Artykuł metodologiczny

Wysokoprzepustowa technika oparta na cytometrii przepływowej do badań przesiewowych leków hamujących integryny

2.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64401

⸱

2 lutego 2024

 ,  ,  ,  , 
1Department of Immunology, School of Medicine, UConn Health, 2Center for Molecular Discovery, University of New Mexico Health Sciences Center, 3Comprehensive Cancer Center, University of New Mexico Health Sciences Center, 4Department of Pathology, University of New Mexico Health Sciences Center, 5Autophagy, Inflammation, & Metabolism (AIM) Center, University of New Mexico

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje opartą na cytometrii przepływowej, wysokoprzepustową metodę przesiewową w celu identyfikacji małocząsteczkowych leków, które hamują aktywację integryny β2 na ludzkich neutrofilach.

Streszczenie

Ten protokół ma na celu ustanowienie metody identyfikacji małych molekularnych antagonistów aktywacji integryny β2, wykorzystując przeciwciała zgłaszające zmiany konformacyjne i wysokoprzepustową cytometrię przepływową. Metoda ta może również służyć jako przewodnik dla innych wysokoprzepustowych metod badań przesiewowych opartych na przeciwciałach. Integryny β2 to cząsteczki adhezyjne specyficzne dla leukocytów, które mają kluczowe znaczenie w odpowiedziach immunologicznych. Neutrofile polegają na aktywacji integryny, aby opuścić krwioobieg, nie tylko w celu zwalczania infekcji, ale także w celu wzięcia udziału w wielu chorobach zapalnych. Kontrolowanie aktywacji integryny β2 stanowi realne podejście do leczenia chorób zapalnych związanych z neutrofilami. W tym protokole przeciwciało monoklonalne, mAb24, które specyficznie wiąże się z głowicą o wysokim powinowactwie integryn β2, jest wykorzystywane do ilościowego oznaczania aktywacji integryny β2 na izolowanych pierwotnych ludzkich neutrofilach. N-formylometylo-leucylo-fenyloalanina (fMLP) jest stosowana jako bodziec do aktywacji integryn β2 neutrofili. W badaniu wykorzystano wysokoprzepustowy cytometr przepływowy, zdolny do automatycznego uruchamiania próbek z płytek 384-dołkowych. Wpływ 320 substancji chemicznych na hamowanie integryny β2 ocenia się w ciągu 3 godzin. Dzięki temu podejściu można zidentyfikować cząsteczki, które są bezpośrednio ukierunkowane na integryny β2 lub cząsteczki docelowe w inicjowanym przez receptor białkowym białku G szlaku sygnalizacji aktywacji integryny od wewnątrz na zewnątrz.

Wprowadzenie

Wiele chorób zapalnych charakteryzuje się infiltracją neutrofili w miejscu obrzęku lub urazu1. Aby przeniknąć do tych tkanek, neutrofile muszą przejść przez kaskadę rekrutacji neutrofili, która obejmuje zatrzymanie do śródbłonka, wynaczynienie przez ścianę naczynia i rekrutację do tkanki2. Krążące neutrofile potrzebują aktywacji integryny β2, aby zakończyć tę kaskadę, szczególnie w fazie zatrzymania. Tak więc leki hamujące integryny, które zmniejszają adhezję neutrofili, wynaczynienie i rekrutację, mogą skutecznie leczyć choroby zapalne3,4.

β2 integryny były już wcześniej celem chorób zapalnych. Efalizumab, przeciwciało monoklonalne skierowane bezpośrednio przeciwko integrynie αLβ2, zostało opracowane w leczeniu łuszczycy5. Jednak efalizumab został wycofany ze względu na jego śmiertelny skutek uboczny - postępującą wieloogniskową leukoencefalopatię wynikającą z reaktywacji wirusa JC6,7. Nowe terapie przeciwzapalne oparte na integrynach powinny uwzględniać utrzymanie funkcji przeciwinfekcyjnych leukocytów w celu zminimalizowania skutków ubocznych. Skutki uboczne efalizumabu mogą wynikać z przedłużonego krążenia przeciwciał monoklonalnych w krwiobiegu, które mogą hamować funkcje immunologiczne w dłuższej perspektywie8. Niedawne badanie pokazuje, że efalizumab pośredniczy w sieciowaniu αLβ2 i niepożądanej internalizacji integryn α4, zapewniając alternatywne wyjaśnienie skutków ubocznych9. Tak więc krótkowieczni, małocząsteczkowi antagoniści mogą uniknąć tego problemu.

Przedstawiono tutaj wysokoprzepustową metodę badania małocząsteczkowych antagonistów integryny β2 przy użyciu ludzkich neutrofili. Aktywacja integryny β2 wymaga zmian konformacyjnych ektodomeny integryny, aby uzyskać dostęp do liganda i zwiększyć jego powinowactwo wiązania. W kanonicznym modelu switchblade, ektodomena wygiętej integryny najpierw rozciąga się do konformacji rozszerzonej-zamkniętej, a następnie otwiera swoją głowicę do w pełni aktywowanej konformacji rozszerzonej-otwartej10,11,12,13. Istnieje również alternatywna ścieżka, która zaczyna się od zagiętego zamkniętego do wygiętego-otwartego i rozszerzonego-otwartego, ostatecznie14,15,16,17,18,19. Przeciwciało specyficzne dla konformacji mAb24 wiąże się z epitopem w ludzkiej domenie podobnej do β2-I, gdy głowica ektodomeny jest otwarta20,21,22,23.

Tutaj mAb24-APC służy do określenia, czy integryny β2 są aktywowane. Aby aktywować neutrofile i integrynę, N-formylometylo-leucylo-fenyloalanina (fMLP), krótki peptyd chemotaktyczny pochodzenia bakteryjnego, który może aktywować integryny β2 neutrofili24, jest używany jako bodziec w tym protokole. Kiedy fMLP wiąże się z Fpr1 na neutrofilach, aktywowane są kaskady sygnałowe obejmujące białka G, fosfolipazę Cβ i γ kinazy fosfoinozytolu. Te zdarzenia sygnalizacyjne ostatecznie skutkują aktywacją integryny poprzez szlak sygnalizacyjny inside-out18,25. Oprócz małocząsteczkowych antagonistów, którzy bezpośrednio wiążą się z integrynami β2 i zapobiegają zmianom konformacyjnym aktywacji integryny26, za pomocą tej metody wykryte zostaną również związki, które mogą hamować składniki szlaku sygnalizacji aktywacji integryny β2 inside-out. Zautomatyzowane cytometry przepływowe umożliwiają wysokoprzepustowe badania przesiewowe. Identyfikacja nowych antagonistów może nie tylko pogłębić naszą wiedzę na temat fizjologii integryny, ale także zapewnić wgląd w translacyjny wgląd w terapię przeciwzapalną opartą na integrynie.

