Artykuł metodologiczny

Powinowactwo komórkowe emulsji stabilizowanej cząstkami w celu zwiększenia internalizacji antygenu

DOI:

10.3791/64406

⸱

2 września 2022

 ,  ,  ,  , 
1Graduate School of Bio-Applications and Systems Engineering, Tokyo University of Agriculture and Technology, 2Institute of Global Innovation Research, Tokyo University of Agriculture and Technology, 3State Key Laboratory of Biochemical Engineering, Institute of Process Engineering, Chinese Academy of Sciences, 4University of Chinese Academy of Sciences

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby racjonalnie zaprojektować skuteczne adiuwanty, opracowaliśmy emulsję Pickeringa stabilizowaną nanocząstkami kwasu poli-mlekowo-glikolowego (PNPE). PNPE posiadał wyjątkową miękkość i hydrofobowy interfejs zapewniający silny kontakt komórkowy i oferował ładowanie antygenem o wysokiej zawartości, poprawiając powinowactwo komórkowe systemu dostarczania do komórek prezentujących antygen i indukując wydajną internalizację antygenów.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Powinowactwo komórkowe mikro-/nanocząsteczek jest warunkiem wstępnym rozpoznawania komórek, pobierania i aktywacji komórek, które są niezbędne do dostarczania leków i odpowiedzi immunologicznej. Niniejsze badanie wywodzi się z obserwacji, że wpływ ładunku, wielkości i kształtu cząstek stałych na powinowactwo komórek jest zwykle brany pod uwagę, ale rzadko zdajemy sobie sprawę z istotnej roli miękkości, dynamicznego zjawiska restrukturyzacji i złożonej interakcji interfejsu w powinowactwie komórkowym. W tym miejscu opracowaliśmy emulsję Pickeringa (PNPE) stabilizowaną nanocząstkami kwasu polimlekowo-ko-glikolowego (PLGA), która przezwyciężyła wady sztywnych form i symulowała elastyczność i płynność patogenów. Stworzono metodę w celu zbadania powinowactwa PNPE do powierzchni komórek i opracowania szczegółowych informacji na temat późniejszej internalizacji przez komórki odpornościowe. Powinowactwo PNPE do biomimetycznych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (bEVs) - zamiennika komórek dendrytycznych szpiku kostnego (BMDC) - określono za pomocą mikrowagi kwarcowej z monitorowaniem dyssypacji (QCM-D), która umożliwiła monitorowanie adhezji emulsji komórkowej w czasie rzeczywistym. Następnie do dostarczenia antygenu (albuminy jaja kurzego, OVA) wykorzystano PNPE, a wychwyt antygenów przez BMDC obserwowano za pomocą konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego (CLSM). Reprezentatywne wyniki wykazały, że PNPE natychmiast zmniejszył częstość (ΔF) w momencie napotkania bEVs, co wskazuje na szybką adhezję i wysokie powinowactwo PNPE do BMDC. PNPE wykazywał znacznie silniejsze wiązanie z błoną komórkową niż mikrocząstki PLGA (PMP) i adiuwant AddaVax (oznaczany jako nanoemulsja stabilizowana środkami powierzchniowo czynnymi [SSE]). Ponadto, ze względu na zwiększone powinowactwo komórkowe do immunocytów poprzez dynamiczne zmiany krzywizny i dyfuzje boczne, wychwyt antygenu został następnie zwiększony w porównaniu z PMP i SSE. Protokół ten dostarcza informacji na temat projektowania nowatorskich preparatów o wysokim powinowactwie komórkowym i wydajnej internalizacji antygenu, zapewniając platformę do opracowywania skutecznych szczepionek.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby zwalczać choroby epidemiczne, przewlekłe i zakaźne, konieczne jest opracowanie skutecznych adiuwantów do szczepień profilaktycznych i terapeutycznych1,2. Idealnie byłoby, gdyby adiuwanty charakteryzowały się doskonałym bezpieczeństwem i aktywacją immunologiczną3,4,5. Uważa się, że efektywny wychwyt i proces antygenów przez komórki prezentujące antygen (APC) jest kluczowym etapem w dalszych kaskadach sygnalizacyjnych i inicjacji odpowiedzi immunologicznej6,7,8. W związku z tym uzyskanie jasnego zrozumienia mechanizmu interakcji komórek odpornościowych z antygenami i projektowanie adiuwantów w celu zwiększenia internalizacji to skuteczne strategie zwiększania skuteczności szczepionek.

Mikrocząsteczki o unikalnych właściwościach były wcześniej badane jako systemy dostarczania antygenów pośredniczące w komórkowym pobieraniu antygenów i interakcji komórkowej z wzorcami molekularnymi związanymi z patogenami9,10. Po kontakcie z komórkami systemy dostarczania zaczynają wchodzić w interakcje z macierzą zewnątrzkomórkową i błoną komórkową, co prowadzi do internalizacji i późniejszych odpowiedzi komórkowych11,12. Wcześniejsze badania ujawniły, że internalizacja cząstek odbywa się poprzez adhezję błony komórkowej i cząstek13, po której następuje elastyczna deformacja błony komórkowej i dyfuzja receptora do błony powierzchniowej14,15. W tych okolicznościach właściwości systemu dostarczania zależą od powinowactwa do APC, które z kolei wpływają na ilość wychwytu16,17.

