Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Manipulacja genetyczna krętka boreliozy Borrelia burgdorferi za pośrednictwem fagów

2.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64408

⸱

28 września 2022

1Department of Biomedical Sciences, Quinnipiac University

W tym artykule

Podsumowanie

Zdolność bakteriofaga do przenoszenia DNA między komórkami bakteryjnymi czyni je skutecznymi narzędziami do genetycznej manipulacji ich bakteryjnych gospodarzy. Przedstawiono tutaj metodologię indukcji, odzyskiwania i wykorzystania φBB-1, bakteriofaga Borrelia burgdorferi, do transdukcji heterologicznego DNA między różnymi szczepami krętka boreliozy.

Streszczenie

Wprowadzenie obcego DNA do krętka Borrelia burgdorferi zostało prawie wyłącznie osiągnięte przez transformację za pomocą elektroporacji. Proces ten ma znacznie niższą skuteczność krętków boreliozy w porównaniu z innymi, lepiej scharakteryzowanymi bakteriami Gram-ujemnymi. Szybkość powodzenia transformacji jest w dużym stopniu zależna od posiadania skoncentrowanych ilości wysokiej jakości DNA z określonych środowisk i podlega znacznej zmienności między szczepami. Alternatywne sposoby wprowadzania obcego DNA (tj. wektorów wahadłowych, reporterów fluorescencyjnych i markerów oporności na antybiotyki) do B. burgdorferi mogą być ważnym dodatkiem do arsenału użytecznych narzędzi do manipulacji genetycznej krętka boreliozy. Bakteriofagi zostały uznane za naturalne mechanizmy przemieszczania się DNA wśród bakterii w procesie zwanym transdukcją. W tym badaniu opracowano metodę wykorzystania wszechobecnego faga rakowego φBB-1 do transdukcji DNA między komórkami B. burgdorferi zarówno o tym samym, jak i różnym pochodzeniu genetycznym. Transdukowane DNA obejmuje zarówno DNA borrelialne, jak i DNA heterologiczne w postaci małych wektorów wahadłowych. Demonstracja ta sugeruje potencjalne zastosowanie transdukcji za pośrednictwem fagów jako uzupełnienia elektroporacji do manipulacji genetycznej krętka boreliozy. W niniejszym raporcie opisano metody indukcji i oczyszczania faga φBB-1 z B. burgdorferi, zastosowanie tego faga w testach transdukcji oraz selekcję i badania przesiewowe potencjalnych transduktorów.

Wprowadzenie

Rozwój narzędzi do genetycznej manipulacji bakterii krętka Borrelia burgdorferi wniósł niezmierzoną wartość do zrozumienia natury boreliozy1,2,3,4. B. burgdorferi ma niezwykle złożony genom składający się z małego liniowego chromosomu oraz plazmidów liniowych i kolistych5,6. Spontaniczna utrata plazmidu, rearanżacja wewnątrzgenowa (przemieszczanie się genów z jednego plazmidu do drugiego w tym samym organizmie) i horyzontalny transfer genów (HGT, ruch DNA między dwoma organizmami) spowodowały zawrotną ilość heterogeniczności genetycznej wśród B. burgdorferi (na przykład patrz Schutzer et al.7). Powstałe w ten sposób genotypy (lub "szczepy") są członkami tego samego gatunku, ale mają różnice genetyczne, które wpływają na ich zdolność do przenoszenia i infekowania różnych ssaków gospodarzy8,9,10,11. W niniejszym sprawozdaniu termin "szczep" będzie używany w odniesieniu do B. burgdorferi o szczególnym pochodzeniu genetycznym pochodzenia naturalnego; Termin "klon" będzie używany w odniesieniu do szczepu, który został genetycznie zmodyfikowany w określonym celu lub w wyniku manipulacji eksperymentalnej.

Molekularny zestaw narzędzi dostępny do użycia u B. burgdorferi zawiera markery do wyboru, reportery genów, wektory wahadłowe, mutagenezę transpozonów, indukowalne promotory i markery do kontrselekcji (dla przeglądu, zobacz Drektrah and Samuels12). Skuteczne zastosowanie tych metodologii wymaga sztucznego wprowadzenia heterologicznego (obcego) DNA do badanego szczepu B. burgdorferi. U B. burgdorferi wprowadzenie heterologicznego DNA odbywa się prawie wyłącznie za pomocą elektroporacji, metody, która wykorzystuje impuls elektryczny, aby błona bakteryjna stała się przejściowo przepuszczalna dla małych fragmentów DNA wprowadzonych do pożywki1. Większość komórek (szacowana na ≥99,5%) jest zabijana przez impuls, ale pozostałe komórki mają wysoką częstotliwość zachowywania heterologicznego DNA13. Chociaż uważana za jedną z najbardziej efektywnych metod wprowadzania DNA do bakterii, częstotliwość elektroporacji u B. burgdorferi jest bardzo niska (od 1 transformantu na 5 ×10 4 do 5 × 106 komórek)13. Bariery na drodze do osiągnięcia wyższych częstotliwości transformacji wydają się być zarówno techniczne, jak i biologiczne. Bariery techniczne dla udanej elektroporacji B. burgdorferi obejmują zarówno ilość niezbędnego DNA (>10 μg), jak i wymóg, aby krętki znajdowały się w dokładnie prawidłowej fazie wzrostu (mid-log, między 2 × 107 komórek·mL−1 i 7 × 107 komórek·mL−1) podczas przygotowywania komórek elektrokompetentnych12, 13. Te bariery techniczne mogą być jednak łatwiejsze do pokonania niż bariery biologiczne.

