Artykuł metodologiczny

Kwantyfikacja aktywności przeciwgrzybiczej peptydów przeciwko Candida albicans

DOI:

10.3791/64416

⸱

13 stycznia 2023

 ,  , 
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of Maryland

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje metodę uzyskiwania danych ilościowych na temat przeciwgrzybiczej aktywności peptydów i innych związków, takich jak małocząsteczkowe środki przeciwgrzybicze, przeciwko Candida albicans. Wykorzystanie gęstości optycznej zamiast liczenia jednostek tworzących kolonie w celu ilościowego określenia zahamowania wzrostu oszczędza czas i zasoby.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tradycyjne metody testowania wrażliwości na leki przeciwgrzybicze Candida albicans są czasochłonne i nie dają ilościowych wyników. Na przykład powszechne podejście polega na posiewaniu komórek potraktowanych różnymi stężeniami cząsteczek przeciwgrzybiczych na płytkach agarowych, a następnie zliczaniu kolonii w celu określenia związku między stężeniem cząsteczek a zahamowaniem wzrostu. Ta metoda wymaga wielu płytek i znacznej ilości czasu na policzenie kolonii. Inne powszechne podejście eliminuje płytki i liczenie kolonii poprzez wizualną kontrolę kultur poddanych działaniu środków przeciwgrzybiczych w celu określenia minimalnego stężenia wymaganego do zahamowania wzrostu; Jednak oględziny dają tylko wyniki jakościowe, a informacje o wzroście w stężeniach subhamujących są tracone. Protokół ten opisuje metodę pomiaru podatności C. albicans na peptydy przeciwgrzybicze. Opierając się na pomiarach gęstości optycznej kultur, metoda ta skraca czas i ilość materiałów potrzebnych do uzyskania ilościowych wyników wzrostu kultur przy różnych stężeniach peptydów. Inkubację grzyba z peptydami przeprowadza się na 96-dołkowej płytce przy użyciu odpowiedniego buforu, przy czym kontrole reprezentują brak zahamowania wzrostu i całkowite zahamowanie wzrostu. Po inkubacji z peptydem, powstałe zawiesiny komórek są rozcieńczane w celu zmniejszenia aktywności peptydów, a następnie hodowane przez noc. Po nocnym wzroście mierzy się gęstość optyczną każdej studzienki i porównuje ją z kontrolami pozytywnymi i ujemnymi w celu obliczenia wynikowego zahamowania wzrostu przy każdym stężeniu peptydu. Wyniki przy użyciu tego testu są porównywalne z wynikami przy użyciu tradycyjnej metody posiewu kultur na płytkach agarowych, ale protokół ten zmniejsza ilość odpadów z tworzyw sztucznych i czas poświęcony na liczenie kolonii. Chociaż zastosowania tego protokołu koncentrowały się na peptydach przeciwgrzybiczych, metoda będzie miała również zastosowanie do testowania innych cząsteczek o znanej lub podejrzewanej aktywności przeciwgrzybiczej.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Candida albicans jest członkiem ludzkiej mikrobioty, która kolonizuje wiele miejsc, w tym jamę ustną, skórę, przewód pokarmowy i pochwę1. W przypadku pacjentów, którzy mają obniżoną odporność z powodu chorób, takich jak ludzki wirus niedoboru odporności (HIV) i leczenie immunosupresyjne, kolonizacja C. albicans może prowadzić do miejscowej lub ogólnoustrojowej kandydozy2,3. Stosowanie obecnie dostępnych małocząsteczkowych leków przeciwgrzybiczych, takich jak amfoterycyna B, azole lub echinokandyny, może być skomplikowane ze względu na problemy z rozpuszczalnością i toksycznością oraz oporność infekcji na środki terapeutyczne4,5. Ze względu na ograniczenia obecnych środków przeciwgrzybiczych, naukowcy nieustannie poszukują nowych cząsteczek przeciwgrzybiczych o działaniu przeciwko C. albicans.

