Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Powinowactwo komórkowe emulsji stabilizowanej cząstkami w celu zwiększenia internalizacji antygenu

2.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64406

⸱

2 września 2022

 ,  ,  ,  , 
1Graduate School of Bio-Applications and Systems Engineering, Tokyo University of Agriculture and Technology, 2Institute of Global Innovation Research, Tokyo University of Agriculture and Technology, 3State Key Laboratory of Biochemical Engineering, Institute of Process Engineering, Chinese Academy of Sciences, 4University of Chinese Academy of Sciences

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Aby racjonalnie zaprojektować skuteczne adiuwanty, opracowaliśmy emulsję Pickeringa stabilizowaną nanocząstkami kwasu poli-mlekowo-glikolowego (PNPE). PNPE posiadał wyjątkową miękkość i hydrofobowy interfejs zapewniający silny kontakt komórkowy i oferował ładowanie antygenem o wysokiej zawartości, poprawiając powinowactwo komórkowe systemu dostarczania do komórek prezentujących antygen i indukując wydajną internalizację antygenów.

Streszczenie

Powinowactwo komórkowe mikro-/nanocząsteczek jest warunkiem wstępnym rozpoznawania komórek, pobierania i aktywacji komórek, które są niezbędne do dostarczania leków i odpowiedzi immunologicznej. Niniejsze badanie wywodzi się z obserwacji, że wpływ ładunku, wielkości i kształtu cząstek stałych na powinowactwo komórek jest zwykle brany pod uwagę, ale rzadko zdajemy sobie sprawę z istotnej roli miękkości, dynamicznego zjawiska restrukturyzacji i złożonej interakcji interfejsu w powinowactwie komórkowym. W tym miejscu opracowaliśmy emulsję Pickeringa (PNPE) stabilizowaną nanocząstkami kwasu polimlekowo-ko-glikolowego (PLGA), która przezwyciężyła wady sztywnych form i symulowała elastyczność i płynność patogenów. Stworzono metodę w celu zbadania powinowactwa PNPE do powierzchni komórek i opracowania szczegółowych informacji na temat późniejszej internalizacji przez komórki odpornościowe. Powinowactwo PNPE do biomimetycznych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (bEVs) - zamiennika komórek dendrytycznych szpiku kostnego (BMDC) - określono za pomocą mikrowagi kwarcowej z monitorowaniem dyssypacji (QCM-D), która umożliwiła monitorowanie adhezji emulsji komórkowej w czasie rzeczywistym. Następnie do dostarczenia antygenu (albuminy jaja kurzego, OVA) wykorzystano PNPE, a wychwyt antygenów przez BMDC obserwowano za pomocą konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego (CLSM). Reprezentatywne wyniki wykazały, że PNPE natychmiast zmniejszył częstość (ΔF) w momencie napotkania bEVs, co wskazuje na szybką adhezję i wysokie powinowactwo PNPE do BMDC. PNPE wykazywał znacznie silniejsze wiązanie z błoną komórkową niż mikrocząstki PLGA (PMP) i adiuwant AddaVax (oznaczany jako nanoemulsja stabilizowana środkami powierzchniowo czynnymi [SSE]). Ponadto, ze względu na zwiększone powinowactwo komórkowe do immunocytów poprzez dynamiczne zmiany krzywizny i dyfuzje boczne, wychwyt antygenu został następnie zwiększony w porównaniu z PMP i SSE. Protokół ten dostarcza informacji na temat projektowania nowatorskich preparatów o wysokim powinowactwie komórkowym i wydajnej internalizacji antygenu, zapewniając platformę do opracowywania skutecznych szczepionek.

Wprowadzenie

Aby zwalczać choroby epidemiczne, przewlekłe i zakaźne, konieczne jest opracowanie skutecznych adiuwantów do szczepień profilaktycznych i terapeutycznych1,2. Idealnie byłoby, gdyby adiuwanty charakteryzowały się doskonałym bezpieczeństwem i aktywacją immunologiczną3,4,5. Uważa się, że efektywny wychwyt i proces antygenów przez komórki prezentujące antygen (APC) jest kluczowym etapem w dalszych kaskadach sygnalizacyjnych i inicjacji odpowiedzi immunologicznej6,7,8. W związku z tym uzyskanie jasnego zrozumienia mechanizmu interakcji komórek odpornościowych z antygenami i projektowanie adiuwantów w celu zwiększenia internalizacji to skuteczne strategie zwiększania skuteczności szczepionek.

Mikrocząsteczki o unikalnych właściwościach były wcześniej badane jako systemy dostarczania antygenów pośredniczące w komórkowym pobieraniu antygenów i interakcji komórkowej z wzorcami molekularnymi związanymi z patogenami9,10. Po kontakcie z komórkami systemy dostarczania zaczynają wchodzić w interakcje z macierzą zewnątrzkomórkową i błoną komórkową, co prowadzi do internalizacji i późniejszych odpowiedzi komórkowych11,12. Wcześniejsze badania ujawniły, że internalizacja cząstek odbywa się poprzez adhezję błony komórkowej i cząstek13, po której następuje elastyczna deformacja błony komórkowej i dyfuzja receptora do błony powierzchniowej14,15. W tych okolicznościach właściwości systemu dostarczania zależą od powinowactwa do APC, które z kolei wpływają na ilość wychwytu16,17.