Badacze choroby boreliozy uznają, że klony B. burgdorferi można podzielić na dwie szerokie kategorie pod względem ich zdolności do genetycznej manipulacji13,14. Izolaty o wysokiej pasażowości, przystosowane do badań laboratoryjnych są często łatwo przekształcane, ale zwykle tracą plazmidy niezbędne do zakaźności, zachowują się w fizjologicznie nieprawidłowy sposób i nie są w stanie zainfekować żywiciela ssaków ani przetrwać w wektorze kleszcza12,13. Chociaż klony te były przydatne do analizowania biologii molekularnej krętka w laboratorium, mają niewielką wartość dla badania krętka w biologicznym kontekście cyklu enzootycznego. Z drugiej strony, izolaty zakaźne o niskim pasażu zachowują się w sposób fizjologiczny odzwierciedlający stan zakaźny i mogą zakończyć cykl zakaźny, ale zwykle są oporne na wprowadzenie heterologicznego DNA i dlatego trudno nimi manipulować na potrzeby badania12,13. Trudność w przekształcaniu izolatów niskoprzepustowych jest związana z co najmniej dwoma różnymi czynnikami: (i) izolaty niskoprzepustowe często ściśle się ze sobą zlepiają, szczególnie w warunkach dużej gęstości wymaganych do elektroporacji, blokując w ten sposób wiele komórek przed pełnym zastosowaniem ładunku elektrycznego lub dostępem do DNA w pożywce13,15; oraz (ii) B. burgdorferi koduje co najmniej dwa różne systemy modyfikacji restrykcyjno-restrykcyjnej (R-M) przenoszone przez plazmid, które mogą zostać utracone w izolatach wysokoprzepustowych14,16. Systemy R-M ewoluowały, aby umożliwić bakteriom rozpoznawanie i eliminowanie obcego DNA17. Rzeczywiście, kilka badań nad B. burgdorferi wykazało, że wydajność transformacji wzrasta, gdy źródłem DNA jest B. burgdorferi, a nie Escherichia coli13,16. Niestety, uzyskanie od B. burgdorferi wymaganego wysokiego stężenia DNA do elektroporacji jest kosztowną i czasochłonną perspektywą. Innym potencjalnym problemem podczas elektroporacji i wyboru izolatów niskoprzelotowych jest to, że proces ten wydaje się faworyzować transformanty, które utraciły krytyczny plazmid związany ze zjadliwością, lp2514,18,19; tak więc sam akt genetycznej manipulacji izolatami B. burgdorferi o niskim pasażu za pomocą elektroporacji może selekcjonować klony, które nie nadają się do biologicznie istotnej analizy w cyklu enzootycznym20. Biorąc pod uwagę te problemy, system, w którym heterologiczne DNA może być elektrotransformowane w wysokopasażowe klony B. burgdorferi, a następnie przenoszone do niskopasażowych izolatów zakaźnych metodą inną niż elektroporacja, może być mile widzianym dodatkiem do rosnącej kolekcji narzędzi molekularnych dostępnych do stosowania w krętkach boreliozy.

Oprócz transformacji (pobierania nagiego DNA), istnieją dwa inne mechanizmy, dzięki którym bakterie regularnie pobierają heterologiczne DNA: koniugacja, która jest wymianą DNA między bakteriami w bezpośrednim kontakcie fizycznym ze sobą, oraz transdukcja, która jest wymianą DNA za pośrednictwem bakteriofaga21. Rzeczywiście, zdolność bakteriofaga do pośredniczenia w HGT została wykorzystana jako eksperymentalne narzędzie do analizy procesów molekularnych w wielu systemach bakteryjnych22,23,24. B. burgdorferi nie jest naturalnie zdolny do wychwytu nagiego DNA i niewiele jest dowodów na to, że B. burgdorferi koduje aparat niezbędny do pomyślnego sprzężenia. Poprzednie doniesienia opisywały jednak identyfikację i wstępną charakterystykę φBB-1, umiarkowanego bakteriofaga B. burgdorferi25,26,27,28. φBB-1 zawiera rodzinę plazmidów o wielkości 30 kb znalezionych w B. burgdorferi25; Członkowie tej rodziny zostali oznaczeni jako CP32S. Zgodnie z rolą φBB-1 w udziale w HGT wśród szczepów B. burgdorferi, Stevenson i in. zgłosili identyczny cp32 znaleziony w dwóch szczepach z innymi różnymi cp32, co sugeruje niedawne dzielenie tego cp32 między tymi dwoma szczepami, prawdopodobnie poprzez transdukcję29. Istnieją również dowody na znaczącą rekombinację poprzez HGT wśród cp32 w skądinąd stosunkowo stabilnym genomie30,31,32,33. Wreszcie, zdolność φBB-1 do transdukcji zarówno cp32, jak i heterologicznego DNA wektora wahadłowego między komórkami tego samego szczepu i między komórkami dwóch różnych szczepów została zademonstrowana wcześniej27,28. Biorąc pod uwagę te odkrycia, φBB-1 został zaproponowany jako kolejne narzędzie, które zostanie opracowane do analizy biologii molekularnej B. burgdorferi.

Celem tego raportu jest szczegółowe opisanie metody indukcji i oczyszczania faga φBB-1 z B. burgdorferi, a także dostarczenie protokołu do przeprowadzenia testu transdukcji między klonami B. burgdorferi oraz selekcji i badania przesiewowego potencjalnych transduktorów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty z użyciem rekombinowanego DNA i organizmów BSL-2 zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet Bezpieczeństwa Biologicznego Uniwersytetu Quinnipiac.

1. Przygotowanie kultury B. burgdorferi do produkcji φBB-1

  1. Przygotuj pożywkę Barbour-Stoenner-Kelly uzupełnioną 6,6% inaktywowaną termicznie normalną surowicą króliczą (BSK)15. Na 1 l 1x BSK połączyć składniki wymienione w tabeli 1 w 900 ml wody, dostosować pH do 7,6 za pomocą 1 N wodorotlenku sodu i powoli mieszać w temperaturze 4 °C przez 2-4 godziny. Po zakończeniu mieszania sprawdź i w razie potrzeby ponownie dostosuj pH do 7,6 i zwiększ objętość do 1 l wodą. Wysterylizuj pożywkę, przepuszczając przez filtr 0,22 μM (patrz tabela materiałów) i użyj świeżej lub przechowuj w temperaturze 4 °C przez ≤2 miesiące.
  2. Trzy do pięciu dni przed rozpoczęciem protokołu transdukcji zaszczepić 150 μl odpowiedniego klonu (klonów) B. burgdorferi do 15 ml 1x BSK w szczelnie zamkniętych sterylnych stożkowych probówkach wirówkowych (patrz Tabela materiałów). Uzupełnić pożywkę odpowiednim stężeniem antybiotyków lub kombinacją antybiotyków w celu selekcji i utrzymania heterologicznego DNA w obrębie klonu(-ów) B. burgdorferi (Tabela 2).
    UWAGA: B. burgdorferi jest organizmem o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2. Podejmij wszelkie odpowiednie środki ostrożności podczas pracy z tym organizmem. Wszystkie prace z żywymi kulturami bakterii B. burgdorferi należy wykonywać w certyfikowanym i odpowiednio zdezynfekowanym komorze bezpieczeństwa biologicznego II klasy. Właściwie zutylizuj cały materiał, który ma kontakt z B. burgdorferi i samymi organizmami zgodnie z wytycznymi CDC34.
  3. Inkubować kultury w temperaturze 33 °C bez wstrząsania, aż kultury osiągną gęstość ≥5 × 107 krętków·mL−1, co zajmuje około 3-5 dni.

