Wysokoprzepustowa technika oparta na cytometrii przepływowej do badań przesiewowych leków hamujących integryny

Summary

Ten protokół opisuje opartą na cytometrii przepływowej, wysokoprzepustową metodę przesiewową w celu identyfikacji małocząsteczkowych leków, które hamują aktywację integryny β2 na ludzkich neutrofilach.

Abstract

Ten protokół ma na celu ustanowienie metody identyfikacji małych molekularnych antagonistów aktywacji integryny β2, wykorzystując przeciwciała zgłaszające zmiany konformacyjne i wysokoprzepustową cytometrię przepływową. Metoda ta może również służyć jako przewodnik dla innych wysokoprzepustowych metod badań przesiewowych opartych na przeciwciałach. Integryny β2 to cząsteczki adhezyjne specyficzne dla leukocytów, które mają kluczowe znaczenie w odpowiedziach immunologicznych. Neutrofile polegają na aktywacji integryny, aby opuścić krwioobieg, nie tylko w celu zwalczania infekcji, ale także w celu wzięcia udziału w wielu chorobach zapalnych. Kontrolowanie aktywacji integryny β2 stanowi realne podejście do leczenia chorób zapalnych związanych z neutrofilami. W tym protokole przeciwciało monoklonalne, mAb24, które specyficznie wiąże się z głowicą o wysokim powinowactwie integryn β2, jest wykorzystywane do ilościowego oznaczania aktywacji integryny β2 na izolowanych pierwotnych ludzkich neutrofilach. N-formylometylo-leucylo-fenyloalanina (fMLP) jest stosowana jako bodziec do aktywacji integryn β2 neutrofili. W badaniu wykorzystano wysokoprzepustowy cytometr przepływowy, zdolny do automatycznego uruchamiania próbek z płytek 384-dołkowych. Wpływ 320 substancji chemicznych na hamowanie integryny β2 ocenia się w ciągu 3 godzin. Dzięki temu podejściu można zidentyfikować cząsteczki, które są bezpośrednio ukierunkowane na integryny β2 lub cząsteczki docelowe w inicjowanym przez receptor białkowym białku G szlaku sygnalizacji aktywacji integryny od wewnątrz na zewnątrz.

Introduction

Wiele chorób zapalnych charakteryzuje się infiltracją neutrofili w miejscu obrzęku lub urazu¹. Aby przeniknąć do tych tkanek, neutrofile muszą przejść przez kaskadę rekrutacji neutrofili, która obejmuje zatrzymanie do śródbłonka, wynaczynienie przez ścianę naczynia i rekrutację do tkanki². Krążące neutrofile potrzebują aktywacji integryny β2, aby zakończyć tę kaskadę, szczególnie w fazie zatrzymania. Tak więc leki hamujące integryny, które zmniejszają adhezję neutrofili, wynaczynienie i rekrutację, mogą skutecznie leczyć choroby zapalne^3,4.

β2 integryny były już wcześniej celem chorób zapalnych. Efalizumab, przeciwciało monoklonalne skierowane bezpośrednio przeciwko integrynie αLβ2, zostało opracowane w leczeniu łuszczycy⁵. Jednak efalizumab został wycofany ze względu na jego śmiertelny skutek uboczny - postępującą wieloogniskową leukoencefalopatię wynikającą z reaktywacji wirusa JC^6,7. Nowe terapie przeciwzapalne oparte na integrynach powinny uwzględniać utrzymanie funkcji przeciwinfekcyjnych leukocytów w celu zminimalizowania skutków ubocznych. Skutki uboczne efalizumabu mogą wynikać z przedłużonego krążenia przeciwciał monoklonalnych w krwiobiegu, które mogą hamować funkcje immunologiczne w dłuższej perspektywie⁸. Niedawne badanie pokazuje, że efalizumab pośredniczy w sieciowaniu αLβ2 i niepożądanej internalizacji integryn α4, zapewniając alternatywne wyjaśnienie skutków ubocznych⁹. Tak więc krótkowieczni, małocząsteczkowi antagoniści mogą uniknąć tego problemu.

