Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Transdermalny pomiar szybkości filtracji kłębuszkowej u prosiąt wentylowanych mechanicznie

3.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64413

⸱

13 września 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology, College of Medicine University of Tennessee Health Science Center

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Współczynnik filtracji kłębuszkowej (GFR) jest idealnym markerem do oceny funkcji nerek. Jednak standardowa metoda pomiaru polegająca na wstrzykiwaniu inuliny z seryjną analizą krwi i moczu jest niepraktyczna. W artykule przedstawiono praktyczną metodę transdermalnego pomiaru GFR u prosiąt.

Streszczenie

Transdermalny pomiar współczynnika filtracji kłębuszkowej (GFR) został wykorzystany do oceny funkcji nerek u świadomych zwierząt. Ta technika jest dobrze znana u gryzoni do badania ostrego uszkodzenia nerek i przewlekłej choroby nerek. Pomiar GFR przy użyciu systemu transdermalnego nie został jednak zwalidowany u świń, gatunku o układzie nerkowym podobnym do ludzkiego. W związku z tym zbadaliśmy wpływ sepsy na przezskórny GFR u znieczulonych i wentylowanych mechanicznie nowonarodzonych świń. Sepsa wielodrobnoustrojowa została wywołana przez podwiązanie i nakłucie jelita ślepego (CLP). Transdermalny system pomiaru GFR składający się ze zminiaturyzowanego czujnika fluorescencji został przymocowany do ogolonej skóry świni w celu określenia klirensu skoniugowanej z fluoresceiną i izotiocyjanianem (FITC) sinistryny, znacznika GFR wstrzykiwanego dożylnie. Nasze wyniki pokazują, że po 12 godzinach od CLP stężenie kreatyniny w surowicy wzrosło wraz ze spadkiem GFR. Badanie to po raz pierwszy pokazuje użyteczność transdermalnego podejścia GFR w określaniu funkcji nerek u nowonarodzonych świń wentylowanych mechanicznie.

Wprowadzenie

Praktyczna i ilościowa ocena funkcji nerek to pomiar współczynnika filtracji kłębuszkowej (GFR), który mówi o tym, jak dobrze nerki filtrują krew na zasadzie klirensu1. Wcześniejsza metoda pomiaru GFR polega na dożylnym wstrzykiwaniu związków egzogennych, takich jak inulina lub sinistryna, przeprowadzaniu seryjnych pomiarów poziomu w osoczu/moczu w celu wykrycia ich klirensu2,3. Ta metoda jest kłopotliwa, wymaga seryjnego pobierania próbek osocza i moczu4. Alternatywą jest pomiar endogennych produktów końcowych przemiany materii, takich jak kreatynina. Jest to jednak czasochłonne, a czasami niedokładne, ponieważ jest nie tylko filtrowane przez kłębuszki nerkowe, ale także wydzielane przez kanaliki5,6. Ponadto na poziom kreatyniny ma wpływ płeć, wiek, dieta i masa mięśniowa7,8,9.

Bardziej precyzyjną, minimalnie inwazyjną i powszechnie stosowaną miarą GFR jest użycie transdermalnych monitorów GFR, które mierzą GFR w czasie rzeczywistym u zwierząt4,10. Sinistrin, wysoce rozpuszczalny i swobodnie filtrowany egzogenny marker nerkowy, jest znakowany izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC). Ten sprzężony związek jest wstrzykiwany dożylnie, a czynność nerek w czasie rzeczywistym może być oceniana bez pobierania próbek krwi i moczu11. Stosowanie transdermalnego pomiaru GFR zostało zatwierdzone u gryzoni12, dogs13 i cats14, ale nie u świń.

Gatunki świń mają kilka cech anatomicznych i fizjologicznych wspólnych z ludźmi, co czyni je idealnymi zwierzętami do badania różnych chorób ludzkich15. Wykorzystanie świń w translacyjnych badaniach biomedycznych staje się coraz bardziej popularne i preferowane w stosunku do modeli gryzoni, ponieważ naśladuje ludzką fizjologię i patofizjologię16. Nowonarodzone świnie są interesujące w zrozumieniu mechanizmów chorób charakterystycznych dla pacjentów pediatrycznych17. Co więcej, niedawny postęp w transplantacji narządów od świni do człowieka stwarza potrzebę rozszerzenia narzędzi diagnostycznych do badań przedklinicznych i klinicznych18,19,20,21. W niniejszej pracy, po raz pierwszy, przedstawiono wytyczne dotyczące stosowania urządzenia transdermalnego do pomiaru GFR u nowonarodzonych świń.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Procedury zostały opracowane zgodnie z krajowymi standardami opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych i zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) University of Tennessee Health Science Center (UTHSC).

UWAGA: Prosięta w grupie eksperymentalnej zostają poddane podwiązaniu i nakłuciu kątnicy, natomiast grupa kontrolna (sham) przechodzi jedynie otwarcie jamy brzusznej bez podwiązania lub nakłucia kątnicy. Prosięta w obu grupach pozostają pod narkozą przez 12 h po zabiegu, aby zapewnić wystarczający czas na rozwój sepsy i ostrego uszkodzenia nerek (AKI) w grupie eksperymentalnej. Przezskórny pomiar GFR zostanie przeprowadzony w 8 h po zabiegu, przez łącznie 12 h.

