Ten protokół opisuje, jak mierzyć kurczliwość u pierwotnych kardiomiocytów dorosłych ludzi z serc dawców za pomocą systemu MyoBLAZER, niezawodnej platformy do oceny zmian kurczliwości wywołanych lekiem podczas rozwoju przedklinicznego.
Artykuł metodologiczny
Pomiar kurczliwości serca w izolowanych kardiomiocytach pierwotnych u dorosłych ludzi
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Ocena zmian w kurczliwości serca jest niezbędna podczas przedklinicznego rozwoju nowych związków ukierunkowanych na serce i nie. W artykule opisano protokół oceny zmian kurczliwości w pierwotnych kardiomiocytach komorowych dorosłego człowieka z wykorzystaniem MyoBLAZER, nieinwazyjnej metody optycznej, która zachowuje prawidłową fizjologię i farmakologię komórek. Ta metoda zapisu optycznego w sposób ciągły mierzy stany przejściowe kurczliwości z wielu komórek równolegle, zapewniając zarówno średnią przepustowość, jak i cenne informacje dla każdej pojedynczej komórki w polu widzenia, umożliwiając śledzenie działania leku w czasie rzeczywistym. Skurcze kardiomiocytów są indukowane przez stymulację polem elektrycznym w stymulacji, a uzyskane obrazy jasnego pola są przekazywane do oprogramowania do przetwarzania obrazu, które mierzy skrócenie sarkomeru w wielu kardiomiocytach. Metoda ta szybko generuje różne punkty końcowe związane z kinetyką faz skurczu i relaksacji, a uzyskane dane mogą być następnie interpretowane w odniesieniu do różnych stężeń badanego przedmiotu. Metoda ta jest również stosowana na późnych etapach rozwoju przedklinicznego w celu przeprowadzenia dalszych badań mechanistycznych w celu wsparcia trwających badań klinicznych. W związku z tym model oparty na kardiomiocytach pierwotnych u dorosłego człowieka w połączeniu z systemem optycznym do ciągłego monitorowania kurczliwości może potencjalnie przyczynić się do nowej ery translatywalności danych sercowych in vitro w rozwoju przedklinicznej terapii medycznej.
Wprowadzenie
Kurczliwość mięśnia sercowego (inotropia), która reprezentuje naturalną zdolność mięśnia sercowego do kurczenia się, jest kluczową właściwością funkcji serca i zależy od dynamiki sprzężenia elektromechanicznego. Zmiany kurczliwości mięśnia sercowego wywołane lekami są pożądane w leczeniu chorób serca (np. niewydolności serca) i niepożądane w kontekście kardiotoksyczności (np. zmniejszenie frakcji wyrzutowej lewej komory). W związku z tym przedkliniczne modele kurczliwości muszą być powiązane z dokładną predykcyjnością, aby mieć pewność, że nowe leki odniosą sukces podczas rozwoju klinicznego. Jednak obecne strategie przedkliniczne, które opierają się na redukcjonistycznych sztucznych modelach komórkowych (np. genetycznie modyfikowanych, unieśmiertelnionych liniach komórkowych, które nadmiernie eksprymują określone cele sercowe będące przedmiotem zainteresowania) i modelach zwierzęcych innych niż ludzie, wykazały znaczne ograniczenia i stwierdzono, że są związane z wysokimi wskaźnikami wyczerpania leków (tj. wysokim wskaźnikiem fałszywych sygnałów)1,2,3,4. W związku z tym, konieczne jest ustanowienie nowych i wiarygodnych modeli kurczliwości ludzkiego serca komórkowego, które są związane z dużą mocą (tj. wysokim wskaźnikiem prawdziwych sygnałów), aby przewidywać wyniki leków u ludzi, a tym samym pomóc przyspieszyć wprowadzanie nowych terapii5.
Przełomowe metody odzyskiwania ludzkich serc dawców do badań6,7,8,9,10 oraz w technikach izolacji kardiomiocytów11,12,13,14,15 zapewniły wyjątkową możliwość prowadzenia badań na ludziach podczas rozwoju przedklinicznego. W tym celu pierwotne kardiomiocyty dorosłego człowieka wykazały już przydatność w ocenie wywołanych lekami zmian w kurczliwości ludzkiego serca11,12,13,14. Niniejszy artykuł szczegółowo opisuje protokół badania wpływu nowych związków na kurczliwość w kardiomiocytach dorosłego człowieka.
Protokół
Wszystkie metody zostały przeprowadzone zgodnie z odpowiednimi wytycznymi i przepisami. Wszystkie ludzkie serca użyte w badaniach nie nadawały się do przeszczepu i zostały pozyskane w sposób etyczny za świadomą zgodą prawną (pierwsza osoba lub najbliższa krewna) od zmarłych dawców narządów w Stanach Zjednoczonych (USA). Protokoły rekonwalescencji i eksperymenty in vitro zostały wstępnie zatwierdzone przez Instytucjonalne Komisje Rewizyjne (IRB) w ośrodkach transplantacyjnych w ramach amerykańskiej sieci pozyskiwania narządów i przeszczepów (OPTN). Co więcej, wszystkie transfery serc dawców są w pełni identyfikowalne i okresowo sprawdzane przez władze federalne USA.
UWAGA: Stosuj wszystkie niezbędne procedury bezpieczeństwa podczas wykonywania tego protokołu, włączając w to noszenie odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej (np. fartuchy laboratoryjne, okulary ochronne, rękawice).
