Obecny protokół opisuje prostą i efektywną metodę transportu kwasów perfluoroalkilowych w pszenicy na duże odległości.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Badanie transportu kwasów perfluoroalkilowych na duże odległości w pszenicy za pomocą techniki ekspozycji z rozszczepionymi korzeniami
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Duże ilości kwasów perfluoroalkilowych (PFAA) zostały wprowadzone do gleby i zgromadzone przez rośliny, stanowiąc potencjalne zagrożenie dla zdrowia ludzkiego. Konieczne jest zbadanie akumulacji i translokacji PFAA w roślinach. Transport na duże odległości jest ważną drogą dla PFAA przenoszonych z liści roślin do tkanek jadalnych przez łyko. Jednak wcześniej trudno było ocenić potencjał translokacji zanieczyszczeń organicznych w krótkotrwałym okresie narażenia. Eksperyment z rozszczepionym korzeniem dostarcza rozwiązania pozwalającego skutecznie odkryć translokację PFAA na duże odległości za pomocą eksperymentu hydroponicznego, który w tym badaniu przeprowadzono w dwóch probówkach wirówkowych o pojemności 50 ml (A i B), z których probówka wirówkowa A zawierała 50 ml sterylnego roztworu odżywczego Hoagland o mocy jednej czwartej, podczas gdy probówka wirówkowa B miała takie samo stężenie składników odżywczych, oraz docelowe PFAA (kwas perfluorooktanosulfonowy, PFOS i kwas perfluorooktanowy, PFOA) dodawane w danym stężeniu. Cały korzeń pszenicy został ręcznie podzielony na dwie części i ostrożnie włożony do rurek A i B. Stężenie PFAA w korzeniach, pędach pszenicy i roztworach w probówkach A i B oceniano odpowiednio za pomocą LC-MS/MS po hodowli w inkubatorze przez 7 dni i zebraniu. Wyniki sugerują, że PFOA i PFOS przechodzą podobny proces transportu na duże odległości przez łyko z pędu do korzenia i mogą być uwalniane do środowiska otoczenia. W związku z tym technika rozłupywanego korzenia może być stosowana do oceny transportu różnych substancji chemicznych na duże odległości.
Wprowadzenie
Kwasy perfluoroalkilowe (PFAA) są szeroko stosowane w różnych produktach komercyjnych i przemysłowych ze względu na ich doskonałe właściwości fizykochemiczne, w tym aktywność powierzchniową oraz stabilność termiczną i chemiczną1,2,3. Kwas perfluorooktanosulfonowy (PFOS) i kwas perfluorooktanowy (PFOA) to dwa najważniejsze PFAA stosowane na całym świecie4,5,6, chociaż te związki zostały wymienione w międzynarodowej konwencji sztokholmskiej w 2009 i 2019 roku7,8odpowiednio. Ze względu na ich trwałość i powszechne stosowanie, PFOS i PFOA zostały powszechnie wykryte w różnych matrycach środowiskowych. Stężenia PFOA i PFOS w wodach powierzchniowych z różnych rzek i jezior na całym świecie wynoszą odpowiednio 0,15-52,8 ng/L i 0,09-29,7 ng/L9. Ze względu na wykorzystanie wód gruntowych lub odzyskanej wody do nawadniania, a także stosowanie biologicznych odpadów stałych jako nawozu, PFOA i PFOS są powszechnie obecne w glebie, odpowiednio w zakresie od 0,01 do 123 μg/kg i 0,003-162 μg/kg10, co może wprowadzić dużą ilość PFAA do roślin i stanowić potencjalne zagrożenie dla zdrowia ludzkiego. Stężenia PFAA (C4-C8) w glebie rolnej i zbożu (pszenicy i kukurydzy) wykazują dodatnią korelację liniową11. Dlatego konieczne jest zbadanie akumulacji i translokacji PFAA w roślinach.