1. Pozyskanie i zakwaterowanie prosiąt

  1. Znajdź lokalną fermę trzody chlewnej, która może dostarczyć noworodkowe prosięta w wieku 3-5 dni. Zaplanuj dostawę na początek tygodnia, aby zakończyć eksperyment, zanim prosięta przekroczą 7 dni życia.
    UWAGA: W tym eksperymencie dostawca dostarczał od trzech do pięciu prosiąt w poniedziałki; do piątku prosięta przechodziły procedury eksperymentalne. Użycie osobników tej samej płci i w zbliżonym wieku jest niezbędne, aby uniknąć czynników zakłócających.
  2. Po przyjeździe prosiąt upewnij się, że posiadają one indywidualną identyfikację (np. kolczyk w uchu oraz dokumentację zawierającą wagę i wiek).
  3. Umieść prosięta w jednostce opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi (LACU) pod opieką licencjonowanego weterynarza. Zwierzęta są utrzymywane grupowo w przestronnym kojcu z litej betonowej podłogi, która jest łatwo zmywalna wodą w celu zachowania właściwej higieny.
  4. Wprowadź element wyposażenia, taki jak ciężka piłka, aby zapewnić wzbogacenie środowiskowe i stymulację.
  5. Upewnij się, że LACU zapewnia optymalne warunki środowiskowe, w tym następujące kluczowe elementy: higienę, żywienie, kontrolę temperatury, wentylację oraz cykl dnia i nocy poprzez sterowanie oświetleniem.
  6. Zleć weterynarzowi codzienną kontrolę prosiąt, w tym pomiar masy ciała, aby informował badacza o każdym prosięciu, które wydaje się chore, co może wymagać jego wykluczenia z eksperymentu.
  7. Pozostaw prosięta na co najmniej 1 dzień w celu aklimatyzacji do środowiska, co pomaga zminimalizować stres.

2. Przygotowanie przedoperacyjne

  1. Przed rozpoczęciem eksperymentu należy przygotować stanowisko chirurgiczne. Powinno ono obejmować mata grzewczą, cewniki, respirator, rurkę endotrachealną, sól fizjologiczną z heparyną oraz worek z płynem Ringera z mleczanem.
    UWAGA: Prosięta charakteryzują się niską zdolnością do termoregulacji i są podatne na hipotermię, która zmienia hemodynamikę22,23W związku z tym niezbędne jest zapewnienie wystarczającej ilości czasu na rozgrzanie podkładki grzejnej.
  2. Przygotuj roztwór $\alpha$-chloralozu o stężeniu 10 mg/ml, mieszając go z solą fizjologiczną w temperaturze 60 ˚C do momentu uzyskania klarownej mieszaniny. Nie przegrzewaj roztworu, aby uniknąć krystalizacji leku podczas chłodzenia. Przefiltruj za pomocą filtra strzykawkowego (rozmiar 0.22 µm) przed podaniem prosiętom.
  3. Przygotować leki znieczulające w oparciu o masę ciała zwierzęcia – ketamina: 20 mg/kg oraz ksylazyna: 2,2 mg/kg. Do podtrzymania znieczulenia zastosować $\alpha$-chloralozę (5 ml/kg).
    UWAGA: stosuje się α-chloralozę ze względu na łatwość podawania dożylnego w porównaniu z podawaniem drogą wziewną 
    środki znieczulające, ponieważ te drugie wymagają użycia aparatu do znieczulenia oraz odpowiedniego systemu odprowadzania gazów w celu podania przez rurkę endotrachealną.

3. Znieczulenie

  1. Wprowadź znieczulenie w zagrodzie dla świń, czyli w środowisku znanym prosiętom, aby uniknąć nadmiernego stresu.
  2. Delikatnie chwyć prosię za tylne nogi i podaj Ketaminę: 20 mg/kg oraz Ksylazynę: 2,2 mg/kg domięśniowo w tylną nogę (mięsień półbłoniasty/półścięgnisty), używając igły 23 G ¾.
  3. Odczekaj kilka minut, aż leki zaczną działać. Sprawdź, czy poziom znieczulenia jest odpowiedni, upewniając się, że zwierzę jest na tyle rozluźnione, by pozostać w bezruchu, z utratą odruchu powiekowego i napięcia żuchwy, co umożliwi łatwy i bezpieczny transport na stanowisko chirurgiczne. Oceń odruch powiekowy, dotykając wewnętrznego kącika oka; brak mrugania świadczy o odpowiednim poziomie znieczulenia.

4. Tracheotomia

UWAGA: Eksperyment ten nie jest przeznaczony do przeżycia, dlatego w celu zapewnienia drożności dróg oddechowych dla wentylacji mechanicznej przeprowadza się tracheotomię. Tracheostomia jest procedurą szybką i łatwą, w przeciwieństwie do intubacji endotrachealnej, która u prosiąt jest utrudniona ze względu na anatomię głowy i górnych dróg oddechowych24,25. Ponadto podczas intubacji często zgłaszany jest laryngospazm, co prowadzi do przedłużonego okresu hipoksji i hiperkarbii, które mogą wpłynąć na wyniki26.