1. Izolacja kardiomiocytów (1 dzień przed pomiarem kurczliwości)
- Natychmiast po przybyciu do laboratorium należy ponownie wykonać perfuzję serc dawcy za pomocą lodowatego, zastrzeżonego roztworu kardioplegicznego6 i wyizolować enzymatycznie dorosłe ludzkie miocyty pierwotne z komór11,12,13,14,15.
- Następnie utrzymuj kardiomiocyty w zawiesinie i przechowuj je w 10 ml roztworu A (110 mM sacharozy, 0,005 mM CaCl2, 3 mM MgCl2, 70 mM KOH, 60 mM kwasu laktobionowego, 10 mM KH2PO4, 20 mM tauryny, 20 mM L-histydyny, 20 mM HEPES, 2 mM kwasu L-glutaminowego, 2 mM kwasu L-(-)-jabłkowego, pH 7,4 z KOH) w 20 ml fiolkach Wheaton (tabela materiałów) w temperaturze schłodzonej, dopóki nie zostaną eksperymentalnie zbadane.
UWAGA: Przechowywać 200 000 komórek w jednej fiolce.
2. Przygotowanie powłoki Laminin (1 dzień przed pomiarem kurczliwości)
- Umieścić pojedyncze szklane szkiełko nakrywkowe (kwadrat 25 mm x 25 mm, tabela materiałów) w każdym dołku ośmiodołkowej płytki hodowlanej (tabela materiałów).
- Następnie pokryj szkiełka nakrywkowe lamininą w stężeniu 5 μg/ml. W tym celu dodaj 800 μl ludzkiego rekombinowanego preparatu Laminin 521 (tabela materiałów, przechowywana w temperaturze -20 °C) do 7,2 ml roztworu B (145 mM NaCl, 4 mM KCl, 2,5 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 11,1 mM glukozy i 10 mM HEPES, pH 7,4 z NaOH) i dobrze wymieszaj.
- Wrzuć 200 μl rozcieńczonego roztworu lamininy na środek każdego szkiełka nakrywkowego. Następnie przykryj talerz i wstaw go do lodówki o temperaturze 4 °C.
UWAGA: Przygotuj wiele ośmiodołkowych płytek hodowlanych, aby upewnić się, że jest wystarczająca ilość szkiełek nakrywkowych pokrytych lamininą.
3. Przygotowanie kardiomiocytów tolerujących Ca2+ (w dniu pomiaru kurczliwości)
- Wyjąć fiolkę z komórkami z lodówki, odessać roztwór A z fiolki i dodać schłodzone 10 ml roztworu B.
UWAGA: Upewnij się, że komórki nie są odsysane i zdyspergować roztwór B do fiolki, umieszczając pipetę po wewnętrznej stronie górnej części ścianki fiolki. - Zakryj fiolkę z komórkami, a następnie delikatnie zamieszaj, aby upewnić się, że komórki są rozproszone w roztworze B. Na koniec pozwól komórkom osiąść przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej (RT).
4. Przygotowanie systemu rejestracji (w dniu pomiaru kurczliwości)
UWAGA: System rejestracji zawiera skrzynkę kontroli temperatury, stymulator, sterowaną komputerowo perfuzję sterowaną ciśnieniem, butelki perfuzyjne sterowane ciśnieniem, wewnętrzne oprogramowanie do akwizycji pozwalające na wybór obszarów zainteresowania (ROI) i wyświetlanie stanów przejściowych kurczliwości, odwrócony mikroskop, komorę komórkową i kamerę (Rysunek 1).
- Włącz system próżni ssącej. Następnie zdejmij pokrywę mikroskopu, włącz ją, podłącz kamerę (Tabela materiałów, Rysunek 1), a na koniec upewnij się, że wentylator jest włączony, aby upewnić się, że kamera się nie przegrzewa .
- Następnie włącz płytę grzewczą mikroskopu (Tabela materiałów) i skrzynkę kontrolną temperatury (Tabela materiałów, Rysunek 1) i ustaw je na odpowiednią temperaturę roboczą. Następnie włącz stymulator pola (Tabela materiałów, Rysunek 1) i system ciśnienia. Na koniec podłącz rurkę roztworu (Tabela materiałów) do komory nagrywającej (Tabela materiałów, Rysunek 1).
5. Przygotowanie badanych związków (w dniu pomiaru kurczliwości)
- Rozcieńczony dimetylosulfotlenek (DMSO; Tabela materiałów) 1,000-krotnie w roztworze C (145 mM NaCl, 4 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 11,1 mM glukozy i 10 mM HEPES, pH 7,4 z NaOH), aby uzyskać 0,1% roztwór nośnika DMSO.
- Aby przetestować związek przy 1-krotnej, 10-krotnej, 100-krotnej i 1000-krotnej ekspozycji terapeutycznej wynoszącej 0,001 μM, rozpuść badany związek w DMSO w stężeniu 1 mM.
- Rozcieńczyć ten roztwór seryjnie za pomocą DMSO, aby wytworzyć trzy kolejne zapasy DMSO (np. 0,001 mM, 0,01 mM i 0,1 mM). Na koniec rozcieńczyć każdy badany związek podstawowy 1000 razy w 100 ml roztworu C, aby uzyskać końcowe stężenia testowe (0,001 μM, 0,01 μM, 0,1 μM i 1 μM).