Aby uzyskać wgląd w projekt systemu dostarczania dla poprawy odpowiedzi immunologicznej, szeroko zakrojone wysiłki skupiły się na badaniu związku między właściwościami cząsteczek a wychwytem komórkowym. Obecne badanie wynika z obserwacji, że stałe mikro-/nanocząstki o różnych ładunkach, rozmiarach i kształtach są często badane w tym świetle, podczas gdy rola płynności w internalizacji antygenu jest rzadko badana18,19. W rzeczywistości podczas adhezji miękkie cząstki wykazywały dynamiczne zmiany krzywizny i dyfuzje boczne w celu zwiększenia powierzchni kontaktu dla oddziaływań wielowartościowych, które z trudem mogą być powtórzone przez cząstki stałe20,21. Ponadto błony komórkowe są dwuwarstwami fosfolipidowymi (sfingolipidami lub cholesterolem) w miejscu wychwytu, a substancje hydrofobowe mogą zmieniać entropię konformacyjną lipidów, zmniejszając ilość energii potrzebnej do wychwytu komórkowego22,23. Tak więc zwiększenie mobilności i promowanie hydrofobowości systemu dostarczania może być skuteczną strategią wzmacniania internalizacji antygenu w celu wzmocnienia odpowiedzi immunologicznej.

emulsja Pickeringa, stabilizowana przez cząstki stałe zgromadzone na granicy dwóch niemieszających się cieczy, była szeroko stosowana w dziedzinie biologii24,25. W rzeczywistości cząsteczki agregujące na granicy faz olej/woda determinują tworzenie wielopoziomowych struktur, które promują wielopoziomowe interakcje system-komórka systemu dostarczania i dalej indukują wielofunkcyjne właściwości fizykochemiczne w dostarczaniu leków. Ze względu na ich odkształcalność i ruchliwość boczną, oczekiwano, że emulsje Pickeringa wejdą w wielowartościową interakcję komórkową z immunocytami i zostaną rozpoznane przez białka błonowe26. Ponadto, ponieważ oleiste rdzenie miceli w emulsjach Pickeringa nie są całkowicie pokryte cząstkami stałymi, emulsje Pickeringa mają przerwy o różnych rozmiarach między cząstkami na granicy faz olej/woda, co powoduje wyższą hydrofobowość. Dlatego tak ważne jest zbadanie powinowactwa emulsji Pickeringa do APC i opracowanie późniejszej internalizacji w celu opracowania skutecznych adiuwantów.

Na podstawie tych rozważań, zaprojektowaliśmy stabilizowaną nanocząstkami emulsję Pickeringa (PNPE) jako system dostarczania szczepionki płynnościowej, który również pomógł uzyskać cenne informacje na temat powinowactwa PNPE do BMDC i internalizacji komórkowej. Adhezja biomimetycznych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (bEVs; zamiennik BMDC) do PNPE w czasie rzeczywistym monitorowano metodą bezznacznikową przy użyciu mikrowagi kwarcowej z monitorowaniem dyssypacji (QCM-D). Po scharakteryzowaniu powinowactwa PNPE do BMDC, zastosowano konfokalną laserową mikroskopię skaningową (CLSM) w celu określenia wychwytu antygenu. Wynik wskazał na większe powinowactwo PNPE do BMDC i efektywną internalizację antygenu. Spodziewaliśmy się, że PNPE będzie wykazywać większe powinowactwo do APC, które mogą lepiej stymulować internalizację antygenów w celu wzmocnienia odpowiedzi immunologicznej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie metody opisane w niniejszym protokole zostały zatwierdzone przez Instytut Inżynierii Procesowej Chińskiej Akademii Nauk. Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone w ścisłej zgodności z przepisami dotyczącymi opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych oraz wytycznymi dotyczącymi etycznej oceny badań na zwierzętach (Chiny, GB/T35892-2018).

1. Przygotowanie i charakterystyka nanocząsteczek PLGA

  1. Przygotowanie nanocząstek PLGA (PNPs)
    1. Dodać 0,5 g alkoholu poliwinylowego (PVA) do 120 mL wody dejonizowanej w temperaturze 90 °C i mieszać do całkowitego rozpuszczenia, aby przygotować roztwór PVA. Przechowywać roztwór w lodówce (4 °C) po schłodzeniu do temperatury pokojowej.
    2. Dodać 100 mg PLGA do 10 mL mieszaniny acetonu i etanolu (w stosunku 4:1), która będzie służyć jako faza olejowa.
    3. Umieścić 20 mL wodnego roztworu PVA pod wyciągiem i mieszać magnetycznie z prędkością 400 rpm/min. Dodać 5 mL fazy olejowej do roztworu PVA kropla po kropli, używając pompy strzykawkowej. Następnie mieszać mieszaninę w wyciągu, aż rozpuszczalniki organiczne całkowicie odparują.
      UWAGA: Wraz ze wzrostem stężenia cząstek w fazie olejowej, roztwór fazy wodnej stopniowo zmienia się w klarowny i przezroczysty, jasnobłękitno-biały lub mleczno-biały.
    4. Po odparowaniu rozpuszczalników organicznych (2-3 h), odwirować mieszaninę przy 15,000 x g. Przemywać trzy lub więcej razy, aż woda z ostatniego płukania będzie klarowna i przezroczysta.
      ​UWAGA: Celem tego kroku jest przede wszystkim usunięcie resztek PVA z powierzchni cząstek, aby zapobiec ich wpływowi na przygotowanie emulsji Pickeringa.
    5. Resuspendować wypłukane PNPs w 2 mL wody dejonizowanej i zamrozić mieszaninę w temperaturze -80 °C przez 24 h. Następnie liofilizować cząstki w liofilizatorze przez 48-72 h. Przygotowane PNPs mają postać białego kłaczkowatego osadu.
  2. Charakterystyka PNPs
    1. W celu określenia wielkości i potencjału zeta PNPs, dodać 10 µL PNPs do 1 mL wody dejonizowanej, aby uzyskać roztwór rozcieńczony, a następnie przenieść go do kuwety DTS1070. Włączyć komputer oraz analizator dynamicznego rozpraszania światła (DLS), a następnie umieścić kuwetę DTS1070 w systemie DLS.
    2. Kliknąć w program Zeta Size Software i utworzyć nowy plik pomiarowy, aby ustawić procedurę oznaczenia. Następnie Uruchomić (Start) procedurę oznaczenia, aby uzyskać rozkład wielkości cząstek i potencjału zeta.
    3. Aby zaobserwować morfologię PNPs, równomiernie rozprowadzić 0,1 mL roztworu PNPs (rozcieńczonego 40-krotnie) na arkuszu folii cynowej o wymiarach 5 cm x 5 cm i pozwolić wodzie odparować naturalnie w dobrze wentylowanym wyciągu przez noc.
    4. Wyciąć niewielką część folii cynowej i przymocować ją do stolika z próbkami za pomocą taśmy przewodzącej. Napylić złoto przy prądzie 10 mA przez 120 s. Następnie zaobserwować morfologię powierzchni próbki przy użyciu skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM).

