Artykuł metodologiczny

Przedkliniczne testy leków w skalowalnych tkankach mięśniowych modyfikowanych w 3D

6.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64399

⸱

7 kwietnia 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Curi Bio Inc.

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół dostarcza metod generowania tkanek serca i mięśni szkieletowych w inżynierii 3D oraz opisuje ich zastosowanie w przedklinicznych badaniach przesiewowych leków. Opisane metody wykorzystują system detekcji magnetycznej, aby ułatwić jednoczesną ocenę 24 tkanek równolegle.

Streszczenie

Dokładne modelowanie zdrowych i chorobowych warunków in vitro jest niezbędne do opracowania nowych strategii leczenia i terapii. W przypadku chorób serca i mięśni szkieletowych siła skurczu i kinetyka stanowią kluczowe wskaźniki oceny funkcji mięśni. Nowe i ulepszone metody generowania zmodyfikowanych tkanek mięśniowych (EMT) z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych sprawiły, że modelowanie chorób in vitro stało się bardziej wiarygodne dla tkanek kurczliwych; Jednak powtarzalne wytwarzanie tkanek z zawieszonych kultur komórkowych i mierzenie ich kurczliwości jest wyzwaniem. Takie techniki są często obarczone wysokim wskaźnikiem awaryjności i wymagają złożonego oprzyrządowania oraz niestandardowych procedur analizy danych. Nowa platforma i urządzenie, które wykorzystuje EMT 3D w połączeniu z bezetykietowym, wysoce równoległym i przyjaznym w automatyzacji testem kurczliwości, omijają wiele z tych przeszkód. Platforma umożliwia łatwe i powtarzalne wytwarzanie ratowników medycznych 3D przy użyciu praktycznie dowolnego źródła komórek. Kurczliwość tkanek jest następnie mierzona za pomocą przyrządu, który jednocześnie mierzy 24 tkanki bez konieczności stosowania skomplikowanych procedur analizy oprogramowania. Przyrząd może niezawodnie mierzyć zmiany siły mikroniutonów, co pozwala na badania przesiewowe związków zależnych od dawki w celu zmierzenia wpływu leku lub terapii na zdolność skurczową. Zmodyfikowane tkanki wykonane za pomocą tego urządzenia są w pełni funkcjonalne, generują skurcze drgawcowe i tężcowe po stymulacji elektrycznej i mogą być analizowane podłużnie w hodowli przez tygodnie lub miesiące. Tutaj pokazujemy dane z EMT mięśnia sercowego pod ostrym i przewlekłym dawkowaniem znanych substancji toksycznych, w tym leku (BMS-986094), który został wycofany z badań klinicznych po zgonach pacjentów z powodu nieprzewidzianej kardiotoksyczności. Przedstawiono również zmienioną funkcję mięśni szkieletowych w tkankach zmodyfikowanych w odpowiedzi na leczenie inhibitorem miozyny. Platforma ta umożliwia naukowcom integrację złożonych, bogatych w informacje systemów modeli bioinżynieryjnych z przepływem pracy związanym z odkrywaniem leków przy minimalnym dodatkowym szkoleniu lub wymaganych umiejętnościach.

Wprowadzenie

Modele indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) coraz częściej stają się kluczowymi graczami w procesie przedklinicznym w zakresie odkryć i rozwoju terapeutycznego, a także podstawowych badań biologicznych i modelowania chorób1,2,3,4,5. Tkanki kurczliwe, takie jak mięśnie sercowe i szkieletowe pochodzące z iPSC, mają ogromny potencjał w zakresie poprawy mocy predykcyjnej badań in vitro u ludzi, ponieważ bezpośrednia ocena siły skurczu mięśni i kinetyki są wskaźnikami ilościowymi do badania ogólnej funkcji tkanki4,6,7,8. Zazwyczaj pomiary siły skurczu uzyskuje się albo pośrednio, albo przez optyczne śledzenie ugięcia podłoża9,10, albo bezpośrednio przez przyłączenie komórek/tkanek do przetwornika siły4,11,12. Metody te, choć dokładne, są z natury mało wydajne i zwykle wymagają wysoko wykwalifikowanych operatorów do zbierania i analizowania danych.

Poprzednie prace wykazały, że wykrywanie pola magnetycznego omija te przeszkody i dostarcza alternatywnej metody do oceny funkcji mięśni jednocześnie w wielu konstruktach tkankowych13. Platforma kurczliwości 3D Mantarray (Magnetometric Analyzer for eNgineered Tissue ARRAY) opiera się na tej technologii przy użyciu urządzenia zdolnego do pomiaru kurczliwości zmodyfikowanych tkanek mięśniowych w wysoce równoległy sposób, który wykorzystuje złożoność modeli komórkowych 3D z przesiewaniem o wyższej przepustowości14. Platforma umożliwia ilościowe monitorowanie w czasie rzeczywistym funkcji skurczu w tkankach serca i mięśni szkieletowych w standardowym inkubatorze do hodowli komórkowych lub poza nim, eliminując potrzebę optycznego obrazowania i analizy kurczliwości. Technologia ta ułatwia bezpośrednie porównywanie zdrowych i chorych linii komórkowych oraz umożliwia pomiar wpływu leku na tkanki kurczliwe, ustalając wymierne dane in vitro dotyczące bezpieczeństwa i skuteczności nowych i istniejących związków terapeutycznych.

Zmodyfikowane tkanki mięśniowe 3D mogą być wytwarzane między dwoma słupkami w wysoce powtarzalny sposób przy użyciu 24-dołkowej płytki odlewniczej z materiału eksploatacyjnego Mantarray (Rysunek 1). Jeden słupek jest sztywny, podczas gdy drugi słupek jest elastyczny i zawiera mały magnes. Kiedy konstrukcja tkanki kurczy się, przemieszcza elastyczny słupek i osadzony magnes. Płytka EMT jest umieszczona w instrumencie, a przemieszczenie słupka jest mierzone za pomocą zestawu czujników magnetycznych na płytce drukowanej pod uchwytem płytki. Zmierzone zmiany pola magnetycznego są przekształcane w bezwzględną siłę skurczu za pomocą algorytmu matematycznego. Przyrząd wykorzystuje szybkie tempo próbkowania danych, aby umożliwić zbieranie szczegółowych informacji na temat zdolności funkcjonalnej i dojrzałości badanego typu komórki (komórek), w tym częstotliwości skurczu, prędkości i czasu rozpadu. Te funkcjonalne pomiary można uzyskać we wszystkich 24 dołkach jednocześnie za pomocą magnetycznej platformy detekcyjnej lub indywidualnie i sekwencyjnie przy użyciu tradycyjnych metod optycznych.

To badanie opisuje wysoce powtarzalną metodę inżynierii mikrotkanek 3D mięśni szkieletowych i serca w hydrożelu na bazie fibryny. Podczas krótkiej, 80-minutowej reakcji, trombina katalizuje przemianę fibrynogenu w fibrynę, zapewniając rusztowanie dla komórek mięśniowych do rozwoju w zawieszonej hodowli15. Komórki zrębu pomagają przebudować macierz, a tkanki stają się kurczliwe, ponieważ komórki mięśniowe tworzą syncytium w hydrożelu. Kurczliwość tych tkanek analizowano przy użyciu podejścia opartego na detekcji magnetycznej, zarówno przed, jak i po ekspozycji na związek, co potwierdziło przydatność tej metody do stosowania w badaniach leków typu dawka-odpowiedź. Pierwotne ludzkie mioblasty z biopsji zdrowego dawcy uzyskano komercyjnie i wyhodowano w 2D zgodnie z protokołami dostawcy. Komórki zostały namnażone za pomocą pożywki do wzrostu mięśni szkieletowych przez trzy przejścia, aby wygenerować wystarczającą liczbę komórek do wytworzenia tkanek 3D. Komórki zrębu i kardiomiocyty pochodzące z hiPSC hodowano zgodnie z protokołem dostawcy przez 3 dni, aby umożliwić regenerację po kriokonserwacji przed wrzuceniem komórek do tkanek. Przedstawiono reprezentatywne wyniki ilustrujące typy zestawów danych, które można gromadzić za pomocą platformy czujników magnetycznych. Omówiono również powszechne pułapki związane z wytwarzaniem tkanek inżynieryjnych przy użyciu tych metod.