2. Określ gęstość kultur(ów) B. burgdorferi (zmodyfikowane z Samuels)15

  1. W przypadku gęstości, które mają wynosić powyżej 5 × 106 komórek·mL−1, należy określić gęstość komórek za pomocą spektroskopii.
    1. Przenieść 1 ml kultury do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,7 ml i wirować przy 8 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    2. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4 i 1,8 mM KH2PO4). Przenieś całą zawiesinę komórek do półmikro przezroczystej kuwety UV.
    3. Oznaczyć gęstość optyczną zawieszonej próbki o długości fali 600 nm (A600). Wyzerować spektrofotometr (patrz Tabela materiałów) względem PBS.
    4. Aby obliczyć stężenie krętków·mL−1 w oryginalnej hodowli, pomnóż gęstość optyczną w A600 przez 1,4 × 109.
  2. W przypadku gęstości, które mają wynosić od 5 × 104 komórek·mL−1 i 5 × 106 komórek·mL−1, należy określić gęstość komórek za pomocą komory liczącej Petroffa-Haussera (patrz Tabela materiałów) w celu bezpośredniego policzenia liczby krętków. Metoda ta może być również stosowana w przypadku większych gęstości po odpowiednim rozcieńczeniu.
    UWAGA: Wizualizacja żywych krętków wymaga mikroskopu zmodyfikowanego kondensatorem ciemnego pola.
    1. Nanieść 10 μl próbki do komory zliczania i przykryć odpowiednią szklaną pokrywą. W przypadku gęstości większych niż 1 ×10 7 należy rozcieńczyć próbkę w PBS, aby uzyskać 50-100 krętków na pole.
    2. Policz komórki za pomocą mikroskopu ciemnego pola przy powiększeniu 200x-400x. Policz całe pole 25 grup po 16 małych kwadratów na wszystkich płaszczyznach.
    3. Pomnóż liczbę policzoną przez współczynnik rozcieńczenia (jeśli istnieje) i 5 × 104, aby otrzymać komórki ·mL−1 oryginalnej hodowli.

3. Indukcja faga B. burgdorferi φBB-1

UWAGA: Wysterylizuj wszystkie naczynia szklane i plastikowe przez autoklawowanie; wysterylizuj wszystkie roztwory przez autoklawowanie lub filtrację przez filtr 0,22 μM. Poniższe kroki przedstawiono w oparciu o objętości 15 ml, ale metoda jest skalowalna do mniejszych lub większych objętości w zależności od indywidualnych potrzeb eksperymentu.

  1. W przypadku kultury B. burgdorferi, z której zostanie wyprodukowany (dawca), należy użyć stężenia obliczonego za pomocą dowolnej metody w kroku 2 w celu określenia objętości kultury starterowej potrzebnej do otrzymania 4 ml 2 × 108 krętków·mL−1. W ten sposób uzyska się końcowe stężenie 5 × 107 krętków ·mL−1 w 15 ml na etapie odzyskiwania (krok 3.6 poniżej).
  2. Odwirować objętość kultury obliczoną w kroku 3.1 przy 6 000 x g przez 10 minut. Zdekantować supernatant i ponownie zawiesić osad w 4 ml świeżego BSK. Przenieść próbkę do najmniejszej dostępnej sterylnej probówki, w której można umieścić próbkę przy minimalnej przestrzeni nad głową.
  3. Dodać odpowiednią ilość środka indukującego do zalecanego stężenia (Tabela 3) w oparciu o objętość hodowli wynoszącą 4 ml w celu indukcji produkcji fagów. Szczelnie zakręć tubkę i dokładnie wymieszaj.
  4. Inkubować próbkę w temperaturze 33 °C przez 2-4 godziny.
  5. Po inkubacji przenieść próbkę do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Odwirować próbkę o masie 6 000 x g przez 10 minut. Zdekantować supernatant.
  6. Zawiesić osad komórkowy w 15 ml 1x BSK.
    UWAGA: Po indukcji faga istnieją dwa różne sposoby przeprowadzenia testu transdukcji. Metody te są przedstawione w Rysunek 1 oraz w kroku 4 i kroku 6.

4. Transdukcja podczas wspólnej hodowli po ekspozycji dawcy na czynnik indukujący (Rysunek 1A)

UWAGA: Ten protokół może być stosowany tylko wtedy, gdy szczep produkujący fagi (dawca) ma oporność na określony antybiotyk, a szczep, który ma być transdukowany (biorca) ma oporność na inny antybiotyk.

  1. Przygotować kulturę B. burgdorferi, która zostanie wykorzystana jako biorca w testach transdukcji, jak opisano dla szczepu dawcy w kroku 1 powyżej. Na podstawie gęstości określonej jak w kroku 2 oblicz objętość potrzebną do uzyskania 15 ml 1 × 107 krętków·ml−1.
  2. Odwirować objętość kultury obliczoną w kroku 4.1 przy 6 000 x g przez 10 minut. Zdekantować supernatant.
  3. Zawiesić osad w 1 ml kultury z kroku 3.6 (zawieszony dawca fagów). Dodaj ponownie zawieszonego biorcę z powrotem do posiewu z dawcą. Nie należy suplementować antybiotykiem. Całkowita objętość zawierająca obie kultury wynosi 15 ml.
  4. Inkubować w temperaturze 33 °C przez 72-96 godzin.
  5. Przeprowadzić selekcję transduktorów przez posiew w fazie stałej po kohodowli, jak opisano w kroku 7.

5. Wytrącanie glikolu polietylenowego (PEG) w celu odzyskania faga do wykorzystania w teście transdukcji

UWAGA: Ten protokół może być stosowany w przypadkach, gdy szczep wytwarzający fagi (dawca) ma oporność na określony antybiotyk, a szczep, który ma być transdukowany (biorca) albo nie ma oporności na antybiotyki, albo jest oporny na inny antybiotyk.