  1. Upołożyć prosię na plecach. Zidentyfikować chrząstkę pierścienno-tarczową, badając palpacyjnie wystający, twardy obszar chrząstki tarczowej. Zdezynfekować obszar za pomocą powidonu jodowego i 70% etanolu, a następnie założyć jałowe pole operacyjne.
  2. Za pomocą skalpela wykonać nacięcie w linii środkowej brzusznej o długości 2-3 cm, poniżej tylnego końca chrząstki tarczowej.
  3. Za pomocą zakrzywionego kleszczyka typu mosquito tępym sposobem rozdzielić tkanki podskórne i mięśnie (mięsień mostkowo-językowy oraz mięsień szyjny skóry), aż do uwidocznienia błony pierścienno-tarczowej i pierwszych kilku pierścieni tchawicy. Podczas preparowania należy zachować ostrożność, aby nie uszkodzić naczyń krwionośnych.
  4. Uzyskać wyraźny wgląd w błonę pierścienno-tarczową i pierścienie tchawicy24, a następnie użyć długich kleszczyków kątowych typu Mixter do uniesienia tych struktur.
    1. Za pomocą małych nożyczek wykonać niewielkie nacięcie w błonie pierścienno-tarczowej lub w pierwszym pierścieniu tchawicy. Przedłużyć nacięcie poziomo do ok. 0.5 cm, aby umożliwić wprowadzenie rurki endotrachealnej o średnicy 3.0 mm.
    2. Wprowadzić rurkę do markera 5 cm. Przed przymocowaniem rurki upewnić się, że klatka piersiowa rozszerza się obustronnie i słyszalne są szmery oddechowe.
  5. Obwiązać tchawicę taśmą pępowinową, aby unieruchomić rurkę w miejscu. Dodatkową taśmą przymocować rurkę do podstawy żuchwy.
  6. Włączyć respirator, podłączyć rurkę endotrachealną i przekręcić odpowiednie pokrętła (np. pokrętła SIMV, PEEP itp.), aby wybrać następujące ustawienia podstawowe. Tryb kontroli ciśnienia: zsynchronizowana przerywana wentylacja mechaniczna (SIMV); szczytowe ciśnienie wdechowe (PIP) – 15; dodatnie ciśnienie końcowowydechowe (PEEP) – 5; Częstotliwość – 20; Czas wdechu (I-time) – 0.6. Po pierwszej analizie gazometrycznej dostosować ustawienia respiratora zgodnie z wynikami gazometrii, dążąc do utrzymania prawidłowego natlenienia i wentylacji.

5. Kanulacja naczyń udowych

  1. Zapewnij drożność dróg oddechowych i wentylację, a następnie przejdź do dostępu do naczyń udowych w celu uzyskania dostępu żylnego i inwazyjnego monitorowania ciśnienia tętniczego. Tętnicę udową identyfikuje się poprzez wyczucie tętna w bruździe między mięśniem krawieckim a mięśniem smukłym; żyła znajduje się bezpośrednio przyśrodkowo w stosunku do tętnicy.
  2. Podczas gdy prosię znajduje się w pozycji grzbietnej, wysterylizuj okolicę pachwiny za pomocą powidonu jodowego i etanolu, a następnie załóż odpowiednio dobraną sterylną draperię.
  3. Za pomocą skalpela wykonaj nacięcie podłużne o długości 3-4 cm, rozpoczynając od strony kranialnej w zgięciu pachwinowym i prowadząc je dystalnie wzdłuż kanału udowego.
  4. Zastosuj rozwarstwianie tępe i ostre, używając odpowiednio zakrzywionych kleszczyków typu mosquito oraz nożyczek, aby dotrzeć do poziomu pęczka naczyniowo-nerwowego uda. Pęczek znajduje się głęboko w obrębie mięśnia smukłego27. Wypreparuj okrężnie tętnicę i żyłę udową na odcinku 2-3 cm w celu umożliwienia kaniulacji. W razie potrzeby podwiąż małe odgałęzienia boczne.
  5. Na proksymalnych i dystalnych końcach tętnicy i żyły załóż jedwabne nici 3.0 w celu uzyskania trakcji. Zawiąż dystalne szwy jedwabne na żyle i tętnicy, podwiązując naczynia.
  6. Zaczynając od żyły udowej, utrzymuj trakcję dystalną i proksymalną na niciach jedwabnych, a następnie za pomocą mikronożyczek wykonaj wenotomię.
  7. Następnie użyj prowadnika do cewnika żylnego, aby otworzyć naczynie, wprowadzając wcześniej odmierzony cewnik poliuretanowy o średnicy wewnętrznej x zewnętrznej 0.86 mm x 1.32 mm. Po wprowadzeniu zawiąż proksymalny szew jedwabny 3.0, aby unieruchomić cewnik. Przepłucz cewnik 3 mL soli fizjologicznej z heparyną (1 U/mL). Roztwór ten można przygotować, dodając 0.5 mL heparyny do 50 mL soli fizjologicznej.
  8. Wprowadź inwazyjny cewnik do pomiaru ciśnienia krwi, stosując opisany powyżej sposób w celu wykonania arteriotomii i wprowadzenia cewnika.
    UWAGA: Utrzymanie trakcji dystalnej i proksymalnej jest niezbędne do zminimalizowania utraty krwi podczas dostępu do tętnicy.
  9. Po zabezpieczeniu cewników przykryj miejsce wkłucia gazą nasączoną solą fizjologiczną; w razie potrzeby skórę można zaszyć nicią jedwabną 3.0, aby zapobiec infekcji.