Przedstawiono tutaj wysokoprzepustową metodę badania małocząsteczkowych antagonistów integryny β2 przy użyciu ludzkich neutrofili. Aktywacja integryny β2 wymaga zmian konformacyjnych ektodomeny integryny, aby uzyskać dostęp do liganda i zwiększyć jego powinowactwo wiązania. W kanonicznym modelu switchblade, ektodomena wygiętej integryny najpierw rozciąga się do konformacji rozszerzonej-zamkniętej, a następnie otwiera swoją głowicę do w pełni aktywowanej konformacji rozszerzonej-otwartej^10,11,12,13. Istnieje również alternatywna ścieżka, która zaczyna się od zagiętego zamkniętego do wygiętego-otwartego i rozszerzonego-otwartego, ostatecznie^{14,15,16,17,18,19}. Przeciwciało specyficzne dla konformacji mAb24 wiąże się z epitopem w ludzkiej domenie podobnej do β2-I, gdy głowica ektodomeny jest otwarta^20,21,22,23.

Tutaj mAb24-APC służy do określenia, czy integryny β2 są aktywowane. Aby aktywować neutrofile i integrynę, N-formylometylo-leucylo-fenyloalanina (fMLP), krótki peptyd chemotaktyczny pochodzenia bakteryjnego, który może aktywować integryny β2 neutrofili²⁴, jest używany jako bodziec w tym protokole. Kiedy fMLP wiąże się z Fpr1 na neutrofilach, aktywowane są kaskady sygnałowe obejmujące białka G, fosfolipazę Cβ i γ kinazy fosfoinozytolu. Te zdarzenia sygnalizacyjne ostatecznie skutkują aktywacją integryny poprzez szlak sygnalizacyjny inside-out^18,25. Oprócz małocząsteczkowych antagonistów, którzy bezpośrednio wiążą się z integrynami β2 i zapobiegają zmianom konformacyjnym aktywacji integryny²⁶, za pomocą tej metody wykryte zostaną również związki, które mogą hamować składniki szlaku sygnalizacji aktywacji integryny β2 inside-out. Zautomatyzowane cytometry przepływowe umożliwiają wysokoprzepustowe badania przesiewowe. Identyfikacja nowych antagonistów może nie tylko pogłębić naszą wiedzę na temat fizjologii integryny, ale także zapewnić wgląd w translacyjny wgląd w terapię przeciwzapalną opartą na integrynie.

Protocol

Heparynizowane próbki krwi pełnej zostały pobrane od niezidentyfikowanych zdrowych dawców ludzkich po uzyskaniu świadomej zgody, zatwierdzonej przez Institutional Review Board of UConn Health, zgodnie z zasadami Deklaracji Helsińskiej. Uzyskano świadomą zgodę od wszystkich dawców. Kryteria włączenia/wykluczenia dla tego badania zostały starannie opracowane, aby zapewnić odpowiednią kwalifikację uczestników i zminimalizować potencjalne ryzyko. Uprawnieni uczestnicy byli w wieku od 18 do 65 lat, niezależnie od pochodzenia etnicznego, biegle posługiwali się językiem angielskim i byli zdolni do wyrażenia świadomej zgody. Wykluczeni uczestnicy obejmowali osoby, które nie były w stanie wyrazić świadomej zgody dla siebie, takie jak osoby wymagające prawnie upoważnionego przedstawiciela, osoby poniżej 18 roku życia lub powyżej 65 lat, osoby osadzone w więzieniach i kobiety w ciąży. Dodatkowo uczestnicy musieli być wolni od stosowania leków przeciwzapalnych i stanów zapalnych. Obecne infekcje lub trwające przewlekłe lub ostre stany zapalne były również kryteriami wykluczenia. Wreszcie, osoby z aktualną lub niedawną historią zakażenia COVID-19 nie kwalifikowały się do badania. Kryteria te zostały opracowane w celu zapewnienia bezpieczeństwa i przydatności uczestników przy jednoczesnej minimalizacji potencjalnych czynników zakłócających, które mogłyby mieć wpływ na wyniki badania.