- Dodać roztwór nośnika i roztwory o końcowych stężeniach mikromolowych związku do szklanych butelek o pojemności 100 ml (tabela materiałów, rysunek 1), a następnie podłączyć butelki do ciśnieniowego systemu perfuzyjnego (tabela materiałów, Rysunek 1).
- Następnie zalej system perfuzyjny programem sterowanym komputerowo (Tabela materiałów) pod ciśnieniem 200-300 mbar, aby zapewnić stały przepływ perfuzyjny z szybkością 1,8 ml/min.
UWAGA: Nie przeprowadzaj eksperymentu, jeśli okaże się, że badany związek jest związany z problemem rozpuszczalności. Należy również sformułować złożone roztwory testowe z roztworów podstawowych w ciągu 30 minut przed eksperymentalnym zastosowaniem do komórek.
6. Posiewanie kardiomiocytów (w dniu pomiaru kurczliwości)
- Wyjąć z lodówki o temperaturze 4 °C ośmiodołkową płytkę zawierającą szkiełka nakrywkowe pokryte lamininą i ostrożnie umieścić jedno szkiełko nakrywkowe w bardzo dobrze oczyszczonej komorze nagraniowej (Rysunek 1). Następnie włóż ośmiodołkową płytkę z powrotem do lodówki o temperaturze 4 °C do następnego powlekania.
UWAGA: Użyj niestrzępiącej się chusteczki (Tabela materiałów), aby wytrzeć powlekane szkiełko nakrywkowe, jednocześnie utrzymując szkiełko nakrywkowe pokryte cienką warstwą lamininy. Upewnij się również, że zużyte szkiełka nakrywkowe wyrzucasz do pojemnika na ostre przedmioty. - Następnie weź powiększoną fiolkę z komórkami (krok 3.2) i odessaj roztwór B z fiolki, aby osiągnąć jak najmniejszą objętość bez utraty komórek (~200 μL). Następnie należy dozować 200 μl komórek do komory mikroskopu rejestrującego zamontowanej na stoliku mikroskopu odwróconego (tabela materiałów).
- Pozwól komórkom osiąść na szkiełku nakrywkowym przez 5 minut. Czekając, aż komórki w pełni się uspokoją, otwórz pole widzenia na mikroskopie i określ, czy gęstość komórek jest odpowiednia (~70%), aby rozpocząć eksperyment.
UWAGA: Upewnij się, że ssanie nie zasysa wszystkich komórek, jeśli dozuje się więcej niż 200 μl.
7. Zapis kurczliwości kardiomiocytów
- Po zakończeniu posiewu należy zrównoważyć komórki przez 5 minut, ciągłej perfuzji roztworu C za pomocą systemu perfuzyjnego napędzanego ciśnieniem (tabela materiałów). Prawidłowo wyreguluj ssanie, włącz zarówno skrzynkę kontrolną temperatury, jak i płytę grzewczą i ustaw je tak, aby dostarczały ~35 °C.
- Następnie stymuluj komórki napięciem ponadprogowym o częstotliwości stymulacji 1 Hz (impuls bipolarny o czasie trwania 3 ms) na stymulatorze pola z parą platynowych drutów umieszczonych po przeciwnych stronach komory podłączonej do stymulatora pola.
- Ustaw amplitudę impulsu stymulującego na 1 V, a następnie zwiększaj ją, aż kardiomiocyty zaczną generować cykle skurczowo-relaksacyjne. W całym eksperymencie należy przyjąć wartość progu 1,5x.
UWAGA: Wybierz zdrowe komórki o morfologii w kształcie pręcika i wyraźnych prążkach. Następnie dostosuj pole widzenia i skup się na umieszczeniu w polu widzenia jak największej liczby kurczących się komórek (Rysunek 2A). - Następnie wyświetl zdigitalizowane obrazy komórek w oprogramowaniu akwizycyjnym systemu optycznego rejestrowania kurczliwości. To oprogramowanie wykorzystuje kamerę o wysokiej rozdzielczości i dużej liczbie klatek na sekundę z szybkością 150 kl./s (tabela materiałów, Rysunek 1) do nagrywania strumienia wideo zawierającego wiele miocytów w tej samej klatce.
UWAGA: Zapewnia to wystarczającą rozdzielczość czasową i przestrzenną, aby uchwycić i zmierzyć dynamikę sarkomeru kilku zdrowych miocytów jednocześnie. Nowoczesne procesory o dużej liczbie rdzeni są wykorzystywane do równoległego obliczania zmian długości sarkomeru ze strumienia wideo w czasie rzeczywistym (dane o gęstości optycznej są zbierane ze zdefiniowanych przez użytkownika obszarów zainteresowania [ROI] umieszczonych na obrazach zdrowych kardiomiocytów i równolegle do osi skurczu, Rysunek 2B). Dane dotyczące intensywności optycznej pokazują jasne i ciemne pasma odpowiadające liniom Z kardiomiocytów (Rysunek 1, Rysunek 2C). Na koniec dane te są wyświetlane użytkownikowi w celach monitorowania i zapisywane na dysku w celu późniejszej analizy (Rysunek 2C).- Unikaj obszarów komórek, które nie są ostre. Nie należy również umieszczać ROI blisko krawędzi komórek, ponieważ zmiany w kurczeniu się komórek podczas stosowania leków mogą spowodować, że ROI nie będą w stanie odczytać skurczu komórek.