2. Przygotowanie i charakterystyka PNPE

  1. Aby przygotować PNPE, należy dodać liofilizowane PNPs do wody dejonizowanej w stężeniu 4 mg/ml (faza wodna), a następnie dodać skwalen jako fazę olejową. Przygotować PNPE. poprzez jednotapowa sonikacja przez 5 min przy mocy 100 W w myjce ultradźwiękowej z kąpielą wodną. Stosunek fazy olejowej do wodnej wynosi 1:9.
  2. Charakterystyka przygotowanego PNPE
    1. Otwórz Mastersizer 2000 oprogramowanie i laser w odpowiedniej kolejności. Kliknij w Pomiar aby otworzyć zaprogramowany wcześniej program i wprowadzić nazwę próbki. Kliknij w Start aby rozpocząć pomiar tła próbki, a następnie, używając zakraplacza, dodać 1 ml PNPE do komory pomiarowej laserowego analizatora wielkości cząstek, aby trzykrotnie równolegle zmierzyć wielkość cząstek emulsji.
    2. Rozcieńczać 20 µL PNPE w 1 ml wody dejonizowanej. Kroplowo 20 µL emulsji na szkiełku. Za pomocą mikroskopii optycznej przy powiększeniu 40x należy ocenić morfologię i homogeniczność emulsji oraz wykonać dokumentację fotograficzną.
  3. Wydajność ładowania antygenu
    1. Rozpuścić 200 µg owalbuminy (OVA) w 500 ml wody dejonizowanej. Następnie zmieszać ją z 500 ml przygotowanego PNPE i mieszać przez 1 h w temperaturze pokojowej. Osad antygenowy oddzielić w drodze wirowania przy 5000 x g przez 20 min.
    2. Oznaczanie stężeń antygenów w cieczy za pomocą testów z kwasem bicinchoninowym (BCA)27Wzór na obliczenie wydajności załadunku antygenu jest następujący:
      Wydajność ładowania antygenu = Wzór na ilościowe oznaczenie antygenu, obliczanie procentowej zawartości wolnego antygenu w analizie immunoassay.
      Tę samą metodę należy zastosować w celu określenia wydajności załadunku antygenu w SSE wykorzystywanym jako grupa kontrolna.
  4. Stabilność PNPE
    1. Podziel 6 ml przygotowanego PNPE na sześć równych części i przechowuj po trzy części w temperaturze 4 °C i 25 °Codpowiednio. Rozcieńczyć 20 µL przechowywanego PNPE do 1 ml wody dejonizowanej (1:50) w dniu 0, 3 i 6. Następnie należy zmierzyć rozmiar oraz potencjał zeta roztworów zapasowych PNPE przechowywanych w różnych temperaturach.
      UWAGA: Różne temperatury przechowywania zostały dobrane w celu porównania wpływu temperatury na stabilność PNPE, co pozwala na zoptymalizowanie warunków przechowywania w celu zapewnienia wysokiej stabilności i długiego okresu przydatności do użycia.
  5. Przygotowanie mikrocząstek PLGA (PMPs)
    1. Rozpuścić 500 mg PLGA w 5 ml dichlorometanu, tworząc fazę olejową, a następnie wlać do 50 ml zewnętrznej fazy wodnej zawierającej 1,5% PVA, aby otrzymać mieszaninę olej/woda. Homogenizować mieszaninę przy 3000 obr./min przez 1 min przy użyciu homogenizatora w celu uzyskania emulsji gruboziarnistych.
    2. Zapewnienie jednorodności rozmiaru cząstek mikrosfer PLGA (wyznaczanego przez grube emulsje) za pomocą emulsyfikacji membranowej. Zainstaluj 5.2 µm membranę w rurce membranowej. Ustawić ciśnienie na 800 kPa i utrzymać je na stałym poziomie.
    3. Otwórz zawór wylotowy oraz zawór zasilający, a po dodaniu grubych emulsji do zbiornika z próbką zamknij zawór wylotowy i zawór zasilający, otwórz zawór spustowy oraz zawór wlotowy i pobierz emulsję poformowanie do zlewki o pojemności 200 ml. Powtórz ten proces trzykrotnie, aby uzyskać wstępne emulsje podwójne.
    4. Mieszaj pre-podwójne emulsje, aby odparować dichlorometan w temperaturze pokojowej w celu utwardzenia mikrosfer. Przemyj mikrosfery wodą dejonizowaną przy 7741 x g przez 3 minuty pięć razy. Wstępne zamrażanie w zamrażarce w temperaturze -80 °C i na koniec poddać liofilizacji w celu uzyskania suszonych mikrosfer.
  6. Charakterystyka PMP
    1. Otwórz Mastersizer 2000 oprogramowanie, a następnie laser. Kliknij w Pomiar aby otworzyć zdefiniowany program i ustawić nazwę próbki. Kliknij w Start następnie należy rozpocząć pomiar tła próbki. Potem, za pomocą pipety zakraplającej, dodać 1 ml PMP do zbiornika na próbki analizatora laserowego wielkości cząstek i trzykrotnie pomiar równolegle wielkość mikrocząstek.
  7. Analiza miękkości
    UWAGA: PNPE zostało naniesione na SiO22 czujnik do pomiaru miękkości.
    1. Wyczyść SiO22 płytkę czujnika kwarcowego poddać działaniu ozonu UV przez 10 min, dwukrotnie przepłukać 5 ml etanolu (75% v/v) i osuszyć strumieniem N22Zainstaluj pusty SiO2 chip kwarcowego czujnika do celi przepływowej.
    2. Włącz komputer i aktywuj kontrolę temperatury w prawym dolnym rogu oprogramowania, aby upewnić się, że temperatura zadana wynosi około 1 °C poniżej temperatury pokojowej.
    3. Kliknij w Pozyskiwanie danych przycisk na pasku narzędzi i wybierz Konfiguracja pomiaru aby wyszukać 1., 3., 5., 7., 9. i 11. harmoniczną oktawę chipa w używanym kanale. Kliknij w Pozyskiwanie danych przycisk na pasku narzędzi i wybierz Rozpocznij pomiar.
    4. Skoryguj linię bazową za pomocą powietrza, a gdy linia bazowa zostanie wyrównana, wybierz Stop i zapisz plik jako próbkę ślepą.
    5. Oczyść chip i wykonaj powlekanie wirowaniem 10 µg/mL PNPE na chipie. W skrócie: włącz urządzenie do powlekania wirowego (spin coater) i ustaw parametry pracy. Podłącz N2 podłącz rurkę do spin coatera, ustaw przepływ z butli gazowej na 0,4 kPa i umieść czysty chip na przyssawce spin coatera. Dodaj 100 µL PNPE kroplami do centrum SiO2 czujnik i zamknij górną pokrywę urządzenia do nanoszenia warstw metodą spin coatingu, aby zakończyć proces powlekania.
    6. Zainstaluj chip powlekany PNPE w celi przepływowej. Powtórz kroki 2.7.3–2.7.4 i zapisz plik jako PNPE. Otwórz oba pliki (blank oraz PNPE) i kliknij przycisk Stitch, aby uzyskać powiązane dane dotyczące dyssypacji (ΔD).