1. Przygotowanie odczynników

1. Pożywka neutrofilowa: Przygotować pożywkę neutrofilową, dodając 2% albuminy surowicy ludzkiej do RPMI-1640 bez czerwieni fenolowej (patrz Tabela materiałów).
2. Roztwór fMLP: Przygotować roztwór fMLP, rozcieńczając go 100 razy z 10 mM roztworu do przechowywania dimetylosulfotlenku fMLP (DMSO) (patrz tabela materiałów) RPMI 1640 bez czerwieni fenolowej, dając roztwór fMLP o stężeniu 100 μM.
3. Roztwór przeciwciała: Rozcieńczyć 120 μl przeciwciała monoklonalnego sprzężonego z allofikocyjaniną (APC) mAb24 (mAb24-APC) (patrz tabela materiałów), które informuje o wysokim powinowactwie integryny β2, w 10 ml pożywki neutrofilowej, tworząc roztwór 1,2 μg/ml mAb24-APC.
4. Biblioteka związków: Rozcieńczyć początkową bibliotekę związków o stężeniu od 10 mM do 1 mM, dodając 5 μl biblioteki 10 mM (patrz tabela materiałów) do 45 μl DMSO w 384-dołkowych płytkach za pomocą płynu. Następnie przenieś 5 μl na studzienkę z biblioteki związków 1 mM na pustą płytkę 384-dołkową za pomocą manipulatora cieczy.
5. Jak pokazano w Rysunek 1, cztery kolumny (1, 2, 23, 24) zawierały tylko DMSO, ale nie zawierały związków, służąc jako kontrole dodatnie i ujemne w badaniu przesiewowym. Następnie rozcieńczyć każdą studzienkę, dodając 45 μl RPMI-1640 bez czerwieni fenolowej, uzyskując końcowe stężenie 100 μM dla wszystkich związków.

2. Izolacja neutrofili z ludzkiej krwi

1. Za pomocą pipety serologicznej ostrożnie ułóż 4 ml krwi na 8 ml dostępnego w handlu podłoża o gradiencie gęstości (patrz tabela materiałów) w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml (Rysunek 2A).
2. Odwirować krew przy stężeniu 550 × g przez 30-50 minut w temperaturze 20 °C. Stopniowo zwalniać wirnik (współczynnik opóźnienia 1).
   UWAGA: Pomyślne oddzielenie neutrofili (pasmo 2 w Ryc. 2B) od czerwonych krwinek może się różnić w zależności od dawcy. W przypadku większości dawców wystarczające jest 30-minutowe wirowanie. Jednak w przypadku niektórych dawców może być wymagane dodatkowe 10-30 minut wirowania, jeśli separacja się nie powiedzie (Rysunek 2C).
3. Ostrożnie usuń osocze (żółty płyn na wierzchu) i komórki jednojądrzaste (górne mętne pasmo; Pasmo PBMC w klasie Rysunek 2B) przy użyciu pipety o pojemności 1 ml.
4. Zebrać neutrofile z dolnego mętnego pasma (pasmo neutrofili w Rysunek 2B) i około 3-4 ml poniżej klarownej cieczy do 15 ml probówki wirówkowej zawierającej 10 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Delikatnie wymieszaj zawiesinę neutrofili, odwracając ją 2-3 razy.
5. Odwirować zawiesinę o stężeniu 400 × g przez 10 minut w temperaturze 20 °C, a następnie ostrożnie usunąć supernatant przez dekantację.
6. Delikatnie zawiesić osad z 5 ml PBS i odwirować go przy 300 × g przez 5 minut w temperaturze 20 °C.
7. Usunąć supernatant przez dekantację i ostrożnie usunąć wszelkie pozostałości supernatantu wokół ujścia probówki i na ściance probówki za pomocą odsysania próżniowego. Zawiesić osad w 1 ml pożywki z granulocytami obojętnochłonnymi.
8. Policz numery komórek za pomocą hemocytometru. Zazwyczaj od 1 do 4 × 10⁷ neutrofili uzyskiwano z 8 ml ludzkiej krwi.
   UWAGA: W zawiesinie neutrofili może występować zanieczyszczenie krwinkami czerwonymi. Czerwone krwinki nie wpływają znacząco na większość testów i mogą zapobiegać aktywacji/torowaniu neutrofili²⁷. Czerwone krwinki muszą zostać poddane lizie przed liczeniem, aby uzyskać dokładne stężenie neutrofili. Dodaj 10 μl zawiesiny komórkowej do 891 μl dejonizowanej wody przez 10-30 s, aby lizować czerwone krwinki, a następnie dodaj 99 μl 10× PBS, aby zrównoważyć ciśnienie osmotyczne, zapobiegając lizie neutrofili
.
9. Dostosuj gęstość komórek do 6,25 × 10⁵ komórek/ml, dodając pożywkę neutrofilową.

