 (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/)dd-PCR
System Illumina NextSeq 500Illumina Inc (San Diego, CA, USA)Biblioteka SY-415-1001NGS sekwencjonowanie
KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X)*Roche AG (Bazylea, Szwajcaria)KK2600 07958919001przygotowanie próbki NGS
MagnaBot 96 Magnetyczne urządzenie separacyjne PromegaGmbH (Madison, WI, USA)V8151Przygotowanie próbki do biblioteki NGS
Spektrofotometr NanoDrop 2000Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)ND-2000Trawienie wkładki dwuniciowej
NGS_frwSigma-Aldrich (Burlinght, MA, USA)Starter GTT CTG TAT CCA, CCA, ACC NGS
NGS_revSigma-Aldrich (Burlinght, MA, USA)Podkład CGC CTT GTG TGT TGA CATC NGS
NextSeq 500/550 High Output Kit (75 cykli)Illumina Inc (San Diego, CA, USA)FC-404-2005NGS Biblioteka sekwencjonowania
System biblioteki Ovation dla próbek o niskiej złożoności Zestaw NuGEN Technologies, Inc. (San Carlos, CA, USA)9092-256NGS Przygotowanie biblioteki
PX1 Zgrzewarka do płyt Bio-Rad (Hercules, CA, USA)1814000Zgrzewarka do płytek dd-PCR
Zgrzewany folia przebijanaBio-Rad (Hercules, CA, USA)1814040Folia uszczelniająca dd-PCR
Phusion High-Fidelity DNA-PolymeraseThermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)F530SSynteza drugiej nici wkładki oligonukleotydowej
PEI MAX - Liniowy chlorowodorek polietyleniminy klasy transfekcyjnej (MW 40,000)Polysciences, Inc. (Warrington, PA, USA)24765-1GPrzygotowanie biblioteki AAV
ProNex Size-Selective Purification SystemPromega GmbH (Madison, WI, USA)NG2002Przygotowanie próbki dla biblioteki NGS
Polimeraza Phusion Hot Start II Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)F549LNGS Przygotowanie biblioteki
Proteinaza KRoche AG (Bazylea, Szwajcaria)5963117103Ekstrakcja DNA/RNA
pRep2Cap2_PISwektor ITR-Rep2Cap2-ITR. Miejsce insercji peptydów w Cap2 ORF, wyprodukowane/przygotowane w laboratorium 
Generator kropel QX200Bio-Rad (Hercules, CA, USA)1864002Generator kropel dd-PCR
Czytnik kropel QX200Bio-Rad (Hercules, CA, USA)1864003Analiza kropel dd-PCR Zestaw
usuwania nukleotydów QIAquickQiagen (Venlo, Holandia)28306Synteza drugiej nici oczyszczania wkładki oligonukleotydowej
Zestaw do ekstrakcji żelu QIAquickQiagen (Venlo, Holandia)28704Oczyszczanie wektorów plazmidowych
QIAGEN Plasmid Maxi KitQiagen (Venlo, Holandia)12162Biblioteka plazmidów Przygotowanie DNA
Zestaw do oczyszczania Qiaquick PCRQiagen (Venlo, Holandia)28104Przygotowanie próbki do biblioteki NGS
Fluorometr kubitowyInvitrogen (Waltham, MA, USA)Q32857NGS Przygotowanie biblioteki
Qubit dsDNA HSThermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)Q32851NGS Przygotowanie biblioteki
QuantiFast PCR Master MixQiagen (Venlo, Holandia)1044234Taqman qPCR
rep_fwIDT (San Joce, CA, USA)AAGTCCTCGGCCCAGATAGACstarter dd-PCR
rep_rvIDT (San Joce, CA, USA)CAATCACGGCGCACATGTstarter dd-PCR
rep_probeIDT (San Joce, CA, USA)FAM-TGATCGTCACCTCCAACA-BHQ1sonda dd-PCR
Wolna od RNaz DNazaQiagen (Venlo, Holandia)79254Ekstrakcja DNA/RNA
SfiINew England Biolabs (Ipswich, MA, USA)R0123Trawienie wektora
5 mm, stal KoralikiQiagen (Venlo, Holandia)69989Ekstrakcja DNA/RNA
TRIMER-OLIGONUKLEOTYDYELLA Biotech (Monachium, Niemcy)-Zdegenerowany oligonukleotyd
T4 LigazaNew England Biolabs (Ipswich, MA, USA)M0202LLigacja biblioteki plazmidów
TissueLyserLTQiagen (Venlo, Holandia)Ekstrakcja DNA/RNA85600
YFP_fwIDT (San Joce, CA, USA)GAGCGCACCATCTTCTTCAAGstarter dd-PCR
YFP_rvIDT (San Joce, CA, USA)Starter dd-PCR TGTCGCCCTCGAACTTCAC
YFP_probeIDT (San Joce, CA, USA)FAM-ACGACGGCAACTACA-BHQ1sonda dd-PCR
Zymo DNA Clean & Concentrator-5 (Capped)Badania Zymo (Irvine, CA, USA)D4013Oczyszczanie wektorów i ligacji
do elektroporacji do

Bibliografia

  1. Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).