Aby uzyskać wgląd w projekt systemu dostarczania dla poprawy odpowiedzi immunologicznej, szeroko zakrojone wysiłki skupiły się na badaniu związku między właściwościami cząsteczek a wychwytem komórkowym. Obecne badanie wynika z obserwacji, że stałe mikro-/nanocząstki o różnych ładunkach, rozmiarach i kształtach są często badane w tym świetle, podczas gdy rola płynności w internalizacji antygenu jest rzadko badana18,19. W rzeczywistości podczas adhezji miękkie cząstki wykazywały dynamiczne zmiany krzywizny i dyfuzje boczne w celu zwiększenia powierzchni kontaktu dla oddziaływań wielowartościowych, które z trudem mogą być powtórzone przez cząstki stałe20,21. Ponadto błony komórkowe są dwuwarstwami fosfolipidowymi (sfingolipidami lub cholesterolem) w miejscu wychwytu, a substancje hydrofobowe mogą zmieniać entropię konformacyjną lipidów, zmniejszając ilość energii potrzebnej do wychwytu komórkowego22,23. Tak więc zwiększenie mobilności i promowanie hydrofobowości systemu dostarczania może być skuteczną strategią wzmacniania internalizacji antygenu w celu wzmocnienia odpowiedzi immunologicznej.

emulsja Pickeringa, stabilizowana przez cząstki stałe zgromadzone na granicy dwóch niemieszających się cieczy, była szeroko stosowana w dziedzinie biologii24,25. W rzeczywistości cząsteczki agregujące na granicy faz olej/woda determinują tworzenie wielopoziomowych struktur, które promują wielopoziomowe interakcje system-komórka systemu dostarczania i dalej indukują wielofunkcyjne właściwości fizykochemiczne w dostarczaniu leków. Ze względu na ich odkształcalność i ruchliwość boczną, oczekiwano, że emulsje Pickeringa wejdą w wielowartościową interakcję komórkową z immunocytami i zostaną rozpoznane przez białka błonowe26. Ponadto, ponieważ oleiste rdzenie miceli w emulsjach Pickeringa nie są całkowicie pokryte cząstkami stałymi, emulsje Pickeringa mają przerwy o różnych rozmiarach między cząstkami na granicy faz olej/woda, co powoduje wyższą hydrofobowość. Dlatego tak ważne jest zbadanie powinowactwa emulsji Pickeringa do APC i opracowanie późniejszej internalizacji w celu opracowania skutecznych adiuwantów.

Na podstawie tych rozważań, zaprojektowaliśmy stabilizowaną nanocząstkami emulsję Pickeringa (PNPE) jako system dostarczania szczepionki płynnościowej, który również pomógł uzyskać cenne informacje na temat powinowactwa PNPE do BMDC i internalizacji komórkowej. Adhezja biomimetycznych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (bEVs; zamiennik BMDC) do PNPE w czasie rzeczywistym monitorowano metodą bezznacznikową przy użyciu mikrowagi kwarcowej z monitorowaniem dyssypacji (QCM-D). Po scharakteryzowaniu powinowactwa PNPE do BMDC, zastosowano konfokalną laserową mikroskopię skaningową (CLSM) w celu określenia wychwytu antygenu. Wynik wskazał na większe powinowactwo PNPE do BMDC i efektywną internalizację antygenu. Spodziewaliśmy się, że PNPE będzie wykazywać większe powinowactwo do APC, które mogą lepiej stymulować internalizację antygenów w celu wzmocnienia odpowiedzi immunologicznej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie metody opisane w tym protokole zostały zatwierdzone przez Instytut Inżynierii Procesowej Chińskiej Akademii Nauk. Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone w ścisłej zgodności z Przepisami dotyczącymi opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi i ich wykorzystywaniem oraz Wytycznymi dotyczącymi oceny etycznej zwierząt (Chiny, GB/T35892-2018).