3. Izolacja i hodowla BMDC 28

UWAGA: Należy upewnić się, że wszystkie odczynniki i próbki znajdują się w lodzie, ponieważ ma to pozytywny wpływ na aktywność komórek. Aby zachować sterylność, wszystkie kroki należy przeprowadzić w komorze z laminarnym przepływem powietrza, używając sterylnych narzędzi.

  1. Uśmierć myszy C57BL/6 (samice, w wieku 6–8 tygodni) poprzez Tlenek węgla (II)2 poddać inhalacji, a następnie namoczyć w 70% (v/v) etanolu w celu krótkiej sterylizacji.
  2. Po namaczaniu przez 3–5 min przenieś myszy do komory z laminarnym przepływem powietrza. Usuń mięśnie kończyn za pomocą nożyczek ze stali nierdzewnej, aby odsłonić kość udową i piszczelową, a następnie rozdziel obie kości.
  3. Napełnij szalkę Petriego 70% (v/v) etanolem i zanurz w nim czyste kości na 5–10 s, aby przeprowadzić sterylizację zewnętrzną. Oczyść wszystkie kości i umieść je w sterylnej probówce w lodzie.
  4. Przytnąć kość udową i piszczelową blisko stawu za pomocą nożyczek. Wprowadzić igłę strzykawki do kości, aby wypłukać szpik kostny do probówki do wirowania, używając schłodzonego wcześniej medium RPMI (1640).
  5. Płukać dwa lub trzy razy, aż kość stanie się całkowicie biała. Kilkukrotnie pipetować szpik kostny, aby rozbić wszystkie grudki. Przefiltrować komórki do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml, używając 40 µm sito o danej średnicy otworu
  6. Wiruj przy 4 °C oraz 500x g przez 5 min. Odrzucić nadsącz i dodać 2 ml lizatu erytrocytów do osadu na 4 min.
  7. Po dwu- lub trzykrotnym przemyciu resuspender komórki w 2 ml pożywki kompletnej (1% penicyliny-streptomycyny, 10% płodowej surowicy bydlęcej, 20 ng/ml IL-4 oraz 10 ng/ml GM-CSF). Następnie rozcieńczyć 10 µL komórek do 1 ml PBS, a następnie wprowadź chip ręcznego automatycznego licznika komórek do rozcieńczenia komórek w celu ich przeliczenia. Na koniec wysiej komórki z gęstością 1 x 106 komórek/ml do naczynia hodowlanego o średnicy 10 mm z pełną pożywką.
  8. Hoduj komórki w inkubatorze komórkowym z 5% CO22 w 37 °CWymieniaj medium co 2 dni. W 7. dniu przenieś komórki do probówki o pojemności 50 ml i wiruj przy 450 x g przez 5 min w celu zebrania komórek.