6. Podtrzymanie znieczulenia, płynoterapii i parametrów gazometrycznych

  1. Monitoruj głębokość anestezji przez cały czas trwania eksperymentu, oceniając napięcie mięśni żuchwy oraz odruch powiekowy, i podawaj dożylnie α-chloralozę w razie potrzeby, aby utrzymać zwierzę w głębokiej anestezji. Zastosuj początkową dawkę nasycającą 50 mg/kg oraz kolejne dawki bolusowe 20 mg/kg.
  2. Wprowadzaj dożylnie mleczan Ringera z prędkością 4 mL/kg/h przez cały czas trwania eksperymentu jako płyn podtrzymujący. Na przykład, jeśli prosię waży 3 kg, prędkość infuzji płynów wynosi 12 mL/h.
  3. W celu przeprowadzenia przyłóżkowej analizy gazometrii, pobierz próbkę krwi tętniczej do heparynowanej strzykawki do gazometrii i umieść próbkę w analizatorze. Wybierz opcję arterial blood gas (gazometria krwi tętniczej) i poczekaj około 2-3 s, aż analizator wysunie igłę do poboru krwi.
    1. Ostrożnie włóż igłę do końca strzykawki zawierającej próbkę krwi. Poczekaj, aż analizator aspiruje wymaganą ilość próbki, a następnie wyjmij strzykawkę. Pozostaw urządzenie do analizy gazometrii i wyświetlenia wyników.
    2. Na podstawie wyników dostosuj parametry respiratora, aby utrzymać pH w zakresie 7.35--7.45, ciśnienie parcjalne dwutlenku węgla (PCO2) w zakresie 35-45 mmHg oraz ciśnienie parcjalne tlenu (PaO2) w zakresie 80-150 mmHg. Ustawienia różnią się w zależności od typu respiratora, ale polegają głównie na zwiększaniu lub zmniejszaniu częstości oddechów za pomocą odpowiednich pokręteł w celu kompensacji hipoksji i/lub hiperkapni.
  4. Pobierz 3 mL krwi do probówki z jasnozieloną zakrętką (heparyna litu). Wirować próbkę przy 2000 xg przez 15 min w temperaturze 4 ˚C w celu wydzielenia osocza. Po zakończeniu procesu osocze można natychmiast poddać analizie poziomu kreatyniny w surowicy za pomocą przyłóżkowego analizatora biochemicznego lub przechowywać w temperaturze -80 ˚C do późniejszej analizy.
  5. stale monitoruj temperaturę za pomocą rektalnego termometru sondowego i reguluj temperaturę mata grzewczego, aby utrzymać temperaturę prosięcia w przedziale od 101 do 103 ˚F.

7. Grupa doświadczalna; podwiązanie i perforacja kątnicy (CLP) 25,28,29

UWAGA: W przypadku prosiąt z grupy eksperymentalnej należy przeprowadzić CLP w celu wywołania sepsy polimikrobiologicznej28 i monitorować zwierzę przez 12 h po operacji, aby zapewnić wystarczający czas na rozwój ciężkiej sepsy. Przezskórny pomiar GFR rozpoczyna się 8 h po podwiązaniu kątnicy, co pozwala na 4 h rejestracji.

  1. Za pomocą skalpela wykonaj pionowe cięcie paramedianne po lewej stronie o długości 5-6 cm, ponieważ u świń kątnica znajduje się w lewym dołku lędźwiowym30. Przecinaj warstwy ściany brzusznej, unikając uszkodzenia naczyń nadrzewnych powierzchownych.
  2. Po nacięciu warstwy otrzewnej użyj rozwieraka, aby poprawić dostęp do struktur wewnątrzbrzusznych.
  3. Zidentyfikuj okrężnicę spiralną w górnym lewym kwadrancie jamy brzusznej. Podążaj wzdłuż okrężnicy spiralnej w kierunku ogonowym i grzbietowym, aby zlokalizować kątnicę. Jelito kręte jest widoczne w miejscu połączenia z okrężnicą spiralną u podstawy kątnicy.
  4. Podwiąż kątnicę tuż za połączeniem kątniczo-krętniczym (Ryc. 1).
  5. Używając igły 18 G, wykonaj siedem nakłuć w kątnicy i wprowadź kał do jam brzusznej.
  6. Zamknij jamę brzuszną warstwowo, używając szwu jedwabnego 3.0, stosując szwy pojedyncze przerywane lub ciągłe. Jeśli jest dostępny, do zamknięcia warstwy skóry można użyć zszywacza.

8. Grupa pozorowana

  1. Postępuj zgodnie z krokami 7.2-7.4 opisanymi powyżej. Po zidentyfikowaniu kątnicy, odłóż ją nienaruszoną i zamknij ścianę brzuszną w analogiczny sposób.
  2. Monitoruj prosięta w grupie pozorowanej (sham) przez 12 h, aby wyeliminować wszelkie błędy zakłócające przypisywane przedłużonej ekspozycji na znieczulenie.