1. Przygotowanie i charakterystyka nanocząstek PLGA

  1. Otrzymywanie nanocząstek PLGA (PNP)
    1. Dodać 0,5 g alkoholu poliwinylowego (PVA) do 120 ml wody dejonizowanej o temperaturze 90 °C i mieszać aż do całkowitego rozpuszczenia, aby przygotować roztwór PVA. Przechowywać roztwór w lodówce (4 °C) po schłodzeniu do temperatury pokojowej.
    2. Dodać 100 mg PLGA do 10 ml mieszaniny acetonu i etanolu (w stosunku 4:1), aby posłużyły jako faza olejowa.
    3. Umieścić 20 ml wodnego roztworu PVA pod wyciągiem i mieszać magnetycznie z prędkością 400 obr./min. Dodać 5 ml fazy olejowej do roztworu PVA kropla po kropli za pomocą pompy strzykawkowej. Następnie mieszaj mieszaninę w dygestorium, aż rozpuszczalniki organiczne całkowicie odparują.
      UWAGA: Wraz ze wzrostem stężenia cząstek w fazie olejowej roztwór fazy wodnej stopniowo zamienia się w klarowny i przezroczysty jasnoniebieskawo-biały lub mlecznobiały.
    4. Po ulatnianiu się rozpuszczalników organicznych (2-3 h) odwirować mieszaninę przy 15 000 x g. Umyj trzy lub więcej razy, aż końcowa woda do mycia będzie czysta i przezroczysta.
      UWAGA: Celem tego etapu jest głównie zmycie resztek PVA z powierzchni cząstek, aby zapobiec ich wpływowi na preparat emulsyjny Pickeringa.
    5. Ponownie zawiesić umyte PNP w 2 ml wody dejonizowanej i zamrozić mieszaninę w temperaturze -80 °C przez 24 godziny. Następnie liofilizować cząstki w liofilizatorze przez 48-72 godziny. Przygotowane PNP są białe flokowate.
  2. Charakterystyka PNP
    1. Aby scharakteryzować wielkość i potencjał zeta PNP, dodaj 10 μl PNP do 1 ml wody dejonizowanej, aby uzyskać roztwór rozcieńczalnika i przenieś roztwór rozcieńczalnika do DTS1070 komórki. Włącz komputer i analizator dynamicznego rozpraszania światła (DLS), a następnie umieść ogniwo DTS1070 w systemie DLS.
    2. Kliknij na oprogramowanie Zeta Size i utwórz nowy plik pomiarowy, aby skonfigurować procedurę oznaczania. Następnie rozpocznij procedurę oznaczania, aby uzyskać wielkość cząstek i rozkład potencjału zeta.
    3. Aby obserwować morfologię PNP, równomiernie rozprowadź 0,1 ml roztworu PNPs (rozcieńczonego 40 razy) na arkuszu folii aluminiowej o wymiarach 5 cm x 5 cm i pozwól wodzie naturalnie odparować w dobrze wentylowanym dygestoriach przez noc.
    4. Wytnij niewielką część folii aluminiowej i zabezpiecz ją na stole z próbkami taśmą przewodzącą. Spryskaj go złotem o natężeniu 10 mA przez 120 s. Następnie obserwuj morfologię powierzchni próbki za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM).

2. Przygotowanie i charakterystyka PNPE

  1. Aby przygotować PNPE, dodaj liofilizowane PNP do wody dejonizowanej o stężeniu 4 mg/ml (faza wodna), a następnie dodaj skwalen jako fazę olejową. Przygotuj PNPE za pomocą jednoetapowej sonikacji przez 5 minut przy 100 W w sonikatorze w łaźni wodnej. Stosunek faz olej-woda wynosi 1:9.
  2. Charakterystyka przygotowanego PNPE
    1. Otwórz kolejno oprogramowanie Mastersizer 2000 i laser. Kliknij Zmierz, aby otworzyć wstępnie ustawiony program i ustawić nazwę próbki. Kliknij Start, aby rozpocząć pomiar tła próbki, a następnie za pomocą zakraplacza dodaj 1 ml PNPE do zbiornika próbki laserowego analizatora wielkości cząstek, aby trzykrotnie równolegle zmierzyć wielkość cząstek emulsji.
    2. Rozcieńczyć 20 μl PNPE w 1 ml wody dejonizowanej. Upuść 20 μl emulsji na szkiełko. Obserwować morfologię i jednorodność emulsji za pomocą mikroskopii optycznej przy 40-krotnym powiększeniu i uzyskać fotografie.
  3. Efektywność ładowania antygenu
    1. Rozpuść 200 μg albuminy jaja kurzego (OVA) w 500 ml wody dejonizowanej. Następnie wymieszaj go z 500 ml przygotowanego PNPE i wstrząsaj przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Usunąć antygen płynny przez odwirowanie przy 5000 x g przez 20 minut.
    2. Określ stężenia antygenu płynnego za pomocą testów kwasu bicinchoninowego (BCA)27. Wzór na obliczenie wydajności ładowania antygenu jest następujący:
      Efektywność ładowania antygenu = figure-protocol-1
      Użyj tej samej metody, aby określić wydajność ładowania antygenu przez SSE, która jest używana jako grupa kontrolna.
  4. Stabilność PNPE
    1. Podzielić 6 ml przygotowanego PNPE na sześć równych porcji i przechowywać po trzy części w temperaturze odpowiednio 4 °C i 25 °C. Rozcieńczyć 20 μl przechowywanego PNPE w 1 ml wody dejonizowanej (1:50) w dniu 0, 3 i 6. Następnie zmierz wielkość i potencjał zeta roztworów podstawowych PNPE utrzymywanych w różnych temperaturach.
      UWAGA: Różne temperatury przechowywania są ustawione w celu porównania wpływu różnych temperatur na stabilność PNPE, co może zoptymalizować warunki przechowywania w celu uzyskania wysokiej stabilności i długiego okresu przydatności do spożycia.
  5. Przygotowanie mikrocząstek PLGA (PMP)
    1. Rozpuścić 500 mg PLGA w 5 ml dichlorometanu jako fazie olejowej, a następnie wlać do 50 ml zewnętrznej fazy wodnej zawierającej 1,5% PVA w celu otrzymania mieszaniny oleju i wody. Homogenizować mieszaninę przy 3000 obr./min przez 1 minutę za pomocą homogenizatora w celu uzyskania gruboziarnistych emulsji.
    2. Utrzymanie jednorodności wielkości cząstek PLGA w mikrosferach (określonej przez gruboziarniste emulsje) przez emulgację membranową. Zainstaluj membranę 5,2 μm w rurce membranowej. Dostosuj ciśnienie do 800 kPa i utrzymuj je na stałym poziomie.
    3. Otworzyć zawór wydechowy i zawór zasilający, a po dodaniu gruboziarnistych emulsji do zbiornika próbki zamknąć zawór wydechowy i zawór zasilający, otworzyć zawór spustowy i zawór wlotowy, a następnie pobrać emulsję po filmie do zlewki o pojemności 200 ml. Powtórz proces trzy razy, aby uzyskać wstępnie podwójne emulsje.
    4. Wymieszaj emulsje wstępnie podwójne, aby odparować dichlorometan w temperaturze pokojowej w celu utwardzenia mikrosfer. Umyj mikrosfery wodą dejonizowaną o stężeniu 7741 x g przez 3 minuty pięć razy. Wstępnie zamrozić w zamrażarce w temperaturze -80 °C, a na koniec liofilizować, aby uzyskać wysuszone mikrosfery.
  6. Charakterystyka PMP
    1. Otwórz kolejno oprogramowanie Mastersizer 2000 i laser. Kliknij Zmierz, aby otworzyć wstępnie ustawiony program i ustawić nazwę próbki. Kliknij Start, aby rozpocząć pomiar tła próbki. Następnie dodaj 1 ml PMP do zbiornika do dodawania próbki laserowego analizatora wielkości cząstek z zakraplaczem i zmierz wielkość cząstek mikrocząstek trzy razy równolegle.
  7. Analiza miękkości
    UWAGA: PNPE został pokryty na czujnik SiO2 w celu zmierzenia miękkości.
    1. Wyczyść chip czujnika kwarcowegoSiO 2 przez obróbkę ozonem UV przez 10 minut, spłucz dwukrotnie 5 ml etanolu (75% v/v) i osuszN2. Zainstaluj pusty chip czujnika kwarcowego SiO2 w komorze przepływowej.
    2. Włącz komputer i aktywuj regulator temperatury w prawym dolnym rogu oprogramowania, aby upewnić się, że ustawiona temperatura jest o około 1 °C niższa od temperatury pokojowej.
    3. Kliknij przycisk Akwizycja na pasku narzędzi i wybierz Setup Measurement, aby wyszukać 1, 3, 5, 7, 9 i 11 oktawy chipa w używanym kanale. Kliknij przycisk Akwizycja na pasku narzędzi i wybierz Rozpocznij pomiar.
    4. Skoryguj linię bazową za pomocą powietrza, a gdy linia bazowa jest zrównoważona, wybierz opcję Zatrzymaj i zapisz plik jako pusty.
    5. Oczyść wiór i odwiruj 10 μg/ml PNPE na chipie. Krótko włącz powlekarkę wirową i ustaw parametr pracy. Podłącz rurę N2 do powlekarki wirowej, wyreguluj frakcjonowanie butli gazowej na 0,4 kPa i umieść czysty wiór na przyssawce powlekarki wirowej. Dodaj kroplami 100 μl PNPE do środka czujnika SiO2 i zamknij górną pokrywę powlekarki wirowej, aby zakończyć powlekanie.
    6. Zainstaluj wiór pokryty PNPE w komorze przepływowej. Powtórz kroki 2.7.3-2.7.4 i zapisz plik jako PNPE. Otwórz zarówno puste pliki, jak i PNPE i kliknij przycisk Ścieg, aby uzyskać powiązane dane rozpraszania (ΔD).