Protokół

Heparynizowane próbki krwi pełnej zostały pobrane od niezidentyfikowanych zdrowych dawców ludzkich po uzyskaniu świadomej zgody, zatwierdzonej przez Institutional Review Board of UConn Health, zgodnie z zasadami Deklaracji Helsińskiej. Uzyskano świadomą zgodę od wszystkich dawców. Kryteria włączenia/wykluczenia dla tego badania zostały starannie opracowane, aby zapewnić odpowiednią kwalifikację uczestników i zminimalizować potencjalne ryzyko. Uprawnieni uczestnicy byli w wieku od 18 do 65 lat, niezależnie od pochodzenia etnicznego, biegle posługiwali się językiem angielskim i byli zdolni do wyrażenia świadomej zgody. Wykluczeni uczestnicy obejmowali osoby, które nie były w stanie wyrazić świadomej zgody dla siebie, takie jak osoby wymagające prawnie upoważnionego przedstawiciela, osoby poniżej 18 roku życia lub powyżej 65 lat, osoby osadzone w więzieniach i kobiety w ciąży. Dodatkowo uczestnicy musieli być wolni od stosowania leków przeciwzapalnych i stanów zapalnych. Obecne infekcje lub trwające przewlekłe lub ostre stany zapalne były również kryteriami wykluczenia. Wreszcie, osoby z aktualną lub niedawną historią zakażenia COVID-19 nie kwalifikowały się do badania. Kryteria te zostały opracowane w celu zapewnienia bezpieczeństwa i przydatności uczestników przy jednoczesnej minimalizacji potencjalnych czynników zakłócających, które mogłyby mieć wpływ na wyniki badania.

1. Przygotowanie odczynników

  1. Pożywka neutrofilowa: Przygotować pożywkę neutrofilową, dodając 2% albuminy surowicy ludzkiej do RPMI-1640 bez czerwieni fenolowej (patrz Tabela materiałów).
  2. Roztwór fMLP: Przygotować roztwór fMLP, rozcieńczając go 100 razy z 10 mM roztworu do przechowywania dimetylosulfotlenku fMLP (DMSO) (patrz tabela materiałów) RPMI 1640 bez czerwieni fenolowej, dając roztwór fMLP o stężeniu 100 μM.
  3. Roztwór przeciwciała: Rozcieńczyć 120 μl przeciwciała monoklonalnego sprzężonego z allofikocyjaniną (APC) mAb24 (mAb24-APC) (patrz tabela materiałów), które informuje o wysokim powinowactwie integryny β2, w 10 ml pożywki neutrofilowej, tworząc roztwór 1,2 μg/ml mAb24-APC.
  4. Biblioteka związków: Rozcieńczyć początkową bibliotekę związków o stężeniu od 10 mM do 1 mM, dodając 5 μl biblioteki 10 mM (patrz tabela materiałów) do 45 μl DMSO w 384-dołkowych płytkach za pomocą płynu. Następnie przenieś 5 μl na studzienkę z biblioteki związków 1 mM na pustą płytkę 384-dołkową za pomocą manipulatora cieczy.
  5. Jak pokazano w Rysunek 1, cztery kolumny (1, 2, 23, 24) zawierały tylko DMSO, ale nie zawierały związków, służąc jako kontrole dodatnie i ujemne w badaniu przesiewowym. Następnie rozcieńczyć każdą studzienkę, dodając 45 μl RPMI-1640 bez czerwieni fenolowej, uzyskując końcowe stężenie 100 μM dla wszystkich związków.

2. Izolacja neutrofili z ludzkiej krwi

  1. Za pomocą pipety serologicznej ostrożnie ułóż 4 ml krwi na 8 ml dostępnego w handlu podłoża o gradiencie gęstości (patrz tabela materiałów) w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml (Rysunek 2A).
  2. Odwirować krew przy stężeniu 550 × g przez 30-50 minut w temperaturze 20 °C. Stopniowo zwalniać wirnik (współczynnik opóźnienia 1).
    UWAGA: Pomyślne oddzielenie neutrofili (pasmo 2 w Ryc. 2B) od czerwonych krwinek może się różnić w zależności od dawcy. W przypadku większości dawców wystarczające jest 30-minutowe wirowanie. Jednak w przypadku niektórych dawców może być wymagane dodatkowe 10-30 minut wirowania, jeśli separacja się nie powiedzie (Rysunek 2C).
  3. Ostrożnie usuń osocze (żółty płyn na wierzchu) i komórki jednojądrzaste (górne mętne pasmo; Pasmo PBMC w klasie Rysunek 2B) przy użyciu pipety o pojemności 1 ml.
  4. Zebrać neutrofile z dolnego mętnego pasma (pasmo neutrofili w Rysunek 2B) i około 3-4 ml poniżej klarownej cieczy do 15 ml probówki wirówkowej zawierającej 10 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Delikatnie wymieszaj zawiesinę neutrofili, odwracając ją 2-3 razy.
  5. Odwirować zawiesinę o stężeniu 400 × g przez 10 minut w temperaturze 20 °C, a następnie ostrożnie usunąć supernatant przez dekantację.
  6. Delikatnie zawiesić osad z 5 ml PBS i odwirować go przy 300 × g przez 5 minut w temperaturze 20 °C.
  7. Usunąć supernatant przez dekantację i ostrożnie usunąć wszelkie pozostałości supernatantu wokół ujścia probówki i na ściance probówki za pomocą odsysania próżniowego. Zawiesić osad w 1 ml pożywki z granulocytami obojętnochłonnymi.
  8. Policz numery komórek za pomocą hemocytometru. Zazwyczaj od 1 do 4 × 107 neutrofili uzyskiwano z 8 ml ludzkiej krwi.
    UWAGA: W zawiesinie neutrofili może występować zanieczyszczenie krwinkami czerwonymi. Czerwone krwinki nie wpływają znacząco na większość testów i mogą zapobiegać aktywacji/torowaniu neutrofili27. Czerwone krwinki muszą zostać poddane lizie przed liczeniem, aby uzyskać dokładne stężenie neutrofili. Dodaj 10 μl zawiesiny komórkowej do 891 μl dejonizowanej wody przez 10-30 s, aby lizować czerwone krwinki, a następnie dodaj 99 μl 10× PBS, aby zrównoważyć ciśnienie osmotyczne, zapobiegając lizie neutrofili
    9. .
  9. Dostosuj gęstość komórek do 6,25 × 105 komórek/ml, dodając pożywkę neutrofilową.