9. Konfiguracja urządzenia do transdermalnego pomiaru GFR

  1. Po 8 h od podwiązania kątnicy należy przygotować się do rozpoczęcia przezskórnego pomiaru GFR.
  2. Użyj oprogramowania serwisowego MB w wersji 3.0, aby dostosować częstotliwość próbkowania w urządzeniu GFR. W skrócie: podłącz przezskórne urządzenie GFR do oprogramowania komputerowego za pomocą złącza USB. Otwórz oprogramowanie, kliknij connect i ustaw czas na 4000 ms. Kliknij write, aby zapisać ustawienia.
    UWAGA: Pozwala to na uzyskanie do 6 h całkowitego czasu próbkowania. U świń pomiar przezskórnego GFR kończy się w ciągu 4 h. W przypadku eksperymentów wymagających próbkowania do 12 h należy wybrać opcję 8000 ms.
  3. Do urządzenia przytwierdź dwustronne plastry samoprzylepne z przezroczystym okienkiem. Przymocuj urządzenie z jednej strony, upewniając się, że dioda emitująca światło znajduje się nad przezroczystym okienkiem, aby umożliwić detekcję znacznika.
  4. Wygol obszar nad boczną ścianą klatki piersiowej. Podłącz baterię do urządzenia, a następnie niezwłocznie naklej plaster samoprzylepny z zamocowanym urządzeniem, upewniając się, że jest ono dobrze zabezpieczone (Rycina 2). Ponieważ prosięta znajdują się w głębokiej narkozie, taśma mocująca może być zbędna.
    UWAGA: Sam plaster samoprzylepny jest wystarczający do stabilizacji. Jednak w procedurach, w których zwierzę byłoby manipulowane, stałoby się aktywne lub w których znieczulenie mogłoby zostać przerwane, ważne może być zastosowanie taśmy. Alternatywnym podejściem może być również użycie bandaża31.
  5. Przed podaniem FITC-sinistryny wymagane jest wykonanie pomiaru bazowego trwającego 3-5 min.

10. Przygotowanie i wstrzyknięcie FITC-sinistryny

  1. Przygotować mieszaninę FITC-sinistryny z roztworem soli fizjologicznej do stężenia końcowego 50 mg/mL. Dawka podawana prosięciu wynosi 20 mg/kg. FITC-sinistryna jest dostarczana w formie proszku.
    UWAGA: FITC-sinistrynę można również podawać za pomocą obwodowego cewnika żylnego wprowadzonego do żyły usznej. Aby uzyskać wysoki poziom szczytowy, niezbędne jest podanie FITC-sinistryny w formie bolusa przez cewnik żylny w żyle udowej.
  2. Podłączyć strzykawkę z lekiem do jednej strony trójdrożnego kurka, a roztwór soli fizjologicznej do przepłukania do drugiej strony kurka. Wstrzyknąć FITC-sinistrynę, a następnie niezwłocznie podać bolus 5 mL soli fizjologicznej przed zamknięciem trójdrożnego kurka prowadzącego do żyły prosięcia.

11. Przezskórna rejestracja GFR

  1. Pozostaw urządzenie przymocowane do prosięcia przez 4 h. W tym czasie utrzymuj prosię w narkozie, podając przerywanie dawki α-chloralozu w stężeniu 20 mg/kg, aby uniknąć artefaktów ruchowych.
  2. Po upływie 4 h zdejmij urządzenie i natychmiast odłącz baterię.

12. Pomiar GFR

  1. Podłącz transdermalne urządzenie do pomiaru GFR do komputera za pomocą złącza USB dostarczonego przez dostawcę.
  2. Otwórz oprogramowanie do odczytu, aby pobrać dane z urządzenia. Zapisz surowe dane, klikając sekwencyjnie: connect, read, re-name oraz save. Zgodnie z instrukcją obsługi, przetwórz i oceń zapisane dane w oprogramowaniu analitycznym.
  3. Krótko mówiąc, otwórz oprogramowanie w wersji 3.0 i zaimportuj dane. Dostosuj pozycje offsetu, początku i końca za pomocą automatycznych znaczników. W razie potrzeby usuń artefakty i kliknij fit. Pozwala to na uzyskanie odczytu wykazującego klirens FITC-sinistryny w minutach (t1/2). Wartość t1/2 jest następnie wykorzystywana do obliczenia tGFR32,33 zgodnie z poniższym wzorem:
    Wzór na tGFR w analizie funkcji nerek; równanie do szacowania szybkości filtracji kłębuszkowej.
    UWAGA: Po konsultacji z producentem, współczynnik konwersji stosowany dla świń wynosi 20 (co wskazuje, że 20% masy ciała stanowi przestrzeń pozakomórkowa), w przeciwieństwie do 21,33 u szczurów (tGFR w mL/min) i 14 616,8 u myszy (tGFR w µL/min). Wynika to z faktu, że GFR jest precyzyjnie mierzony jako funkcja płynu pozakomórkowego34,35, który z kolei zależy od masy ciała36.