- Kiedy selekcja ROI zostanie zakończona, a skurcze spełnią normy niezbędne do użycia (np. skrócenie sarkomeru >1%; rytmiczny skurcz po zastosowaniu częstotliwości stymulacji 1 Hz, brak zdarzeń arytmicznych), rozpocznij eksperyment w celu oceny skutków związku. Protokół stymulacji i sekwencję stosowania przez związek badanych stężeń przedstawiono w tabeli 1. Oprogramowanie do akwizycji będzie zarządzać, w sposób zautomatyzowany, pozyskiwaniem i wyświetlaniem danych oraz oznaczaniem stężeń testowych i czasu leczenia.
UWAGA: Zastosować badane stężenia, jeżeli skurcz utrzymuje się na stabilnej amplitudzie przez cały okres podłoża dla linii podstawowej. Wyłącz komórki, w których wyświetlany jest widok rozbiegu lub dołu. Upewnij się również, że perfuzja jest przełączana na różne stężenia testowe w trakcie eksperymentu. - Po zakończeniu eksperymentu i przechowywaniu danych na serwerze wyłącz perfuzję i grzałkę, zatrzymaj stymulację, wyczyść komorę mikroskopu wodą destylowaną, następnie usuń szklane szkiełko nakrywkowe i dokładnie wysusz komorę.
UWAGA: Dokładnie wyczyść komorę, ponieważ ma to kluczowe znaczenie, aby uniknąć przedwczesnego wystawienia następnego zestawu komórek na działanie jakiegokolwiek związku, unieważniając w ten sposób wszelkie zebrane dane. - Następnie wykonaj nowe posiew kardiomiocytów i wykonaj dodatkowy eksperyment, aby uzyskać wystarczającą ilość danych do zakończenia testowania związku lub testowania nowego związku.
8. Wyłączanie systemu optycznego zapisu kurczliwości
- Po zakończeniu codziennych testów związków należy najpierw wyłączyć wszystkie urządzenia, które nie są niezbędne do czyszczenia systemu i skopiować dane do analizy w trybie offline.
- Następnie wyjąć szklane butelki o pojemności 100 ml (tabela materiałów) zawierające roztwory o końcowych stężeniach testowych i zastąpić je szklanymi butelkami wypełnionymi do połowy roztworem koncentratu RBS 25 (tabela materiałów). Przelej roztwór RBS przez komorę mikroskopu przez 5 minut, następnie odłącz rurkę perfuzyjną od komory, wyczyść ją wodą destylowaną, a na koniec dokładnie wysusz.
UWAGA: Upewnij się, że odkurzacz działa dobrze, aby zapobiec ewentualnemu zalaniu. - Następnie podłącz rurkę perfuzyjną do rurki drenażowej. Korzystając z oprogramowania systemu perfuzji sterowanego ciśnieniem (tabela materiałów), uruchom roztwór RBS na 10 minut, upewniając się, że ciśnienie i natężenie przepływu są odpowiednio ustawione. Następnie perfuzuj 1% DMSO przez 5 minut, a następnie destyluj wodę przez 15-20 minut, aby zakończyć czyszczenie systemu perfuzyjnego.
- Wyłącz światło mikroskopu i załóż jego osłonę. Następnie odłącz przewody kamery od pudełka z boku mikroskopu i wyłącz wentylator. Upewnij się, że wszystkie zużyte butelki zostały wysłane do czyszczenia i autoklawu. Na koniec upewnij się, że wszystkie wiadra drenażowe są wypełnione w 1/4 lub mniej.
UWAGA: Upewnij się, że jest wystarczająco dużo szkiełek nakrywkowych pokrytych lamininą do użycia następnego dnia. - Na koniec skopiuj pliki z folderu akwizycji wszystkich eksperymentów przeprowadzonych w każdym systemie nagrywania i wklej je na bezpieczny serwer kopii zapasowych w celu dodatkowej analizy offline. Następnie usuń wszystkie pliki danych z folderu akwizycji.
9. Analiza danych dotyczących kurczliwości
- Wykonuj analizę w trybie offline za pomocą oprogramowania analitycznego i niestandardowego makra do uśredniania danych. Oprogramowanie analityczne oblicza i raportuje różne metryki na podstawie danych dynamiki sarkomeru generowanych przez oprogramowanie do akwizycji. Szczegółowa lista tych parametrów znajduje się w Rysunek 2D.
UWAGA: Zastosowanie niskopoziomowych technik programowych pozwala na analizę wielu serii nagrań w ciągu 5 sekund. Głównym parametrem służącym do oceny zmian kurczliwości wywołanych lekiem jest amplituda kurczliwości (% skrócenia sarkomeru = zmiana długości sarkomeru). Oblicza się ją jako długość sarkomeru w szczytowym skurczu/spoczynkowej długości sarkomeru i uśrednia w ciągu ostatnich 20 stanów przejściowych kurczliwości dla każdego badanego stężenia. - Określić ilościowo wpływ badanego związku na uśrednioną amplitudę kurczliwości w stosunku do specyficznych podstawowych warunków kontroli nośnika każdego kardiomiocytu.
- Wyrazić średnie wyniki jako średnią ± SEM i sporządzić wykres przedstawiający wpływ badanego związku na stężenie na amplitudę kurczliwości. Następnie dopasuj krzywą stężenie-odpowiedź do równania Hilla za pomocą oprogramowania analitycznego (tabela materiałów), aby uzyskać wartości IC50 (stężenie powodujące 50% zahamowanie amplitudy kurczliwości) i EC50 (stężenie powodujące 50% wzrost amplitudy kurczliwości).