3. Izolowanie i hodowla BMDC 28

UWAGA: Upewnij się, że wszystkie odczynniki i próbki są umieszczone na lodzie, ponieważ ma to pozytywny wpływ na aktywność komórek. Aby zachować sterylność, wykonuj wszystkie czynności na ultra czystej ławce przy użyciu sterylnych przyborów.

  1. Myszy C57BL/6 (samica w wieku 6-8 tygodni) należy poddać eutanazji poprzez inhalację CO2 i zanurzyć je w etanolu 70% (v/v) w celu krótkiej sterylizacji.
  2. Po namoczeniu przez 3-5 minut przenieś myszy na super czystą ławkę. Usuń mięśnie nóg za pomocą nożyczek ze stali nierdzewnej, aby odsłonić kość udową i piszczelową, a następnie oddziel kość udową i piszczelową.
  3. Napełnij szalkę Petriego 70% (v/v) etanolem i zanurz w niej czyste kości przez 5-10 sekund, aby zakończyć zewnętrzną sterylizację. Oczyść wszystkie kości i umieść je w sterylnej probówce z lodem wokół nich.
  4. Przytnij kość udową i piszczelową blisko stawu za pomocą nożyczek. Wprowadzić igłę strzykawki do kości, aby wypłukać szpik kostny do probówki wirówkowej przy użyciu wstępnie schłodzonej pożywki RPMI (1640).
  5. Opłucz dwa lub trzy razy, aż kość będzie całkowicie biała. Kilkakrotnie odpipetować szpik kostny, aby oddzielić wszystkie grudki. Przefiltrować komórki do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml za pomocą sita o średnicy 40 μm.
  6. Wirować w temperaturze 4 °C i 500 x g przez 5 min. Odrzucić supernatant i dodać 2 ml lizatu erytrocytów do osadu na 4 min.
  7. Po dwukrotnym lub trzykrotnym umyciu ponownie zawiesić komórki w 2 ml kompletnej pożywki (1 % penicyliny-streptomycyny, 10 % płodowej surowicy bydlęcej, 20 ng/ml IL-4 i 10 ng/ml GM-CSF). Następnie rozcieńczyć 10 μl komórek w 1 ml PBS i włożyć chip ręcznego automatycznego licznika komórek do rozcieńczalnika komórek w celu zliczenia komórek. Na koniec komórki nasienne o gęstości 1 x 106 komórek/ml do 10 mm naczynia hodowlanego z kompletną pożywką.
  8. Hodować komórki w inkubatorze komórkowym z 5% CO2 w temperaturze 37 °C. Pożywkę należy zmieniać co 2 dni. W dniu 7 przenieś komórki do probówki o pojemności 50 ml i odwiruj przy 450 x g przez 5 minut, aby zebrać komórki.