3. Przygotowanie płytki 384-dołkowej

1. W probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml połącz 1 ml roztworu przeciwciała (1,2 μg/ml mAb24-APC) z 0,2 ml pożywki neutrofilowej, aby uzyskać roztwór 1 μg/ml mAb24-APC. Następnie dodaj 25 μl tej mieszaniny do studzienek kontroli ujemnej na płytce 384-dołkowej (niebieskie studzienki w Rysunek 1).
2. W probówce wirówkowej o pojemności 15 ml wymieszaj 9 ml roztworu przeciwciała z 21,6 μl roztworu fMLP (100 μM) i 1,7784 ml pożywki neutrofilowej, aby uzyskać roztwór zawierający 1 μg/ml mAb24-APC i 200 nM fMLP. Następnie dodaj 25 μl tej mieszaniny do kontroli pozytywnej i studzienek testowych w płytce 384-dołkowej (czerwone i niebieskie studzienki w Rysunek 1).
3. Przenieść 5 μl 100 μM roztworów związków z płytki biblioteki związków na płytkę 384-dołkową za pomocą pipety wielokanałowej.
4. Odwirowywać ciecz przez 1 minutę w temperaturze 500 × g, w temperaturze pokojowej.
   UWAGA: Do wirowania płytek wymagany jest wirnik z odchylanym kubełkiem i wiadra z płytami.

4. Leczenie komórek

1. Dodać 20 μl zawiesiny neutrofili do każdego dołka za pomocą pipety 16-kanałowej (zakres 5-50 μl, dla każdej kolumny płytki 384-dołkowej). Delikatnie wymieszaj 5-10 razy za pomocą pipety, zachowując stały odstęp czasu między każdym pipetowaniem.
   UWAGA: Końcowe stężenia w studzienkach są następujące: neutrofile 2,5 × 10⁵ komórek/ml (wszystkie studzienki); mAb24-APC 0,5 μg/ml (wszystkie studzienki); fMLP 100 nM (kontrolne i testowe studzienki kontrolne); związki 10 μM (studzienki badawcze).
2. Inkubować płytkę na wytrząsarce z prędkością 300 obr./min, w temperaturze pokojowej (RT), przez 10 minut.
3. Utrwal komórki, dodając 3 μl 16% paraformaldehydu (PFA) do każdej studzienki za pomocą 16-kanałowej pipety (końcowe stężenie PFA ~0,91%). Następnie inkubować na lodzie przez 10 min.
   UWAGA: Zaleca się zachowanie stałego odstępu czasu między różnymi kolumnami podczas dodawania neutrofili i PFA. Gwarantuje to, że neutrofile w każdym dołku mają taki sam czas inkubacji z fMLP i mAb24-APC.

5. Cytometria przepływowa

1. Włącz cytometr przepływowy (patrz Tabela materiałów) i upewnij się, że komputer podłączony do przyrządu jest również włączony.
2. Upewnij się, że pojemnik na płyn w osłonie jest napełniony, a pojemnik na odpady jest pusty i prawidłowo podłączony do instrumentu.
3. Załadować płytkę 384-dołkową na ładowarkę próbki cytometru przepływowego. Upewnij się, że wgłębienie A1 na tabliczce jest wyrównane z oznaczeniem A1 na ładowarce.
4. Otwórz oprogramowanie i utwórz nowy eksperyment. Wybierz dobrze 384 i wybierz żądane fluorofory. Następnie kliknij Ustawienia płyty, przeciągnij, aby zaznaczyć wszystkie dołki, a następnie kliknij Próbka. Włącz przełącznik "Wysoka przepustowość" i wybierz opcję Wysoka pod panelem stawek.
   1. W polu woluminu wprowadź wartość 50. Wybierz próbki w kolumnach nieparzystych, a następnie aktywuj przełącznik "Mieszanie". Na koniec nazwij próbki w prawym panelu.
5. Kliknij na Działka i brama. Następnie kliknij przycisk Zastosuj (dwie strzałki na zielonym kółku), a następnie kliknij przycisk odtwarzania (kształt trójkąta). Poczekaj kilka sekund, aby obserwować niektóre komórki z pierwszej studni, a następnie kliknij przycisk pauzy.
   1. Dostosuj napięcia FSC i SSC, aby zapewnić prawidłową wizualizację komórek na wykresie. Kliknij Akwizycja, a następnie kliknij przycisk odtwarzania (kształt trójkąta), aby rozpocząć test.
6. Cytometr przepływowy będzie sekwencyjnie pobierał próbki ~ 50 μL 1000-3000 neutrofili z każdej studzienki. Wykonanie całej płytki 384-dołkowej zajmie około 3 godzin.
7. Po wykonaniu wszystkich przykładów wyeksportuj pliki .fcs do następnego kroku.