Translokacja PFAA w roślinach najpierw zachodzi od korzeni do tkanek nadziemnych, a translokacja PFAA z korzeni do tkanek jadalnych jest uważana za transport na duże odległości12,13. Poprzednie badania wykryły bisfenol A, nonylofenol i naturalne estrogeny w warzywach i owocach14, co sugeruje, że te substancje chemiczne mogą migrować przez łyko. W związku z tym odkrycie translokacji PFAA w roślinach jest ważne dla oceny ich potencjalnego ryzyka. Jednak na akumulację i translokację PFAA ma wpływ ich biodostępność w glebie, dlatego nie jest łatwo ocenić zdolność do translokacji docelowych PFAA w roślinach. Ponadto eksperymenty hydroponiczne są na ogół ograniczone przez kilka czynników, co utrudnia pozyskiwanie jadalnych tkanek roślin. Zazwyczaj łyko zbierano bezpośrednio z roślin, aby obserwować translokację związków organicznych na duże odległości w roślinach, podczas gdy trudno jest pozyskać łyko z siewek roślin15. W związku z tym wprowadzono prostą i skuteczną metodę, technikę rozłupywanego korzenia, w celu zbadania translokacji PFAA w roślinach podczas stosunkowo krótkotrwałej ekspozycji. Jeśli chodzi o badanie rozdwojonego korzenia, korzenie w jednej sadzonce rośliny są podzielone na dwie części; jedną część umieszcza się w pożywce zawierającej docelowe PFAA (probówka A), a drugą umieszcza się w pożywce pod nieobecność PFAA (probówka B). Po ekspozycji przez kilka dni, PFAA w probówce B są mierzone za pomocą LC-MS/MS. Stężenie PFAA w probówce B ujawnia potencjał translokacji PFAA przez łyko w roślinach16,17,18.
Eksperyment z rozszczepionym korzeniem został zgłoszony do badania długodystansowej translokacji wielu związków w roślinach, takich jak nanocząstki CuO17, estrogeny steroidowe18, oraz estry fosforoorganiczne16. Badania te dostarczyły dowodów na to, że związki te mogą przenosić się przez łyko do jadalnych części roślin. Jednak to, czy PFAA mogą pomóc w translokacji w roślinach i wpływie właściwości związku, wymaga dalszych badań. Na podstawie tych doniesień w niniejszym badaniu przeprowadzono eksperyment z rozszczepionymi korzeniami, aby ujawnić transport PFAA w pszenicy na duże odległości.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Nasiona pszenicy, Triticum aestivum L., zostały pozyskane (zobacz Tabelę Materiałów) i wykorzystane do niniejszego badania.
1. Kiełkowanie sadzonek pszenicy i uprawa hydroponiczna
- Wybierz nasiona pszenicy o podobnej wielkości i dezynfekuj je przez 15 minut 8% (w/w) roztworem nadtlenku wodoru.
- Zdezynfekowane nasiona dokładnie opłucz wodą dejonizowaną, a następnie umieść je na wilgotnej bibule filtracyjnej w ciemności w temperaturze pokojowej, aby kiełkowały przez 5 dni.
- Wybierz około dziewięciu kiełkujących sadzonek o jednakowej wielkości i przenieś je do plastikowych zlewek z 250 ml pożywki (1/4 mocy roztworu Hoaglanda; jego skład chemiczny pokazano w tabeli 1).
UWAGA: Z dziewięciu nasion, po trzy zostały wybrane odpowiednio do ślepej próby, PFOA i PFOS. - Sadzonki należy uprawiać w komorach wzrostowych przez 7 dni przed ekspozycją w cyklu 14 godzin w temperaturze 22 °C i 10 godzin w temperaturze 27 °C.
2. Eksperyment z rozłupywaniem korzeni
- Uprawę sadzonek należy przeprowadzić w dwóch probówkach wirówkowych (A i B) o pojemności 50 ml).
UWAGA: W probówce wirówkowej A znajdowało się 50 ml sterylnego roztworu Hoaglanda o stężeniu 1/4, a taka sama ilość pożywki znajdowała się w probówce wirówkowej B.- Rozpuścić handlowe PFOA i PFOS (patrz tabela materiałów) w metanolu i rozcieńczyć je sterylnym roztworem odżywczym jako roztworem podstawowym. Następnie dodać roztwór podstawowy do probówki B o stężeniu PFOA/PFOS 100 μg/l.