3. Przygotowanie płytki 384-dołkowej

  1. W probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml połącz 1 ml roztworu przeciwciała (1,2 μg/ml mAb24-APC) z 0,2 ml pożywki neutrofilowej, aby uzyskać roztwór 1 μg/ml mAb24-APC. Następnie dodaj 25 μl tej mieszaniny do studzienek kontroli ujemnej na płytce 384-dołkowej (niebieskie studzienki w Rysunek 1).
  2. W probówce wirówkowej o pojemności 15 ml wymieszaj 9 ml roztworu przeciwciała z 21,6 μl roztworu fMLP (100 μM) i 1,7784 ml pożywki neutrofilowej, aby uzyskać roztwór zawierający 1 μg/ml mAb24-APC i 200 nM fMLP. Następnie dodaj 25 μl tej mieszaniny do kontroli pozytywnej i studzienek testowych w płytce 384-dołkowej (czerwone i niebieskie studzienki w Rysunek 1).
  3. Przenieść 5 μl 100 μM roztworów związków z płytki biblioteki związków na płytkę 384-dołkową za pomocą pipety wielokanałowej.
  4. Odwirowywać ciecz przez 1 minutę w temperaturze 500 × g, w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Do wirowania płytek wymagany jest wirnik z odchylanym kubełkiem i wiadra z płytami.

4. Leczenie komórek

  1. Dodać 20 μl zawiesiny neutrofili do każdego dołka za pomocą pipety 16-kanałowej (zakres 5-50 μl, dla każdej kolumny płytki 384-dołkowej). Delikatnie wymieszaj 5-10 razy za pomocą pipety, zachowując stały odstęp czasu między każdym pipetowaniem.
    UWAGA: Końcowe stężenia w studzienkach są następujące: neutrofile 2,5 × 105 komórek/ml (wszystkie studzienki); mAb24-APC 0,5 μg/ml (wszystkie studzienki); fMLP 100 nM (kontrolne i testowe studzienki kontrolne); związki 10 μM (studzienki badawcze).
  2. Inkubować płytkę na wytrząsarce z prędkością 300 obr./min, w temperaturze pokojowej (RT), przez 10 minut.
  3. Utrwal komórki, dodając 3 μl 16% paraformaldehydu (PFA) do każdej studzienki za pomocą 16-kanałowej pipety (końcowe stężenie PFA ~0,91%). Następnie inkubować na lodzie przez 10 min.
    UWAGA: Zaleca się zachowanie stałego odstępu czasu między różnymi kolumnami podczas dodawania neutrofili i PFA. Gwarantuje to, że neutrofile w każdym dołku mają taki sam czas inkubacji z fMLP i mAb24-APC.

5. Cytometria przepływowa

  1. Włącz cytometr przepływowy (patrz Tabela materiałów) i upewnij się, że komputer podłączony do przyrządu jest również włączony.
  2. Upewnij się, że pojemnik na płyn w osłonie jest napełniony, a pojemnik na odpady jest pusty i prawidłowo podłączony do instrumentu.
  3. Załadować płytkę 384-dołkową na ładowarkę próbki cytometru przepływowego. Upewnij się, że wgłębienie A1 na tabliczce jest wyrównane z oznaczeniem A1 na ładowarce.
  4. Otwórz oprogramowanie i utwórz nowy eksperyment. Wybierz dobrze 384 i wybierz żądane fluorofory. Następnie kliknij Ustawienia płyty, przeciągnij, aby zaznaczyć wszystkie dołki, a następnie kliknij Próbka. Włącz przełącznik "Wysoka przepustowość" i wybierz opcję Wysoka pod panelem stawek.
    1. W polu woluminu wprowadź wartość 50. Wybierz próbki w kolumnach nieparzystych, a następnie aktywuj przełącznik "Mieszanie". Na koniec nazwij próbki w prawym panelu.
  5. Kliknij na Działka i brama. Następnie kliknij przycisk Zastosuj (dwie strzałki na zielonym kółku), a następnie kliknij przycisk odtwarzania (kształt trójkąta). Poczekaj kilka sekund, aby obserwować niektóre komórki z pierwszej studni, a następnie kliknij przycisk pauzy.
    1. Dostosuj napięcia FSC i SSC, aby zapewnić prawidłową wizualizację komórek na wykresie. Kliknij Akwizycja, a następnie kliknij przycisk odtwarzania (kształt trójkąta), aby rozpocząć test.
  6. Cytometr przepływowy będzie sekwencyjnie pobierał próbki ~ 50 μL 1000-3000 neutrofili z każdej studzienki. Wykonanie całej płytki 384-dołkowej zajmie około 3 godzin.
  7. Po wykonaniu wszystkich przykładów wyeksportuj pliki .fcs do następnego kroku.