4. Przygotowanie biomimetycznych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (bEVs)

  1. Zmontuj mini-ekstruder zgodnie z kolejnością opisaną w instrukcjach producenta. Przed użyciem upewnij się, że obudowa strzykawki nie jest pęknięta. Przed każdym eksperymentem sprawdź, czy wszystkie pierścienie uszczelniające (O-ringi) są w dobrym stanie i niezwłocznie wymień zużyte lub uszkodzone elementy. Zużyte lub uszkodzone pierścienie uszczelniające mogą spowodować nagły spadek ciśnienia podczas pracy ekstrudera.
  2. Wielokrotnie odaspiruj BMDCs i przenieś je do probówki do wirowania. Zbierz komórki poprzez wirowanie przy 450 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C. Przepuść zawiesiny komórkowe pod ciśnieniem przez membrany poliwęglanowe o porach 10 µm, 5 µm i 1 µm przez 30 cykli, używając mini-ekstrudera29.
    UWAGA: Aby zapewnić jednolitość rozmiaru bEV, zawiesiny BMDC przepuszczano przez membrany poliwęglanowe 10 µm, 5 µm i 1 µm przez 30 cykli. Ponadto podczas pracy należy upewnić się, że siła jest przykładana równomiernie i utrzymywana wzdłuż osi strzykawki.
  3. Odwiruj połączone nadnadstawniki przez 5 min przy 1000 x g i 4 °C, aby usunąć komórki. Zbierz nadnadstawnik i odwiruj go przy 3000 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C, aby usunąć pozostałe komórki i szczątki komórkowe.
  4. Zbierz nadnadstawnik i odwiruj go przy 100 000 x g przez 90 min w temperaturze 4 °C. Odlej nadnadstawnik i resuspenderuj bEV w 2 mL soli buforowej HEPES (HBS). Oczyść bEV via filtrację przez membranę 0,45 µm i przechowuj oczyszczone bEV w temperaturze −80 °C.

5. bEVs przylegają do PNPE

UWAGA: SiO2 sensor został zmodyfikowany poprzez metoda spin-coatingu

  1. Czujnik SiO2 zmodyfikowany poli-L-lizyną (PLL).
    1. Oczyść kwarcowy chip czujnika SiO2 za pomocą obróbki UV-ozonem przez 10 min, przepłucz dwukrotnie etanolem i osusz N2.
    2. Włącz powłokomierz odśrodkowy, naciskając przycisk Power, naciśnij przycisk Control i ustaw czas oraz prędkość nanoszenia powłoki. Początkowa prędkość obrotowa wynosi 400 rpm, która jest stopniowo zwiększana do 5000 rpm.
    3. Podłącz przewód N2 do powłokomierza odśrodkowego i ustaw frakcjonowanie butli gazowej na 0,4 kPa. Umieść czysty chip na przyssawce powłokomierza. Dodaj kroplowo 100 µL PLL na środek czujnika SiO2 i zamknij górną pokrywę urządzenia.
    4. Naciśnij przycisk Start, aby rozpocząć nanoszenie powłoki na próbkę, a po zakończeniu zatrzymaj urządzenie. Wyłącz pompę próżniową, wyłącz przyciski Power i Control, a następnie wyjmij zmodyfikowany PLL czujnik SiO2.
      UWAGA: Przed naciśnięciem przycisku Start upewnij się, że ustawiono czas i prędkość nanoszenia powłoki. Dodatkowo upewnij się, że czujnik SiO2 jest umieszczony w centrum przyssawki. Przed uruchomieniem procesu upewnij się, że pokrywa jest zamknięta, aby zapobiec wypadkom.
  2. Oznaczanie adhezji bEV do PNPE
    1. Włącz komputer, jednostkę elektroniczną, pompę perystaltyczną i aktywuj kontrolę temperatury w prawym dolnym rogu oprogramowania, aby upewnić się, że ustawiona temperatura jest o około 1 °C niższa od temperatury pokojowej.
    2. Umieść zmodyfikowane PLL czujniki SiO2 w celi przepływowej zgodnie z instrukcją obsługi i połącz linię pomiarową między celą przepływową a pompą przepływową. Umieść celę przepływową w systemie modułu przepływowego i przepłucz je wodą ultrapure przed rozpoczęciem eksperymentów.
    3. Kliknij pasek narzędzi Acquisition i wybierz Setup Measurement, aby wyszukać 1, 3, 5, 7, 9 i 11 oktaw chipa w używanym kanale. Aby skorygować linię bazową, kliknij Start Measurement, aby dopuścić powietrze do modułu przepływowego, aż linia bazowa powietrza stanie się gładka. Następnie przepuść wodę dejonizowaną przez 10-15 min, aby ponownie uzyskać równowagę linii bazowej roztworu.
    4. Wprowadź przygotowany roztwór PNPE do modułu przepływowego z prędkością przepływu 50 µL/min, aby osiągnąć równowagę adsorpcji na czujniku SiO2.
      UWAGA: Wartość ΔF nie zmienia się już podczas ponownego pompowania PNPE do modułu przepływowego, co wskazuje, że powierzchnia czujników SiO2 została całkowicie pokryta PNPE.
    5. Wprowadź przygotowany roztwór bEV do modułu przepływowego z prędkością przepływu 50 µL/min, aby śledzić proces adhezji bEV do powierzchni PNPE.