- Oprócz amplitudy kurczliwości można również obliczyć inne parametry:
- Po skurczu: Zidentyfikuj skurcz wtórny jako spontaniczny wtórny skurcz przejściowy kardiomiocytu, który występuje przed następnym regularnym skurczem i powoduje nieprawidłowy i niezsynchronizowany skurcz.
- Niepowodzenie skurczu: Zidentyfikuj niepowodzenie skurczu jako niezdolność bodźca elektrycznego do wywołania skurczu.
- Zmienność krótkoterminowa (STV) i alternany: Wizualizacja tych dwóch parametrów na wykresach Poincarégo zmienności amplitudy skurczu.
- Obliczanie STV (∑|CAn + 1 − CAn| (20 × √2)−1) z ostatnimi 20 stanami nieustalonymi w każdym okresie stężeń wyrobu kontrolnego i badanego. Zidentyfikuj alternany jako powtarzające się naprzemienne stany przejściowe amplitudy krótko- i długotrwałej kurczliwości.
- Aby obliczyć częstość występowania proarytmii, znormalizuj wartości STV do wartości kontrolnej nośnika każdej komórki, wykreśl afterskurcz, niepowodzenie skurczu, STV i alternany i wyraź je jako % częstości występowania komórek wykazujących każdy z sygnałów.
- Uzupełnij wieloparametryczne profilowanie mechanistyczne o obliczenie czasu szczytu Ato, rozpadu do 30% relaksacji (Decay 30), decay do 90% relaksacji (Decay 90), czasu do 90% relaksacji (TR90) (Rysunek 2D), podstawowej długości sarkomeru, czasu do 50% szczytu, wysokości piku, długości sarkomeru przy szczytowej kurczliwości, maksymalnej prędkości skurczu i maksymalnej prędkości relaksacji12. Podobnie jak amplitudę kurczliwości, wyraź te parametry w odniesieniu do specyficznych warunków kontroli wyjściowej każdego kardiomiocytu i przedstaw je na wykresach stężenie-odpowiedź.
Wyniki
W niniejszym protokole opisano procedurę pomiaru kurczliwości w izolowanych pierwotnych kardiomiocytach dorosłego człowieka pobranych od dawców narządów oraz ocenę ostrych zmian parametrów kurczliwości wywołanych związkiem testowym. Pomiar stanu przejściowego kurczliwości realizowany jest przy użyciu systemu geometrii komórkowej opartego na analizie wideo, MyoBLAZER, który mierzy dynamikę sarkomerów, a stan serca dorosłego człowieka jest emulowany poprzez indukowanie kurczliwości za pomocą stymulacji elektrycznej z fizjologiczną częstotliwością stymulacji (1 Hz). Funkcjonalna żywotność kardiomiocytów jest potwierdzana poprzez ocenę sprzężenia wzbudzenie-skurcz (tj. procesów komórkowych łączących wzbudzenie elektryczne [potencjał czynnościowy sarkolemmy] ze skurczem). W kardiomiocytach ludzkich nie występują spontaniczne stany przejściowe kurczliwości, a kardiomiocyty reagują na zewnętrzną stymulację elektryczną cyklami skurczu/rozkurczu (Rycina 2C, E), a także na izoproterenol, agonistę receptorów β-adrenergicznych (Rycina 2F,G). Izoproterenol powoduje zależny od stężenia wzrost kurczliwości (Rycina 2G), a jego wpływ na kinetykę stanu przejściowego kurczliwości może zostać również scharakteryzowany (Rycina 2D)12.
Rysunek 1: Schemat eksperymentalny systemu optycznego zapisu kurczliwości. Rejestracja kurczliwości w polu jasnym jest prowadzona na pierwotnych kardiomiocytach ludzkich dorosłych, zgodnie z wcześniejszymi opisami11,12,13,14. Układ obejmuje (A) komorę termostatową, (B) stymulator pola, (C,D) system perfuzji sterowany ciśnieniem, (E) program komputerowy do sterowania ciśnieniem, (F) butle z ciśnieniem, (G) oprogramowanie do akwizycji, (H) wybór ROI w oprogramowaniu do akwizycji, (I) wyświetlanie przejściowych zmian kurczliwości w oprogramowaniu do akwizycji, (J) mikroskop odwrócony, (K) komorę mikroskopową oraz (L) kamerę. Wszystkie parametry sprzętu zostały podane w Tabeli materiałów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 2: Walidacja pomiaru kurczliwości ludzkich kardiomiocytów oraz efekt stymulacji β-adrenergicznej. (A) Obraz mikroskopii kontrastowej reprezentatywnego pierwotnego ludzkiego kardiomiocytu dorosłego, (B) zdefiniowane przez użytkownika obszary zainteresowania (ROI) umieszczone na obrazach zdrowych kardiomiocytów równolegle do osi skurczu, (C) wyświetlanie przejściowych zmian kurczliwości uzyskanych z tych samych ROI co w (B) za pomocą oprogramowania akwizycyjnego, (D) parametry związane z przejściową kurczliwością mierzone za pomocą oprogramowania akwizycyjnego: amplituda kurczliwości, czas do szczytu, Decay 30, Decay 90, TR90. Można również zmierzyć dodatkowe parametry: bazową długość sarkomeru, czas do 50% szczytu, wysokość szczytu, długość sarkomeru w szczycie kurczliwości, maksymalną prędkość skurczu oraz maksymalną prędkość rozkurczu. (E) Typowe przejściowe zmiany kurczliwości zarejestrowane z pierwotnego ludzkiego miocytu komorowego dorosłego przy częstotliwości stymulacji 1 Hz w obecności kontroli nośnika (F) oraz po ekspozycji na 30 nM izoproterenolu, nieselektywnego agonistę β-adrenergicznego. Przejściowe zmiany kurczliwości przedstawione na panelach E i F zostały zebrane z tego samego kardiomiocytu. Do wygenerowania informacji o sile działania wykorzystano izoproterenol w ludzkich kardiomiocytach stymulowanych z częstotliwością 1 Hz. (G) Typowa kumulatywna krzywa zależności odpowiedzi od stężenia wygenerowana poprzez pomiar kurczliwości ludzkich kardiomiocytów z użyciem izoproterenolu (n = 8 komórek). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