6. Analiza danych

  1. Otwórz oprogramowanie do analizy danych cytometrii przepływowej (patrz tabela materiałów). Wybierz i przeciągnij folder zawierający wszystkie pliki .fcs do okna oprogramowania, a następnie zwolnij, aby zaimportować dane do oprogramowania.
  2. Kliknij dwukrotnie na jedną próbkę, bramkują pojedyncze neutrofile w oparciu o FSC i SSC28,29,30 w wyskakującym okienku, jak pokazano w Rysunek 3. Zaznacz wiersze bramkowane i przeciągnij je do folderu, a następnie zwolnij przycisk, aby zastosować bramkowanie do wszystkich próbek w tym folderze.
  3. Oblicz i wyeksportuj medianę intensywności fluorescencji (MFI) granulocytów obojętnochłonnych APC z każdego dołka, korzystając z funkcji edytora tabel w oprogramowaniu. Kliknij Dodaj kolumnę na karcie Edytuj. Wybierz opcję Mediana na karcie Statystyka, wybierz bramkowaną populację neutrofili i wybierz APC jako parametr. Kliknij przycisk OK.
  4. Wróć do zakładki "Edytor tabel", wybierz Wszystkie próbki w zakładce "Grupa" i naciśnij przycisk Utwórz tabelę. Pojawi się nowe okno wyświetlające utworzoną tabelę. Zapisz go jako plik tekstowy, CSV lub Excel.
  5. Otwórz wyeksportowaną tabelę, oblicz średnią wartość i odchylenie standardowe APC MFI dla dodatnich i ujemnych próbek kontrolnych (Rysunek 4).
  6. Oblicz współczynnik Z' (Z') tabliczki za pomocą równania:
    Z' = 1 - 3(σp + σn)/(μp - μn),
    gdzie σp i σn są odchyleniami standardowymi odpowiednio kontroli dodatniej i ujemnej, a μp i μn są średnimi odpowiednio kontroli dodatnich i ujemnych31.
    UWAGA: Współczynnik Z' wskazuje rozdzielenie rozkładu kontroli dodatniej i ujemnej. Z' równe 0 oznacza brak separacji, podczas gdy Z' równe 0,5 oznacza równą separację. Jak wspomniano w poprzednim badaniu31, Z' > 0,5 wskazuje na doskonały test do badań przesiewowych związków. Z' w zakresie od 0,5 do 0 jest dopuszczalne, ale może identyfikować tylko silne trafienia w teście, co będzie wymagało dalszej walidacji w testach wtórnych.
  7. Związki należy traktować jako "trafienia" do badań przesiewowych, gdy wartość APC MFI neutrofili poddanych działaniu związków jest mniejsza niż trzykrotność odchylenia standardowego MFI kontroli dodatniej odjętej od MFI kontroli dodatniej (P = 0,0013, reprezentowana przez przerywaną linię w Rysunek 4).

Wyniki

Dane z reprezentatywnego przesiewu na płytce 384-dołkowej (Rycina 4) wykazały, że kontrole negatywne miały MFI dla mAb24-APC wynoszące 3236 ± 110, podczas gdy kontrole pozytywne miały MFI dla mAb24-APC wynoszące 7588 ± 858. Współczynnik Z' dla tej płytki wynosi około 0,33, co mieści się w dopuszczalnym zakresie31. Niemniej jednak, Z' wymaga dalszej walidacji w testach wtórnych.

W celu normalizacji danych wszystkie wartości zostały przeskalowane tak, aby przypisać wartość maksymalną 1 do średniej dodatniej i wartość minimalną 0 do średniej ujemnej. Współczynnik Z' zostanie poddany bardziej rygorystycznej walidacji w testach wtórnych. Próg odcięcia dla tej płytki ustalono na poziomie 0,41, co oznacza, że próbki z relatywnym MFI niższym niż 0,41 zostaną uznane za trafienia hamujące indukowaną fMLP aktywację integryny β2 w ludzkich neutrofilach. Na tej płytce nie zidentyfikowano żadnych trafień.

Aby potwierdzić skuteczność protokołu, zastosowano Nexinhib20, który hamuje aktywację β2 integryny poprzez antagonizowanie funkcji Rac-1, oraz lifitegrast, który bezpośrednio antagonizuje integrynę αLβ232,33. Czas inkubacji dostosowano jednak do jednej godziny dla Nexinhib20 i pół godziny dla lifitegrastu. Uzyskane dane z tych eksperymentów znormalizowano przy użyciu tej samej metody skalowania opisanej powyżej. Następnie punkty danych te połączono z wynikami z płytek i przeanalizowano zbiorczo (Rysunek 4).