4. Przygotowanie bio-mimetycznych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (bEVs)

  1. Zmontuj mini-ekstruder w kolejności zgodnie z instrukcjami producenta. Przed użyciem należy upewnić się, że obudowa strzykawki nie jest pęknięta. Upewnij się, że wszystkie O-ringi są w dobrym stanie przed każdym eksperymentem i natychmiast wymień zużyte lub uszkodzone. Zużyte lub uszkodzone O-ringi mogą powodować nagłe spadki ciśnienia podczas pracy wytłaczarki.
  2. Kilkakrotnie zasysać BMDC i przenieść je do probówki wirówkowej. Zebrać komórki przez odwirowanie w temperaturze 450 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Zwiększyć ciśnienie w zawiesinach komórek przez membrany poliwęglanowe 10 μm, 5 μm i 1 μm przez 30 przejść za pomocą mini-ekstrudera29.
    UWAGA: Aby umożliwić jednorodność wielkości bEV, zawieszenia BMDC przepchnięto przez membrany poliwęglanowe 10 μm, 5 μm i 1 μm przez 30 przejść. Dodatkowo podczas pracy należy upewnić się, że siła jest równomiernie przyłożona i utrzymać kierunek siły wzdłuż osi strzykawki.
  3. Odwirować zebrane supernatanty przez 5 minut w temperaturze 1000 x g i temperaturze 4 °C w celu usunięcia komórek. Zebrać sklarowany osad i odwirować go przy 3000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia pozostałych komórek i resztek komórek.
  4. Zebrać sklarowany osad i odwirować go przy stężeniu 100 000 x g przez 90 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić bEVs w 2 ml soli fizjologicznej buforowanej przez HEPES (HBS). Oczyść bEV poprzez filtrację przez membranę 0,45 μm i przechowuj oczyszczone bEV w temperaturze -80 °C.

5. bEV są zgodne z PNPE

UWAGA: Czujnik SiO2 został zmodyfikowany metodą powlekania wirowego.

  1. Czujnik SiO2 zmodyfikowany poli-L-lizyną (PLL).
    1. Wyczyść chip czujnika kwarcowego SiO2 za pomocą ozonu UV przez 10 minut, spłucz dwukrotnie etanolem i osuszN2.
    2. Włącz wirówkę, naciskając przycisk zasilania, naciśnij przycisk Control i ustaw czas i prędkość powlekania. Początkowa prędkość obrotowa wynosi 400 obr./min, która jest stopniowo zwiększana do 5000 obr./min.
    3. Podłączyć rurę N2 do powlekarki wirowej i dostosować frakcjonowanie butli gazowej do 0,4 kPa. Umieść czysty wiór na przyssawce wirówki. Dodaj kroplami 100 μl PLL do środka czujnika SiO2 i zamknij górną pokrywę powlekarki wirowej.
    4. Naciśnij przycisk Start, aby rozpocząć powlekanie próbki i zatrzymać maszynę po zakończeniu. Wyłącz pompę próżniową, wyłącz przyciski zasilania i sterowania oraz wyjmij zmodyfikowany przez PLL czujnik SiO2.
      UWAGA: Przed naciśnięciem przycisku Start upewnij się, że czas i prędkość powlekania zostały ustawione. Dodatkowo upewnij się, że czujnik SiO2 jest umieszczony na środku przyssawki. Upewnij się, że pokrywa jest zamknięta przed uruchomieniem, aby zapobiec wypadkom.
  2. Oznaczanie przyczepności bEV do PNPE
    1. Włącz komputer, jednostkę elektroniczną, pompę perystaltyczną i aktywuj regulator temperatury w prawym dolnym rogu oprogramowania, aby upewnić się, że ustawiona temperatura jest o około 1 °C niższa od temperatury pokojowej.
    2. Umieść zmodyfikowane przez PLL czujniki SiO2 w komorze przepływowej zgodnie z instrukcją obsługi i podłącz linię pomiarową między komorą przepływową a pompą przepływową. Umieść komórkę przepływową wewnątrz systemu modułu przepływowego i przepłucz je ultraczystą wodą przed rozpoczęciem eksperymentów.
    3. Kliknij na pasek narzędzi Akwizycja i wybierz Setup Measurement, aby wyszukać 1, 3, 5, 7, 9 i 11 oktawy chipa w używanym kanale. Aby skorygować linię bazową, kliknij przycisk Rozpocznij pomiar, aby umożliwić dopływ powietrza do modułu przepływu, aż linia bazowa powietrza będzie gładka. Następnie przepływaj wodę dejonizowaną przez 10-15 minut, aby ponownie umożliwić równowagę podstawową roztworu.
    4. Wpompować przygotowany roztwór PNPE do modułu przepływowego z natężeniem przepływu 50 μl/min, aby uzyskać adsorpcję równowagową na czujniku SiO2.
      UWAGA: ΔF nie zmienia się już, gdy PNPE jest ponownie pompowany do modułu przepływu, co wskazuje, że powierzchnia czujników SiO2 została całkowicie pokryta PNPE.
    5. Przepompuj przygotowany roztwór bEVs do modułu przepływowego z natężeniem przepływu 50 μl/min, aby śledzić proces przylegania bEV do powierzchni PNPE.