| Sekwencja perfuzji | Roztwór nośnikowy | Stężenie 1 (µM) | Stężenie 2 (µM) | Stężenie 3 (µM) | Stężenie 4 (µM) | Przemyć |
| Czas trwania zabiegu | 120 s | 300 s | 300 s | 300 s | 300 s | 300 s |
| Częstotliwość stymulacji | 1 Hz | 1 Hz | 1 Hz | 1 Hz | 1 Hz | 1 Hz |
Tabela 1: Protokół stymulacji i sekwencja aplikacji związku testowego. Stabilność przejściowych skurczów jest oceniana poprzez ciągły zapis przez 120 s w roztworze C, co pozwala na ustanowienie kontroli nośnika (zazwyczaj w 0,1% DMSO). Następnie stosuje się stężenie substancji testowej przez minimum 300 s lub do momentu osiągnięcia efektu stanu stacjonarnego. Wykorzystuje się cztery rosnące stężenia substancji testowej, co pozwala na uzyskanie kumulacyjnych krzywych zależność stężenie-efekt (C-E). Po zakończeniu kumulatywnych dodatków substancji testowej można zastosować 300-sekundowy okres wypłukiwania.
Dyskusja
Niniejszy manuskrypt zawiera szczegółowy protokół dla układu optycznego opartego na kurczliwości kardiomiocytów u dorosłego człowieka dla uproszczonej metody średnioprzepustowej, która umożliwia testowanie ostrej skuteczności i kardiotoksyczności nowych związków. Ten optyczny system rejestracji kurczliwości jest łatwy w użyciu, umożliwia równoległe zapisy z wielu komórek, umożliwia jednoczesną ocenę zdrowia komórek, fizjologii i farmakologii, jest wyposażony w automatyczną i szybką analizę danych (seria wielu komórek jest analizowana w ciągu 5 sekund) i umożliwia szybkie gromadzenie danych (krzywa stężenie-odpowiedź co 30 minut / związek / urządzenie). Biorąc pod uwagę te cechy, system rejestracji może być wykorzystywany nie tylko do wykrywania wpływu leków na kurczliwość kardiomiocytów, ale także do dostarczania danych dotyczących zależności struktura-aktywność w celu wsparcia wysiłków chemii medycznej we wczesnych fazach odkrywania leków16. Ponieważ za pomocą protokołu izolacji kardiomiocytów można uzyskać dziesiątki milionów komórek, obecnie badane jest zastosowanie systemu optycznego zapisu kurczliwości - platformy kardiomiocytów w celu osiągnięcia zwiększonej zdolności testowej (przy użyciu dobrze opartych płytek) przy obniżonych kosztach. Co więcej, ocena wpływu leku na parametry skurczowe i relaksacyjne mierzona za pomocą systemu rejestracji może zapewnić wieloparametryczne profilowanie mechanistyczne leków inotropowych12. Ponadto dane dotyczące kurczliwości kardiomiocytów można wykorzystać do uszeregowania nowych leków od najbardziej do najmniej kardiotoksycznych (np. margines bezpieczeństwa) i od najmniej do najbardziej skutecznych (np. margines mocy). Można również przeprowadzić kontrolne badania kurczliwości kardiomiocytów w celu wsparcia programów rozwojowych, które są związane z klinicznym spadkiem kurczliwości mięśnia sercowego12.
Kolejną istotną zaletą stosowania systemu optycznej rejestracji kurczliwości ludzkich kardiomiocytów jest jego zgodność z koncepcją 3R (zastępstwo, redukcja i udoskonalenie)17 , ponieważ można go uznać za alternatywną metodę, która pozwala uniknąć lub zastąpić wykorzystanie zwierząt do generowania danych w przemyśle farmaceutycznym. Tę korzyść 3R można również rozszerzyć na akademickie badania kardiologiczne. Cała obecna wiedza na temat fizjologii i farmakologii kardiomiocytów pochodzi z badań naukowych przeprowadzonych na komórkach wyizolowanych z serc zwierząt18. W ten sposób model kurczliwości optycznej ludzkich kardiomiocytów otwiera możliwość przeprowadzenia krytycznych badań translacyjnych. Aby przeprowadzić te badania, muszą zostać opracowane protokoły konserwacji i transportu dorosłych kardiomiocytów ludzkich (obecnie oceniane w laboratorium AnaBios), a system kurczliwości musi mieć zdolność rejestrowania zmian długości sarkomerów z kardiomiocytów innych niż ludzkie (tak jest w przypadku optycznego systemu rejestracji kurczliwości, ponieważ sarkomery są dobrze zachowane wśród gatunków).