Schemat płytki 96-dołkowej, wyniki testu, kontrole pozytywne/negatywne, analiza rozkładu związków.
Rycina 1: Układ płytki do przesiewania związków. Schemat ilustrujący rozmieszczenie badanych związków i kontroli w płytce 384-dołkowej. Dołki kontroli negatywnej zaznaczono na niebiesko (kolumny 1 i 23), a dołki kontroli pozytywnej na czerwono (kolumny 2 i 24). Dołki testowe przedstawiono w kolorze beżowym (kolumny od 3 do 22). Strzałki wskazują kolejność odczytu płytki. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Proces frakcjonowania krwi; przygotowanie probówki do izolacji PBMC metodą gradientu gęstości.
Rysunek 2: Separacja neutrofili z wykorzystaniem medium gradientu gęstości. Reprezentatywne zdjęcia demonstrujące prawidłową i nieprawidłową separację neutrofili z wykorzystaniem medium gradientu gęstości. (A) Początkowo 4 mL krwi nakłada się warstwowo na 8 mL medium gradientu gęstości. (B) Po wirowaniu powinny być widoczne dwa mętne pasma: górne pasmo zawierające głównie mononuklearne komórki krwi obwodowej (PBMCs) oraz dolne pasmo zawierające głównie neutrofile wraz z pewną ilością erytrocytów (RBCs). Większość erytrocytów osadza się na dnie. (C) Nieprawidłowa separacja, w której erytrocyty nie zostały osadzone, a pasmo neutrofili nie jest widoczne. Do wydzielenia pasma neutrofili wymagane byłoby dodatkowe wirowanie (10-30 min). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykresy cytometrii przepływowej, analiza populacji komórek, neutrofile, procent pojedynczych komórek.
Rycina 3: Gating neutrofili z wykorzystaniem wykresów FSC/SSC. Reprezentatywne wykresy rozproszenia światła w przód (FSC) oraz rozproszenia bocznego (SSC) ilustrujące strategię gatingu w celu identyfikacji neutrofili. (A) Neutrofile są wyznaczane (gating) na podstawie pola rozproszenia w przód (FSC-A) i rozproszenia bocznego (SSC-A) zarejestrowanego przez cytometr przepływowy. (B) Pojedyncze komórki są następnie wyznaczane na podstawie szerokości (FSC-W) i wysokości (FSC-H) rozproszenia w przód, a (C) szerokości (SSC-W) i wysokości (SSC-H) rozproszenia bocznego. Skala kolorystyczna reprezentuje gęstość komórek, przechodząc z koloru czerwonego przez żółty i zielony do niebieskiego wraz ze spadkiem gęstości. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres punktowy porównujący znormalizowane MFI dla mAb24 w zależności od związków; legenda wskazuje kontrole pozytywne/negatywne.
Rysunek 4: Wyniki przesiewania na reprezentatywnej płytce 384-dołkowej. Wyniki przesiewania z reprezentatywnej płytki 384-dołkowej, wykazujące współczynnik Z' wynoszący 0,3. Kontrole negatywne i pozytywne są oznaczone odpowiednio niebieskimi i czerwonymi kropkami. Próbki testowe traktowane różnymi związkami są przedstawione jako beżowe kropki. Linia przerywana reprezentuje wartość odcięcia średniej intensywności fluorescencji (MFI) służącą do identyfikacji hitów. Żaden z testowanych związków nie został zidentyfikowany jako antagonista integryny β2, ponieważ wszystkie przetestowane związki wykazały wartości MFI powyżej linii odcięcia. Wyniki z niezależnych eksperymentów testujących znane antagonisty integryny β2 przy różnych czasach inkubacji (Nexinhib20 przez 1 h, lifitegrast przez pół godziny) zostały połączone w celu prezentacji na tym rysunku. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Inicjacja i zakończenie stymulacji i barwienia neutrofili jest determinowane przez dodanie neutrofili i utrwalacza PFA. Dlatego tak ważne jest zapewnienie takiego samego odstępu czasu między pipetowaniem neutrofili lub PFA do każdej kolumny. Gwarantuje to, że czas stymulacji i barwienia neutrofili z każdej studzienki pozostaje stały. Ze względu na krótką żywotność neutrofili cały eksperyment, od pobrania krwi od dawców do zakończenia cytometrii przepływowej, musi zostać przeprowadzony tego samego dnia. Neutrofile są bardzo wrażliwe na zmiany temperatury i mogą ulec aktywacji pod wpływem gwałtownych wzrostów temperatury, takich jak przejście z 4 °C do temperatury pokojowej lub z temperatury pokojowej do 37 °C. Dodatkowo, w oparciu o nasze wcześniejsze doświadczenia, indukowana przez fMLP aktywacja integryny neutrofili β2 nie zachodzi, gdy komórki są przechowywane na lodzie lub w temperaturze 4 °C (dane nie pokazane). Dlatego przed utrwaleniem krew pełną i neutrofile należy przechowywać w temperaturze pokojowej lub 20 °C (podczas etapu wirowania izolacyjnego). Nie umieszczaj krwi pełnej i neutrofili na lodzie.

Barwienie mAb24 w kontrolach ujemnych powinno dać bardzo niskie wyniki. Jeśli w eksperymencie zaobserwuje się wysoki poziom barwienia mAb24, należy sprawdzić, co następuje: (1) czy podczas eksperymentu przed utrwaleniem nastąpiła znacząca zmiana temperatury; (2) czy w pożywce neutrofilowej doszło do zanieczyszczenia fMLP lub endotoksynami; (3) czy obchodzenie się z próbką było zbyt agresywne, np. wytwarzanie pęcherzyków podczas pipetowania i mieszania.

Obecny protokół wykorzystuje mAb24 do zgłaszania otwarcia głowicy integryny β2. Teoretycznie KIM127, przeciwciało monoklonalne informujące o rozszerzeniu integryn β234,35, może być stosowane w połączeniu z mAb24 do kompleksowej oceny konformacji integryny β2. Jednak stosunek sygnału do szumu barwienia KIM127 (1,5 do 2 razy) nie jest tak korzystny jak w przypadku mAb24 (od 5 do 10 razy), co zwykle nie zapewnia zadowalającego współczynnika Z' w teście płytkowym 384-dołkowym. W teście na 96-dołkowej płytce próbki można umyć przed wykonaniem cytometrii przepływowej, redukując rozpuszczalne sygnały tła pochodzące od przeciwciał. Dlatego test oparty na KIM127 można przeprowadzić w teście na płytce 96-dołkowej, która ma niższą przepustowość w porównaniu z testem na płytce 384-dołkowej.

Ponieważ metoda ta wykorzystuje intensywność fluorescencji jako odczyt do oceny hamującego działanie leków na integryny, niektóre leki fluorescencyjne mogą zakłócać wyniki. Dodatkowo, toksyczne leki, które indukują śmierć neutrofili w ciągu 10-minutowego okresu stymulacji, również wydają się zgłaszać hamowanie integryny. Leki, które hamują degranulację neutrofili, hamują ogólną ekspresję integryny β2. Te inhibitory degranulacji zostaną również zidentyfikowane w naszych badaniach przesiewowych. W związku z tym konieczne jest wtórne badanie przesiewowe z innymi kontrolami, aby potwierdzić hamujące działanie trafień. Ekrany wtórne są przywoływane jako środek zarówno do walidacji, jak i określenia mechanizmu działania trafień. Oprócz powtórzenia testów mAb24, całkowita ekspresja CD18 na powierzchni komórki zostanie oceniona przy użyciu przeciwciała anty-ludzkiego CD18. Poziom aktywowanej integryny β2, mierzony za pomocą mAb24, zostanie znormalizowany przez całkowitą ekspresję CD18. Umożliwi nam to ustalenie, czy mechanizm działania czynnika polega na antagonizowaniu aktywacji integryny i/lub hamowaniu ekspresji CD18 na powierzchni komórki. Należy również przeprowadzić test żywotności na wtórnym sicie, aby wykluczyć wszelkie toksyczne skutki trafień.