6. Analiza CLSM wychwytu antygenu

  1. Współhodowla PNPE-OVA z BMDC
    1. Inkubować BMDC z 1640 kompletnymi pożywkami (1% penicylina-streptomycyna, 10% płodowej surowicy bydlęcej, 20 ng/ml IL-4 i 10 ng/ml GM-CSF) przez 7 dni, a następnie wysiewać je do małych konfokalnych czaszy laserowych w proporcji 1 x 106 na studzienkę przez noc w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 .
    2. Mieszać 0,5 ml OVA znakowanego Cy5 (400 μg/ml) z 0,5 ml PNPE przez 1 godzinę i usunąć płynny antygen przez odwirowanie przy 5000 x g przez 20 minut, aby opracować postać szczepionki. Po ponownym zaparowaniu w 200 μl wody dejonizowanej, dodaj 10 μl preparatu (10 μg/ml OVA) do małych konfokalnych czaszy laserowych pod super czystą ławką i współhoduj z BMDC przez 6 godzin.
  2. Barwienie cytoszkieletu aktynowego
    1. Usunąć płyn hodowlany z komórek i przemyć je dwukrotnie wstępnie podgrzanym roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS; pH 7,4).
    2. Utrwal komórki 4% roztworem formaldehydu w PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Podczas utrwalania należy unikać utrwalaczy zawierających metanol, który może niszczyć aktynę.
    3. Umyj komórki PBS dwa lub trzy razy w temperaturze pokojowej przez 10 minut każda. Przepuszczalność komórek za pomocą 100 μl 0,5% roztworu Triton X-100 przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Umyj komórki PBS dwa lub trzy razy w temperaturze pokojowej przez 10 minut każda.
    4. Przykryj komórki na naczyniu ze szklanym dnem małych konfokalnych czaszy laserowych 200 μl roztworu roboczego falloidyny sprzężonego z izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Aby zmniejszyć sygnał tła, dodaj 1% albuminy surowicy bydlęcej do roztworu roboczego falloidyny sprzężonej z FITC. Ponadto podczas inkubacji należy przykryć pokrywę małych konfokalnych czasz laserowych, aby zapobiec parowaniu roztworu.
    5. Umyj komórki PBS razy przez 5 minut każda. Ponownie wybarwić jądra 200 μl roztworu DAPI (stężenie: 100 nM) przez około 30 s.
  3. Analiza obrazu
    1. Włączaj kolejno sprzęt mikroskopu konfokalnego, w tym laser, konfokalny, mikroskop i komputer. Kliknij oprogramowanie NIS-Elements AR 5.20.00 i wybierz opcję Nikon Confokal, aby przejść do systemu testowego.
    2. W systemie mikroskopu konfokalnego włącz różne jednostki w zanotowanej kolejności. Najpierw skonfiguruj kanały FITC, DAPI i Cy5 i dostosuj odpowiadające im HV i offset. Następnie wybierz soczewkę olejową 100x i nałóż na nią kroplę olejku cedrowego. Umieść małe konfokalne czasze laserowe zawierające barwione BMDC na stoliku mikroskopu.
    3. Kliknij przycisk Skanuj. Pod mikroskopem fluorescencyjnym zlokalizuj interesujące Cię komórki, przesuwając oś X, oś Y i oś Z. Dostosuj intensywność lasera, rozmiar obrazu i inne parametry, aby umożliwić skanowanie wysokiej jakości obrazów konfokalnych. Na koniec kliknij przycisk Przechwyć i zapisz obrazy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Do uzyskania PNPE użyto prostej, jednoetapowej sonifikacji. Po pierwsze, przygotowaliśmy jednolite PNP do użycia jako stabilizator ciał stałych (Rysunek 1A). Morfologia PNP została zaobserwowana za pomocą SEM, pokazując, że są one w większości jednolite i kuliste (Rysunek 1B). Wielkość hydrodynamiczna i potencjał zeta preparatów zostały wykryte za pomocą DLS. Średnica PNP wynosiła 187,7 ± 3,5 nm, a potencjał zeta wynosił -16,4 ± 0,4 mV (Rysunek 1C i