Protokół

1. Protokół hodowli komórkowej

  1. Pierwotna ludzka kultura mioblastów
    1. Rozcieńczyć macierz zewnątrzkomórkową (ECM) w stosunku 1:100 w 8 ml pożywki DMEM/F12 na lodzie.
    2. Nanieść 8 ml roztworu ECM na jedną kolbę T175 i inkubować w temperaturze 37 °C przez co najmniej 1 godzinę przed wysiewem komórek, ale nie dłużej niż 24 godziny. Upewnij się, że roztwór ECM pokrywa całe dno kolby.
    3. Podwielokrotność 5 ml pożywki do pomiaru wzrostu mięśni szkieletowych do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
    4. Rozmrozić zamrożoną fiolkę z komórkami (5,0 x 105 mioblastów) w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 2 minuty lub do momentu, gdy lód się rozpuści. Spryskaj fiolkę 70% etanolem i przenieś ją do szafki bezpieczeństwa biologicznego (BSC).
    5. Przenieść komórki do podzielonej pożywki za pomocą P1000. Nie rozcierać. Odwirować komórki przy 300 x g przez 3 minuty.
    6. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1 ml pożywki wzrostowej za pomocą pipety P1000, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki.
    7. Przemyć kolbę pokrytą ECM 15 ml DPBS. Odessać DPBS, a następnie dodać 30 ml pożywki wzrostowej do kolby.
    8. Dodać 4 ml pożywki wzrostowej do komórek, wymieszać i rozprowadzić zawiesinę komórek w kolbie T-175. Upewnij się, że całkowita objętość wynosi 35 ml. Delikatnie przesuń kolbę wzdłuż powierzchni roboczej w lewo i w prawo 5-6 razy, a następnie 5-6 razy do przodu i do tyłu, aby zapewnić równomierne rozmieszczenie komórek na powierzchni kolby.
    9. Umieścić kolbę T-175 w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Hoduj komórki przez 3 dni lub do momentu, gdy osiągną nie więcej niż 70% zbieżności, a następnie pasażuj komórki.
  2. Pasażowanie pierwotnych ludzkich mioblastów
    1. Rozcieńczyć ECM w stosunku 1:100 w 30 ml pożywki DMEM/F12 na lodzie.
    2. Nanieść 10 ml roztworu ECM na trzy kolby T225 i inkubować w temperaturze 37 °C przez co najmniej 1 godzinę przed wysiewem komórek, ale nie dłużej niż 24 godziny. Upewnić się, że roztwór ECM pokrywa całe dno kolby.
    3. Umyj komórki 15 ml DPBS. Odessać i dodać odczynnik dysocjacyjny zgodnie z protokołem dostawcy.
    4. Po podniesieniu komórek należy przerwać reakcję zgodnie z protokołem dostawcy i zebrać komórki do stożkowej probówki. Odwirować komórki przy 300 x g przez 3 minuty.
    5. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1 ml pożywki wzrostowej za pomocą pipety P1000, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki.
    6. Umyć kolbę pokrytą ECM 15 ml DPBS. Odessać DPBS, a następnie dodać 40 ml pożywki wzrostowej do każdej kolby T225.
    7. Dodać 14 ml pożywki wzrostowej do zawiesiny komórek, wymieszać i rozprowadzić 5 ml zawiesiny komórek do każdej kolby T225. Upewnij się, że całkowita objętość w każdej kolbie wynosi 45 ml. Delikatnie przesuń kolbę wzdłuż powierzchni roboczej w lewo i w prawo 5-6 razy, a następnie 5-6 razy do przodu i do tyłu, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie.
    8. Umieścić kolby w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
    9. Hoduj komórki przez 2-3 dni lub do momentu, gdy osiągną nie więcej niż 70% zbieżności, a następnie pasaż. Podziel komórki w stosunku 1:3 lub 1:4 w każdym przejściu i zasiaj między 3 x 103 i 1 x 104 komórki/cm2.
  3. Posiew kardiomiocytów pochodzących z hiPSC
    1. Rozcieńczyć ECM w stosunku 1:60 w 12 ml pożywki DMEM/F12 na lodzie.
    2. Nałożyć 1 ml roztworu ECM na każde zagłębienie z dwóch płytek 6-dołkowych i inkubować w temperaturze 37 °C przez co najmniej 1 godzinę przed wysiewem komórek, ale nie dłużej niż 24 godziny.
    3. Rozmrażać zamrożoną fiolkę z kardiomiocytami w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 2 minuty lub do momentu, gdy lód się rozpuści.
    4. Spryskać fiolkę 70% etanolem i przenieść ją do BSC.
    5. Użyj pipety p1000, aby przenieść rozmrożone komórki do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
    6. Przepłucz pusty kriowial 1 ml pożywki galwanicznej o temperaturze pokojowej (RT), aby odzyskać pozostałe komórki.
    7. Powoli dozuj kroplami 1 ml pożywki płuczącej (jedna kropla co 5 s) do stożkowej probówki komórek w ciągu 90 sekund. Ciągle obracaj probówkę, aby wymieszać komórki podczas powolnego dodawania pożywki.
    8. Powoli dodać 8 ml pożywki galwanicznej za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml do stożkowej probówki z komórkami o pojemności 50 ml.
    9. Po dozowaniu wszystkich pożywek delikatnie pipetuj w górę i w dół 3 razy, aby dokładnie wymieszać komórki. Policz komórki za pomocą hemekytometru i błękitu trypanowego.
    10. Odwirować komórki w stożkowej probówce o pojemności 50 ml przy 300 x g przez 3 minuty.
    11. Po ogranulowaniu komórek odessać supernatant.
    12. Za pomocą pipety p1000 przenieś 1 ml podłoża galwanicznego do probówki i delikatnie rozdrobnij granulkę, powoli pipetując w górę i w dół 3-5 razy. Ponownie zawiesić komórki za pomocą dodatkowego podłoża galwanicznego.
    13. Wysiewać od 2-4 x 106 komórek na studzienkę płytki 6-dołkowej w 2 ml pożywki galwanicznej.
    14. Umyć 6-dołkowe płytki pokryte ECM DPBS (2 ml/dołek).
    15. Odpipetować 2 ml zawiesiny komórek na dołek płytki 6-dołkowej. Delikatnie przesuwaj płytki wzdłuż powierzchni roboczej w lewo i w prawo 5-6 razy, a następnie 5-6 razy do przodu i do tyłu, aby zapewnić równomierne rozmieszczenie komórek na powierzchniach płyt.
    16. Umieścić płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
    17. Powtórzyć kroki 1.3.3-1.3.16 dla wszystkich fiolek z komórkami, które mają zostać rozmrożone.
    18. Zmień na 3-5 ml (w zależności od linii komórkowej i gęstości) pożywki konserwacyjnej następnego dnia po posiewie, a następnie zmieniaj pożywkę co drugi dzień. Hoduj komórki przez 3-4 dni przed odlaniem do tkanek 3D.
  4. Hodowla komórek zrębu
    1. Nanieść 30 ml roztworu ECM do kolby T175 i inkubować w temperaturze 37 °C przez co najmniej 1 godzinę przed wysiewem komórek, ale nie dłużej niż 24 godziny.
    2. Podwielokrotność 5 ml pożywki z komórek zrębu do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
    3. Rozmrażać zamrożoną fiolkę z komórkami zrębu w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C przez 2 minuty lub do momentu, gdy lód się rozpuści.
    4. Spryskać fiolkę 70% etanolem i przenieść ją do BSC.
    5. Za pomocą pipety p1000 powoli dodaj 1 ml pożywki z komórek zrębu do rozmrożonych komórek w fiolce.
    6. Przenieść zawiesinę komórkową z fiolki na pozostałą pożywkę do rozmrażania w stożkowej probówce. Użyj pipety serologicznej o pojemności 5 ml, aby wymieszać komórki. Pipetę w górę i w dół 3 razy.
    7. Policz komórki za pomocą hemacytometru i błękitu trypanowego. Nie odwirowuj komórek.
    8. Umyć kolbę T175 z powłoką ECM 15 ml DPBS.
    9. Przenieść komórki zrębu do kolby o gęstości 3-4 x 103 komórki/cm2. Delikatnie przesuń kolbę wzdłuż powierzchni roboczej w lewo i w prawo 5-6 razy, a następnie 5-6 razy do przodu i do tyłu, aby zapewnić równomierne rozmieszczenie komórek na powierzchni kolby.
    10. Zmień pożywkę następnego dnia na 45 ml podgrzanej pożywki z komórek zrębu. Hoduj komórki przez 3-4 dni przed odlaniem do tkanek 3D.