  1. Uzupełnić posiew z kroku 3.6 odpowiednim antybiotykiem o stężeniu wskazanym w tabeli 2. Inkubować próbkę w temperaturze 33 °C przez 72–96 godzin.
  2. Przygotuj roztwory do wytrącania PEG.
    1. Przygotować 500 ml 5 M NaCl. Sterylizować w autoklawie i pozostawić do ostygnięcia przed użyciem. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
    2. Przygotuj 500 ml 40% PEG, rozpuszczając 200 g PEG8000 w 400 ml wody; delikatnie podgrzewaj, mieszając, aż roztwór będzie dobrze wymieszany. Uzupełnić objętość do 500 ml wodą. Aby całkowicie rozpuścić PEG8000 i wysterylizować roztwór, należy autoklawować roztwór i schłodzić przed użyciem. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
    3. Przygotować 100 ml pożywki zawiesinowej (SM; 100 mM NaCl, 10 mMMgSO4 i 50 mM Tris-HCl [pH 7,5]). Sterylizuj w autoklawie. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
  3. W przypadku wytrącania PEG faga z klonu dawcy B. burgdorferi (od etapu 3.6), po 72-96 godzinach inkubacji, odwirować próbki w temperaturze 8 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
  4. Zdekantować supernatant do czystej stożkowej probówki o pojemności 50 ml; usunąć osad z komórek. Dodać 5 M NaCl do końcowego stężenia 1 M. Dobrze wymieszać. Delikatnie kołysz w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
  5. Odwirować próbki o masie 8 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Zdekantować supernatant do czystej stożkowej probówki o pojemności 50 ml; osad może być mały lub nie ma go wcale. Dodać 40% PEG8000 roztworu do supernatantu do końcowego stężenia 10%. Dobrze wymieszaj i ustaw na lodzie na dłużej niż 1 godzinę do nocy.
    UWAGA: Dłuższe czasy nie wydają się korelować ze znacznie zwiększonym odzyskiwaniem fagów.
  6. Odwirować próbki o masie 8 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i usunąć jak najwięcej nadmiaru cieczy, nie tracąc przy tym żadnych osadów, które zawierają cząstki fagów.
  7. Zawiesić osad w minimalnej objętości SM, używając SM do zmycia boku butelki i zebrania wszelkich potencjalnych cząstek fagów. Zalecany stosunek to 400 μl SM na 10 ml oryginalnego supernatantu, ale w zależności od wielkości osadu, do całkowitego ponownego zaparcia może być wymagana większa lub mniejsza ilość SM.
  8. Odzyskaną próbkę faga należy poddać działaniu równej objętości chloroformu w zależności od objętości ponownego zawieszenia. Dobrze wymieszać próbkę, a następnie odwirować przy 8 000 x g przez 10 minut. Usuń wodną (górną) warstwę do czystej probówki, unikając grubej warstwy interfejsu.
    UWAGA: φBB-1 jest bakteriofagiem bezotoczkowym i nie jest podatny na obróbkę chloroformem25. Ten krok ma na celu dalsze zakłócenie wszelkich struktur związanych z błoną (tj. komórek lub pęcherzyków) i zabicie wszelkich potencjalnych zanieczyszczeń komórkowych. Chloroform jest lotnym substancją substancyjną substancją substancyjną i może być stosowany wyłącznie w dobrze wentylowanym dygestorium; Materiał zawierający chloroform należy wyrzucić jako odpad organiczny.
  9. Oznaczyć objętość odzyskaną po pierwszym poddaniu działaniu chloroformu i ponownie poddać próbkę działaniu chloroformu w ilości równej 10% tej objętości. Dobrze wymieszać i odwirować przy 8 000 x g przez 10 minut. Usuń warstwę wodną (górną), uważając, aby uniknąć jakiejkolwiek warstwy interfejsu lub warstwy organicznej. Przenieś warstwę wodną do czystej probówki.
  10. należy zużyć natychmiast (zgodnie z opisem w kroku 6) lub przechowywać w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Nie zaleca się zamrażania próbek fagów φBB-1. Chociaż stabilność φBB-1 w temperaturze 4 °C nie została rygorystycznie zbadana, próbki przechowywane w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca po wyzdrowieniu były z powodzeniem wykorzystywane w testach transdukcji.

6. Test transdukcji po wytrąceniu PEG φBB-1 (Rysunek 1B)

  1. Przygotować kultury B. burgdorferi do wykorzystania jako biorca w testach transdukcji, jak opisano dla szczepu dawcy w kroku 1 powyżej. Na podstawie gęstości określonej jak w kroku 2 oblicz objętość kultury biorcy potrzebną do uzyskania 15 ml 1 × 107 krętków·mL−1.
  2. Odwirować objętość kultury obliczoną w kroku 6.1 przy 6 000 x g przez 10 minut. Zdekantować supernatant i ponownie zawiesić osad w 14,5 ml świeżego BSK.
  3. Dodać ≤500 μl próbki faga wytrąconej PEG (z kroku 5) do hodowli klonu biorcy. Dobrze wymieszać i inkubować w temperaturze 33 °C przez 72-96 h.
    UWAGA: Ilość faga odzyskanego podczas wytrącania PEG może być zmienna, w zależności od wielu czynników. Jednak z 15 ml hodowli indukowanego szczepu B. burgdorferi CA-11.2A, 500 μL zazwyczaj zawiera 50-1,000 żywotnych fagów28. Objętości odzysku fagów ≥500 μl niekorzystnie wpływają na wzrost B. burgdorferi, prawdopodobnie ze względu na zwiększony stosunek SM do BSK.
  4. Przeprowadzić selekcję transduktorów przez posiewanie w fazie stałej po zmieszaniu z fagiem wytrąconym przez PEG, jak opisano w kroku 7.

7. Wybór transduktorów

UWAGA: Posiewanie potencjalnych transduktorów w fazie stałej odbywa się za pomocą jednowarstwowej modyfikacji protokołu opisanego po raz pierwszy przez Samuels15. Kolonie B. burgdorferi rosną w agarze tak, więc w celu selekcji transduktorów przez posiewanie w fazie stałej, próbki muszą być dodawane do pożywki podczas nalewania płytek. Alternatywna metoda doboru transformantów metodą rozcieńczania w płytkach 96-dołkowych również została opisana wcześniej35. Technika ta może być również skuteczna w doborze transduktorów, ale nie została jeszcze wypróbowana w tym celu.