6. Analiza danych

1. Otwórz oprogramowanie do analizy danych cytometrii przepływowej (patrz tabela materiałów). Wybierz i przeciągnij folder zawierający wszystkie pliki .fcs do okna oprogramowania, a następnie zwolnij, aby zaimportować dane do oprogramowania.
2. Kliknij dwukrotnie na jedną próbkę, bramkują pojedyncze neutrofile w oparciu o FSC i SSC^28,29,30 w wyskakującym okienku, jak pokazano w Rysunek 3. Zaznacz wiersze bramkowane i przeciągnij je do folderu, a następnie zwolnij przycisk, aby zastosować bramkowanie do wszystkich próbek w tym folderze.
3. Oblicz i wyeksportuj medianę intensywności fluorescencji (MFI) granulocytów obojętnochłonnych APC z każdego dołka, korzystając z funkcji edytora tabel w oprogramowaniu. Kliknij Dodaj kolumnę na karcie Edytuj. Wybierz opcję Mediana na karcie Statystyka, wybierz bramkowaną populację neutrofili i wybierz APC jako parametr. Kliknij przycisk OK.
4. Wróć do zakładki "Edytor tabel", wybierz Wszystkie próbki w zakładce "Grupa" i naciśnij przycisk Utwórz tabelę. Pojawi się nowe okno wyświetlające utworzoną tabelę. Zapisz go jako plik tekstowy, CSV lub Excel.
5. Otwórz wyeksportowaną tabelę, oblicz średnią wartość i odchylenie standardowe APC MFI dla dodatnich i ujemnych próbek kontrolnych (Rysunek 4).
6. Oblicz współczynnik Z' (Z') tabliczki za pomocą równania:
   Z' = 1 - 3(σ_p + σ_n)/(μ_p - μ_n),
   gdzie σ_p i σ_n są odchyleniami standardowymi odpowiednio kontroli dodatniej i ujemnej, a μ_p i μ_n są średnimi odpowiednio kontroli dodatnich i ujemnych31.
   UWAGA: Współczynnik Z' wskazuje rozdzielenie rozkładu kontroli dodatniej i ujemnej. Z' równe 0 oznacza brak separacji, podczas gdy Z' równe 0,5 oznacza równą separację. Jak wspomniano w poprzednim badaniu³¹, Z' > 0,5 wskazuje na doskonały test do badań przesiewowych związków. Z' w zakresie od 0,5 do 0 jest dopuszczalne, ale może identyfikować tylko silne trafienia w teście, co będzie wymagało dalszej walidacji w testach wtórnych.
7. Związki należy traktować jako "trafienia" do badań przesiewowych, gdy wartość APC MFI neutrofili poddanych działaniu związków jest mniejsza niż trzykrotność odchylenia standardowego MFI kontroli dodatniej odjętej od MFI kontroli dodatniej (P = 0,0013, reprezentowana przez przerywaną linię w Rysunek 4).

Results

Dane z reprezentatywnego badania przesiewowego płytki 384-dołkowej (Rysunek 4) ujawniły, że kontrole negatywne miały MFI mAb24-APC wynoszące 3236 ± 110, podczas gdy kontrole pozytywne miały MFI mAb24-APC wynoszące 7588 ± 858. Współczynnik Z' dla tej płytki wynosi około 0,33, co mieści się w dopuszczalnym zakresie³¹. Jednak Z' wymaga dalszej walidacji w testach wtórnych.

Aby znormalizować dane, wszystkie wartości zostały przeskalowane tak, aby przypisać maksymalną wartość 1 do średniej dodatniej i minimalną wartość 0 do średniej ujemnej. Czynnik Z' zostanie poddany bardziej rygorystycznej walidacji w testach wtórnych. Wartość odcięcia dla tej płytki jest ustalona na 0,41, co oznacza, że próbki o względnym MFI niższym niż 0,41 będą uważane za trafienia hamujące indukowaną przez fMLP aktywację integryny β2 w ludzkich neutrofilach. Nie zidentyfikowano żadnych trafień z tej tablicy.

Aby potwierdzić skuteczność protokołu, użyto Nexinhib20, który hamuje aktywację integryny β2 poprzez antagonizację funkcji Rac-1, oraz lifitegrast, który bezpośrednio antagonizuje integrynę αLβ2^32,33. Czas inkubacji dostosowano jednak do jednej godziny w przypadku Nexinhib20 i pół godziny w przypadku lifitegrastu. Dane wynikowe z tych eksperymentów zostały znormalizowane przy użyciu tej samej metody skalowania, która została opisana powyżej. Te punkty danych zostały następnie połączone z wynikami płytki i przeanalizowane zbiorczo (Rysunek 4).