Ludzki system kurczliwości kardiomiocytów może naśladować kilka stanów fizjologicznych (np. sprzężenie elektromechaniczne, częstotliwość stymulacji naśladującą tętno, temperaturę ciała, integrację wszystkich ludzkich celów sercowych) i wykazał wartość translacyjną jako kluczowy składnik w odkrywaniu leków 11,12,13,14 , chociaż nie może naśladować zmian obciążenia mechanicznego i naprężeń ścinających obserwowanych podczas cyklu kurczliwości serca. Struktura i funkcja macierzy zewnątrzkomórkowych serca są obecnie lepiej poznane19, opracowanie takich matryc może potencjalnie pomóc w przezwyciężeniu ograniczenia obciążenia mechanicznego, a matryce o różnych sztywnościach podobnych do sercowych są obecnie oceniane w laboratorium AnaBios. Innym ograniczeniem układu kurczliwości optycznej ludzkich kardiomiocytów jest brak sieci nerwów zaopatrujących serce (np. włókien współczulnych i przywspółczulnych)20. Ten kontakt neuro-sercowy można przywrócić przy jednoczesnym zastosowaniu neuroprzekaźników (np. izoproterenolu, agonisty receptorów β-adrenergicznych; acetylocholiny, agonisty receptorów muskarynowych M2), przy czym związek ten jest oceniany pod kątem potencjalnego wpływu na kurczliwość kardiomiocytów. Ponadto stany przejściowe kurczliwości są rejestrowane bez jednoczesnych pomiarów potencjałów czynnościowych i stanów nieustalonychCa2+, które są również niezbędne przy ocenie działania leku na elektrokardiogramie i obchodzeniu się z Ca2+. Chociaż to pominięcie można uznać za ograniczenie systemu, nie jest ono zbyt krytyczne, ponieważ zapisy sygnałów potencjału czynnościowego (metodą cęgów prądowych lub barwników wrażliwych na napięcie) i stanów nieustalonych Ca2 + (ze wskaźnikami / barwnikami Ca2 +) mogą być związane z cytotoksycznością. Takie efekty cytotoksyczne mogą mieć wpływ na ocenę nowych leków modulujących kurczliwość serca. Wręcz przeciwnie, zastosowanie nieinwazyjnej metody optycznej, która zachowuje zdrowie, fizjologię i farmakologię kardiomiocytów, takiej jak system zapisu opisany w tym protokole, nie tylko zapewniłoby uzyskanie najwyższej jakości danych dotyczących kurczliwości, ale także dostarczyłoby danych, które mogą dobrze przewidzieć skutki skurczowe nowych leków u ludzi.
Oświadczenia
Wszyscy autorzy są pracownikami korporacji AnaBios i deklarują brak sprzecznych interesów.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez AnaBios Corporation i grant NIH Small Business Innovation Research (SBIR) (1R44TR003162-01).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 100– 1000 &mikro; L Filtrowana, Szeroki otwór, Sterylne końcówki | Pipeta | UF-1000W | |
| 100 mL, Duran ciśnienie plus butelki | DWK Nauki Przyrodnicze | 218102406 | |
| 1 L, 0,22 &mikro; m System filtrów próżniowych | VWR | 567-0020 | |
| 290 mmol/kg Wzorzec osmolarności | Wescor | OA-029 | |
| Laboratoryjny pH-metr | Mettler Toledo | https://www.mt.com/us/en/home/products/Laboratory_Analytics_Browse/pH-meter/pH-meters.html | |
| Chlorek wapnia dwuwodny (CaCl2) | Kamera Sigma-Aldrich | C3881 | |
| Optronis GmbH | Cyclone-25-150-M | https://optronis.com/en/products/cyclone-25-150/ | |
| Corning 25 mm x25 mm Kwadrat #1 Szkło osłonowe | Corning | 2845-25 | |
| Cyclone-25-150 | Optronis | https://optronis.com/en/products/cyclone-25-150/ | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Cyfrowy timer/stoper | Fisher Scientific | 14-649-17 | |
| Dimetylosulfotlenek (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Ośmiodołkowa prostokątna sterylna płytka hodowlana z polistyrenu | Thermo Fisher Scientific | 73521-426 | |
| https://us.vwr.com/store/product/4679368/nunclontm-delta-rectangular-dishes-polystyrene-sterile-thermo-scientific System komór mikroskopowych FHD | IonOptix | ||
| Flow EZ, Modułowy ciśnieniowy regulator przepływu z programem sterowanym komputerowo w wersji 1.1.0.0. | Fluigent OxyGEN | ||
| Heavy Duty | VWR | 16211-080 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Ludzka rekombinowana Laminina 521 | BioLamina | LM521-05 | |
| Rurki chromatograficzne Idex, naturalny FEP, 1/16" OD x 0,030" ID | Cole-Palmer | 1520L | |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666 | |
| Kwas L-(-)-jabłkowy | Sigma-Aldrich | 112577 | |
| Kwas laktobionowy | Sigma-Aldrich | 153516 | |
| Kwas L-glutaminowy | Sigma-Aldrich | 49449 | |
| L-H-Histydyna | Sigma-Aldrich | H8000 | |
| Sześciowodny chlorek magnezu (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| Mikroskop Kontrola temperatury Podgrzewacz stopnia | AmScope | TCS-100 | |
| MyoPacer Stymulator pola | IonOptix | ||
| Nunc Prostokątne naczynia | Thermo Scientific | 267062 | |
| Olympus IX83P1ZF Ixplore Standardowy mikroskop | Olympus | https://www.olympus-lifescience.com/en/microscopes/inverted/ixplore-standard/?campaignid=657680540&adgroupid =116963199831& słowo kluczowe=ix73%20 mikroskop& gclid=EAIaIQobChMIl qjyiMWP-AIVVx-tBh2JoQ85EAA YASAAEgLp3fD_BwE | |