2. Przygotowanie materiału

  1. Fibrynogen
    UWAGA: Podczas odtwarzania fibrynogenu należy zwrócić uwagę, aby zmaksymalizować powierzchnię, na którą nakładany jest proszek fibrynogenu. W tym protokole ilość użytego rozcieńczalnika została zoptymalizowana do wielkości używanego pojemnika, tj. użyto tylko tyle rozcieńczalnika, aby pokryć dno naczynia. Na przykład umieść 0,5 g fibrynogenu na 10 ml PBS w naczyniu o średnicy 100 mm, a nie w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml. Maksymalizacja powierzchni rozcieńczalnika skróci czas potrzebny do rozpuszczenia fibrynogenu i zmniejszy potencjalne zlepianie się białka.
    1. Rekonstytucji
      1. Przenieść 10 ml PBS do naczynia do hodowli komórkowych o średnicy 100 mm i ogrzać do temperatury 37 °C w inkubatorze do hodowli komórkowych.
      2. Nałożyć 0,5 g proszku fibrynogenu na całą powierzchnię ciepłego PBS i utrzymywać w temperaturze 37 °C aż do całkowitego rozpuszczenia fibrynogenu. Powinno to zająć nie więcej niż 2 godziny. Rozpuszczający się proszek można delikatnie zawirować, ale nie należy energicznie potrząsać naczyniem.
    2. Filtracja sterylna
      1. Gdy proszek całkowicie się rozpuści, przepuść roztwór przez filtr 100 μm i zbierz go do stożkowej probówki o pojemności 50 ml, aby usunąć wszelkie grudki zżelowanego fibrynogenu.
      2. Przefiltrowany roztwór wlać do strzykawki o pojemności 10 ml z filtrem 0,2 μm. Przepchnij roztwór przez filtr i zbierz go do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Filtr może wymagać wymiany więcej niż jeden raz, aby wysterylizować całe 10 ml roztworu.
      3. Porcję 300 ml sterylnego fibrynogenu rozmieścić w 1,5 ml probówkach do mikrowirówek i przechowywać w temperaturze -20 °C. W razie potrzeby rozmrozić podwielokrotności na lodzie lub w temperaturze 4 °C. Unikaj wielokrotnego zamrażania/rozmrażania.
  2. Trombiny
    1. Dodać 6 ml PBS i 4 ml diH2O bezpośrednio do jednej fiolki trombiny (1 j.), aby uzyskać 100 j./ml roztworu podstawowego trombiny.
    2. Filtr sterylizować za pomocą filtra 0,2 μm, podwielokrotności, i przechowywać w temperaturze -20 °C w plastikowych probówkach do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml w miarę adsorpcji trombiny do szkła. Unikaj wielokrotnego zamrażania/rozmrażania.
  3. Roztwór poli(etyleniminy) (PEI)
    UWAGA: PEI jest toksyczny. Stosować odpowiednie środki ochrony indywidualnej zgodnie z zaleceniami producenta.
    UWAGA: PEI jest dostarczany w postaci roztworu 50% w/v. Jest bardzo lepki i trudny do pipetowania. Przygotuj 0,1% roztwór z 10% roztworu podstawowego, a nie bezpośrednio z 50% roztworu w/v.
    1. Odmierz 5 ml 50% w/v roztworu PEI w stożkowej probówce o pojemności 50 ml.
    2. Dodać 20 ml diH2O i wymieszać, aby uzyskać 10% roztwór podstawowy. Ten wysoce skoncentrowany roztwór podstawowy nie może być sterylnie filtrowany.
    3. Aby przygotować 0,1% roztwór do hodowli komórkowej, dodaj 5 ml 10% bulionu do 495 ml diH2O. Sterylny filtr za pomocą kolby filtracyjnej o pojemności 500 ml i przechowuj w temperaturze pokojowej nie dłużej niż 1 tydzień.
  4. Aldehyd glutarowy
    UWAGA: Aldehyd glutarowy jest toksyczny. Stosować odpowiednie środki ochrony indywidualnej zgodnie z zaleceniami producenta.
    1. Aldehyd glutarowy jest dostarczany w postaci 25% roztworu. Aby przygotować 0,01% roztwór, dodać 40 μl do 99,6 ml diH2O. Sterylny filtr i przechowywać w temperaturze 4 °C nie dłużej niż 1 tydzień.
  5. Przygotowanie posta
    1. Umieść zestaw do odlewania tkanek z materiałów eksploatacyjnych w sterylnym kapturze do hodowli. Zestaw odlewniczy zawiera pokrywę, kratownicę słupkową mieszczącą 24 pary słupków (jedna para słupków na studzienkę płytki 24-dołkowej) oraz specjalistyczne dno płytki 24-dołkowej zawierające 24 dołki odlewnicze. Każda studnia odlewnicza zawiera rów w dnie studni, w którym znajdują się składniki komórki/hydrożelu i formują je w tkankę w kształcie rurki, gdy hydrożel polimeryzuje (Rysunek 1B).
    2. Napełnij dołki 24-dołkowej płytki 1,5 ml/studzienkę 0,1% roztworu PEI i umieść słupki w płytce tak, aby końcówki każdej pary wkładów były zanurzone. Pozostaw na 10 minut. PEI osadzi ładunek dodatni na słupkach, aby białka w hydrożelu mocno przyczepiły się do słupków podczas odlewania tkanki.
    3. Napełnić dołki drugiej 24-dołkowej płytki 2 ml/studzienkę sterylnego diH2O i przenieść wkładki. Pozostaw na 1 minutę.
    4. Na trzeciej 24-dołkowej płytce napełnij studzienki 1,5 ml/studzienkę 0,01% aldehydu glutarowego (GA) i przenieś wkładki. Pozostaw na 30 minut. GA naprawi ładunek dodatni z PEI do słupków.
    5. Podczas gdy słupki są osadzone w aldehydzie glutarowym, odessać studzienki diH2O, przemyć 2 ml / studzienkę sterylnego diH2O, aspirować i ponownie napełnić 2 ml / studzienkę sterylnego diH2O. Zamiast płukania można użyć świeżej, 24-dołkowej płytki.
    6. Po upływie 30 minut przenieś wkładki do 2 ml / studzienkę sterylnego diH2O. Pozostaw na 1 minutę.
    7. Odessać diH2O i dodać kolejne 2 ml / studzienkę sterylnego diH2O. Pozostaw na 5 minut.
    8. Przenieś wkładki na płytkę 24-dołkową do wyschnięcia (około 15 min).
    9. Po wyschnięciu ponownie zmontuj zestaw odlewniczy. Krawędzie należy sfilmować parafilmem, aby uszczelnić pokrywkę i płytkę, a następnie przechowywać w temperaturze 4 °C do 72 godzin przed wysiewem komórek. Dłuższe okresy przechowywania są prawdopodobnie możliwe, ale nie zostały przetestowane.