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opracowaliśmy stabilizowaną nanocząstkami emulsję olejowo-wodną PLGA jako system dostarczania w celu zwiększenia internalizacji antygenu. Przygotowany PNPE posiadał gęsto upakowaną powierzchnię, która wspierała miejsce lądowania oraz wyjątkową miękkość i płynność zapewniającą silny kontakt komórkowy z błoną komórek odpornościowych. Co więcej, interfejs olej/woda zapewniał obciążenie antygenem o wysokiej zawartości, a amfifilowy PLGA zapewniał PNPE wysoką stabilność w transporcie antygenów do komórek odpornościowych. PNPE...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Projekt wspierany przez Narodowy Kluczowy Program Badawczo-Rozwojowy Chin (2021YFE020527, 2021YFC2302605, 2021YFC2300142), od 0 do 1 Oryginalny Projekt Innowacyjny Podstawowego Pionierskiego Programu Badań Naukowych Chińskiej Akademii Nauk (ZDBS-LY-SLH040), Fundacji Innowacyjnych Grup Badawczych Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (Grant nr 21821005).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AddVaxInvivoGenVac-adx-10
Sitko do komórekBiosharpBS-70-CS70 μ
m Konfokalny laserowy mikroskop skaningowy (CLSM)NikonA1
Cy3 NHS EsterYEASEN40777ES03
Roztwór do barwienia DAPIBeyotimeC1005
Surowica bydlęca płodu (FBS)Gibco16000-044
FITC PhalloidinSolarbioCA1620
Mastersizer 2000 Analizator wielkości cząstekMalvern
Micro BCAThermo Science23235
Sprzęt do emulgowania membranZhongke Senhui Microsphere TechnologyFM0201/500M
Mini-wytłaczarkaAvanti Polar Lipids, Inc
NANO ZSMalvernJSM-6700F
Membrany poliwęglanoweAvanti Polar Lipids,
Poly (kwas mlekowo-ko-glikolowy) (PLGA)Sigma-Aldrich26780-50-7Mw 7,000-17,000
Roztwór poli-L-lizynySolarbioP2100
Poly (alkohol winylowy) (PVA)Sigma-Aldrich9002-89-5
QSense Czujnik dwutlenku krzemuBiolin ScientificQSX 303Chropowatość powierzchni < 1 nm RMS
Mikrowaga kwarcowaBiosharpQ-SENSE E4
RPMI Medium 1640 basicGibcoC22400500BTL-glutamina, 25 mM
Skaningowa mikroskopia elektronowaJEOLJSM-6700F
SkwalenSigma-Aldrich111-02-4
Zestaw do oznaczania białek Inc HEPES, SEM)