6. Analiza poboru antygenu przy użyciu CLSM

  1. Współhodowla PNPE-OVA z BMDC
    1. Inkubować BMDC w pełnej pożywce 1640 (1% penicyliny-streptomycyny, 10% płodowej surowicy bydlęcej, 20 ng/mL IL-4 oraz 10 ng/mL GM-CSF) przez 7 dni, a następnie wysiać je do małych szalek do mikroskopii konfokalnej w zagęszczeniu 1 x 106 na studniczkę przez noc w temperaturze 37 °C w 5% CO22 inkubator
    2. Wymieszać 0,5 ml OVA znakowanej Cy5 (400 µg/mL) z 0,5 ml PNPE przez 1 h, a następnie usunąć antygen w formie płynnej poprzez wirowanie przy 5000 x g przez 20 min w celu opracowania formulacji szczepionki. Po ponownym zawieszeniu w 200 µL wody zdejonizowanej, dodać 10 µL formuły (10 µg/mL (OVA) do małych naczyń konfokalnych z laserem w komorze z laminarnym przepływem powietrza, a następnie współhodowle z BMDC przez 6 h.
  2. Barwienie cytoszkieletu aktynowego
    1. Usunąć ciecz hodowlaną z komórek i przemyć je dwukrotnie uprzednio ogrzanym solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS; pH 7,4).
    2. Utrwal komórki w 4% roztworze formaldehydu w PBS przez 10 min w temperaturze pokojowej. Podczas utrwalania należy unikać stosowania utrwalaczy zawierających metanol, który może zniszczyć aktynę.
    3. Przemyć komórki roztworem PBS dwa lub trzy razy w temperaturze pokojowej, każdorazowo przez 10 min. Przeprowadzić permeabilizację komórek za pomocą 100 µL roztworem 0,5% Triton X-100 przez 5 min w temperaturze pokojowej. Ponownie przemyć komórki w PBS dwa lub trzy razy w temperaturze pokojowej, po 10 min każde z myć.
    4. Przykryj komórki na szklanym dnie małych naczyń do konfokalnej mikroskopii laserowej za pomocą 200 µL roztworu roboczego falloidyny znakowanej izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) i inkubować przez 30 min w temperaturze pokojowej w ciemności. Aby zmniejszyć sygnał tła, do roztworu roboczego falloidyny znakowanej FITC należy dodać 1% albuminy surowicy bydlęcej. Ponadto podczas inkubacji należy przykryć pokrywką małe szalki do mikroskopii konfokalnej, aby zapobiec odparowaniu roztworu.
    5. Przemyć komórki trzech razy buforem PBS, za każdym razem przez 5 min. Ponownie zabarwić jądra za pomocą 200 µL roztworu DAPI (stężenie: 100 nM) przez około 30 s.
  3. Analiza obrazu
    1. Włącz kolejno komponenty mikroskopu konfokalnego, w tym laser, moduł konfokalny, mikroskop oraz komputer. Kliknij NIS-Elements AR 5.20.00 oprogramowanie i wybierz Konfokalny mikroskop Nikon aby wejść do systemu testowego.
    2. W systemie mikroskopu konfokalnego włącz poszczególne jednostki w podanej kolejności. Najpierw skonfiguruj kanały FITC, DAPI i Cy5, a następnie dostosuj odpowiednie wartości HV oraz offset. Następnie wybierz obiektyw immersyjny 100x i nałóż na niego kroplę olejku cedrowego. Umieść na stole mikroskopu małe szalki konfokalne zawierające barwione komórki BMDC.
    3. Kliknij w Skanowanie przycisk. Pod mikroskopem fluorescencyjnym zlokalizuj interesujące komórki, przesuwając oś X, oś Y oraz oś Z. Dostrój intensywność lasera, rozmiar obrazu oraz inne parametry, aby umożliwić skanowanie wysokiej jakości obrazów konfokalnych. Na koniec kliknij Przechwytywanie przycisk i zapisz obrazy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W celu otrzymania PNPE zastosowano prostą, jednoczynnikową sonifikację. W pierwszej kolejności przygotowano jednorodne PNP, które posłużyły jako stabilizator stały (Rycina 1A). Morfologię PNP obserwowano za pomocą SEM, co wykazało, że są one w większości jednorodne i sferyczne (Rycina 1B). Wyznaczono rozmiar hydrodynamiczny oraz potencjał zeta sformułowań poprzez DLS. Średnica PNP wynosiła 187,7 ± 3,5 nm, a potencjał zeta wynosił -16,4 ± 0,4 mV (