3. Protokół odlewania tkanek

  1. Przygotowanie płyty odlewniczej
    1. Wstępnie schłodzić zestaw do odlewania tkanek w temperaturze 4 °C.
    2. Przenieś wiadro z lodem do BSC. Na lodzie przygotować 50 μl roztworu trombiny (3 μl trombiny + 47 μl pożywki EMT) na studzienkę do odlania.
      UWAGA: Zobacz krok 3.2.1, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat podłoża EMT.
    3. Wyjmij schłodzony zestaw odlewniczy z lodówki i umieść go na zimnym bloku lub lodzie w kapturze do hodowli komórkowych. Połóż płytkę odlewniczą płasko na lodzie i przenieś kratownicę z płytki odlewniczej na nową, sterylną płytkę 24-dołkową.
    4. Odpipetować 50 μl roztworu trombiny do każdego wstępnie schłodzonego dołka płytki odlewniczej.
    5. Złóż zestaw i włóż go z powrotem do lodówki, aż będzie potrzebny do odlewania tkanki. Odlewać tkanki w ciągu 3 godzin od trombiny oprócz studzienek.
  2. Przygotowanie komórek
    1. Przygotuj pożywkę bazową EMT, sterylny filtr i pozostaw na lodzie.
      UWAGA: Jeśli podłoże odlewnicze specyficzne dla komórki zawiera FBS, należy użyć inaktywowanego termicznie FBS, ponieważ może on wchodzić w interakcje z fibrynogenem i powodować przedwczesną polimeryzację.
      1. Przygotuj pożywkę EMT dla serca: Dodaj 500 ml pożywki RPMI, 10 ml witaminy B27 i 2,5 g kwasu aminokapronowego. (Opcjonalnie) Dodać 10 mM inhibitora ROCK (dodać tylko do pożywki EMT używanej do odlewania tkanek, a nie całą objętość 500 ml).
      2. Przygotuj pożywkę szkieletową EMT: Dodaj 50 ml pożywki F10 i 0,25 g kwasu aminokapronowego (ACA) dla pierwotnych EMT i 0,1 g ACA dla EMT pochodzących z iPSC.
    2. Ogrzać odczynnik dysocjacyjny do hodowli komórkowych do temperatury 37 °C. Ogrzać równą objętość pożywki EMT, aby rozcieńczyć odczynnik dysocjacyjny.
      UWAGA: Bardzo ważne jest, aby zastosowana proteaza była całkowicie dezaktywowana. Aktywna proteaza będzie zakłócać tworzenie się tkanek 3D i przyleganie do zaleceń lekarskich.
    3. Umyj komórki (Rysunek 1A) za pomocą PBS. Użyj 2 ml / dołek na płytkę 6-dołkową. Użyj odpowiednio 6 ml, 15 ml i 15 ml na miskę 100 mm, kolbę T175 i kolbę T225.
    4. Dodać podgrzany odczynnik dysocjacyjny do hodowli komórkowych w celu podniesienia komórek i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut lub do momentu, gdy komórki się podniosą. W przypadku posiewów serca należy użyć 10-krotnego odczynnika dysocjacyjnego. W przypadku komórek zrębu i mioblastów mięśni szkieletowych użyj 1x odczynnika dysocjacyjnego. Użyj 1 ml / dołek na płytkę 6-dołkową, 3 ml na szalkę 100 mm, 8 ml na kolbę T175 i 10 ml na kolbę T225.
    5. Sprawdzaj kultury co 2-3 minuty, stukając w bok płytki.
    6. Po podniesieniu komórek przenieś je do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i rozetrzyj pipetą P1000, aby zapewnić zawiesinę pojedynczych komórek.
    7. Przemyć płytkę lub kolbę dodatkowym podłożem EMT, aby zebrać pozostałe komórki i dodać je do stożkowej probówki. Użyj 1 ml/dołek pożywki EMT dla płytki 6-dołkowej, 2 ml dla naczynia o średnicy 100 mm, 5 ml dla kolby T175 i 5 ml dla kolby T225.
    8. Rozdziel komórki, aby zapewnić zawieszenie pojedynczej komórki.
    9. Dodaj pożywkę EMT, aby zakończyć proces dysocjacji, a następnie pobierz próbki zawiesin komórkowych do zliczania komórek. Użyj 1 ml / dołek na płytkę 6-dołkową, 3 ml na szalkę 100 mm, 8 ml na kolbę T175 i 10 ml na kolbę T225.
    10. Wirować komórki w masie 200 x g przez 4 minuty. Zliczać komórki za pomocą hemekytometru i trypana niebieskiego podczas odwirowywania zawiesin.
    11. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 5 ml pożywki zasadowej EMT w celu usunięcia pozostałego odczynnika dysocjacyjnego.
    12. Odwirować komórki przy 200 x g przez 4 minuty. Odessać supernatant i przygotować zawiesiny komórek o odpowiedniej gęstości.
    13. Zwiększ żywotność i funkcję EMT mięśni szkieletowych 3D dzięki dodatkowi 10%-20% białek ECM w EMT medium14,16.
    14. Kardiomiocyty pochodzące z nasiennych komórek macierzystych i ich komórki zrębu odpowiednio 5 x 10 5 komórek i 7,5 x 104 komórki na konstrukt tkankowy. Wysiewaj mioblasty mięśni szkieletowych w 7,5 x 105 komórek na konstrukt tkankowy.
    15. Tkanki serca
      1. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki zrębu o gęstości 2,5 x 106 komórek na ml w pożywce EMT i umieścić je na lodzie. Użyć 30 μl tej zawiesiny na EMT.
      2. Odessać supernatant i ponownie zawiesić CM o gęstości 8,3 x 106 komórek na ml w pożywce EMT i umieścić je na lodzie. Użyć 60 μl tej zawiesiny na EMT.
    16. Tkanki mięśni szkieletowych
      1. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki mięśni szkieletowych o gęstości 8,3 x 106 komórek na ml w pożywce EMT i umieścić je na lodzie. Użyć 90 μl tej zawiesiny na EMT.
    17. Obliczyć objętość każdego roztworu komórkowego potrzebną do uzupełnienia żądanej liczby tkanek (np. 60 μl przygotowanych CM i 30 μl przygotowanych komórek zrębu lub 90 μl komórek mięśni szkieletowych na EMT).
    18. Odpipetować obliczone objętości komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
    19. Dodaj 10 μl fibrynogenu na EMT do zawiesiny komórkowej i trzymaj ją na lodzie.
    20. Całkowita liczba odczynników i objętości komórek na EMT: Upewnij się, że każdy EMT ma 90 μl komórek, 10 μl fibrynogenu i 50 μl roztworu trombiny.
  3. Odlewanie tkanek
    1. Przenieś zestaw do odlewania tkanek do okapu do hodowli komórkowych i zdejmij pokrywę (kratka słupkowa zawierająca elastyczne i sztywne wkładki powinna pozostać na płytce odlewniczej; Rysunek 1B). Utrzymuj płytę odlewniczą z kratownicą słupkową leżącą płasko na lodzie.
    2. Wymieszać mieszaninę komórki/fibrynogenu i pobrać 100 μl za pomocą pipety P200.
    3. Dodać 100 μl mieszaniny do studzienek przygotowanych z 50 μl roztworu trombiny i rozcierać 5 razy, aby dobrze wymieszać. Nie należy wypychać pipety poza pierwszy ogranicznik i wyjmować końcówkę po roztarciu, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków.
    4. Na tym etapie i do momentu, gdy kratownica słupka jest gotowa do podniesienia z płyty odlewniczej (krok 3.3.10), każdy ruch kraty może zagrozić długotrwałemu przyleganiu tkanki do słupków. Przytrzymaj jednocześnie kratę i płytkę studzienki odlewniczej, używając palca wskazującego i kciuka jednej ręki, aby uniknąć jakiegokolwiek ruchu kraty.
    5. Powtórz z nową końcówką P200 dla każdej tkanki, aż wszystkie tkanki zostaną odlewane. Wymieszaj zawiesinę komórek w stożkowej probówce o pojemności 15 ml przed odlaniem każdej tkanki, gdy komórki szybko się uspokajają.
    6. Ostrożnie przenieś zestaw z nasionami do inkubatora, uważając, aby nie przesunąć kraty. Przemieszczenie się sieci po wysiewie może skutkować zmniejszoną skutecznością w przenoszeniu tkanek ze studzienek odlewniczych. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 80 minut, niezależnie od typu komórki. Rozpocznie to polimeryzację hydrożelu i umożliwi białkom przyczepienie się do słupków.
    7. W międzyczasie przygotuj świeżą 24-dołkową płytkę z 2 ml / dołek pożywki EMT dla tkanek serca. W razie potrzeby do pożywki EMT można dodać inhibitor 10 mM ROCK. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C w celu ogrzania pożywki.
    8. Przygotować 2 ml / dołek pożywki wzrostowej zawierającej 5 g / l kwasu aminokapronowego (0,2 mm sterylnie przefiltrowany) dla pierwotnych tkanek mięśni szkieletowych lub 2 g / l ACA dla EMT pochodzących z iPSC. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C w celu ogrzania pożywki.
    9. Po inkubacji delikatnie dodać 1 ml pożywki EMT do krawędzi studzienek odlewniczych i inkubować przez kolejne 10 minut w temperaturze 37 °C, niezależnie od typu komórek. Spowoduje to usunięcie hydrożelu z krawędzi odlewu i umożliwi łatwe przenoszenie tkanki.
    10. Po 10 minutach ostrożnie podnieś kratownicę słupka i przenieś tkanki z płytki odlewniczej na przygotowaną płytkę 24-dołkową z podłożem (Rysunek 1C). Umieścić płytki z tkankami w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C.
  4. konserwacja
    1. Po 24 godzinach przenieść odlane tkanki na świeżą 24-dołkową płytkę z 2 ml/dołek pożywki EMT (bez inhibitora ROCK, jeśli był dołączony) i inkubować w temperaturze 37 °C. W przypadku komórek mięśni szkieletowych zmień pożywkę wzrostową na pożywkę różnicującą, aby przyspieszyć fuzję mioblastów.
    2. Przenieś tkanki serca do świeżych studzienek z 2 ml / dołek pożywki EMT co 2-3 dni.
    3. Przenieś tkanki mięśni szkieletowych do świeżych studzienek z 2 ml / studzienkę z pożywką różnicującą zawierającą 5 g / l kwasu aminokapronowego (0,2 mm sterylnego filtra) co 2-3 dni. Użyj 2 g/L ACA dla tkanek pochodzących z iPSC.
    4. Aby pomóc w zmianach podłoża, przenieś siatkę po podłożu na świeżą 24-dołkową płytkę, zamiast zmieniać podłoże w tej samej płytce, aby uniknąć uszkodzenia tkanek 3D. Przygotować drugą 24-dołkową płytkę z pożywką EMT i przenieść tkanki do świeżej pożywki. Trzymaj płytkę ze starą pożywką obok aktywnej kultury, aby użyć jej do następnej zmiany podłoża. Przenoś kratkę słupkową tam iz powrotem między dwiema płytkami przez cały okres hodowli. Alternatywnie, użyj świeżej płytki do każdej zmiany podłoża.
    5. Zmierz skurcz EMT za pomocą optycznego śledzenia ugięcia po ugięciu (Rysunek 1D) lub sprzętu do wykrywania magnetycznego13,14. Tkanki serca zaczynają bić samoistnie po 3-4 dniach w hodowli. Tkanki mięśni szkieletowych są zazwyczaj kurczliwe pod wpływem stymulacji polem elektrycznym po 7 dniach w hodowli.