  2. Muhuri, M., Levy, D. I., Schulz, M., McCarty, D., Gao, G. Durability of transgene expression after rAAV gene therapy. Molecular Therapy. 30 (4), 1364-1380 (2022).
  3. Li, C., Samulski, R. J. Engineering adeno-associated virus vectors for gene therapy. Nature Reviews Genetics. 21 (4), 255-272 (2020).
  4. Kuzmin, D. A., et al. The clinical landscape for AAV gene therapies. Nature Reviews Drug Discovery. 20 (3), 173-174 (2021).
  5. Mullard, A. Gene therapy community grapples with toxicity issues, as pipeline matures. Nature Reviews Drug Discovery. 20 (11), 804-805 (2021).
  6. Nature Biotechnology. Gene therapy at the crossroads. Nature Biotechnology. 40 (5), 621(2022).
  7. Becker, P., et al. Fantastic AAV Gene Therapy Vectors and How to Find Them-Random Diversification, Rational Design and Machine Learning. Pathogens. 11 (7), 756(2022).
  8. Perabo, L., et al. In vitro selection of viral vectors with modified tropism: the adeno-associated virus display. Molecular Therapy. 8 (1), 151-157 (2003).
  9. Muller, O. J., et al. Random peptide libraries displayed on adeno-associated virus to select for targeted gene therapy vectors. Nature Biotechnology. 21 (9), 1040-1046 (2003).
  10. Dalkara, D., et al. In vivo-directed evolution of a new adeno-associated virus for therapeutic outer retinal gene delivery from the vitreous. Science Translational Medicine. 5 (189), (2013).
  11. Sahel, J. A., et al. Partial recovery of visual function in a blind patient after optogenetic therapy. Nature Medicine. 27 (7), 1223-1229 (2021).
  12. Adachi, K., Enoki, T., Kawano, Y., Veraz, M., Nakai, H. Drawing a high-resolution functional map of adeno-associated virus capsid by massively parallel sequencing. Nature Communications. 5, 3075(2014).
  13. Marsic, D., Mendez-Gomez, H. R., Zolotukhin, S. High-accuracy biodistribution analysis of adeno-associated virus variants by double barcode sequencing. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 2, 15041(2015).
  14. Korbelin, J., et al. Pulmonary targeting of adeno-associated viral vectors by next-generation sequencing-guided screening of random capsid displayed peptide libraries. Molecular Therapy. 24 (6), 1050-1061 (2016).
  15. Deverman, B. E., et al. Cre-dependent selection yields AAV variants for widespread gene transfer to the adult brain. Nature Biotechnology. 34 (2), 204-209 (2016).
  16. Ravindra Kumar, S., et al. Multiplexed Cre-dependent selection yields systemic AAVs for targeting distinct brain cell types. Nature Methods. 17 (5), 541-550 (2020).
  17. Hanlon, K. S., et al. Selection of an efficient AAV vector for robust CNS transgene expression. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 15, 320-332 (2019).
  18. Nonnenmacher, M., et al. Rapid evolution of blood-brain-barrier-penetrating AAV capsids by RNA-driven biopanning. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 20, 366-378 (2021).
  19. Tabebordbar, M., et al. Directed evolution of a family of AAV capsid variants enabling potent muscle-directed gene delivery across species. Cell. 184 (19), 4919-4938 (2021).