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opracowaliśmy stabilizowaną nanocząstkami emulsję olejowo-wodną PLGA jako system dostarczania w celu zwiększenia internalizacji antygenu. Przygotowany PNPE posiadał gęsto upakowaną powierzchnię, która wspierała miejsce lądowania oraz wyjątkową miękkość i płynność zapewniającą silny kontakt komórkowy z błoną komórek odpornościowych. Co więcej, interfejs olej/woda zapewniał obciążenie antygenem o wysokiej zawartości, a amfifilowy PLGA zapewniał PNPE wysoką stabilność w transporcie antygenów do komórek odpornościowych. PNPE...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Projekt wspierany przez Narodowy Kluczowy Program Badawczo-Rozwojowy Chin (2021YFE020527, 2021YFC2302605, 2021YFC2300142), od 0 do 1 Oryginalny Projekt Innowacyjny Podstawowego Pionierskiego Programu Badań Naukowych Chińskiej Akademii Nauk (ZDBS-LY-SLH040), Fundacji Innowacyjnych Grup Badawczych Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (Grant nr 21821005).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AddVaxInvivoGenVac-adx-10
Sitko do komórekBiosharpBS-70-CS70 μ
m Konfokalny laserowy mikroskop skaningowy (CLSM)NikonA1
Cy3 NHS EsterYEASEN40777ES03
Roztwór do barwienia DAPIBeyotimeC1005
Surowica bydlęca płodu (FBS)Gibco16000-044
FITC PhalloidinSolarbioCA1620
Mastersizer 2000 Analizator wielkości cząstekMalvern
Micro BCAThermo Science23235
Sprzęt do emulgowania membranZhongke Senhui Microsphere TechnologyFM0201/500M
Mini-wytłaczarkaAvanti Polar Lipids, Inc
NANO ZSMalvernJSM-6700F
Membrany poliwęglanoweAvanti Polar Lipids,
Poly (kwas mlekowo-ko-glikolowy) (PLGA)Sigma-Aldrich26780-50-7Mw 7,000-17,000
Roztwór poli-L-lizynySolarbioP2100
Poly (alkohol winylowy) (PVA)Sigma-Aldrich9002-89-5
QSense Czujnik dwutlenku krzemuBiolin ScientificQSX 303Chropowatość powierzchni < 1 nm RMS
Mikrowaga kwarcowaBiosharpQ-SENSE E4
RPMI Medium 1640 basicGibcoC22400500BTL-glutamina, 25 mM
Skaningowa mikroskopia elektronowaJEOLJSM-6700F
SkwalenSigma-Aldrich111-02-4
Zestaw do oznaczania białek Inc HEPES, SEM)