Rysunek 1: Układ płyt do przesiewania złożonego. Schematyczny schemat ilustrujący rozmieszczenie związków przesiewowych i kontroli na płytce 384-dołkowej. Studzienki kontroli ujemnej są oznaczone kolorem niebieskim (kolumny 1 i 23), a studzienki kontroli dodatniej są oznaczone kolorem czerwonym (kolumny 2 i 24). Studnie testowe są przedstawione w kolorze beżowym (kolumny od 3 do 22). Strzałki wskazują kolejność odczytywania tabliczki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Separacja neutrofili za pomocą podłoża o gradiencie gęstości. Reprezentatywne zdjęcia pokazujące udane i nieudane rozdzielanie neutrofili za pomocą ośrodka o gradiencie gęstości. (A) Początkowo 4 ml krwi nakłada się warstwami na 8 ml pożywki o gradiencie gęstości. (B) Po odwirowaniu powinny być widoczne dwa mętne prążki: górne pasmo zawierające głównie jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC) i dolne pasmo zawierające głównie neutrofile z niektórymi krwinkami czerwonymi (RBC). Większość erytrocytów jest granulowana na dnie. (C) Nieudane rozdzielanie, w którym erytrocyty nie są granulowane i nie obserwuje się pasma neutrofili. Dodatkowe odwirowanie (10-30 min) byłoby wymagane do oddzielenia pasma neutrofili. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Bramkowanie neutrofili za pomocą wykresów FSC/SSC. Wykresy reprezentatywnego rozproszenia do przodu (FSC) i rozrzutu bocznego (SSC) ilustrujące strategię bramkowania w celu identyfikacji neutrofili. (A) Neutrofile są bramkowane na podstawie obszaru rozpraszania do przodu (FSC-A) i rozpraszania bocznego (SSC-A) zarejestrowanych przez cytometr przepływowy. (B) Pojedyncze komórki są dalej bramkowane na podstawie szerokości (FSC-W) i wysokości (FSC-H) rozproszenia do przodu oraz (C) szerokości (SSC-W) i wysokości (SSC-H) rozproszenia bocznego. Skala kolorów reprezentuje gęstość komórek, przechodząc od czerwonego do żółtego, zielonego i niebieskiego wraz ze zmniejszaniem się gęstości. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Wyniki badań przesiewowych na reprezentatywnej płytce 384-dołkowej. Wyniki badań przesiewowych pochodzą z reprezentatywnej płytki 384-dołkowej, wykazując współczynnik Z' równy 0,3. Kontrole ujemne i dodatnie są oznaczone odpowiednio niebieskimi i czerwonymi kropkami. Próbki testowe poddane działaniu różnych związków są reprezentowane jako beżowe kropki. Linia przerywana reprezentuje średnią granicę intensywności fluorescencji (MFI) służącą do identyfikacji trafień. Żaden z badanych związków nie został zidentyfikowany jako antagoniści integryny β2, ponieważ wszystkie badane związki wykazywały wartości MFI powyżej linii odcięcia. Wyniki niezależnych eksperymentów testujących znanych antagonistów integryny β2 o różnym czasie inkubacji (Nexinhib20 przez 1 godzinę, lifitegrast przez pół godziny) zebrano w celu przedstawienia na tym rysunku. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

Inicjacja i zakończenie stymulacji i barwienia neutrofili jest determinowane przez dodanie neutrofili i utrwalacza PFA. Dlatego tak ważne jest zapewnienie takiego samego odstępu czasu między pipetowaniem neutrofili lub PFA do każdej kolumny. Gwarantuje to, że czas stymulacji i barwienia neutrofili z każdej studzienki pozostaje stały. Ze względu na krótką żywotność neutrofili cały eksperyment, od pobrania krwi od dawców do zakończenia cytometrii przepływowej, musi zostać przeprowadzony tego samego dnia. Neutrofile są bardzo wrażliwe na zmiany temperatury i mogą ulec aktywacji pod wpływem gwałtownych wzrostów temperatury, takich jak przejście z 4 °C do temperatury pokojowej lub z temperatury pokojowej do 37 °C. Dodatkowo, w oparciu o nasze wcześniejsze doświadczenia, indukowana przez fMLP aktywacja integryny neutrofili β2 nie zachodzi, gdy komórki są przechowywane na lodzie lub w temperaturze 4 °C (dane nie pokazane). Dlatego przed utrwaleniem krew pełną i neutrofile należy przechowywać w temperaturze pokojowej lub 20 °C (podczas etapu wirowania izolacyjnego). Nie umieszczaj krwi pełnej i neutrofili na lodzie.