- Zabiegi należy wykonać w trzech powtórzeniach ze ślepą próbą kontrolną w celu monitorowania zanieczyszczenia tła. Schemat ideowy eksperymentów z ekspozycją na rozdwojony korzeń jest pokazany na Rysunek 1.
- Oddziel całe korzenie sadzonki pszenicy za pomocą pęsety na dwie równe części, tak aby korzenie były nadal zaczepione o ten sam pęd i ostrożnie włóż je odpowiednio do rurek A i B.
- Uszczelnij dwie probówki folią aluminiową i hoduj je w inkubatorze przez 7 dni. Utrzymać te same warunki inkubacji, jak określono w kroku 1.4.
- Zbierz sadzonki pszenicy po 7 dniach hodowli i podziel pszenicę na trzy części: pędy i korzenie wyhodowane odpowiednio w kolczastym roztworze PFAA i roztworze bez kolców, używając wysterylizowanych nożyczek.
- Liofilizować próbki roślinne w liofilizatorze w temperaturze -55 °C przez 48 godzin.
- Homogenizować i ważyć próbki korzeni i pędów. Pobrać próbki roztworu wzbogaconego i niewzbogaconego.
3. Ekstrakcja PFOA i PFOS z tkanek roślinnych
- Dodać 2 ml buforu węglanu sodu (0,25 mol/l), 1 ml wodorosiarczanu tetrabutyloamonu (0,5 mol/l) i 5 ml eteru metylowo-tert-butylowego (patrz tabela materiałów) do probówki polipropylenowej o pojemności 15 ml, w tym homogenizowanego korzenia lub pędu.
- Wstrząsać probówką z prędkością 250 obr./min przez 20 minut i odwirowywać przy 2 000 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej w celu uzyskania supernatantu fazy organicznej. Wykonaj proces ekstrakcji dwukrotnie.
- Zebrane ekstrakty należy wymieszać, odparować do sucha w delikatnym strumieniu azotu (N2), a następnie rozpuścić w 5 ml metanolu i wirować, utrzymując tę samą prędkość przez około 30 s.
- Kondycjonuj wkład pesticarb (patrz tabela materiałów) 5 ml 0,1% NH4OH w metanolu, 5 ml wody i 5 ml metanolu.
- Dodać 5 ml ekstrakcyjnego roztworu metanolu przez wkład pesticarb (500 mg/6 ml) w celu usunięcia pigmentu, wymyć wkład 5 ml metanolu i zebrać w tych samych probówkach.
- Zebrane 10 ml roztworu metanolu odparować prawie do sucha i ponownie rozpuścić w 200 μl metanolu, a następnie wirować i odwirować przy 10 000 x g przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
4. Przygotowanie próbki z pożywki
- Stan za pomocą 5 ml metanolu i 5 ml wody w celu aktywacji wkładu ekstrakcyjnego z polarnego wzmocnionego polimeru (PEP) (60 mg/g, 3 ml) (patrz tabela materiałów).
- Dodać odpowiednio 1 ml roztworu wzbogaconego lub 50 ml próbek roztworu bez wzbogacania (krok 2.6) przez wkład.
- Eluować docelowe PFAA za pomocą 10 ml metanolu, odparować ekstrakt za pomocą delikatnegoN2, a następnie rozpuścić w 200 μl metanolu do analizy.
5. Analiza instrumentalna
- Stosować ultrasprawną chromatografię cieczową UPLC sprzężoną z tandemową spektrometrią mas (LC-MS/MS) do oznaczania ilościowego docelowych PFAA w trybie wielokrotnej reakcji (MRM) i ujemnej jonizacji elektrorozpylania (ESI-) (patrz tabela materiałów).
- Wstrzyknąć 10 μl próbek i oddzielić docelowe PFAA za pomocą kolumny do chromatografii cieczowej C18 (1,7 μm, 2,1 mm x 50 mm, patrz tabela materiałów) i użyć 2 mM octanu amonu w wodzie (faza A) i metanolu (faza B) jako fazy ruchomej dla UPLC, o natężeniu przepływu 0,3 ml/min. Utrzymać temperaturę kolumny na poziomie 50 °C.