  1. Określić liczbę płytek potrzebnych do wyboru transduktorów na podstawie liczby próbek z testów transdukcji i kontroli, które mają być platerowane.
    UWAGA: Zazwyczaj na próbkę wlewa się dwie płytki, jedną odpowiadającą około 10% objętości kultury i drugą, która zawiera pozostałą część kultury. Dodatkowo należy wlać płytki, które służą jako kontrola ujemna do indywidualnego testowania, czy preparat fagowy i/lub klony rodzicielskie użyte jako dawca i biorca nie rosną w obecności antybiotyku (antybiotyków) użytego podczas selekcji. Zaleca się również przygotowanie materiału galwanicznego na co najmniej dwie dodatkowe płyty. Na przykład, jeśli liczba próbek i prób kontrolnych do posiewu wynosi osiem, należy przygotować wystarczającą ilość mieszanki galwanicznej na 10 płytek.
  2. Przygotuj roztwory do powlekania zgodnie z poniższym opisem.
    UWAGA: Każda płytka będzie miała 30 ml, składającą się z 20 ml 1,5x BSK do posiewu i 10 ml 2,1% agarozy (stosunek 2:1). W ten sposób otrzymamy płytkę o końcowych stężeniach 1x BSK i 0,7% agarozy. Na przykład na 10 płytek przygotuj łączną mieszankę galwaniczną o pojemności 300 ml, składającą się z 200 ml 1,5 x BSK i 100 ml 2,1% agarozy.
    1. Przygotować 1 l 1,5x BSK zgodnie z opisem dla 1x BSK w kroku 1.1, używając ilości każdego składnika podanych dla 1,5x BSK w Tabeli 1. Przechowywać zgodnie z opisem dla 1x BSK.
    2. Przygotuj 2,1% agarozy w wodzie i autoklawie. Roztwór agarozy należy stosować na świeżo lub przechowywać w temperaturze pokojowej. W przypadku przechowywania w temperaturze pokojowej należy używać w kuchence mikrofalowej z luźno założoną pokrywką, aż do całkowitego stopienia przed poszyciem.
    3. Określić objętość antybiotyku (antybiotyków) potrzebną do osiągnięcia odpowiedniego stężenia (tabela 2) na podstawie całej mieszaniny galwanicznej.
      UWAGA: Jeśli całkowita objętość końcowego roztworu do powlekania wynosi 300 ml, wymieszaj 200 ml 1,5 x BSK i wystarczającą ilość antybiotyku, aby upewnić się, że całe 300 ml ma prawidłowe końcowe stężenie antybiotyku. Jeśli zarówno dawca, jak i biorca w teście transdukcji mają różne geny oporności na antybiotyki, mieszanka posiewowa powinna zawierać oba antybiotyki. Jeśli wytrącony przez PEG od dawcy (przygotowany w kroku 5) koduje marker oporności na antybiotyki, a biorca nie ma takiego markera, mieszanka posiawiająca powinna zawierać tylko jeden antybiotyk.
  3. W zależności od liczby płytek do nalania, przenieś odpowiednią ilość 1,5x BSK i antybiotyku(ów) do sterylnej butelki wystarczająco dużej, aby pomieścić całą mieszankę galwaniczną. Utrzymywać równowagę w łaźni wodnej w temperaturze 56 °C przez ≥15 min.
  4. Zrównoważyć stopioną agarozę z autoklawu lub kuchenki mikrofalowej w łaźni wodnej o temperaturze 56 °C przez ≥15 min.
  5. Po zrównoważeniu dodać oznaczoną ilość 2,1% agarozy do butelki z 1,5x BSK (z antybiotykiem) i umieścić roztwór galwaniczny z powrotem w łaźni wodnej o temperaturze 42 °C na 10-15 min.
    UWAGA: Wyższe temperatury mogą uszkodzić lub zabić krętki36. Jeśli używasz tej samej łaźni wodnej co powyżej, schłodzić łaźnię wodną do 42-45 °C przed uruchomieniem timera do równoważenia. Nie pozwól, aby roztwór galwaniczny równoważył się w temperaturze 42 °C przez więcej niż 20 minut, w przeciwnym razie zacznie krzepnąć podczas nalewania płytek.
  6. Podczas równoważenia należy przygotować próbki B. burgdorferi do platerowania. Przenieś ilość do posiewu do sterylnej stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml (patrz Tabela materiałów).
    1. W przypadku powlekania ilości mniejszej niż 1,5 ml (<5% końcowej objętości płytki 30 ml), przenieś próbkę do nowej probówki i dodaj mieszankę galwaniczną bezpośrednio do próbki podczas posiewu.
    2. W przypadku większych objętości przenieś żądaną objętość kultury do nowej probówki, a następnie odwiruj przy 6 000 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Zdekantować tylko 100-500 μl supernatantu i użyć pozostałej części do całkowitego zawieszenia osadu przed posiewem.
    3. W przypadku płytek kontrolnych po jednoczesnej hodowli dodać ≥107 komórek klonów dawcy lub biorcy do sterylnych stożkowych probówek wirówkowych o pojemności 50 ml. Jeśli objętość przekracza 1,5 ml, odwirować i ponownie zawiesić osad, jak w kroku 7.6.2. Jeśli test transdukcji został przeprowadzony przy użyciu faga wytrąconego przez PEG, oprócz klonu biorcy, dodaj 100-250 μl próbki faga do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml w celu posiewu.
  7. Po osiągnięciu równowagi roztworu galwanicznego w temperaturze 42-45 °C przez 10-15 minut, przenieść 30 ml roztworu galwanicznego do probówki z odpowiednią próbką; natychmiast dozować mieszaninę galwaniczną i próbkę do oznaczonej tabliczki. Powtórzyć czynności z nową pipetą dla każdej próbki, która ma być pokryta płytką.
  8. Pozostawić płytki do zestalenia się na 15-20 minut, a następnie umieścić je w inkubatorze o temperaturze 33 °C uzupełnionym 5% CO2 . Nie odwracaj płytek przez co najmniej 48 godzin po naleniu.
  9. W zależności od tła klonu biorcy, sprawdź, czy kolonie pojawiają się w agarozie na płytkach selekcyjnych po 10-21 dniach inkubacji. Zbierz co najmniej 5-10 kolonii, które rosną na płytce w obecności obu antybiotyków, za pomocą wysterylizowanej pipety borokrzemianowej 5,75 cala z zatyczką bawełnianą (patrz Tabela materiałów) i zaszczep je w 1,5 ml 1x BSK odpowiednim antybiotykiem (antybiotykami).
  10. Hodować zaszczepione kolonie w temperaturze 33 °C, jak w kroku 1.3, przez 3-5 dni lub do momentu, gdy osiągną gęstość około 20-40 krętków na pole przy 200-krotnym powiększeniu, używając mikroskopii ciemnego pola.
    UWAGA: Po przesianiu (patrz krok 8) krętki można zamrozić w celu długotrwałego przechowywania w temperaturze -80 °C, mieszając równą objętość kultury z mieszaniną 60% glicerolu i 40% 1x BSK, sterylizowane przez filtrację przez filtr 0,22 μm.

8. Weryfikacja potencjalnych transduktorów

UWAGA: Przebadaj klony, które rosną na płytkach w obecności dwóch antybiotyków, aby sprawdzić, czy reprezentują prawdziwe transduktanty w przewidywanym (biorczym) tle. Metody te opierają się na amplifikacji i potencjalnie sekwencjonowaniu określonych regionów w reakcji łańcuchowej polimerazy. Szczegółowe protokoły i praktyki wykonywania PCR u B. burgdorferi są opisane w innym miejscu (niedawny przykład można znaleźć w Seshu et al.37). Wybierz startery używane do przesiewania transduktorów w oparciu o użyte szczepy. Poniżej opisano kilka sugestii, jak podejść do badań przesiewowych transduktorów.