13. Eutanazja prosiąt

  1. Pobrać 3 mL krwi po 12 h od CLP do dalszej analizy biochemicznej.
  2. Uśmiercić prosię poprzez dożylne podanie 0,2 mL/kg gotowej mieszaniny 20% pentobarbitalu sodu i fenytoiny sodowej.
  3. Pobrać prawą nerkę do badania histopatologicznego przed przeniesieniem prosięcia do kostnicy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W tej sekcji przedstawiamy po raz pierwszy reprezentatywne dane z zastosowania przezskórnego pomiaru GFR u noworodków świń. Wykorzystaliśmy model ligacji i punkcji kątnicy (CLP), o którym wcześniej wykazano, że obniża on funkcję nerek28. W związku z tym postawiliśmy hipotezę, że u naszych świń w modelu CLP powinien wystąpić gwałtowny spadek GFR odpowiadający AKI, co powinno zostać wykryte przez urządzenie do przezskórnego pomiaru GFR jako wydłużenie czasu klirensu (t1/2), co tym samym p...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W artykule opisano praktyczne kroki do określenia funkcji nerek u świń przy użyciu zminiaturyzowanych przezskórnych monitorów GFR i FITC-sinistrin w mechanicznie wentylowanym, znieczulonym modelu nowonarodzonego świni. W poprzednich pracach ustalono eksperymentalne protokoły transdermalnego GFR u gryzoni 11,12,14, ale nie istnieją żadne protokoły u świń.

Ostatnio zaczęto badać alternatywne modele zwie...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez granty National Institutes of Health R01 DK120595 i R01 DK127625 przyznane dr Adebiyi. Wyłączną odpowiedzialność za treść tego artykułu ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentuje ona oficjalne poglądy National Institutes of Health. Podziękowania dla dr Daniela Schocka-Kuscha, dyrektora zakładu w MediBeacon GmbH, za jego rady.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Alpha - ChloraloseSigma-AldrichC0128-25GSłuży do konserwacji znieczulenia
pleciony jedwab  3-0Specjalizacje chirurgiczneSP117Jedwabny krawat do trakcji i podwiązania naczyń krwionośnych
Wirówka AccuSpin 8CFischer Scientific75-008-821Służy do ekstrakcji osocza z próbki krwi pełnej
Rurka dotchawicza 3.0 bez mankietuProgressive Medical International1109021995Wprowadzany przez tracheostomię
FITC-Sinistrin 1.0 gMediBeacon Inc.FTCF S001Przechowywać w temperaturze pokojowej i chronić przed światłem
GEM Premier 3000 Analizator parametrów krytycznychLaboratorium oprzyrządowania5700Do analizy gazometrii przy łóżku pacjenta
Poduszka grzewcza średniej wielkości 20 cali x 29 caliAdroit Medical SystemsV029Łączy się z pompą do terapii cieplnej
HTP-Pompa do terapii cieplnejAdroit Medical SystemsHTPUmożliwia ustawienie temperatury w razie potrzeby.
IDEXX Catalyst OneIDEXX Laboratories89-92525-00Analiza kreatyniny w osoczu
Inwazyjny cewnik do pomiaru ciśnienia krwi 3,5FrMillarSPR-524Wprowadzany do tętnicy udowej
Zestaw do podawania IV z regulatorem przepływuTrue CareTCRTCBINF033GSłuży do podłączenia worka z płynem dożylnym do cewnika żylnego
KetaminaCovetrus68317Służy do indukcji znieczulenia
Oprogramowanie analityczne MediBeacon w wersji 3.0MediBeacon Inc.Nie dotyczyProgram używany do analizy danych w celu uzyskania klirensu sinistriny, okresu półtrwania i krzywej
Millex-GV Filtr strzykawkowy 0,22 i mikro; mMillipore SigmaSLGVR33RSFiltr strzykawkowy do wstrzykiwania chloralozy
Respirator dla noworodków/niemowlątSechrist Millennium20409Podłączony do dopływu powietrza w celu zapewnienia wentylacji przez rurkę dotchawiczą
Fenobarbital Sód + Fenytoina Sód (Euthasol)Covetrus72934Używany do eutanazji
Mleczan Ringera 500 ml worekBaxter2B2323QWlew płynu podtrzymującego
Sterylne rękawiczkiHenry Schein104-5920Używany przez operatora podczas operacji
Sterylny fartuchHalyard Health95021Używany przez operatora podczas operacji
Sterylny ręcznikMedline42131704Używany jako serweta do utrzymania sterylnego pola podczas operacji
Jedwabna igła do odwrotnego cięcia szwu 3-0EthiconNC1842168Służy do szycia warstw ścian brzucha
Transdermal Mini GFR MonitorMediBeacon Inc.TDM004Bateria i złącze USB w zestawie
Plaster samoprzylepny do monitora transdermalnegoMediBeacon Inc.PTC-SM001Podwójna łatka samoprzylepna do sondy GFR
Taśma pępowinowa 1/8 cala x 20 jardówFisher ScientificNC9303017Do mocowania rurki dotchawiczej
Cewnik żylny rozmiar PE / 5Mikrorurki medyczneBB31695Do kaniulacji żyły udowej
KsylazynaCovetrus61035Służy do indukcji znieczulenia