Wyniki

Komórki w odlano w formie inżynieryjnych tkanek mięśniowych w płytce konsumencyjnej z 2 słupkami (Rysunek 1). Prawidłowo wytworzone EMT będą wyglądać jednorodnie, a macierz będzie równomiernie rozłożona pomiędzy słupkami (Rysunek 2A). Macierz powinna również opasać oba słupki, tworząc równoważne punkty zakotwiczenia dla tkanki. Niepowodzenia podczas odlewania przy zastosowaniu tej metody zdarzają się rzadko i są zazwyczaj oczywiste podczas kontroli wizualnej. Nieudana produkcja EMT może obejmować zarówno poważne błędy, takie jak odklejenie się tkanki od słupków (Rysunek 2B), jak i subtelniejsze wady strukturalne, takie jak pęcherzyki powietrza i słabe przyleganie do słupków (Rysunek 2C,D). Tkanki z niewielkimi wadami mogą nadal być żywotne, jednak dane z takich tkanek powinny zostać dokładnie przeanalizowane, aby upewnić się, że są one porównywalne z nienaruszonymi EMT. Na przykład pęcherzyki powietrza wewnątrz EMT mogą zostać wypchnięte w miarę zagęszczania się tkanki w czasie, co pozwoli na uzyskanie w pełni funkcjonalnego konstruktu bez deficytów kurczliwych. Tkanki te muszą być jednak oceniane indywidualnie, ponieważ lokalizacja pęcherzyków powietrza może wpływać na regenerację funkcjonalną. Pęcherzyki powietrza powstałe przy słupkach mogą na przykład wpłynąć na przyleganie tkanki, co może utrudnić długoterminową adhezję do słupka.

Tkanki zaczynają się zagęszczać w ciągu pierwszych 24 h, gdy komórki przebudowują macierz wewnątrz hydrożelu (Rycina 3). Zagęszczanie jest procesem stopniowym i zazwyczaj postępuje przez pierwsze 2-4 tygodnie hodowli. Ogólnie rzecz biorąc, stopień zagęszczenia tkanki jest spójny pomiędzy powtórzeniami technicznymi i biologicznymi (Rycina 4). Jest naturalne, że niektóre linie komórkowe zagęszczają macierz w większym stopniu niż inne w miarę dojrzewania tkanek w czasie. Procent komórek miogennych w konstrukcie wpływa na tempo i całkowity stopień zagęszczania EMT. Całkowita zawartość komórek miogennych dla linii komórek mięśni sercowych i szkieletowych powinna przekraczać 80%, aby zminimalizować zmienność między tkaną inżynieryjnie. Jest to szczególnie istotne przy porównywaniu sił kurczliwych i kinetyki pomiędzy różnymi liniami komórkowymi.

W ciągu pierwszych kilku dni po odlewie kardiomiocyty zaczynają spontanicznie bić w hodowli, rytmicznie wyginając elastyczny słupek przy każdym skurczu mięśnia. Konstrukcje mięśni szkieletowych kurczą się w odpowiedzi na stymulację elektryczną do 7. dnia od rozpoczęcia różnicowania. Stymulację polową tkanek mięśni szkieletowych przeprowadzano za pomocą zewnętrznego stymulatora przymocowanego do specjalnie wykonanej pokrywki z elektrodami do płytki 24-dołkowej. Pokrywka, wyposażona w parę elektrod węglowych dla każdego dołka, spoczywa na górnej części płytki 24-dołkowej z tkankami, jednocześnie stymulując każdy EMT w celu wywołania skurczów mięśni. Podczas pomiarów funkcjonalnych tkanki były stymulowane impulsem o napięciu 10 V i czasie trwania 10 ms z częstotliwością 1 Hz. Tkanki kurczliwe wskazują na zfuzowane mioblasty szkieletowe, które tworzą miotuby z funkcjonalnymi sarkomerami i aparatem kurczliwym. Szkieletowe EMT wykazują pozytywne barwienie na ciężki łańcuch miozyny (MyHC), a dystrofina lokalizuje się w błonie miotuby, co w analizie immunohistochemicznej w przekroju poprzecznym objawia się klasycznym kształtem pierścienia (Rysunek 5). Po uzyskaniu funkcjonalności EMT, kurczliwość może być mierzona codziennie w urządzeniu z czujnikiem magnetycznym, co pozwala śledzić siłę i kinetykę w miarę rozwoju i dojrzewania konstrukcji w czasie. Zarówno tkanki mięśni sercowych, jak i szkieletowych pozostają kurczliwe od tygodni do miesięcy w hodowli 3D (Rysunek 6) i mogą być wykorzystywane w szerokim zakresie badań nad kurczliwością.

Metoda detekcji magnetycznej może być wykorzystywana do jednoczesnego pomiaru ostrych i przewlekłych skutków działania strukturalnych kardiotoksykantów, takich jak doksorubicyna (Rysunek 7) i BMS-986094 (Rysunek 8), a także innych leków wpływających na kurczliwość mięśni. Można również stosować optyczne metody śledzenia skurczów, jednak należy zachować ostrożność przy badaniu ostrych efektów działania leków, ponieważ pomiary muszą być wykonywane sekwencyjnie. Zwiększona żywotność tkanek inżynieryjnych (EMT) mięśnia sercowego i szkieletowego w hodowli 3D umożliwia prowadzenie długoterminowych badań nad lekami w tych tkankach. Pozwala to użytkownikom badać efekty wielokrotnego dawkowania, a także ciągłej, długotrwałej ekspozycji na związki, które z czasem mogą wykazywać działanie kardiotoksyczne, co ma miejsce w przypadku doksorubicyny. Doksorubicyna (dox) jest chemioterapeutykiem przeciwnowotworowym17. Ilość leku podawana pacjentom różni się w zależności od rodzaju nowotworu, wieku pacjenta, jego wzrostu i wagi, a także innych czynników. Z tego powodu ważne jest badanie wpływu doksorubicyny w szerokim zakresie stężeń i schematów podawania. W niniejszym badaniu sercowe EMT były traktowane przez 27 dni trzema oddzielnymi stężeniami doksorubicyny (0,1 µM, 1 µM i 10 µM) (Rysunek 7). Grupy dodatkowo podzielono, podając EMT w każdym stężeniu lek albo w formie bolusa, albo w sposób ciągły z wymianą medium co 72 h. Studnie poddawane leczeniu bolusowemu doksorubicyną były eksponowane na lek w trzech oddzielnych punktach czasowych, co pozwalało na regenerację pomiędzy dawkami. Dwie najwyższe dawki w ekspozycji bolusowej i ciągłej spowodowały natychmiastowe i przedłużające się całkowite ustanie generowania siły skurczu w trakcie całego badania. Stężenia średnie i najniższe wywierały zróżnicowany wpływ na tkanki, zależnie od metody podania. W najniższym stężeniu leku grupa bolusowa nie wykazała różnic w stosunku do kontroli. Jednakże siła skurczu zmalała po 2 tygodniach ciągłej ekspozycji. Stężenie średnie wywołało interesujący efekt. Podczas gdy dawkowanie ciągłe zmniejszyło siłę w ciągu pierwszych kilku dni leczenia i efekt ten utrzymywał się przez cały eksperyment, w grupie bolusowej zaobserwowano powrót siły skurczu do poziomów kontrolnych po wypłukaniu leku po 3 dniach. Jednakże drugi bolus leku spowodował całkowite ustanie siły skurczu, po którym nie nastąpiła regeneracja (Rysunek 7), co wskazuje, że wielokrotne dawkowanie w tym stężeniu może mieć działanie kardiotoksyczne u pacjentów leczonych tym lekiem. Szeroki zakres tego badania, zarówno pod względem czasu, jak i warunków eksperymentalnych, podkreśla użyteczność 3D inżynieryjnych tkanek w badaniach toksyczności, ponieważ pozostają one kurczliwe i responsywne na ekspozycję chemiczną przez dłuższy czas, co umożliwia prowadzenie długoterminowych badań leków na jednym zestawie tkanek mięśniowych. Ułatwia to nie tylko identyfikację związków, które mogą wywoływać efekt kardiotoksyczny przy przewlekłej ekspozycji, ale także wykrywanie potencjalnie kardiotoksycznego czasu podania leku.