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ma, G., Gu, Z., Wei, W. Advanced vaccine delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 183, 114170(2022).
  2. Sharma, J., Carson, C. S., Douglas, T., Wilson, J. T., Joyce, S. Nano-particulate platforms for vaccine delivery to enhance antigen-specific cd8(+) t-cell response. Methods in Molecular Biology. 2412, 367-398 (2022).
  3. Nguyen, T. P., et al. Safety and immunogenicity of nanocovax, a sars-cov-2 recombinant spike protein vaccine: interim results of a double-blind, randomised controlled phase 1 and 2 trial. The Lancet Regional Health. Western Pacific. 24, 100474(2022).
  4. Coates, E. E., et al. Safety and immunogenicity of a trivalent virus-like particle vaccine against western, eastern, and venezuelan equine encephalitis viruses: a phase 1, open-label, dose-escalation, randomised clinical trial. The Lancet Infectious Diseases. 22 (8), 1210-1220 (2022).
  5. Wei, L., et al. Efficacy and safety of a nanoparticle therapeutic vaccine in patients with chronic hepatitis b: a randomized clinical trial. Hepatology. 75 (1), 182-195 (2022).
  6. Krishnan, R., Kim, J. O., Qadiri, S. S. N., Kim, J. O., Oh, M. J. Early viral uptake and host-associated immune response in the tissues of seven-band grouper following a bath challenge with nervous necrosis virus. Fish & Shellfish Immunology. 103, 454-463 (2020).
  7. Mishra, D., Mishra, P. K., Dubey, V., Dabadghao, S., Jain, N. K. Evaluation of uptake and generation of immune response by murine dendritic cells pulsed with hepatitis b surface antigen-loaded elastic liposomes. Vaccine. 25 (39-40), 6939-6944 (2007).
  8. Harwood, L. J., Gerber, H., Sobrino, F., Summerfield, A., Mccullough, K. C. Dendritic cell internalization of foot-and-mouth disease virus: influence of heparan sulfate binding on virus uptake and induction of the immune response. Journal of Virology. 82 (13), 6379-6394 (2008).
  9. Jing, H., et al. Fluorescent artificial antigens revealed extended membrane networks utilized by live dendritic cells for antigen uptake. Nano Letters. 22 (10), 4020-4027 (2022).
  10. Meena, J., Goswami, D. G., Anish, C., Panda, A. K. Cellular uptake of polylactide particles induces size dependent cytoskeletal remodeling in antigen presenting cells. Biomaterials Science. 9 (23), 7962-7976 (2021).
  11. Yang, J., et al. Drug delivery via cell membrane fusion using lipopeptide modified liposomes. ACS Central Science. 2 (9), 621-630 (2016).
  12. Rawle, R., Kasson, P., Boxer, S. Disentangling viral membrane fusion from receptor binding by using synthetic dna-lipid conjugates totether influenza virus to model lipid membranes. Biophysical Journal. 111 (1), 123-131 (2016).
  13. Ha, H. K., Kim, J. W., Lee, M. R., Jun, W., Lee, W. J. Cellular uptake and cytotoxicity of β-lactoglobulin nanoparticles: the effects of particle size and surface charge. Asian-Australasian Journal of Animal Sciences. 28 (3), 420-427 (2015).
  14. Malara, A., et al. Extracellular matrix structure and nano-mechanics determine megakaryocyte function. Blood. 118 (16), 4449-4453 (2011).
  15. Dankovich, T. M., et al. Extracellular matrix remodeling through endocytosis and resurfacing of tenascin-r. Nature Communications. 12 (1), 7129(2021).
  16. Evans, E., Buxbaum, K. Affinity of red-blood-cell membrane for particle surfaces measured by the extent of particle encapsulation. Biophysical Journal. 34 (1), 1-12 (1981).
  17. Rohner, N. A., Purdue, L. N., Von Recum, H. A. Affinity-based polymers provide long-term immunotherapeutic drug delivery across particle size ranges optimal for macrophage targeting. Journal of Pharmaceutical Sciences. 110 (4), 1693-1700 (2021).
  18. Zhou, X., Liu, Y., Wang, X. F., Li, X. M., Xiao, B. Effect of particle size on the cellular uptake and anti-inflammatory activity of oral nanotherapeutics. Colloids and Surfaces B-Biointerfaces. 187, 110880(2020).
  19. Zhang, D., et al. The morphology and surface charge-dependent cellular uptake efficiency of upconversion nanostructures revealed by single-particle optical microscopy. Chemical Science. 13 (12), 3610(2022).
  20. Xi, Y. K., et al. Co2-responsive pickering emulsions stabilized by soft protein particles for interfacial biocatalysis. Chemical Science. 13 (10), 2884-2890 (2022).
  21. Trivedi, R. P., Klevets, I. I., Senyuk, B., Lee, T., Smalyukh, I. I. Reconfigurable interactions and three-dimensional patterning of colloidal particles and defects in lamellar soft media. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 109 (13), 4744-4749 (2012).
  22. De Araujo, A. D., Hoang, H. N., Lim, J., Mak, J. Y. W., Fairlie, D. P. Tuning electrostatic and hydrophobic surfaces of aromatic rings to enhance membrane association and cell uptake of peptides. Angewandte Chemie. 61 (29), 03995(2022).
  23. Waku, T., et al. Effect of the hydrophilic-hydrophobic balance of antigen-loaded peptide nanofibers on their cellular uptake, cellular toxicity, and immune stimulatory properties. International Journal of Molecular Sciences. 20 (15), 3781(2019).
  24. Meng, X., et al. A soft pickering emulsifier made from chitosan and peptides endows stimuli-responsiveness, bioactivity and biocompatibility to emulsion. Carbohydrate Polymers. 277, 118768(2022).
  25. Wang, Z., et al. Fabrication and in vitro/vivo evaluation of drug nanocrystals self-stabilized pickering emulsion for oral delivery of quercetin. Pharmaceutics. 14 (5), 897(2022).
  26. Ji, J., et al. Core-shell-structured silica/polyacrylate particles prepared by pickering emulsion: influence of the nucleation model on particle interfacial organization and emulsion stability. Nanoscale Research Letters. 9 (1), 534(2014).
  27. Chen, l, et al. Quantitative evaluation of proteins with bicinchoninic acid (bca): resonance raman and surface-enhanced resonance raman scattering-based methods. Analyst. 137 (24), 5834-5838 (2012).
  28. Colino, J., Shen, Y., Snapper, C. M. Dendritic cells pulsed with intact streptococcus pneumoniae elicit both protein- and polysaccharide-specific immunoglobulin isotype responses in vivo through distinct mechanisms. The Journal of Experimental Medicine. 195 (1), 1-13 (2002).
  29. Zhang, Y., Wu, J., Zhang, H., Wei, J., Wu, J. Extracellular vesicles-mimetic encapsulation improves oncolytic viro-immunotherapy in tumors with low coxsackie and adenovirus receptor. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 574007(2020).
  30. Cappellano, G., Abreu, H., Casale, C., Dianzani, U., Chiocchetti, A. Nano-microparticle platforms in developing next-generation vaccines. Vaccines. 9 (6), 606(2021).
  31. McClelland, R. D., Culp, T. N., Marchant, D. J. Imaging flow cytometry and confocal immunofluorescence microscopy of virus-host cell interactions. Frontiers in Cellular Infection Microbiology. 11, 749039(2021).
  32. Konry, T., Sarkar, S., Sabhachandani, P., Cohen, N. Innovative tools and technology for analysis of single cells and cell-cell interaction. Annual Reviews of Biomedical Engineering. 18 (1), 259-284 (2016).
  33. D'Aurelio, R., et al. A comparison of EIS and QCM nanoMIP-based sensors for morphine. Nanomaterials. 11 (12), 3360(2021).
  34. Li, Y. J., et al. Artificial exosomes for translational nanomedicine. Journal of Nanobiotechnology. 19 (1), 242(2021).
  35. Rydell, G. E., Dahlin, A. B., Hook, F., Larson, G. QCM-D studies of human norovirus VLPs binding to glycosphingolipids in supported lipid bilayers reveal strain-specific characteristics. Glycobiology. 19 (11), 1176-1184 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Pickering EmulsionPLGA NanoparticlesBone Marrow Dendritic CellsConfocal MicroscopyQuartz Crystal MicrobalanceAntigen UptakeVaccine Formulation

Powiązane artykuły