Bibliografia

  1. Pasala, S., Carmody, J. B. How to use... serum creatinine, cystatin C and GFR. Archives of Disease in Childhood Education and Practice Edition. 102 (1), 37-43 (2017).
  2. Smith, H. W. The Kidney: Structure and Function in Health and Disease. , Oxford University Press, USA. (1951).
  3. Gutman, Y., Gottschalk, C. W., Lassiter, W. E. Micropuncture study of inulin absorption in the rat kidney. Science. 147 (3659), 753-754 (1965).
  4. Ellery, S. J., Cai, X., Walker, D. D., Dickinson, H., Kett, M. M. Transcutaneous measurement of glomerular filtration rate in small rodents: through the skin for the win. Nephrology. 20 (3), 117-123 (2015).
  5. Eisner, C., et al. Major contribution of tubular secretion to creatinine clearance in mice. Kidney International. 77 (6), 519-526 (2010).
  6. Wendt, M., Waldmann, K. H., Bickhardt, K. Comparative studies of the clearance of inulin and creatinine in swine. Zentralblatt fur Veterinarmedizin. Reihe A. 37 (10), 752-759 (1990).
  7. Schwartz, G. J., Brion, L. P., Spitzer, A. The use of plasma creatinine concentration for estimating glomerular filtration rate in infants, children, and adolescents. Pediatric Clinics of North America. 34 (3), 571-590 (1987).
  8. Boer, D. P., de Rijke, Y. B., Hop, W. C., Cransberg, K., Dorresteijn, E. M. Reference values for serum creatinine in children younger than 1 year of age. Pediatric Nephrology. 25 (10), 2107-2113 (2010).
  9. Guignard, J. P., Drukker, A. Why do newborn infants have a high plasma creatinine. Pediatrics. 103 (4), 49(1999).
  10. Friedemann, J., Schock-Kusch, D., Shulhevich, Y. Transcutaneous measurement of glomerular filtration rate in conscious laboratory animals: state of the art and future perspectives. Reporters, Markers, Dyes, Nanoparticles, and Molecular Probes for Biomedical Applications IX. 10079, 63-71 (2017).
  11. Herrera Pérez, Z., Weinfurter, S., Gretz, N. Transcutaneous assessment of renal function in conscious rodents. Journal of Visualized Experiments. (109), e53767(2016).
  12. Scarfe, L., et al. Transdermal measurement of glomerular filtration rate in mice. Journal of Visualized Experiments. (140), e58520(2018).
  13. Mondritzki, T., et al. Transcutaneous glomerular filtration rate measurement in a canine animal model of chronic kidney disease. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 90, 7-12 (2018).
  14. Steinbach, S., et al. A pilot study to assess the feasibility of transcutaneous glomerular filtration rate measurement using fluorescence-labelled sinistrin in dogs and cats. PLoS One. 9 (11), 111734(2014).
  15. Almond, G. W. Research applications using pigs. The Veterinary Clinics of North America Food Animal Practice. 12 (3), 707-716 (1996).
  16. Bassols, A., et al. The pig as an animal model for human pathologies: A proteomics perspective. Proteomics Clinical Applications. 8 (9-10), 715-731 (2014).
  17. Ayuso, M., Irwin, R., Walsh, C., Van Cruchten, S., Van Ginneken, C. Low birth weight female piglets show altered intestinal development, gene expression, and epigenetic changes at key developmental loci. FASEB Journal. 35 (4), 21522(2021).
  18. Pierson, R. N. Progress toward pig-to-human xenotransplantation. The New England Journal of Medicine. 386 (20), 1871-1873 (2022).
  19. Montgomery, R. A., et al. Results of two cases of pig-to-human kidney xenotransplantation. The New England Journal of Medicine. 386 (20), 1889-1898 (2022).
  20. Reardon, S. First pig kidneys transplanted into people: what scientists think. Nature. 605 (7911), 597-598 (2022).
  21. Lu, T., Yang, B., Wang, R., Qin, C. Xenotransplantation: current status in preclinical research. Frontiers in Immunology. 10, 3060(2019).
  22. Pattison, R. J., English, P. R., MacPherson, O., Roden, J. A., Birnie, M. Hypothermia and its attempted control in newborn piglets. Proceedings of the British Society of Animal Production. 1990, 81(1972).
  23. Tucker, B. S., Petrovski, K. R., Kirkwood, R. N. Neonatal piglet temperature changes: effect of intraperitoneal warm saline injection. Animals. 12 (10), 1312(2022).
  24. Alcalá Rueda, I., et al. A live porcine model for surgical training in tracheostomy, neck dissection, and total laryngectomy. European Archives of Oto-Rhino-Laryngology. 278 (8), 3081-3090 (2021).
  25. Swindle, M. M., Smith, A. C. Swine in the Laboratory: Surgery, Anesthesia, Imaging, and Experimental Techniques, Third Edition. , CRC Press/Taylor & Francis Group. Boca Raton. (2016).
  26. Steinbacher, R., von Ritgen, S., Moens, Y. P. Laryngeal perforation during a standard intubation procedure in a pig. Laboratory Animals. 46 (3), 261-263 (2012).
  27. Ettrup, K. S., et al. Basic surgical techniques in the Göttingen minipig: intubation, bladder catheterization, femoral vessel catheterization, and transcardial perfusion. Journal of Visualized Experiments. (52), e2652(2011).