In vitro testy toksyczności w inżynieryjnych tkankach mięśniowych człowieka stanowią jeden ze sposobów pomagających zapewnić bezpieczeństwo pacjentom podczas badań klinicznych. BMS-986094 jest inhibitorem polimerazy nukleotydowej (NS5B) stosowanym w leczeniu wirusowego zapalenia wątroby typu C. Lek znajdował się w II fazie rozwoju klinicznego, gdy firma Bristol-Myers Squibb przerwała prace z powodu kilku przypadków nieoczekiwanej niewydolności serca u pacjentów18,19. W niniejszej pracy BMS-986094 zastosowano w odniesieniu do kardiologicznych EMT, aby sprawdzić, czy inżynieryjne tkanki mięśniowe 3D wykażą reakcję kardiotoksyczną na ten lek (Rysunek 8). Zastosowano trzy różne stężenia leku, a tkanki monitorowano przez 13 dni. Siła skurczu spadała po dodaniu leku w sposób zależny od dawki (Rysunek 8A). Częstotliwość drgań również uległa znacznemu pogorszeniu – tempo bicia spowolniło, a ostatecznie ustało, co było oczekiwanym skutkiem ciągłej ekspozycji na związek kardiotoksyczny (p < 0,05, Rysunek 8B). Wyniki te pokazują, w jaki sposób inżynieryjne tkanki mięśniowe człowieka 3D mogą ułatwiać wprowadzanie nowych leków na rynek oraz pozwalać na identyfikację związków, które ostatecznie zostaną odrzucone z powodu kardiotoksyczności. Co więcej, technologia ta mogłaby potencjalnie ratować życie, wykrywając niebezpieczne leki, zanim zostaną one podane pacjentom w badaniach klinicznych.

Zdolność do pomiaru wpływu leków podawanych ostro i przewlekle na ludzką tkankę kurczliwą jest kluczowym pierwszym krokiem podczas badania bezpieczeństwa i skuteczności terapeutyków. Ważne jest jednak, aby stężenia podawanych leków były istotne fizjologicznie i odpowiednie do testów in vitro. Tkanki mięśni szkieletowych zostały wykorzystane do wyznaczenia wartości IC50 dla 2,3-butanodionomonoksymu (BDM) w pełnej krzywej dawka-odpowiedź. Lek ten jest dobrze scharakteryzowanym inhibitorem ATPase miozyny II mięśni szkieletowych20. BDM hamuje skurcze mięśni, zapobiegając tworzeniu się mostków miozynowych z filamentami aktynowymi w sarkomerach21. Przedstawione tutaj wyniki wykazują zależny od dawki spadek siły bezwzględnej po podaniu leku oraz pełny powrót siły skurczowej po wypłukaniu leku, co wskazuje, że przejściowy efekt polega na zapobieganiu skurczom mięśni, a nie na zwykłym zabijaniu komórek w tkance (Rycina 9A). Ponadto, zmierzono pełną krzywą dawka-odpowiedź dla siedmiu badanych stężeń, wyznaczając IC50 na poziomie 3,2 mM w tych ludzkich mikrotkankach (Rycina 9B).

Kultura miogenicznych komórek zماstomy, płytka 24-dołkowa; ustawienie eksperymentalne; proces analizy komórkowej.
Rysunek 1: Odlewanie EMT w 2-postowej płytce 24-dołkowej Mantarray. (A) Komórki miogeniczne i stromalne były hodowane na powierzchniach 2D przed odlewaniem tkanki. (B) Komórki są oddzielane od powierzchni 2D i mieszane z białkami macierzy zewnątrzkomórkowej w celu utworzenia hydrożeli w poszczególnych dołkach odlewniczych płytki, pokazanych na wstawce. (C) Płytka 24-dołkowa zawierająca inżynieryjne tkanki w każdym dołku. (D) Reprezentatywne tkanki wykazujące rozluźniony i skurczony inżynieryjny mięsień, porównujące przemieszczenie magnetycznego słupka (zielone słupki). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Badanie hydrodynamiczne przepływu płynu przez kanały; obrazy mikroskopowe przedstawiają cztery etapy przepływu.
Rycina 2: Prawidłowe i nieprawidłowe odlewanie EMT. (A) Idealna inżynieryjna tkanka mięśniowa 24 h po odlewaniu, jednorodnie skonsolidowana wokół słupków, o homogenicznym składzie komórkowym/macierzy w całej tkance. (B) Nieudane EMT wykazujące odrywanie się hydrożelu od elastycznego słupka. (C) EMT zawierające pęcherzyki powietrza w całej tkance. (D) Nierównomierne osadzanie tkanki wokół obu słupków. Tkanka jest luźno zakotwiczona do elastycznego słupka po jednej stronie. Paski skali wynoszą 1 mm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Postępy w inżynierii tkankowej, gojenie ścięgna, dni 0 do 28, obrazy mikroskopowe, wyniki eksperymentalne.
Rycina 3: Kompaktacja w engineered muscle tissue w czasie. (A) Konstrukt EMT pokazany 1 dzień po odlewie. Tkanki są przenoszone do medium różnicującego, rozpoczynając dzień 0 fuzji komórek i kompaktacji hydrożelu. (B-E) Ten sam EMT od 7. do 21. dnia, wykazujący w czasie nieco krótszą całkowitą długość między dwoma słupkami oraz mniejszą szerokość mierzoną w środkowej sekcji EMT. Paski skali wynoszą 1 mm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres słupkowy i tabela danych przedstawiająca średnicę EMT (mikrony) w ciągu 21 dni dla płytek 1-4; zawarto średnią.
Rycina 4: Średnica EMT w czasie. Śledzono cztery płytki z tkankami przez 21 dni, porównując średnicę EMT w trakcie procesu kompaktacji. Każda tkanka była mierzona w przekroju środkowym co tydzień przy użyciu mikroskopii optycznej. Punkty czasowe wykazują spójną wielkość EMT pomiędzy płytkami. Maksymalna kompaktacja zostaje osiągnięta w 21. dniu, gdy przebudowa macierzy ulegnie stabilizacji. Tabela przedstawia odchylenie standardowe (% całkowitej wartości) kompaktacji w obrębie każdej płytki z tkankami oraz średnie odchylenie dla wszystkich płytek. Kolorowe słupki reprezentują poszczególne płytki. Słupki błędu oznaczają SD dla EMT w obrębie płytek. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Mikroskopia fluorescencyjna tkanki mięśniowej barwionej na MyHC, dystrofinę i DAPI; lokalizacja białek.
Rycina 5: Immunohistochemia zmodyfikowanych tkanek mięśnia szkieletowego. EMT utrwalono 10. dnia hodowli i zatopiono w parafinie. Cienkie przekroje poprzeczne (7 μm) przed obrazowaniem wybarwiono przeciwciałami przeciwko ciężkiemu łańcuchowi miozyny oraz dystrofinie. Zielony = MyHC, czerwony = dystrofina, niebieski = DAPI. Powiększenie obiektywu wynosi 40X; pasek skali to 50 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykresy siły skurczu w czasie dla sercowych i szkieletowych EMT, przedstawiające dynamikę w jednostkach mikronutonów (μN).
Rysunek 6: Siła skurczu w inżynieryjnych tkankach mięśniowych w czasie. (A) Średnia bezwzględna siła skurczu mierzona w sercowych EMT od 7. do 63. dnia hodowli; n = 3 na grupę. (B) Średnia bezwzględna siła skurczu w szkieletowych EMT pochodzących z pierwotnej linii komórkowej od 7. do 53. dnia hodowli; n = 3. Słupki błędu dla obu wykresów oznaczają SD. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykres liniowy przedstawiający zmianę siły w stosunku do dni leczenia doksorubicyną; różne stężenia i warunki.
Rycina 7: Ostre i przewlekłe leczenie doksorubicyną w inżynieryjnej tkance mięśniowej. Trzy oddzielne stężenia dawek doksorubicyny, 0.1 µM, 1 µM i 10 µM, były podawane w formie bolusa lub w sposób ciągły do inżynieryjnych tkanek mięśniowych w ciągu 27 dni. Dawki bolusowe leku dodawano podczas wymiany medium w dniach 0, 12 i 24, co zaznaczono zielonymi strzałkami na osi X. W przypadku dawkowania ciągłego lek dodawano do medium przy każdej wymianie, co zaznaczono czarnymi i zielonymi strzałkami na osi X. Procentowa zmiana siły względem wartości bazowych (przed leczeniem lekiem) znajduje się na osi Y, a czas leczenia w dniach na osi X. Jasnopomarańczowy = kontrola ciągła DMSO, ciemnopomarańczowy = kontrola bolus DMSO, jasnozielony = 0.1 µM doksorubicyny ciągle, ciemnozielony = 0.1 µM doksorubicyny bolus, jasnoniebieski = 1 µM doksorubicyny ciągle, ciemnoniebieski = 1 µM doksorubicyny bolus, jasnożółty = 10 µM doksorubicyny ciągle, ciemnożółty = 10 µM doksorubicyny bolus. Słupki błędów oznaczają SD; n = 3 na warunek. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Wykres siły i częstotliwości drgań; efekt leku na aktywność mięśni w czasie; badanie stężenia BMS.
Rycina 8: Przewlekłe leczenie BMS-986094 w inżynieryjnej tkance mięśniowej. EMTy były traktowane 0,4 µM (zielony), 2 µM (ciemnoniebieski) i 10 µM (jasnoniebieski) BMS-986094 przez 13 dni. (A>) Kurczliwa siła drgań (oś Y) spada przy wszystkich stężeniach leku w ciągu pierwszych 2 dni, podczas gdy tkanki kontrolne w DMSO nadal zyskują na sile w czasie (oś X). (B>) Częstotliwość uderzeń serca, czyli częstotliwość drgań, ustaje w sposób zależny od dawki, równolegle z ustaniem siły kurczliwej pokazanej na wykresie A. Tkanki kontrolne w DMSO (szary) utrzymują regularną częstotliwość uderzeń przez cały okres eksperymentu. Słupki błędów oznaczają SD; n = 3 na warunek. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Wpływ BDM na siłę skurczu; wykresy zależność dawka-odpowiedź; analiza skurczu mięśnia sercowego; IC50 3,223 mM.
Rysunek 9: Zależność dawka-odpowiedź na BDM w inżynieryjnych tkankach mięśni szkieletowych. (A) Bezwzględna siła skurczu maleje w sposób zależny od dawki, gdy EMT pochodzące z pierwotnych komórek są poddane działaniu 2,3-butanodionomonoksymu (BDM) w 16. dniu hodowli 3D. Bezwzględna siła skurczu wraca do wartości bliskich poziomowi bazowemu po wypłukaniu leku. (B) Bezwzględna siła skurczu znormalizowana do wartości bazowych maleje w sposób zależny od dawki po podaniu BDM, co pozwala na wyznaczenie pełnej krzywej dawka-odpowiedź i wartości IC50; n = 4 na dawkę. Słupki błędów oznaczają SD. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