Ten protokół ma ograniczenia. Po pierwsze, mAb24 jest w stanie wykryć domenę podobną do β2 I tylko w przypadkach, gdy integryna jest w stanie wysokiego powinowactwa. W związku z tym nie może zidentyfikować α/β podobnych do I-podobnych antagonistów allosterycznych, takich jak lifitegrast, poprzez zmniejszenie wiązania mAb24. Lifitegrast indukuje więcej wiązania mAb2432 i wykazuje nienormalnie zwiększoną wartość MFI z mAb24 (ryc. 4). W przypadku takich nieprawidłowych wartości mogą być potrzebne inne testy, aby sprawdzić, czy te trafienia są α/β podobnymi do I-podobnych antagonistów allosterycznych, takich jak lifitegrast. Po drugie, współczynnik Z' dla tego testu jest nieoptymalny i potencjalnie można go poprawić dzięki zastosowaniu automatycznego pipetowania i mieszania. Niestety, nasze laboratorium nie dysponuje niezbędną aparaturą do przetestowania tej hipotezy. Powielanie lub trzykrotne testowanie będzie pomocne w identyfikacji wyników fałszywie dodatnich i ujemnych w przypadku, gdy czynnika Z' nie można dalej poprawić za pomocą powyższych metod. Ponadto korzystne może być wydłużenie czasu inkubacji w celu zidentyfikowania większej liczby trafień, jak zaobserwowano w przypadku znanego inhibitora aktywacji integryny β2 Nexinhib20, który wymaga godziny inkubacji, aby wywołać efekty hamujące. Badanie to koncentrowało się na identyfikacji szybko działających środków. Naukowcy powinni pamiętać, że mogą modyfikować czas inkubacji, aby dostosować go do swoich konkretnych potrzeb.

Według naszej wiedzy jest to pierwsza wysokoprzepustowa metoda przesiewowa w kierunku antagonistów integryny β2. Podejście to może być wykorzystane do identyfikacji związków małocząsteczkowych, które bezpośrednio wiążą się z integrynami β2 i zapobiegają zmianom konformacyjnym prowadzącym do stanów integryny o pośrednim/wysokim powinowactwie, podobnie jak antagoniści bez właściwości "agonistycznych" opisanych niedawno dla integryn αIIbβ3 i α4β126. Neutrofile mają kluczowe znaczenie w wielu chorobach zapalnych, takich jak uszkodzenie niedokrwienno-reperfuzyjne mięśnia sercowego36, posocznica37 i choroby autoimmunologiczne38,39. Leki małocząsteczkowe mogą oferować większą elastyczność w leczeniu tych chorób w porównaniu z lekami opartymi na przeciwciałach. Trafienia z naszego ekranu mogą dostarczyć potencjalnych metod leczenia chorób zapalnych.

Obecna metoda to wysokoprzepustowe badanie przesiewowe oparte na przeciwciałach fluorescencyjnych. Ponieważ przeciwciała reporterowe aktywacji są również dostępne dla β1 40,41,42,43,44, αIIbβ3 45,46 i integryn αL 47,48,49,50, metodę tę można rozszerzyć o identyfikację antagonistów dla innych integryn. Konformacyjnie wrażliwe przeciwciało, takie jak HUTS-21, które wiąże się z domeną hybrydową β1 51,52,53, zostało użyte w wysokoprzepustowym badaniu przesiewowym w celu identyfikacji bardzo późnych antagonistów allosterycznych antygenu-4 (VLA-4, integryna α4β1) 54. Obecna metoda badań przesiewowych może być również modyfikowana i rozszerzana w celu znalezienia leków, które hamują lub promują ekspresję innych receptorów powierzchniowych, takich jak związki zwiększające ekspresję powierzchniową transbłonowego regulatora przewodnictwa mukowiscydozy (CFTR) na komórkach mukowiscydozy (CF). W mukowiscydozie wielokrotne mutacje prowadzą do nieprawidłowego fałdowania CFTR, co skutkuje brakiem ekspresji CFTR na błonie komórkowej55. Wykazano, że leki małocząsteczkowe przywracają ekspresję CFTR56. W celu modyfikacji protokołu konieczne jest wydłużenie czasu inkubacji leków do kilku godzin, aby umożliwić zajście zmian w ekspresji białek.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Dziękujemy dr Evanowi Jellisonowi i pani Li Zhu z centrum cytometrii przepływowej w UConn Health za ich pomoc w cytometrii przepływowej, dr Lynn Puddington z Wydziału Immunologii UConn Health za wsparcie instrumentów, Pani Sławie Gajewskiej i dr Paulowi Appletonowi z centrum badań klinicznych w UConn Health za ich pomoc w uzyskaniu próbek krwi. Dziękujemy dr Christopherowi "Kit" Boninowi i dr Genewie Hargis z UConn School of Medicine za ich pomoc w pisaniu naukowym i redagowaniu tego manuskryptu. Badania te były wspierane przez granty z National Institutes of Health, National Heart, Lung, and Blood Institute (R01HL145454), National Institute of General Medical Sciences (P20GM121176), USA, Career Development Award od American Heart Association (18CDA34110426) oraz fundusz startowy od UConn Health. Rysunek 1 został utworzony za pomocą BioRender.com.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Pipety 16-kanałoweThermo4661090N
Instrument 384-dołkowa płytkaGreiner784201Materiały
APC anty-ludzkie CD11a/CD18 (LFA-1) Klon przeciwciała: m24BioLegend363410Odczynniki
Bravo  Zautomatyzowana platforma do obsługi cieczy Agilent16050-102384 wielokanałowa wirówka do obsługi cieczy
EppendorfModel 5810RPrzepływ przyrządu
JoBecton, Dickinson & FirmaNASoftware
Roztwór albuminy ludzkiej surowicy (25%)Odczynniki GeminiBio800-120
LifitegrastThermofisher  50-208-2121Odczynniki
Nexinhib20Tocris6089Odczynniki
N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP)SigmaF3506Odczynniki
Paraformaldehyd 16% roztwórMikroskopia elektronowa Sciences15710Odczynniki
Wiadra płytkoweEppendorfUL155Akcesorium
Wytrząsarka do płytek Fisher88-861-023Instrument
PolymorphPrepPROGEN1895 (poprzedni 1114683)
Odczynniki Biblioteka chemiczna Prestwick Płytki złożone (10 mM)Biblioteki chemiczne PrestwickVer19_3841520 małych cząsteczek, 98% zatwierdzonych do obrotu leków (zatwierdzone przez FDA, EMA, JAN i inne agencje)
RPMI 1640 Medium, bez czerwieni fenolowejOdczynniki Gibco11-835-030
Wirnik czerpako-huśtawkowy Analizator komórek EppendorfA-4-62Rotor
ZE5Instrument Bio-Rad LaboratoriesModel ZE5