UWAGA: Przemiany jonowe PFOA i PFOS wynoszą odpowiednio od 413 do 369 i od 499 do 80. Program elucji gradientowej i parametry instrumentalne LC-MS/MS do oznaczania ilościowego docelowych PFAA wymieniono w tabeli 2. - Przetwarzaj dane za pomocą oprogramowania do analizy danych (patrz tabela materiałów).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Eksperyment z rozdzielonym systemem korzeniowym pozwolił zbadać dalekosiężny transport PFAA w pszenicy. Jak pokazano na Rysunku 2A,C, zarówno PFOA, jak i PFOS mogły być pobierane przez korzeń pszenicy i przenoszone do pędów. PFOS i PFOA nie zostały wykryte w korzeniu pszenicy ani w roztworze w probówce A w kontroli ujemnej. Stwierdzono, że PFOS i PFOA były wykrywane w korzeniach pszenicy hodowanych w roztworze niezatrutym, w stężeniach odpowiednio 0,26 ng/g ± 0,02 ng/g i 0,6...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Aby zapewnić dokładność tej metody, należy zachować ostrożność w celu zapewnienia, że roztwór wzbogacony w probówce B nie zanieczyści roztworu bez wzbogaconego roztworu w probówce A. Podane stężenie docelowych PFAA w niniejszym badaniu było relatywnie wyższe niż ich stężenie w rzeczywistym środowisku, co zapewnia monitorowanie docelowych PFAA w pszenicy i roztworze bez wzbogaceń za pomocą LC-MS/MS.
Ta metoda ma swoje ograniczenia. Ponieważ w każdej grupie poddanej działaniu pszenicy użyto tyl...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Z wdzięcznością dziękujemy za wsparcie finansowe od Chińskiej Fundacji Nauk Przyrodniczych (NSFC 21737003), Funduszu Naukowego Chińskich Uniwersytetów (nr 2452021103) oraz Chińskiej Fundacji Nauk Podoktoranckich (nr 2021M692651, 2021M702680).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Kolumna ACQUITY UPLC BEH C18 | Waters, Milford, MA | Kolumna chromatograficzna cieczowa | |
| Cleanert Wkład PEP | Bonna-Angel Technologies, Chiny | Kolumna do ekstrakcji do fazy stałej | |
| Clearnert Pesticarb cartridge | Bonna-Angel Technologies, Chiny | Kolumna do ekstrakcji do fazy stałej | |
| LC-MS / MS (Waters Acquity UPLC i-Class sprzężona z Xevo TQ-S) | Waters, Milford, MA | chromatografii cieczowej i spektrometrii mas | |
| Boyikang Instrument Ltd., Pekin, Chiny | FD-1A50 | Liofilizowana próbka | |
| Masslynx | Waters, Milford, MA | Oprogramowanie do analizy danych | |
| Eter metylowo-tert-butylowy | Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, USA) | służy do ekstrakcji związków docelowych z tkanek roślinnych | |
| MPFAC-MXA | Wellington Laboratories (Ontario, Kanada) | PFACMXA0518 | normy wewnętrzne |
| PFAC-MXB | Wellington Laboratories (Ontario, Kanada) | PFACMXB0219 | mieszanina wzorców kalibracyjnych PFAA |
| PFOA | Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, USA) | 335-67-1 | a reprezentują PFAA |
| PFOS | Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, USA) | 2795-39-3 | a reprezentują PFAA |
| Bufor węglanu sodu | Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, Stany Zjednoczone) | zastosowanie do ekstrakcji związków docelowych z tkanek roślinnych | |
| Wodorosiarczan tetrabutyloamonu | Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, USA) | służy do ekstrakcji związków docelowych z tkanek roślinnych | |
| Nasiona pszenicy | Chińska Akademia Nauk Rolniczych (Pekin, Chiny) | Triticum aestivum L. |
Bibliografia
- Lindstrom, A. B., Strynar, M. J., Libelo, E. L. Polyfluorinated compounds: Past, present, and future. Environmental Science & Technology. 45 (19), 7954-7961 (2011).
- Kannan, K. Perfluoroalkyl and polyfluoroalkyl substances: Current and future perspectives. Environmental Chemistry. 8 (4), 333-338 (2011).