W tym badaniu opisano metody generowania tkanek serca i mięśni szkieletowych zaprojektowanych w 3D w 24-dołkowym zestawie odlewniczym. Postępując zgodnie z tymi metodami, możliwe jest konsekwentne uzyskiwanie pełnej gamy 24 tkanek bez błędów odlewania do późniejszych badań przesiewowych leków. Kluczowymi kwestiami dla osiągnięcia takiego wyniku są zapewnienie, że podczas odlewania wszystkie etapy są wykonywane na lodzie, aby zapobiec przedwczesnej polimeryzacji hydrożeli, usunięcie odczynnika dysocjacji komórek przed odlaniem tkanki, dokładne wymieszanie zawiesiny komórki i hydrożelu dla każdej tkanki, wymiana końcówek pipet między tkankami oraz zastosowanie inaktywowanego termicznie FBS (jeśli w ogóle jest używany). Ważne jest również, aby upewnić się, że krata słupka nie przesuwa się po rozpoczęciu odlewania i jest delikatnie przenoszona po utworzeniu hydrożeli.

Główne modyfikacje obejmują wykorzystanie różnych typów komórek w celu uzyskania EMT sercowych i szkieletowych oraz domieszkowanie hydrożeli o zmiennych stężeniach białek błony podstawnej w celu promowania dojrzewania komórkowego i stabilności tkanek. Korzystne skutki takiego dopingu muszą być testowane indywidualnie dla każdego przypadku, ale wykazano, że w pewnych okolicznościach poprawiają one wyniki funkcjonalne i trwałość tkanek 14,16,22. Warto również zauważyć, że podane gęstości komórek są wskazówką i mogą wymagać optymalizacji dla różnych linii komórkowych. Alternatywne kompozycje hydrożelowe mogą być również rozważane jako sposób na modyfikację właściwości strukturalnych i funkcjonalnych uzyskanych EMT 23,24,25. Natywne mikrośrodowisko mięśniowe zawiera również typy komórek wspomagających, które promują unaczynienie, unerwienie i odkładanie macierzy w celu wsparcia miocytów pod względem formy i funkcji26,27. Podczas gdy opisany tutaj system obecnie włącza fibroblasty do trójwymiarowych tkanek serca, dodatkowe typy komórek mogą stworzyć bardziej fizjologicznie istotny model do badania bezpieczeństwa i skuteczności związków terapeutycznych in vitro. Wcześniej szereg typów komórek pomocniczych zostało z powodzeniem zintegrowanych z tkankami modyfikowanymi w 3D, co stanowi ekscytujący szablon do przyszłych badań przy użyciu platformy kurczliwości wykrywania magnetycznego 28,29,30.

Rozwiązywanie problemów związanych z tym protokołem koncentruje się na tworzeniu niewiarygodnych lub niespójnych tkanek podczas procesu odlewania. Należy zachować ostrożność, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków w hydrożelach podczas ich odlewania, jednocześnie ułatwiając równomierne rozprowadzenie komórek podczas mieszania. Eksperymenty optymalizacyjne będą prawdopodobnie potrzebne dla każdego nowego typu komórek, aby zidentyfikować idealną gęstość komórek, proporcje komórek i skład matrycy.

Głównym ograniczeniem dla tej techniki jest znaczna liczba komórek wymaganych do ustanowienia pełnej płytki 24 EMT. Do przedstawionych tutaj danych wykorzystano 15 milionów kardiomiocytów i 18 milionów mioblastów szkieletowych na płytkę. Niektórzy badacze mogą nie mieć dostępu do tak dużych pul materiału komórkowego, co może utrudnić im pełne wykorzystanie tej platformy. Jeśli użytkownicy końcowi nie mają dostępu do czujników magnetycznych, pomiary ugięć po zakończeniu muszą być wykonywane optycznie, co znacznie zmniejsza przepustowość i zapobiega jednoczesnemu rejestrowaniu skurczów mięśni w wielu dołkach. Jednak sprzęt Mantarray pokonuje te ograniczenia, oferując pierwszy komercyjny system zdolny do ciągłej, nieinwazyjnej analizy skurczu EMT jednocześnie w wielu konstrukcjach.

Detekcja magnetyczna w 24 dołkach ułatwia badania podłużne rozwoju funkcjonalnego EMT w czasie rzeczywistym i umożliwia dokładny pomiar ostrych reakcji na manipulacje chemiczne, środowiskowe lub genetyczne. Podczas gdy detekcja magnetyczna ma kilka zalet, takich jak jednoczesny pomiar w wielu tkankach i nie wymaga skomplikowanej analizy danych, metody detekcji optycznej umożliwiają jednoczesny pomiar wskaźników fizjologicznych, takich jak strumień wapnia lub mapowanie napięcia. Jednak zestawy danych, takie jak te zilustrowane w sekcji dotyczącej wyników, pokazują szeroki zakres zastosowań tej technologii w przestrzeni opracowywania leków. Biorąc pod uwagę, że niewiele testów dostępnych na rynku oferuje środki do przeprowadzenia bezpośredniej oceny wielkości skurczu w zmodyfikowanych mięśniach, metody te mają potencjał, aby zrewolucjonizować proces rozwoju przedklinicznego.

Oświadczenia

Wszyscy autorzy są pracownikami i udziałowcami Curi Bio Inc., firmy, która komercjalizuje sprzęt Mantarray i związane z nim oprogramowanie.