  1. Przygotuj lizaty B. burgdorferi do badań przesiewowych PCR.
    UWAGA: Poniższy protokół stosuje się do wytwarzania przemytych lizatów B. burgdorferi z hodowanych komórek hodowanych w sposób opisany w kroku 7.9 w celu natychmiastowej analizy DNA metodą PCR. Metoda ta ma na celu zminimalizowanie interferencji potencjalnych inhibitorów w BSK, ale nie jest zalecana do wytwarzania wysokiej jakości DNA do sekwencjonowania lub przechowywania. W tym celu należy użyć protokołu lub zestawu do całkowitej ekstrakcji genomu (patrz tabela materiałów). Zdecydowanie zaleca się, aby lizaty z klonów rodzicielskich (zarówno szczepów dawcy, jak i biorcy) były również przygotowywane w tym samym czasie, aby zostały uwzględnione w każdej analizie.
    1. Przenieść 500 μl każdego potencjalnego transduktora wybranego i wyhodowanego zgodnie z krokiem 7.10 do czystej probówki do mikrowirówki.
    2. Odwirowywać kultury przez 10 minut przy 8 000 x g w temperaturze pokojowej.
    3. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić każdą osadkę w 500 μl TE (10 mM Tris Cl, pH 8,0; 1 mM EDTA, pH 8,0). Wirować przez 5 minut przy 8 000 x g w temperaturze pokojowej.
    4. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić każdą granulkę w 50 μl wody o jakości PCR. Gotować próbki przez 10 minut. Pozwól im krótko ostygnąć, a następnie odwiruj przy 8 000 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
    5. Do każdego PCR należy natychmiast użyć 2 μl od góry odwirowanej próbki; unikać naruszania osadu.
  2. Badanie przesiewowe potencjalnych transduktorów pod kątem określonych genów kodujących oporność na antybiotyki za pomocą PCR. Patrz Tabela 4 dla starterów do badań przesiewowych markerów oporności na antybiotyki powszechnie stosowanych w testach transdukcji.
    UWAGA: Chociaż z naszego doświadczenia wynika, że rzadko dochodzi do spontanicznej mutacji antybiotyków aminoglikozydowych stosowanych do selekcji heterologicznego DNA u B. burgdorferi.
  3. Przesiewaj potencjalne transduktory również za pomocą innego markera szczepu lub klonu, aby potwierdzić, że tło jest tłem biorcy. W analizach tych należy uwzględnić zarówno klony rodzicielskie dawcy, jak i biorcy. Badanie przesiewowe markerów specyficznych dla szczepu przy użyciu sekwencji opartych na użytych szczepach i indywidualnych protokołach laboratoryjnych w celu określenia integralności szczepu.
  4. W przypadku próby transdukcji do zjadliwych klonów do użycia w obrębie wektora kleszcza lub żywiciela ssaka lub do bezpośredniego porównania z innym klonem, należy określić pełną zawartość plazmidu w transduktantach i klonach rodzicielskich. Ma to na celu zapewnienie takiej samej zawartości plazmidu, jak w szczepie porównawczym, lub obecności elementów genetycznych niezbędnych do rozmnażania w cyklu enzootycznym, jak opisano w innym miejscu 18,19,37,38,39.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wykorzystanie bakteriofagów do przenoszenia DNA między łatwiej transformowalnymi szczepami B. burgdorferi a klonami opornymi na elektrotransformację stanowi kolejne narzędzie do dalszych badań molekularnych nad determinantami choroby z Lyme. Opisany w niniejszej pracy test transdukcji może być modyfikowany w zależności od potrzeb, aby ułatwić przenoszenie DNA między dowolnymi interesującymi klonami, z wykorzystaniem jednego lub dwóch antybiotyków do selekcji potencjalnych transduktantów. Wcześniej wykazano tran...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Zastosowanie transdukcji może stanowić jedną z metod pokonywania przynajmniej niektórych barier biologicznych i technicznych związanych z elektrotransformacją B. burgdorferi 1,4,13,37. W wielu systemach bakteriofag może przenosić DNA gospodarza (nie-profagowego) między komórkami bakteryjnymi poprzez uogólnioną lub wyspecjalizowaną transdukcję 22,23,24,49,50.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autor nie ma nic do zdradzienia.

Podziękowania

Autor pragnie podziękować Shawnie Reed, D. Scottowi Samuelsowi i Patrickowi Secorowi za ich użyteczną dyskusję oraz Vareeon (Pam) Chonweerawong za ich pomoc techniczną. Praca ta była wspierana przez Wydział Nauk Biomedycznych i granty badawcze dla Christiana H. Eggersa ze Szkoły Nauk o Zdrowiu na Uniwersytecie Quinnipiac.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Jednostki filtracyjne 1 L (PES, 0,22 µ m rozmiar porów)Rurka Millipore SigmaS2GPU10RE
12 mm x 75 mm (nasadka dwupozycyjna) (polipropylen)USA Scientific1450-0810mieści 4 ml z małą objętością pustek (do indukcji)
Stożkowe probówki wirówkowe 15 ml (polipropylen)USA Scientific5618-8271
1-metylo-3-nitrozo-nitroguanidyna (MNNG)Millipore SigmaUWAGA: potencjalny czynnik rakotwórczy; nie są już łatwo dostępne, nie testowały oferowanych zastępczych
pipet Pasteura 5,75 cala (zatyczone bawełniane/szkło borokrzemianowe/niesterylne)Autoklaw Thermo Fisher Scientific13-678-8Aprzed użyciem
50 ml stożkowe probówki wirówkowe (polipropylen)USA Scientific1500-1211
Absolutny etanol
Agaroza LEDot Scientific inc.AGLE-500
Bacto NeopeptoneGibcoDF0119-17-9
Bacto TC YeastolateGibco255772
Albumina surowicy bydlęcej (stopień wymiany surowicy)Gemini Bio-Products700-104P
Chloroform (do biologii molekularnej)Thermo Fisher ScientificBP1145-1UWAGA: lotne organiczne; Stosować tylko w wyciągu chemicznym
CMRL-1066 bez L-glutaminy (proszek)US BiologicalC5900-01klasa hodowli komórkowej
ErytromycynaResearch Products International CorpE57000-25.0
Roztwór odczynnika gentamycynyGibco15750-060
Glukoza (dekstroza bezwodna)Thermo Fisher ScientificBP350-500
HEPESThermo Fisher ScientificBP310-500
Siarczan kanamycynyThermo Fisher Scientific25389-94-0
Millex-GS (0,22 &mikro; Rozmiar porów M)Millipore SigmaSLGSM33SSdo filtrowania, sterylizacji antybiotyków i innych roztworów o małej objętości
Mitomycyna CThermo Fisher ScientificBP25312UWAGA: potencjalny czynnik rakotwórczy; stosować tylko w dygestorii chemicznej
N-acetylo-D-glukozaminaMP Biomedicals, LLC100068
Oligonukleotydy (startery do PCR)IDT DNA
OmniPrep (zestaw do ekstrakcji całego genomu)G Biosciences786-136
Szalka Petriego (100 mm i razy 15 mm)Thermo Fisher ScientificFB0875712
Komora licząca Petroff-HausserHausser scientificHS-3900
Szkło pokrywowe komory liczenia Petroff-HausserHausser scientificHS-5051
Glikol polietylenowy 8000 (PEG)Thermo Fisher ScientificBP233-1
Surowica królicza niesterylna śladowa hemoliza młodych (NRS)Pel-Freez Biologicals31119-3inaktywacja termiczna zgodnie z instrukcjami producenta
Półmikro przezroczyste kuwety UVUSA Scientific9750-9150
Wodorowęglan soduThermo Fisher ScientificBP328-500
ChloreksoduThermo Fisher ScientificBP358-1
Pirogronian soduMillipore SigmaP8674-25G
Spectronic Genesys 5Thermo Fisher Scientific
roztwór siarczanu streptomycynyMillipore SigmaS6501-50G
Cytrynian trisodowy dwuwodnyMillipore SigmaS1804-500Gcytrynian sodu do BSK