Peptydy przeciwdrobnoustrojowe (AMPs) są potencjalną alternatywą dla obecnych małocząsteczkowych środków przeciwgrzybiczych6,7,8 i są proponowane jako mniej podatne na rozwój oporności w porównaniu do leków małocząsteczkowych9. AMP to zróżnicowany zestaw peptydów, ale często są kationowe, o szerokim spektrum działania10,11,12. AMP o aktywności przeciwko C. albicans obejmują dobrze znane peptydy z rodzin histatyny i cekropiny13,14,15, wraz z nowszymi opisanymi peptydami, takimi jak ToAP2, NDBP-5.7 i wariant histatyny 5 K11R-K17R16,17. Ze względu na ich potencjał w leczeniu zakażeń Candida, identyfikacja i projektowanie nowych AMP ukierunkowanych na C. albicans jest ważnym celem dla wielu grup badawczych.

Jako część procesu opracowywania skutecznych AMP (i innych środków przeciwgrzybiczych), które celują w C. albicans, testy in vitro są powszechnie stosowane do identyfikacji obiecujących peptydów. Metody badania aktywności przeciwgrzybiczej przeciwko C. albicans zazwyczaj obejmują inkubację komórek z seryjnymi rozcieńczeniami AMP (w buforze lub pożywce) na 96-dołkowych płytkach. Dostępnych jest kilka metod oceny aktywności przeciwgrzybiczej po inkubacji. Technika opisana przez Clinical Laboratory Standards Institute wykorzystuje czysto wizualną ocenę zmętnienia studzienek w celu określenia minimalnego stężenia (MIC) dla całkowitego zahamowania wzrostu (co najmniej 50% zahamowania dla wybranych środków przeciwgrzybiczych, takich jak azole i echinokandyny) i nie zapewnia ilościowego określenia wzrostu przy stężeniach poniżej MIC18. Inne powszechnie stosowane podejście polega na ilościowym określeniu żywotności po inkubacji z AMP poprzez posiew zawartości studzienek na płytkach agarowych, inkubację płytek, a następnie zliczenie liczby jednostek tworzących kolonie (CFU) na płytce. Metoda ta została wykorzystana do oceny wielu peptydów, w tym peptydów na bazie histatyny 5, LL-37 i ludzkiej laktoferyny19,20,21. Technika ta wymaga stosunkowo dużej objętości agaru i dużej liczby płytek i polega na żmudnym liczeniu CFU na płytkach. Aby uzyskać więcej danych ilościowych przy jednoczesnym generowaniu mniejszej ilości odpadów z tworzyw sztucznych i unikaniu liczenia CFU, zawartość studzienek można wykorzystać do zaszczepienia świeżej pożywki na innej 96-dołkowej płytce. Po inkubacji nowo zaszczepionej płytki, wzrost można określić ilościowo, mierząc gęstość optyczną przy 600 nm (OD600) na czytniku płytek absorbancyjnych. Metoda ta została wykorzystana do określenia aktywności przeciwgrzybiczej histatyny 5 i jej fragmentów degradacyjnych oraz peptydów penetrujących komórki17,22,23,24,25.

Ten protokół opisuje, jak testować przeciwgrzybicze działanie peptydów i wykorzystuje metodę OD600 do ilościowego określenia zmniejszenia żywotności C. albicans przez peptydy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uzyskano zgodę od University of Maryland, College Park, Institutional Biosafety Committee (IBC) na pracę z C. albicans w tym protokole (PN 274). W niniejszym badaniu wykorzystano szczep C. albicans SC5314 (patrz tabela materiałów); Można jednak również użyć dowolnego innego szczepu.

1. Przygotowanie buforu, sterylnej wody i pożywki hodowlanej

  1. Przygotować sterylny 0,1 M bufor fosforanu sodu (NaPB)26 o pH 7,4 i rozcieńczyć do 2 mM i 1 mM sterylną wodą. Przygotowanie po 100 ml po 2 mM NaPB i 1 mM NaPB będzie więcej niż wystarczające dla większości zastosowań tego protokołu.
  2. Przygotować sterylne płynne podłoże drożdżakowo-peptonowo-dekstrozowe (YPD, patrz tabela materiałów) (10 g/l ekstraktu drożdżowego, 20 g/l dekstrozy, 20 g/l peptonu). Przygotowanie 100 ml YPD będzie więcej niż wystarczające dla większości zastosowań tego protokołu.
  3. Przygotuj sterylną ultraczystą wodę. Przygotowanie 100 ml wody będzie więcej niż wystarczające dla większości zastosowań tego protokołu.
    UWAGA:, pożywki i woda są sterylizowane przez autoklawowanie w temperaturze 121 °C w cyklu ciekłym przez odpowiedni czas w oparciu o objętość w autoklawowanych pojemnikach27. Na przykład w przypadku butelek zawierających 500 ml czas ekspozycji powinien wynosić 40 minut.