  20. Davidsson, M., et al. A systematic capsid evolution approach performed in vivo for the design of AAV vectors with tailored properties and tropism. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (52), 27053-27062 (2019).
  21. Pekrun, K., et al. Using a barcoded AAV capsid library to select for clinically relevant gene therapy vectors. Journal of Clinical Investigation Insight. 4 (22), (2019).
  22. Ogden, P. J., Kelsic, E. D., Sinai, S., Church, G. M. Comprehensive AAV capsid fitness landscape reveals a viral gene and enables machine-guided design. Science. 366 (6469), 1139-1143 (2019).
  23. Kondratov, O., et al. A comprehensive study of a 29-capsid AAV library in a non-human primate central nervous system. Molecular Therapy. 29 (9), 2806-2820 (2021).
  24. Weinmann, J., et al. Identification of a myotropic AAV by massively parallel in vivo evaluation of barcoded capsid variants. Nature Communications. 11 (1), 5432(2020).
  25. Kremer, L. P. M., et al. High throughput screening of novel AAV capsids identifies variants for transduction of adult NSCs within the subventricular zone. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 23, 33-50 (2021).
  26. Borner, K., et al. Pre-arrayed pan-AAV peptide display libraries for rapid single-round screening. Molecular Therapy. 28 (4), 1016-1032 (2020).
  27. Kienle, E., et al. Engineering and evolution of synthetic adeno-associated virus (AAV) gene therapy vectors via DNA family shuffling. Journal of Visualized Experiments. (62), e3819(2012).
  28. Furuta-Hanawa, B., Yamaguchi, T., Uchida, E. Two-dimensional droplet digital PCR as a tool for titration and integrity evaluation of recombinant adeno-associated viral vectors. Human Gene Therapy Methods. 30 (4), 127-136 (2019).
  29. Lyons, E., Sheridan, P., Tremmel, G., Miyano, S., Sugano, S. Large-scale DNA barcode library generation for biomolecule identification in high-throughput screens. Scientific Reports. 7 (1), 13899(2017).
  30. Korbelin, J., et al. Optimization of design and production strategies for novel adeno-associated viral display peptide libraries. Gene Therapy. 24 (8), 470-481 (2017).
  31. Korbelin, J., Trepel, M. How to successfully screen random adeno-associated virus display peptide libraries in vivo. Human Gene Therapy Methods. 28 (3), 109-123 (2017).
  32. Herrmann, A. K., et al. A robust and all-inclusive pipeline for shuffling of adeno-associated viruses. American Chemical Society Synthetic Biology. 8 (1), 194-206 (2019).
  33. Choudhury, S. R., et al. In vivo selection yields AAV-B1 Capsid for central nervous system and muscle gene therapy. Molecular Therapy. 24 (7), 1247-1257 (2016).
  34. Buschmann, T., Bystrykh, L. V. Levenshtein error-correcting barcodes for multiplexed DNA sequencing. BMC Bioinformatics. 14, 272(2013).
  35. Buschmann, T. DNABarcodes: an R package for the systematic construction of DNA sample tags. Bioinformatics. 33 (6), 920-922 (2017).
  36. Li, B., et al. A comprehensive mouse transcriptomic BodyMap across 17 tissues by RNA-seq. Scientific Reports. 7 (1), 4200(2017).
  37. Clarner, P., et al. Development of a one-step RT-ddPCR method to determine the expression and potency of AAV vectors. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 23, 68-77 (2021).
  38. Zolotukhin, S., Vandenberghe, L. H. AAV capsid design: A Goldilocks challenge. Trends in Molecular Medicine. 28 (3), 183-193 (2022).
  39. Brown, D., et al. deep parallel characterization of AAV tropism and AAV-mediated transcriptional changes via single-cell RNA sequencing. Frontiers in Immunology. 12, 730825(2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Inżynieria kapsydów AAVwarianty AAV z kodami kreskowymibiblioteka ekspozycji peptydówprzesiewanie in vivosekwencjonowanie następnej generacjianaliza kodów kreskowychstratyfikacja wariantów kapsydówwydajność transdukcjigrupowanie hierarchiczne
Izolacja wektorów terapii genowej nowej generacji poprzez inżynierię, kodowanie kreskowe i badania przesiewowe wariantów kapsydu wirusa związanego z adenowirusem (AAV)
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.