Barwienie mAb24 w kontrolach ujemnych powinno dać bardzo niskie wyniki. Jeśli w eksperymencie zaobserwuje się wysoki poziom barwienia mAb24, należy sprawdzić, co następuje: (1) czy podczas eksperymentu przed utrwaleniem nastąpiła znacząca zmiana temperatury; (2) czy w pożywce neutrofilowej doszło do zanieczyszczenia fMLP lub endotoksynami; (3) czy obchodzenie się z próbką było zbyt agresywne, np. wytwarzanie pęcherzyków podczas pipetowania i mieszania.

Obecny protokół wykorzystuje mAb24 do zgłaszania otwarcia głowicy integryny β2. Teoretycznie KIM127, przeciwciało monoklonalne informujące o rozszerzeniu integryn β2^34,35, może być stosowane w połączeniu z mAb24 do kompleksowej oceny konformacji integryny β2. Jednak stosunek sygnału do szumu barwienia KIM127 (1,5 do 2 razy) nie jest tak korzystny jak w przypadku mAb24 (od 5 do 10 razy), co zwykle nie zapewnia zadowalającego współczynnika Z' w teście płytkowym 384-dołkowym. W teście na 96-dołkowej płytce próbki można umyć przed wykonaniem cytometrii przepływowej, redukując rozpuszczalne sygnały tła pochodzące od przeciwciał. Dlatego test oparty na KIM127 można przeprowadzić w teście na płytce 96-dołkowej, która ma niższą przepustowość w porównaniu z testem na płytce 384-dołkowej.

Ponieważ metoda ta wykorzystuje intensywność fluorescencji jako odczyt do oceny hamującego działanie leków na integryny, niektóre leki fluorescencyjne mogą zakłócać wyniki. Dodatkowo, toksyczne leki, które indukują śmierć neutrofili w ciągu 10-minutowego okresu stymulacji, również wydają się zgłaszać hamowanie integryny. Leki, które hamują degranulację neutrofili, hamują ogólną ekspresję integryny β2. Te inhibitory degranulacji zostaną również zidentyfikowane w naszych badaniach przesiewowych. W związku z tym konieczne jest wtórne badanie przesiewowe z innymi kontrolami, aby potwierdzić hamujące działanie trafień. Ekrany wtórne są przywoływane jako środek zarówno do walidacji, jak i określenia mechanizmu działania trafień. Oprócz powtórzenia testów mAb24, całkowita ekspresja CD18 na powierzchni komórki zostanie oceniona przy użyciu przeciwciała anty-ludzkiego CD18. Poziom aktywowanej integryny β2, mierzony za pomocą mAb24, zostanie znormalizowany przez całkowitą ekspresję CD18. Umożliwi nam to ustalenie, czy mechanizm działania czynnika polega na antagonizowaniu aktywacji integryny i/lub hamowaniu ekspresji CD18 na powierzchni komórki. Należy również przeprowadzić test żywotności na wtórnym sicie, aby wykluczyć wszelkie toksyczne skutki trafień.

Ten protokół ma ograniczenia. Po pierwsze, mAb24 jest w stanie wykryć domenę podobną do β2 I tylko w przypadkach, gdy integryna jest w stanie wysokiego powinowactwa. W związku z tym nie może zidentyfikować α/β podobnych do I-podobnych antagonistów allosterycznych, takich jak lifitegrast, poprzez zmniejszenie wiązania mAb24. Lifitegrast indukuje więcej wiązania mAb24³² i wykazuje nienormalnie zwiększoną wartość MFI z mAb24 (ryc. 4). W przypadku takich nieprawidłowych wartości mogą być potrzebne inne testy, aby sprawdzić, czy te trafienia są α/β podobnymi do I-podobnych antagonistów allosterycznych, takich jak lifitegrast. Po drugie, współczynnik Z' dla tego testu jest nieoptymalny i potencjalnie można go poprawić dzięki zastosowaniu automatycznego pipetowania i mieszania. Niestety, nasze laboratorium nie dysponuje niezbędną aparaturą do przetestowania tej hipotezy. Powielanie lub trzykrotne testowanie będzie pomocne w identyfikacji wyników fałszywie dodatnich i ujemnych w przypadku, gdy czynnika Z' nie można dalej poprawić za pomocą powyższych metod. Ponadto korzystne może być wydłużenie czasu inkubacji w celu zidentyfikowania większej liczby trafień, jak zaobserwowano w przypadku znanego inhibitora aktywacji integryny β2 Nexinhib20, który wymaga godziny inkubacji, aby wywołać efekty hamujące. Badanie to koncentrowało się na identyfikacji szybko działających środków. Naukowcy powinni pamiętać, że mogą modyfikować czas inkubacji, aby dostosować go do swoich konkretnych potrzeb.