  28. Soni, H., Adebiyi, A. Early septic insult in neonatal pigs increases serum and urinary soluble Fas ligand and decreases kidney function without inducing significant renal apoptosis. Renal Failure. 39 (1), 83-91 (2017).
  29. Bütz, D. E., Morello, S. L., Sand, J., Holland, G. N., Cook, M. E. The expired breath carbon delta value is a marker for the onset of sepsis in a swine model. Journal of Analytical Atomic Spectrometry. 29 (4), 606-613 (2014).
  30. Turner, A. S., McIlwraith, C. W. Techniques in Large Animal Surgery. , Lea & Febiger. (1989).
  31. Steinbach, S., et al. A pilot study to assess the feasibility of transcutaneous glomerular filtration rate measurement using fluorescence-labelled sinistrin in dogs and cats. PLoS One. 9 (11), 111734(2014).
  32. Mondritzki, T., et al. Transcutaneous glomerular filtration rate measurement in a canine animal model of chronic kidney disease. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 90, 7-12 (2018).
  33. Schock-Kusch, D., et al. Transcutaneous measurement of glomerular filtration rate using FITC-sinistrin in rats. Nephrology Dialysis Transplantation. 24 (10), 2997-3001 (2009).
  34. Peters, A. M. Expressing glomerular filtration rate in terms of extracellular fluid volume. Nephrology Dialysis Transplantation. 7 (3), 205-210 (1992).
  35. Groth, S., Christensen, A. B., Nielsen, H. CdTe-detector registration of 99mTc-DTPA clearance. European Journal of Nuclear Medicine. 8 (6), 242-244 (1983).
  36. Guyton, A. C., Hall, J. E. The body fluid compartments: extracellular and intracellular fluids; interstitial fluid and edema. Textbook of Medical Physiology. 9, 306-308 (2000).
  37. Luis-Lima, S., et al. Iohexol plasma clearance simplified by dried blood spot testing. Nephrology, Dialysis, Transplantation. 33 (9), 1597-1603 (2018).
  38. Kobayashi, E., Hishikawa, S., Teratani, T., Lefor, A. T. The pig as a model for translational research: overview of porcine animal models at Jichi Medical University. Transplantation Research. 1 (1), 8(2012).
  39. Swindle, M. M., et al. Swine as models in biomedical research and toxicology testing. Veterinary Pathology. 49 (2), 344-356 (2012).
  40. Ibrahim, Z., et al. Selected physiologic compatibilities and incompatibilities between human and porcine organ systems. Xenotransplantation. 13 (6), 488-499 (2006).
  41. Judge, E. P., et al. Anatomy and bronchoscopy of the porcine lung. A model for translational respiratory medicine. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 51 (3), 334-343 (2014).
  42. Stevens, L. A., Levey, A. S. Measured GFR as a confirmatory test for estimated GFR. Journal of the American Society of Nephrology. 20 (11), 2305-2313 (2009).
  43. Bankir, L., Yang, B. New insights into urea and glucose handling by the kidney, and the urine concentrating mechanism. Kidney International. 81 (12), 1179-1198 (2012).
  44. Ruiz, S., et al. Sepsis modeling in mice: ligation length is a major severity factor in cecal ligation and puncture. Intensive Care Medicine Experimental. 4 (1), 22(2016).
  45. Schock-Kusch, D., et al. Transcutaneous assessment of renal function in conscious rats with a device for measuring FITC-sinistrin disappearance curves. Kidney International. 79 (11), 1254-1258 (2011).
  46. Frennby, B., Sterner, G. Contrast media as markers of GFR. European Radiology. 12 (2), 475484(2002).
  47. Burchardi, H., Kaczmarczyk, G. The effect of anaesthesia on renal function. European Journal of Anaesthesiology. 11 (3), 163-168 (1994).
  48. Fusellier, M., et al. Influence of three anesthetic protocols on glomerular filtration rate in dogs. American Journal of Veterinary Research. 68 (8), 807811(2007).
  49. Arant, B. S. Functional immaturity of the newborn kidney-paradox or prostaglandin. Homeostasis, Nephrotoxicity, and Renal Anomalies in the Newborn. , Springer. Boston, MA. 271-278 (1986).
  50. Gattineni, J., Baum, M. Developmental changes in renal tubular transport-an overview. Pediatric Nephrology. 30 (12), 2085-2098 (2015).
  51. Gu, X., Yang, B. Methods for assessment of the glomerular filtration rate in laboratory animals. Kidney Diseases. , 1-11 (2022).
  52. Mullins, T. P., Tan, W. S., Carter, D. A., Gallo, L. A. Validation of non-invasive transcutaneous measurement for glomerular filtration rate in lean and obese C57BL/6J mice. Nephrology. 25 (7), 575-581 (2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Przezskórne GFRostre uszkodzenie nerekprzewlekła choroba nerekklirens FITC-sinistrynyligacja i punkcja kąbnicyocena funkcji nerekmodel sepsyczujnik fluorescencyjny
Transdermalny pomiar szybkości filtracji kłębuszkowej u prosiąt wentylowanych mechanicznie
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.