Podziękowania

Ta praca była częściowo wspierana przez fundusze z Agencji ds. Żywności i Leków (U01 FD006676-01 przyznane Instytutowi Zdrowia i Nauk o Środowisku) oraz przez fundusze z National Institutes of Health (HL151094 dla dr Geisse). Dziękujemy dr Alecowi S. T. Smithowi za pomoc w przygotowaniu tego manuskryptu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
100 &mikro; Filtr siatkowy M CELLTREAT229485
100 mm naczynie do hodowli komórkowychThermoFisher150466
50 ml Filtr SteriflipMilliporeSigma 
Kolba filtracyjna 500 mlMilliporeSigma 
Kwas 6-aminokapronowySigmaA2504
B27Gibco17504044
Cardiosight Maintenance MediumNEXELCM-002A
NEXELCM-020A
Stymulator C-Pace EM IonOptix EM
Curi Bio Muscle Differentiation Media KitPrimary - DIFF
Curi Bio Muscle Maintenance Media KitCuri BioPrimary - MAINT
DAPIInvitrogenD1306
DMEM, wysoki poziom glukozy, GlutaMAXGibco10566-016
DnaseSigma11284932001
DPBSGibco14190-250
Przeciwciało dystrofiny Abcamab154168
Surowica bydlęca płodu (FBS)Thermo Scientific10082147Musi być inaktywowany termicznie
Fibrynogen (bydlęcy)SigmaE8630
Aldehyd glutarowySigma354400
Ham's F10Gibco11550043
Hemacytometr Sigma 
HS-27A FibroblastyATCCCRL-2496
Ludzkie mioblasty mięśni szkieletowych Lonza CC-2580
Blokada Luer Lock 0,2 i mikro; m filtr strzykawkowyCorning431219
Luer Lock 10 mL strzykawkaBH SuppliesBH10LL
Mantarray InstrumentCuri BioMANTA-24-B1System
Mantarray Zestawy płytek CuriBioMA-24-SKM-5Zestaw 5 zestawów
Pokrywka do stymulacji Mantarray Curi BioEM
Matrigel (ECM)Corning356231
Nexel Cardiosight-S, KardiomiocytyNEXELC-002
Nikon Ti2EMEA54000
Przeciwciało Pan Myosin Heavy Chain DSHBMF-20
Poli(etylenimina)SigmaP3143
Inhibitor ROCKStemCell TechnologiesY-27632
RPMIGibco11875-093
Pożywka do wzrostu mięśni szkieletowych (SkGM-2)LonzaCC-3245
Standardowe płytki 24-dołkoweGreinerM8812 Tabliczki innych producentów nie będą pasować
Standardowe płytki 6-dołkoweThermoFisher140675
Podłoże zrębowe (DMEM + 20% FBS)
Kolba filtracyjna T175Termos159910
T225 Kolba filtracyjnaThermoFisher159934
ThrombinSigmaT4648
Roztwór błękitu trypanowego, 0,4%ThermoFisher15250061
Enzym TrypLE Select (10x)Thermo ScientificA1217702
Enzym TrypLE Select (1x)Termo Scientific12563011
SCGP00525S2GVU05RE Cardiosight Preparat do powlekania Z359629 Mikroskop optyczny

Bibliografia

  1. Sharma, A., Wu, J. C., Wu, S. M. Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for cardiovascular disease modeling and drug screening. Stem Cell Research & Therapy. 4, 150(2013).
  2. Mudera, V., Smith, A. S. T., Brady, M. A., Lewis, M. P. The effect of cell density on the maturation and contractile ability of muscle derived cells in a 3D tissue-engineered skeletal muscle model and determination of the cellular and mechanical stimuli required for the synthesis of a postural phenotype. Journal of Cellular Physiology. 225 (3), 646-653 (2010).
  3. Vandenburgh, H., et al. Tissue-engineered skeletal muscle organoids for reversible gene therapy. Human Gene Therapy. 7 (17), 2195-2200 (1996).
  4. Rao, L., Qian, Y., Khodabukus, A., Ribar, T., Bursac, N. Engineering human pluripotent stem cells into a functional skeletal muscle tissue. Nature Communications. 9 (1), 126(2018).
  5. Fleming, J. W., et al. Bioengineered human skeletal muscle capable of functional regeneration. BMC Biology. 18 (1), 145(2020).
  6. Madden, L., Juhas, M., Kraus, W. E., Truskey, G. A., Bursac, N. Bioengineered human myobundles mimic clinical responses of skeletal muscle to drugs. eLife. 4, 04885(2015).
  7. Urciuolo, A., et al. Engineering a 3D in vitro model of human skeletal muscle at the single fiber scale. PLOS One. 15 (5), 0232081(2020).
  8. Afshar, M. E., et al. A 96-well culture platform enables longitudinal analyses of engineered human skeletal muscle microtissue strength. Scientific Reports. 10, 6918(2020).
  9. Sakar, M. S., et al. Formation and optogenetic control of engineered 3D skeletal muscle bioactuators. Lab on a Chip. 12 (23), 4976-4985 (2012).
  10. Vila, O. F., et al. Quantification of human neuromuscular function through optogenetics. Theranostics. 9 (5), 1232-1246 (2019).
  11. Khodabukus, A., Baar, K. Defined electrical stimulation emphasizing excitability for the development and testing of engineered skeletal muscle. Tissue Engineering Part C: Methods. 18 (5), 349-357 (2011).
  12. Vandenburgh, H., et al. Drug-screening platform based on the contractility of tissue-engineered muscle. Muscle & Nerve. 37 (4), 438-447 (2008).
  13. Bielawski, K. S., Leonard, A., Bhandari, S., Murry, C. E., Sniadecki, N. J. Real-time force and frequency analysis of engineered human heart tissue derived from induced pluripotent stem cells using magnetic sensing. Tissue Enineering Part C Methods. 22 (10), 932-940 (2016).
  14. Smith, A. S. T., et al. High-throughput, real-time monitoring of engineered skeletal muscle function using magnetic sensing. bioRxiv. , 492879(2022).
  15. Scheraga, H. A. The thrombin-fibrinogen interaction. Biophysical Chemistry. 112 (2-3), 117-130 (2004).
  16. Hinds, S., Bian, W., Dennis, R. G., Bursac, N. The role of extracellular matrix composition in structure and function of bioengineered skeletal muscle. Biomaterials. 32 (14), 3575-3583 (2011).
  17. Carvalho, C., et al. Doxorubicin: the good, the bad and the ugly effect. Current Medicinal Chemistry. 16 (25), 3267-3285 (2009).
  18. Ahmad, T., et al. Cardiac dysfunction associated with a nucleotide polymerase inhibitor for treatment of hepatitis C. Hepatology. 62 (2), 409-416 (2015).
  19. Gill, M., et al. From the cover: Investigative nonclinical cardiovascular safety and toxicology studies with BMS-986094, an NS5b RNA-dependent RNA polymerase inhibitor. Toxicological Sciences. 155 (2), 348-362 (2017).
  20. Ostap, E. M. 2,3-Butanedione monoxime (BDM) as a myosin inhibitor. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 23 (4), 305-308 (2002).
  21. Fryer, M. W., Gage, P. W., Neering, I. R., Dulhunty, A. F., Lamb, G. D. Paralysis of skeletal muscle by butanedione monoxime, a chemical phosphatase. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 411 (1), 76-79 (1988).
  22. Fleming, J. W., et al. Functional regeneration of tissue engineered skeletal muscle in vitro is dependent on the inclusion of basement membrane proteins. Cytoskeleton. 76 (6), Hoboken. 371-382 (2019).
  23. Capel, A. J., et al. Scalable 3D printed molds for human tissue engineered skeletal muscle. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 20(2019).
  24. Tsui, J. H., et al. Tunable electroconductive decellularized extracellular matrix hydrogels for engineering human cardiac microphysiological systems. Biomaterials. 272, 120764(2021).
  25. Tsui, J. H., et al. Conductive silk-polypyrrole composite scaffolds with bioinspired nanotopographic cues for cardiac tissue engineering. Journal of Materials Chemistry B. 6 (44), 7185-7196 (2018).
  26. Gabella, G. Muscle cells, nerves, fibroblasts and vessels in the detrusor of the rat urinary bladder. Journal of Smooth Muscle Research. 55 (0), 34-67 (2019).
  27. Christov, C., et al. Muscle satellite cells and endothelial cells: close neighbors and privileged partners. Molecular Biology of the Cell. 18 (4), 1397-1409 (2007).
  28. Bersini, S., et al. Engineering an environment for the study of fibrosis: A 3D human muscle model with endothelium specificity and endomysium. Cell Reports. 25 (13), 3858-3868 (2018).
  29. Gilbert-Honick, J., et al. Engineering functional and histological regeneration of vascularized skeletal muscle. Biomaterials. 164, 70-79 (2018).
  30. Maffioletti, S. M., et al. Three-dimensional human iPSC-derived artificial skeletal muscles model muscular dystrophies and enable multilineage tissue engineering. Cell Reports. 23 (3), 899-908 (2018).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Tr jwymiarowe tkanki mi niowetest kurczliwo cimodelowanie chor bindukowane pluripotencjalne kom rki macierzystefunkcja mi ni szkieletowychtkanki mi nia sercowegomodel z cza nerwowo mi niowegoprzesiewanie zale ne od dawki

Powiązane artykuły