Bibliografia

  1. Herrero-Cervera, A., Soehnlein, O., Kenne, E. Neutrophils in chronic inflammatory diseases. Cellular & Molecular Immunology. 19 (2), 177-191 (2022).
  2. Sadik, C. D., Kim, N. D., Luster, A. D. Neutrophils cascading their way to inflammation. Trends in immunology. 32 (10), 452-460 (2011).
  3. Mitroulis, I., et al. Leukocyte integrins: Role in leukocyte recruitment and as therapeutic targets in inflammatory disease. Pharmacology & Therapeutics. 147, 123-135 (2015).
  4. Slack, R. J., Macdonald, S. J. F., Roper, J. A., Jenkins, R. G., Hatley, R. J. D. Emerging therapeutic opportunities for integrin inhibitors. Nature Reviews Drug Discovery. 21 (1), 60-78 (2022).
  5. Frampton, J. E., Plosker, G. L. Efalizumab. American Journal of Clinical Dermatology. 10 (1), 51-72 (2009).
  6. Talamonti, M., et al. Efalizumab. Expert Opinion on Drug Safety. 10 (2), 239-251 (2011).
  7. Saribaş, A. S., Özdemir, A., Lam, C., Safak, M. JC virus-induced progressive multifocal leukoencephalopathy. Future Virology. 5 (3), 313-323 (2010).
  8. Chames, P., Van Regenmortel, M., Weiss, E., Baty, D. Therapeutic antibodies: successes, limitations and hopes for the future. British Journal of Pharmacology. 157 (2), 220-233 (2009).
  9. Mancuso, R. V., Casper, J., Schmidt, A. G., Krähenbühl, S., Weitz-Schmidt, G. Anti-αLβ2 antibodies reveal novel endocytotic cross-modulatory functionality. British Journal of Pharmacology. 177 (12), 2696-2711 (2020).
  10. Anderson, J. M., Li, J., Springer, T. A. Regulation of integrin α5β1 conformational states and intrinsic affinities by metal ions and the ADMIDAS. Molecular Biology of the Cell. 33 (6), ar56(2022).
  11. Jensen, R. K., et al. Complement receptor 3 forms a compact high-affinity complex with iC3b. The Journal of Immunology. 206 (12), 3032-3042 (2021).
  12. Li, J., Yan, J., Springer, T. A. Low affinity integrin states have faster ligand binding kinetics than the high affinity state. Elife. 10, e73359(2021).
  13. Luo, B. H., Carman, C. V., Springer, T. A. Structural basis of integrin regulation and signaling. Annual Review of Immunology. 25, 619-647 (2007).
  14. Fan, Z., et al. Neutrophil recruitment limited by high-affinity bent β2 integrin binding ligand in cis. Nature communications. 7 (1), 1-14 (2016).
  15. Fan, Z., et al. High-affinity bent β2-integrin molecules in arresting neutrophils face each other through binding to ICAMs in cis. Cell reports. 26 (1), 119-130 (2019).
  16. Gupta, V., et al. The β-tail domain (βTD) regulates physiologic ligand binding to integrin CD11b/CD18. Blood. 109 (8), 3513-3520 (2006).
  17. Sen, M., Yuki, K., Springer, T. A. An internal ligand-bound, metastable state of a leukocyte integrin, αXβ2. Journal of Cell Biology. 203 (4), 629-642 (2013).
  18. Sun, H., Hu, L., Fan, Z. β2 integrin activation and signal transduction in leukocyte recruitment. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 321 (2), C308-C316 (2021).
  19. Sun, H., Zhi, K., Hu, L., Fan, Z. The activation and regulation of β2 integrins in phagocytes. Frontiers in Immunology. 12, 978(2021).
  20. Kamata, T., et al. The role of the CPNKEKEC sequence in the β2 subunit I domain in regulation of integrin αLβ2 (LFA-1). The Journal of Immunology. 168 (5), 2296-2301 (2002).
  21. Lu, C., Shimaoka, M., Zang, Q., Takagi, J., Springer, T. A. Locking in alternate conformations of the integrin αLβ2 I domain with disulfide bonds reveals functional relationships among integrin domains. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (5), 2393-2398 (2001).
  22. Yang, W., Shimaoka, M., Chen, J., Springer, T. A. Activation of integrin β-subunit I-like domains by one-turn C-terminal α-helix deletions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (8), 2333-2338 (2004).
  23. Dransfield, I., Hogg, N. Regulated expression of Mg2+ binding epitope on leukocyte integrin alpha subunits. The EMBO Journal. 8 (12), 3759-3765 (1989).
  24. Torres, M., Hall, F., O'neill, K. Stimulation of human neutrophils with formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine induces tyrosine phosphorylation and activation of two distinct mitogen-activated protein-kinases. The Journal of Immunology. 150 (4), 1563-1577 (1993).
  25. Dorward, D. A., et al. The role of formylated peptides and formyl peptide receptor 1 in governing neutrophil function during acute inflammation. The American Journal of Pathology. 185 (5), 1172-1184 (2015).
  26. Lin, F. Y., et al. A general chemical principle for creating closure-stabilizing integrin inhibitors. Cell. 185 (19), 3533-3550 (2022).
  27. Lizcano, A., et al. Erythrocyte sialoglycoproteins engage Siglec-9 on neutrophils to suppress activation. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 129 (23), 3100-3110 (2017).
  28. Tadema, H., Abdulahad, W. H., Stegeman, C. A., Kallenberg, C. G., Heeringa, P. Increased expression of Toll-like receptors by monocytes and natural killer cells in ANCA-associated vasculitis. PloS One. 6 (9), e24315(2011).
  29. Nagelkerke, S. Q., aan de Kerk, D. J., Jansen, M. H., van den Berg, T. K., Kuijpers, T. W. Failure to detect functional neutrophil B helper cells in the human spleen. PloS one. 9 (2), e88377(2014).
  30. Blanco-Camarillo, C., Alemán, O. R., Rosales, C. Low-density neutrophils in healthy individuals display a mature primed phenotype. Frontiers in Immunology. 12, 672520(2021).
  31. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of biomolecular screening. 4 (2), 67-73 (1999).