| Standardy pH 4,01, 7,00 i 10,01 Oakton | WD-05942-10 | ||
| Chlorek potasu (KCl) | Sigma-Aldrich | 746436 | |
| Wodorotlenek potasu (KOH) | Sigma-Aldrich | P4494 | |
| Fosforan potasu jednozasadowy (KH2PO4) | Oprogramowanie Sigma-Aldrich | 795488 | |
| Prism | Oprogramowanie GraphPad - Dotmatics | https://www.graphpad.com/ | |
| RBS 25 Płynny detergent | Sigma-Aldrich | 83460 | |
| Pojemnik na ostre przedmioty | Uline | S-15307 | |
| Oprogramowanie do analizy SigmaPlot | Systat Software Inc. | https://systatsoftware.com/ | |
| Chlorek sodu (NaCl) | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Wodorotlenek sodu (NaOH) | Sigma-Aldrich | 221465 | |
| Student Dumont #5 Kleszcze | Narzędzia do nauki o naprawach | 91150-20 | |
| Sacharoza | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Tauryna | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Skrzynka kontrolna temperatury | Warner Insturments | TC-324C | |
| Oscylometr ciśnienia pary | ELITechGroup | Model 5600 | |
| Fiolki Wheaton 20 ml | DWK Nauki przyrodnicze | 225288 |
Bibliografia
- Abi-Gerges, N., Miller, P. E., Ghetti, A. Human heart cardiomyocytes in drug discovery and research: new opportunities in translational sciences. Current Pharmaceutical Biotechnology. 21 (9), 787806(2020).
- Cook, D., et al. Lessons learned from the fate of AstraZeneca's drug pipeline: A five dimensional framework. Nature Reviews Drug Discovery. 13 (6), 419-431 (2014).
- Van Meer, B. J., Tertoolen, L. G. J., Mummery, C. L. Measuring physiological responses of human pluripotent stem cell derived cardiomyocytes to drugs and disease. Stem Cell. 34 (8), 2008-2015 (2016).
- Piccini, J. P., et al. Current challenges in the evaluation of cardiac safety during drug development: translational medicine meets the critical path initiative. American Heart Journal. 158 (3), 317-326 (2009).
- Pang, L., et al. Workshop report: FDA workshop on improving cardiotoxicity assessment with human-relevant platforms. Circulation Research. 125 (9), 855-867 (2019).
- Page, G., et al. Human ex-vivo action potential model for pro-arrhythmia risk assessment. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 81, 183-195 (2016).
- Britton, O. J., et al. Quantitative comparison of effects of dofetilide, sotalol, quinidine, and verapamil between human ex vivo trabeculae and in silico ventricular models incorporating inter-individual action potential variability. Frontiers in Physiology. 8, 597(2017).
- Qu, Y., et al. Action potential recording and pro-arrhythmia risk analysis in human ventricular trabeculae. Frontiers in Physiology. 8, 1109(2017).
- Trovato, C., et al. Human Purkinje in silico model enables mechanistic investigations into automaticity and pro-arrhythmic abnormalities. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 142, 24-38 (2020).
- Otsomaa, L., et al. Discovery and characterization of ORM-11372, a novel inhibitor of the sodium-calcium exchanger with positive inotropic activity. British Journal of Pharmacology. 177 (24), 5534-5554 (2020).
- Nguyen, N., et al. Adult human primary cardiomyocyte-based model for the simultaneous prediction of drug-induced inotropic and pro-arrhythmia risk. Frontiers in Physiology. 8, 1073(2017).
- Abi-Gerges, N., et al. Multiparametric mechanistic profiling of inotropic drugs in adult human primary cardiomyocytes. Scientific Reports. 10, 7692(2020).
- Jordaan, P., et al. Cardiotoxic potential of hydroxychloroquine, chloroquine and azithromycin in adult human primary cardiomyocytes. Toxicological Sciences. 180 (2), 356-368 (2021).
- Ton, A. T., et al. Arrhythmogenic and antiarrhythmic actions of late sustained sodium current in the adult human heart. Scientific Reports. 11, 12014(2021).
- Schmid, C., Abi-Gerges, N., Leither, M. G., Zellner, D., Rast, G. Ion channel expression and electrophysiology of singular human (primary and induced pluripotent stem cell-derived) cardiomyocytes. Cells. 10 (12), 3370(2021).
- Guha, R. On exploring structure activity relationships. Methods in Molecular Biology. 993, 81-94 (2013).
- Tannenbaum, J., Bennett, B. T. Russell and Burch's 3Ra then and now: The need for clarity in definition and purpose. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (2), 120-132 (2015).
- Ruiz-Meana, M., Martinson, E. A., Garcia-Dorado, D., Piper, H. M. Animal ethics in cardiovascular research. Cardiovascular Research. 93 (1), 1-3 (2012).
- Rienks, M., Papageorgiou, A. P., Frangogiannis, N. G., Heymans, S. Myocardial extracellular matrix. Circulation Research. 114 (5), 872-888 (2014).
- Zaglia, T., Mongillo, M. Cardiac sympathetic innervation, from a different point of (re)view. Journal of Physiology. 595 (12), 3919-3930 (2017).
Przedruki i uprawnienia