Bibliografia

  1. Samuels, D. S., Drecktrah, D., Hall, L. S. Genetic transformation and complementation. Methods in Molecular Biology. 1690, 183-200 (2018).
  2. Winslow, C., Coburn, J. Recent discoveries and advancements in research on the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi. F1000Research. 8, F1000 Faculty Rev-763 (2019).
  3. Coburn, J., et al. Lyme disease pathogenesis. Current Issues in Molecular Biology. 42, 473-518 (2021).
  4. Rosa, P. A., Jewett, M. W. Genetic manipulation of Borrelia. Current Issues in Molecular Biology. 42, 307-332 (2021).
  5. Fraser, C. M., et al. Genomic sequence of a Lyme disease spirochaete, Borrelia burgdorferi. Nature. 390 (6660), 580-586 (1997).
  6. Casjens, S., et al. A bacterial genome in flux: The twelve linear and nine circular extrachromosomal DNAs in an infectious isolate of the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi. Molecular Microbiology. 35 (3), 490-516 (2000).
  7. Schutzer, S. E., et al. Whole-genome sequences of thirteen isolates of Borrelia burgdorferi. Journal of Bacteriology. 193 (4), 1018-1020 (2011).
  8. Ohnishi, J., Piesman, J., de Silva, A. M. Antigenic and genetic heterogeneity of Borrelia burgdorferi populations transmitted by ticks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (2), 670-675 (2001).
  9. Dykhuizen, D. E., et al. The propensity of different Borrelia burgdorferi sensu stricto genotypes to cause disseminated infections in humans. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 78 (5), 806-810 (2008).
  10. Hanincova, K., et al. Multilocus sequence typing of Borrelia burgdorferi suggests existence of lineages with differential pathogenic properties in humans. PLoS One. 8 (9), 73066(2013).
  11. Kern, A., et al. Heterogeneity of Borrelia burgdorferi sensu stricto population and its involvement in Borrelia pathogenicity: Study on murine model with specific emphasis on the skin interface. PLoS One. 10 (7), 0133195(2015).
  12. Drecktrah, D., Samuels, D. S. Genetic manipulation of Borrelia spp. Current Topics in Microbiology and Immunology. 415, 113-140 (2017).
  13. Tilly, K., Elias, A. F., Bono, J. L., Stewart, P., Rosa, P. DNA exchange and insertional inactivation in spirochetes. Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology. 2 (4), 433-442 (2000).
  14. Lawrenz, M. B., Kawabata, H., Purser, J. E., Norris, S. J. Decreased electroporation efficiency in Borrelia burgdorferi containing linear plasmids lp25 and lp56: Impact on transformation of infectious B. burgdorferi. Infection and Immunity. 70 (9), 4798-4804 (2002).
  15. Samuels, D. S. Electrotransformation of the spirochete Borrelia burgdorferi. Methods in Molecular Biology. 47, 253-259 (1995).
  16. Rego, R. O., Bestor, A., Rosa, P. A. Defining the plasmid-borne restriction-modification systems of the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi. Journal of Bacteriology. 193 (5), 1161-1171 (2011).
  17. Makarova, K. S., Wolf, Y. I., Koonin, E. V. Comparative genomics of defense systems in archaea and bacteria. Nucleic Acids Research. 41 (8), 4360-4377 (2013).
  18. Grimm, D., Elias, A. F., Tilly, K., Rosa, P. A. Plasmid stability during in vitro propagation of Borrelia burgdorferi assessed at a clonal level. Infection and Immunity. 71 (6), 3138-3145 (2003).
  19. Grimm, D., et al. Experimental assessment of the roles of linear plasmids lp25 and lp28-1 of Borrelia burgdorferi throughout the infectious cycle. Infection and Immunity. 72 (10), 5938-5946 (2004).
  20. Heery, D. M., Powell, R., Gannon, F., Dunican, L. K. Curing of a plasmid from E. coli using high-voltage electroporation. Nucleic Acids Research. 17 (23), 10131(1989).
  21. Ochman, H., Lawrence, J. G., Groisman, E. A. Lateral gene transfer and the nature of bacterial innovation. Nature. 405 (6784), 299-304 (2000).
  22. Morsczeck, C. Strategies for mycobacterial genetics. International Journal of Medical Microbiology. 293 (4), 251-259 (2003).
  23. Thomason, L. C., Costantino, N., Court, D. L. E. coli genome manipulation by P1 transduction. Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 1 1-8 (2007).
  24. Keller, C. M., Kendra, C. G., Bruna, R. E., Craft, D., Pontes, M. H. Genetic modification of Sodalis species by DNA transduction. mSphere. 6 (1), e01331(2021).
  25. Eggers, C. H., Samuels, D. S. Molecular evidence for a new bacteriophage of Borrelia burgdorferi. Journal of Bacteriology. 181 (23), 7308-7313 (1999).
  26. Eggers, C. H., et al. Bacteriophages of spirochetes. Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology. 2 (4), 365-373 (2000).
  27. Eggers, C. H., et al. Transduction by φBB-1, a bacteriophage of Borrelia burgdorferi. Journal of Bacteriology. 183 (16), 4771-4778 (2001).
  28. Eggers, C. H., et al. Phage-mediated horizontal gene transfer of both prophage and heterologous DNA by φBB-1, a bacteriophage of Borrelia burgdorferi. Pathogens and Disease. 74 (9), (2016).
  29. Stevenson, B., Miller, J. C. Intra- and interbacterial genetic exchange of Lyme disease spirochete erp genes generates sequence identity amidst diversity. Journal of Molecular Evolution. 57 (3), 309-324 (2003).
  30. Dykhuizen, D. E., Baranton, G. The implications of a low rate of horizontal transfer in Borrelia. Trends in Microbiology. 9 (7), 344-350 (2001).
  31. Brisson, D., Drecktrah, D., Eggers, C. H., Samuels, D. S. Genetics of Borrelia burgdorferi. Annual Reviews in Genetics. 46, 515-536 (2012).
  32. Brisson, D., Zhou, W., Jutras, B. L., Casjens, S., Stevenson, B. Distribution of cp32 prophages among Lyme disease-causing spirochetes and natural diversity of their lipoprotein-encoding erp loci. Applied and Environmental Microbiology. 79 (13), 4115-4128 (2013).
  33. Schwartz, I., Margos, G., Casjens, S. R., Qiu, W. G., Eggers, C. H. Multipartite genome of Lyme disease Borrelia: Structure, variation and prophages. Current Issues in Molecular Biology. 42, 409-454 (2021).
  34. Centers for Disease Control and Prevention. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories,. 6th edition. , Centers for National Institutes of Health. Bethesda, Maryland. (2020).