Według naszej wiedzy jest to pierwsza wysokoprzepustowa metoda przesiewowa w kierunku antagonistów integryny β2. Podejście to może być wykorzystane do identyfikacji związków małocząsteczkowych, które bezpośrednio wiążą się z integrynami β2 i zapobiegają zmianom konformacyjnym prowadzącym do stanów integryny o pośrednim/wysokim powinowactwie, podobnie jak antagoniści bez właściwości "agonistycznych" opisanych niedawno dla integryn αIIbβ3 i α4β1²⁶. Neutrofile mają kluczowe znaczenie w wielu chorobach zapalnych, takich jak uszkodzenie niedokrwienno-reperfuzyjne mięśnia sercowego³⁶, posocznica³⁷ i choroby autoimmunologiczne^38,39. Leki małocząsteczkowe mogą oferować większą elastyczność w leczeniu tych chorób w porównaniu z lekami opartymi na przeciwciałach. Trafienia z naszego ekranu mogą dostarczyć potencjalnych metod leczenia chorób zapalnych.

Obecna metoda to wysokoprzepustowe badanie przesiewowe oparte na przeciwciałach fluorescencyjnych. Ponieważ przeciwciała reporterowe aktywacji są również dostępne dla β1 40,41,42,43,44, αIIbβ3 ^45,46 i integryn αL 47,48,49,50, metodę tę można rozszerzyć o identyfikację antagonistów dla innych integryn. Konformacyjnie wrażliwe przeciwciało, takie jak HUTS-21, które wiąże się z domeną hybrydową β1 51,52,53, zostało użyte w wysokoprzepustowym badaniu przesiewowym w celu identyfikacji bardzo późnych antagonistów allosterycznych antygenu-4 (VLA-4, integryna α4β1) ⁵⁴. Obecna metoda badań przesiewowych może być również modyfikowana i rozszerzana w celu znalezienia leków, które hamują lub promują ekspresję innych receptorów powierzchniowych, takich jak związki zwiększające ekspresję powierzchniową transbłonowego regulatora przewodnictwa mukowiscydozy (CFTR) na komórkach mukowiscydozy (CF). W mukowiscydozie wielokrotne mutacje prowadzą do nieprawidłowego fałdowania CFTR, co skutkuje brakiem ekspresji CFTR na błonie komórkowej⁵⁵. Wykazano, że leki małocząsteczkowe przywracają ekspresję CFTR⁵⁶. W celu modyfikacji protokołu konieczne jest wydłużenie czasu inkubacji leków do kilku godzin, aby umożliwić zajście zmian w ekspresji białek.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pipety 16-kanałowe	Thermo	4661090N
Instrument 384-dołkowa płytka	Greiner	784201	Materiały
APC anty-ludzkie CD11a/CD18 (LFA-1) Klon przeciwciała: m24	BioLegend	363410	Odczynniki
Bravo  Zautomatyzowana platforma do obsługi cieczy	Agilent	16050-102	384 wielokanałowa wirówka do obsługi cieczy
	Eppendorf	Model 5810R	Przepływ przyrządu
Jo	Becton, Dickinson & Firma	NA	Software
Roztwór albuminy ludzkiej surowicy (25%)	Odczynniki GeminiBio	800-120
Lifitegrast	Thermofisher	50-208-2121	Odczynniki
Nexinhib20	Tocris	6089	Odczynniki
N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP)	Sigma	F3506	Odczynniki
Paraformaldehyd 16% roztwór	Mikroskopia elektronowa Sciences	15710	Odczynniki
Wiadra płytkowe	Eppendorf	UL155	Akcesorium
Wytrząsarka do płytek	Fisher	88-861-023	Instrument
PolymorphPrep	PROGEN	1895 (poprzedni 1114683)
Odczynniki Biblioteka chemiczna Prestwick Płytki złożone (10 mM)	Biblioteki chemiczne Prestwick	Ver19_384	1520 małych cząsteczek, 98% zatwierdzonych do obrotu leków (zatwierdzone przez FDA, EMA, JAN i inne agencje)
RPMI 1640 Medium, bez czerwieni fenolowej	Odczynniki Gibco	11-835-030
Wirnik czerpako-huśtawkowy	Analizator komórek Eppendorf	A-4-62	Rotor
ZE5	Instrument Bio-Rad Laboratories	Model ZE5