  32. Shimaoka, M., Salas, A., Yang, W., Weitz-Schmidt, G., Springer, T. A. Small molecule integrin antagonists that bind to the β2 subunit I-like domain and activate signals in one direction and block them in the other. Immunity. 19 (3), 391-402 (2003).
  33. Liu, W., et al. Nexinhib20 Inhibits neutrophil adhesion and β2 integrin activation by antagonizing Rac-1-Guanosine 5′-Triphosphate interaction. The Journal of Immunology. 209 (8), 1574-1585 (2022).
  34. Robinson, M., et al. Antibody against the Leu-CAM beta-chain (CD18) promotes both LFA-1-and CR3-dependent adhesion events. The Journal of Immunology. 148 (4), 1080-1085 (1992).
  35. Lu, C., Ferzly, M., Takagi, J., Springer, T. A. Epitope mapping of antibodies to the C-terminal region of the integrin β2 subunit reveals regions that become exposed upon receptor activation. The Journal of Immunology. 166 (9), 5629-5637 (2001).
  36. Mauler, M., et al. Platelet serotonin aggravates myocardial ischemia/reperfusion injury via neutrophil degranulation. circulation. 139 (7), 918-931 (2019).
  37. Shen, X. F., Cao, K., Jiang, J., Guan, W. X., Du, J. F. Neutrophil dysregulation during sepsis: an overview and update. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 21 (9), 1687-1697 (2017).
  38. Chiang, C. C., Cheng, W. J., Korinek, M., Lin, C. Y., Hwang, T. L. Neutrophils in Psoriasis. Frontiers in Immunology. 10, 02376(2019).
  39. Lood, C., et al. Neutrophil extracellular traps enriched in oxidized mitochondrial DNA are interferogenic and contribute to lupus-like disease. Nature medicine. 22 (2), 146-153 (2016).
  40. Bazzoni, G., Shih, D. T., Buck, C. A., Hemler, M. E. Monoclonal antibody 9EG7 defines a novel β1 integrin epitope induced by soluble ligand and manganese, but inhibited by calcium. Journal of Biological Chemistry. 270 (43), 25570-25577 (1995).
  41. Luque, A., et al. Activated conformations of very late activation integrins detected by a group of antibodies (HUTS) specific for a novel regulatory region(355-425) of the common β1 chain. Journal of Biological Chemistry. 271 (19), 11067-11075 (1996).
  42. Mould, A. P., Akiyama, S. K., Humphries, M. J. The inhibitory Anti-β1 integrin monoclonal antibody 13 recognizes an epitope that is attenuated by ligand occupancy: evidence for allosteric inhibition of integrin function. Journal of Biological Chemistry. 271 (34), 20365-20374 (1996).
  43. Spiess, M., et al. Active and inactive β1 integrins segregate into distinct nanoclusters in focal adhesions. Journal of Cell Biology. 217 (6), 1929-1940 (2018).
  44. Yang, S., et al. Relating conformation to function in integrin α5β1. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (27), E3872-E3881 (2016).
  45. Shattil, S. J., Hoxie, J. A., Cunningham, M., Brass, L. F. Changes in the platelet membrane glycoprotein IIb.IIIa complex during platelet activation. Journal of Biological Chemistry. 260 (20), 11107-11114 (1985).
  46. Shattil, S. J., Motulsky, H. J., Insel, P. A., Flaherty, L., Brass, L. F. Expression of fibrinogen receptors during activation and subsequent desensitization of human platelets by epinephrine. Blood. 68 (6), 1224-1231 (1986).
  47. Carreño, R., et al. 2E8 binds to the high affinity i-domain in a metal ion-dependent manner: a second generation monoclonal antibody selectively targeting activated LFA-1. Journal of Biological Chemistry. 285 (43), 32860-32868 (2010).
  48. Keizer, G. D., Visser, W., Vliem, M., Figdor, C. G. A monoclonal antibody (NKI-L16) directed against a unique epitope on the alpha-chain of human leukocyte function-associated antigen 1 induces homotypic cell-cell interactions. The Journal of Immunology. 140 (5), 1393-1400 (1988).
  49. Lefort, C. T., et al. Distinct roles for talin-1 and kindlin-3 in LFA-1 extension and affinity regulation. Blood. 119 (18), 4275-4282 (2012).
  50. van Kooyk, Y., et al. Activation of LFA-1 through a Ca2(+)-dependent epitope stimulates lymphocyte adhesion. Journal of Cell Biology. 112 (2), 345-354 (1991).
  51. Mould, A. P., et al. Conformational changes in the integrin a domain provide a mechanism for signal transduction via hybrid domain movement. Journal of Biological Chemistry. 278 (19), 17028-17035 (2003).
  52. Chigaev, A., et al. Real-time analysis of conformation-sensitive antibody binding provides new insights into integrin conformational regulation. Journal of Biological Chemistry. 284 (21), 14337-14346 (2009).
  53. Njus, B. H., et al. Conformational mAb as a tool for integrin ligand discovery. Assay and Drug Development Technologies. 7 (5), 507-515 (2009).
  54. Chigaev, A., Wu, Y., Williams, D. B., Smagley, Y., Sklar, L. A. Discovery of very late antigen-4 (VLA-4, α4β1 integrin) allosteric antagonists. Journal of Biological Chemistry. 286 (7), 5455-5463 (2011).
  55. Ghigo, A., De Santi, C., Hart, M., Mitash, N., Swiatecka-Urban, A. Cell signaling and regulation of CFTR expression in cystic fibrosis cells in the era of high efficiency modulator therapy. Journal of Cystic Fibrosis. 22, S12-S16 (2023).
  56. Van Goor, F., Yu, H., Burton, B., Hoffman, B. J. Effect of ivacaftor on CFTR forms with missense mutations associated with defects in protein processing or function. Journal of Cystic Fibrosis. 13 (1), 29-36 (2014).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Inhibicja integrynwysokoprzepustowe przesiewanieizolacja neutrofiliintegryna beta dwaprzesiewanie przeciwciałgradient gęstościczytnik płytekodpowiedź immunologicznamałocząsteczkowe antagoniści
Wysokoprzepustowa technika oparta na cytometrii przepływowej do badań przesiewowych leków hamujących integryny
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.