  35. Yang, X. F., Pal, U., Alani, S. M., Fikrig, E., Norgard, M. V. Essential role for OspA/B in the life cycle of the Lyme disease spirochete. Journal of Experimental Medicine. 199 (5), 641-648 (2004).
  36. Lee, S. K., Yousef, A. E., Marth, E. H. Thermal inactivation of Borrelia burgdorferi, the cause of Lyme disease. Journal of Food Protection. 53 (4), 296-299 (1990).
  37. Seshu, J., Moy, B. E., Ingle, T. M. Transformation of Borrelia burgdorferi. Current Protocols. 1 (3), 61(2021).
  38. Purser, J. E., Norris, S. J. Correlation between plasmid content and infectivity in Borrelia burgdorferi. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (25), 13865-13870 (2000).
  39. Labandeira-Rey, M., Seshu, J., Skare, J. T. The absence of linear plasmid 25 or 28-1 of Borrelia burgdorferi dramatically alters the kinetics of experimental infection via distinct mechanisms. Infection and Immunity. 71 (8), 4608-4613 (2003).
  40. Ruzic-Sabljic, E., et al. Comparison of MKP and BSK-H media for the cultivation and isolation of Borrelia burgdorferi sensu lato. PLoS One. 12 (2), 0171622(2017).
  41. Wang, G., et al. Variations in Barbour-Stoenner-Kelly culture medium modulate infectivity and pathogenicity of Borrelia burgdorferi clinical isolates. Infection and Immunity. 72 (11), 6702-6706 (2004).
  42. Bono, J. L., et al. Efficient targeted mutagenesis in Borrelia burgdorferi. Journal of Bacteriology. 182 (9), 2445-2452 (2000).
  43. Elias, A. F., et al. New antibiotic resistance cassettes suitable for genetic studies in Borrelia burgdorferi. Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology. 6 (1), 29-40 (2003).
  44. Frank, K. L., Bundle, S. F., Kresge, M. E., Eggers, C. H., Samuels, D. S. aadA confers streptomycin resistance in Borrelia burgdorferi. Journal of Bacteriology. 185 (22), 6723-6727 (2003).
  45. Sartakova, M. L., et al. Novel antibiotic-resistance markers in pGK12-derived vectors for Borrelia burgdorferi. Gene. 303 (1-2), 131-137 (2003).
  46. Wormser, G. P., et al. The clinical assessment, treatment, and prevention of Lyme disease, human granulocytic anaplasmosis, and babesiosis: Clinical practice guidelines by the Infectious Diseases Society of America. Clinical Infectious Diseases. 43 (9), 1089-1134 (2006).
  47. Terekhova, D., Sartakova, M. L., Wormser, G. P., Schwartz, I., Cabello, F. C. Erythromycin resistance in Borrelia burgdorferi. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 46 (11), 3637-3640 (2002).
  48. Sorbye, H., Kvinnsland, S., Svanes, K. Penetration of N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine to proliferative cells in gastric mucosa of rats is different in pylorus and fundus and depends on exposure time and solvent. Carcinogenesis. 14 (5), 887-892 (1993).
  49. Muniesa, M., Imamovic, L., Jofre, J. Bacteriophages and genetic mobilization in sewage and faecally polluted environments. Microbial Biotechnology. 4 (6), 725-734 (2011).
  50. Penades, J. R., Chen, J., Quiles-Puchalt, N., Carpena, N., Novick, R. P. Bacteriophage-mediated spread of bacterial virulence genes. Current Opinion in Microbiology. 23, 171-178 (2015).
  51. Thierauf, A., Perez, G., Maloy, A. S. Generalized transduction. Methods in Molecular Biology. 501, 267-286 (2009).
  52. Casjens, S. R., et al. Plasmid diversity and phylogenetic consistency in the Lyme disease agent Borrelia burgdorferi. BMC Genomics. 18 (1), 165(2017).
  53. Ojaimi, C., et al. Borrelia burgdorferi gene expression profiling with membrane-based arrays. Methods in Enzymology. 358, 165-177 (2002).
  54. Stevenson, B., et al. The relapsing fever spirochete Borrelia hermsii contains multiple, antigen-encoding circular plasmids that are homologous to the cp32 plasmids of Lyme disease spirochetes. Infection and Immunity. 68 (7), 3900-3908 (2000).
  55. Kingry, L. C., et al. Whole genome sequence and comparative genomics of the novel Lyme borreliosis causing pathogen, Borrelia mayonii. PLoS One. 11 (12), 0168994(2016).
  56. Kuleshov, K. V., et al. Whole genome sequencing of Borrelia miyamotoi isolate Izh-4: Reference for a complex bacterial genome. BMC Genomics. 21 (1), 16(2020).
  57. Dong, D., Sutaria, S., Hwangbo, J. Y., Chen, P. A simple and rapid method to isolate purer M13 phage by isoelectric precipitation. Applied Microbiology and Biotechnology. 97 (18), 8023-8029 (2013).
  58. Kleiner, M., Hooper, L. V., Duerkop, B. A. Evaluation of methods to purify virus-like particles for metagenomic sequencing of intestinal viromes. BMC Genomics. 16, 7(2015).
  59. Patterson, T. A., Dean, M. Preparation of high titer lambda phage lysates. Nucleic Acids Research. 15 (15), 6298(1987).
  60. Ackermann, H. W., et al. Guidelines for bacteriophage characterization. Advances in Virus Research. 23, 1-24 (1978).
  61. Anderson, B., et al. Enumeration of bacteriophage particles: Comparative analysis of the traditional plaque assay and real-time QPCR- and nanosight-based assays. Bacteriophage. 1 (2), 86-93 (2011).
  62. Eggers, C. H., Casjens, S., Samuels, D. S. Bacteriophages of Borrelia burgdorferi and Other Spirochetes. The Spirochetes: Molecular and Cellular Biology. Saier, M. H., Garcia-Lara, J. , Horizon Scientific Press. Wymondham, UK. Chapter 4 35-44 (2001).
  63. Birge, E. A. Bacterial and Bacteriophage Genetics,. 5th edition. , Springer. New York, NY. (2010).
  64. Eggers, C. H., et al. Identification of loci critical for replication and compatibility of a Borrelia burgdorferi cp32 plasmid and use of a cp32-based shuttle vector for the expression of fluorescent reporters in the Lyme disease spirochaete. Molecular Microbiology. 43 (2), 281-295 (2002).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Transdukcja fagowawprowadzanie DNAalternatywa dla elektroporacjiwektory wahad owemarkery oporno ci na antybiotykiprecypitacja PEGmarkery specyficzne dla szczepu
Manipulacja genetyczna krętka boreliozy Borrelia burgdorferi za pośrednictwem fagów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.