Bibliografia

  1. Ma, G., Gu, Z., Wei, W. Advanced vaccine delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 183, 114170(2022).
  2. Sharma, J., Carson, C. S., Douglas, T., Wilson, J. T., Joyce, S. Nano-particulate platforms for vaccine delivery to enhance antigen-specific cd8(+) t-cell response. Methods in Molecular Biology. 2412, 367-398 (2022).
  3. Nguyen, T. P., et al. Safety and immunogenicity of nanocovax, a sars-cov-2 recombinant spike protein vaccine: interim results of a double-blind, randomised controlled phase 1 and 2 trial. The Lancet Regional Health. Western Pacific. 24, 100474(2022).
  4. Coates, E. E., et al. Safety and immunogenicity of a trivalent virus-like particle vaccine against western, eastern, and venezuelan equine encephalitis viruses: a phase 1, open-label, dose-escalation, randomised clinical trial. The Lancet Infectious Diseases. 22 (8), 1210-1220 (2022).
  5. Wei, L., et al. Efficacy and safety of a nanoparticle therapeutic vaccine in patients with chronic hepatitis b: a randomized clinical trial. Hepatology. 75 (1), 182-195 (2022).
  6. Krishnan, R., Kim, J. O., Qadiri, S. S. N., Kim, J. O., Oh, M. J. Early viral uptake and host-associated immune response in the tissues of seven-band grouper following a bath challenge with nervous necrosis virus. Fish & Shellfish Immunology. 103, 454-463 (2020).
  7. Mishra, D., Mishra, P. K., Dubey, V., Dabadghao, S., Jain, N. K. Evaluation of uptake and generation of immune response by murine dendritic cells pulsed with hepatitis b surface antigen-loaded elastic liposomes. Vaccine. 25 (39-40), 6939-6944 (2007).
  8. Harwood, L. J., Gerber, H., Sobrino, F., Summerfield, A., Mccullough, K. C. Dendritic cell internalization of foot-and-mouth disease virus: influence of heparan sulfate binding on virus uptake and induction of the immune response. Journal of Virology. 82 (13), 6379-6394 (2008).
  9. Jing, H., et al. Fluorescent artificial antigens revealed extended membrane networks utilized by live dendritic cells for antigen uptake. Nano Letters. 22 (10), 4020-4027 (2022).
  10. Meena, J., Goswami, D. G., Anish, C., Panda, A. K. Cellular uptake of polylactide particles induces size dependent cytoskeletal remodeling in antigen presenting cells. Biomaterials Science. 9 (23), 7962-7976 (2021).
  11. Yang, J., et al. Drug delivery via cell membrane fusion using lipopeptide modified liposomes. ACS Central Science. 2 (9), 621-630 (2016).
  12. Rawle, R., Kasson, P., Boxer, S. Disentangling viral membrane fusion from receptor binding by using synthetic dna-lipid conjugates totether influenza virus to model lipid membranes. Biophysical Journal. 111 (1), 123-131 (2016).
  13. Ha, H. K., Kim, J. W., Lee, M. R., Jun, W., Lee, W. J. Cellular uptake and cytotoxicity of β-lactoglobulin nanoparticles: the effects of particle size and surface charge. Asian-Australasian Journal of Animal Sciences. 28 (3), 420-427 (2015).
  14. Malara, A., et al. Extracellular matrix structure and nano-mechanics determine megakaryocyte function. Blood. 118 (16), 4449-4453 (2011).
  15. Dankovich, T. M., et al. Extracellular matrix remodeling through endocytosis and resurfacing of tenascin-r. Nature Communications. 12 (1), 7129(2021).
  16. Evans, E., Buxbaum, K. Affinity of red-blood-cell membrane for particle surfaces measured by the extent of particle encapsulation. Biophysical Journal. 34 (1), 1-12 (1981).
  17. Rohner, N. A., Purdue, L. N., Von Recum, H. A. Affinity-based polymers provide long-term immunotherapeutic drug delivery across particle size ranges optimal for macrophage targeting. Journal of Pharmaceutical Sciences. 110 (4), 1693-1700 (2021).
  18. Zhou, X., Liu, Y., Wang, X. F., Li, X. M., Xiao, B. Effect of particle size on the cellular uptake and anti-inflammatory activity of oral nanotherapeutics. Colloids and Surfaces B-Biointerfaces. 187, 110880(2020).
  19. Zhang, D., et al. The morphology and surface charge-dependent cellular uptake efficiency of upconversion nanostructures revealed by single-particle optical microscopy. Chemical Science. 13 (12), 3610(2022).
  20. Xi, Y. K., et al. Co2-responsive pickering emulsions stabilized by soft protein particles for interfacial biocatalysis. Chemical Science. 13 (10), 2884-2890 (2022).
  21. Trivedi, R. P., Klevets, I. I., Senyuk, B., Lee, T., Smalyukh, I. I. Reconfigurable interactions and three-dimensional patterning of colloidal particles and defects in lamellar soft media. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 109 (13), 4744-4749 (2012).
  22. De Araujo, A. D., Hoang, H. N., Lim, J., Mak, J. Y. W., Fairlie, D. P. Tuning electrostatic and hydrophobic surfaces of aromatic rings to enhance membrane association and cell uptake of peptides. Angewandte Chemie. 61 (29), 03995(2022).
  23. Waku, T., et al. Effect of the hydrophilic-hydrophobic balance of antigen-loaded peptide nanofibers on their cellular uptake, cellular toxicity, and immune stimulatory properties. International Journal of Molecular Sciences. 20 (15), 3781(2019).
  24. Meng, X., et al. A soft pickering emulsifier made from chitosan and peptides endows stimuli-responsiveness, bioactivity and biocompatibility to emulsion. Carbohydrate Polymers. 277, 118768(2022).
  25. Wang, Z., et al. Fabrication and in vitro/vivo evaluation of drug nanocrystals self-stabilized pickering emulsion for oral delivery of quercetin. Pharmaceutics. 14 (5), 897(2022).
  26. Ji, J., et al. Core-shell-structured silica/polyacrylate particles prepared by pickering emulsion: influence of the nucleation model on particle interfacial organization and emulsion stability. Nanoscale Research Letters. 9 (1), 534(2014).
  27. Chen, l, et al. Quantitative evaluation of proteins with bicinchoninic acid (bca): resonance raman and surface-enhanced resonance raman scattering-based methods. Analyst. 137 (24), 5834-5838 (2012).
  28. Colino, J., Shen, Y., Snapper, C. M. Dendritic cells pulsed with intact streptococcus pneumoniae elicit both protein- and polysaccharide-specific immunoglobulin isotype responses in vivo through distinct mechanisms. The Journal of Experimental Medicine. 195 (1), 1-13 (2002).
  29. Zhang, Y., Wu, J., Zhang, H., Wei, J., Wu, J. Extracellular vesicles-mimetic encapsulation improves oncolytic viro-immunotherapy in tumors with low coxsackie and adenovirus receptor. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 574007(2020).
  30. Cappellano, G., Abreu, H., Casale, C., Dianzani, U., Chiocchetti, A. Nano-microparticle platforms in developing next-generation vaccines. Vaccines. 9 (6), 606(2021).
  31. McClelland, R. D., Culp, T. N., Marchant, D. J. Imaging flow cytometry and confocal immunofluorescence microscopy of virus-host cell interactions. Frontiers in Cellular Infection Microbiology. 11, 749039(2021).
  32. Konry, T., Sarkar, S., Sabhachandani, P., Cohen, N. Innovative tools and technology for analysis of single cells and cell-cell interaction. Annual Reviews of Biomedical Engineering. 18 (1), 259-284 (2016).
  33. D'Aurelio, R., et al. A comparison of EIS and QCM nanoMIP-based sensors for morphine. Nanomaterials. 11 (12), 3360(2021).
  34. Li, Y. J., et al. Artificial exosomes for translational nanomedicine. Journal of Nanobiotechnology. 19 (1), 242(2021).
  35. Rydell, G. E., Dahlin, A. B., Hook, F., Larson, G. QCM-D studies of human norovirus VLPs binding to glycosphingolipids in supported lipid bilayers reveal strain-specific characteristics. Glycobiology. 19 (11), 1176-1184 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

emulsja Pickeringananocz stki PLGAdendrytyczne kom rki szpiku kostnegomikroskopia konfokalnakwarcowy mikrowa eniepobieranie antygenuformulacja szczepionki
Powinowactwo komórkowe emulsji stabilizowanej cząstkami w celu zwiększenia internalizacji antygenu
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.