- Cui, Q., et al. Occurrence and tissue distribution of novel perfluoroether carboxylic and sulfonic acids and legacy per/polyfluoroalkyl substances in black-spotted frog (Pelophylax nigromaculatus). Environmental Science & Technology. 52 (3), 982-990 (2018).
- Negri, E., et al. Exposure to PFOA and PFOS and fetal growth: a critical merging of toxicological and epidemiological data. Critical Reviews in Toxicology. 47 (6), 489-515 (2017).
- Chi, Q., Li, Z., Huang, J., Ma, J., Wang, X. Interactions of perfluorooctanoic acid and perfluorooctanesulfonic acid with serum albumins by native mass spectrometry, fluorescence and molecular docking. Chemosphere. 198, 442-449 (2018).
- Zhang, X., Chen, L., Fei, X. C., Ma, Y. S., Gao, H. W. Binding of PFOS to serum albumin and DNA: insight into the molecular toxicity of perfluorochemicals. Bmc Molecular Biology. 10, 16(2009).
- Stockholm Convention. PFASs listed under the Stockholm Convention. , Switzerland. Available from: http://chm.pops.int/Implementation/IndustrialPOPs/PFOS/Overview/tabid/5221/Default.aspx (2009).
- Stockholm Convention. Chemicals proposed for listing under the Convention. , Switzerland. Available from: http://chm.pops.int/TheConvention/ThePOPs/ChemicalsProposedforListing/tabid/2510/Default.aspx (2019).
- Pan, Y. T., et al. Worldwide distribution of novel perfluoroether carboxylic and sulfonic acids in surface water. Environmental Science & Technology. 52 (14), 7621-7629 (2018).
- Knight, E. R., et al. An investigation into the long-term binding and uptake of PFOS, PFOA and PFHxS in soil - plant systems. Journal of Hazardous Materials. 404, 124065(2021).
- Liu, Z. Y., et al. Crop bioaccumulation and human exposure of perfluoroalkyl acids through multi-media transport from a mega fluorochemical industrial park, China. Environment International. 106, 37-47 (2017).
- Mei, W. P., et al. Per- and polyfluoroalkyl substances (PFASs) in the soil-plant system: Sorption, root uptake, and translocation. Environment International. 156, 106642(2021).
- Wang, W., Rhodes, G., Ge, J., Yu, X., Li, H. Uptake and accumulation of per- and polyfluoroalkyl substances in plants. Chemosphere. 261, 127584(2020).
- Lu, J., Wu, J., Stoffella, P. J., Wilson, P. C. Analysis of bisphenol A, nonylphenol, and natural estrogens in vegetables and fruits using gas chromatography-tandem mass spectrometry. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 61 (1), 84-89 (2013).
- Herschbach, C., Gessler, A., Rennenberg, H. Long Distance Transport and Plant Internal Cycling of N- and S-Compounds. Progress in Botany 73. Luttge, U., Beyschlag, W., Budel, B., Francis, D. , Springer. Berlin, Heidelberg. 161-188 (2012).
- Liu, Q., et al. Uptake kinetics, accumulation, and long-distance transport of organophosphate esters in plants: Impacts of chemical and plant properties. Environmental Science & Technology. 53 (9), 4940-4947 (2019).
- Wang, Z. Y., et al. Xylem- and phloem-based transport of CuO nanoparticles in maize (Zea mays L.). Environmental Science & Technology. 46 (8), 4434-4441 (2012).
- Chen, X., et al. Uptake, accumulation, and translocation mechanisms of steroid estrogens in plants. Science of the Total Environment. 753, 141979(2021).
- Felizeter, S., McLachlan, M. S., de Voogt, P. Uptake of perfluorinated alkyl acids by hydroponically grown lettuce (Lactuca sativa). Environmental Science & Technology. 46 (21), 11735-11743 (2012).
- Zhou, J., et al. Insights into uptake, translocation, and transformation mechanisms of perfluorophosphinates and perfluorophosphonates in wheat (Triticum aestivum L.). Environmental Science & Technology. 54 (1), 276-285 (2020).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