2. Szczepienie, hodowla i subkulturacja C. albicans

UWAGA: Przestrzegaj wszystkich instytucjonalnych i rządowych przepisów dotyczących pracy z C. albicans, który jest często klasyfikowany przez akademickie instytucje badawcze jako organizm o poziomie bezpieczeństwa biologicznego (BSL) 2 niezależnie od oporności na leki, a przez American Type Culture Collection (ATCC) jako organizm BSL1 lub BSL2, w zależności od odporności szczepu na leki28.

UWAGA: Wykonaj część tego kroku dotyczącą inokulacji i hodowli (kroki 2.1-2.2) w dniu poprzedzającym rozpoczęcie testowania aktywności przeciwgrzybiczej. Jeśli to możliwe, wykonaj wszystkie kroki protokołu z komórkami (i roztworami, które będą inkubowane z komórkami) w komorze bezpieczeństwa biologicznego.

  1. Zaszczepić pożądany szczep C. albicans w 10 ml pożywki YPD w probówce hodowlanej.
    UWAGA: Kultura może być inokulowana z wywaru z zamrażarki lub z płytki agarowej, ale dla wszystkich danych, które będą porównywane, należy użyć spójnego źródła.
  2. Hoduj kulturę przez noc (~12-16 h) w temperaturze 30 °C i 230 obr./min na wytrząsarce obrotowej.
  3. Subkulturuj nocną kulturę C. albicans i dorastaj do OD600 ~1,0-1,2.
    1. Zmierzyć OD600 w nocnej hodowli za pomocą spektrofotometru UV (patrz Tabela Materiałów).
    2. Opierając się na OD600 z hodowli nocnej, użyj kultury nocnej do zaszczepienia subkultury przy OD600 0,1 na 10 ml YPD.
    3. Hoduj subkulturę w temperaturze 30 °C na wytrząsarce obrotowej z prędkością 230 obr./min, aż OD600 osiągnie ~1,0-1,2, co prawdopodobnie zajmie 4-6 godzin. Wykonaj krok 3 (przygotowanie roztworów peptydowych), gdy subkultura rośnie; subkultura zostanie rozcieńczona do użycia w teście w kroku 4.

3. Przygotowanie roztworów peptydów na płytce 96-dołkowej

UWAGA: Ten krok może być wykonany wcześniej, jeśli roztwory podstawowe peptydów są stabilne podczas przechowywania. Zazwyczaj roztwory peptydów są przechowywane w temperaturze -20 °C do momentu użycia. Można je rozmrozić w łaźni wodnej o temperaturze pokojowej przed przejściem do następnego kroku.

  1. Określić najwyższe stężenie każdego peptydu, który ma być badany w teście. Będzie się to różnić w zależności od wybranych peptydów. Dla danych przedstawionych w sekcji reprezentatywnych wyników przetestowano histatynę 5 i zmodyfikowane analogi22, a najwyższe badane stężenie wyniosło 50 μM.
    UWAGA: Najwyższe stężenie do badania określa się na podstawie danych podanych w literaturze lub poprzez przeprowadzenie wstępnych eksperymentów w szerokim zakresie stężeń peptydów. Tam, gdzie jest to możliwe, należy wybrać najwyższe stężenie, aby zaobserwować plateau dla całkowitego zmniejszenia żywotności przy najwyższych badanych stężeniach i plateau dla braku spadku żywotności przy najniższych badanych stężeniach, co pozwala na ilościowe określenie pełnego zakresu aktywności peptydów.
  2. Rozpuść każdy peptyd w sterylnej wodzie o dwukrotnie wyższym stężeniu niż żądane najwyższe. Dla danych przedstawionych w sekcji dotyczącej wyników reprezentatywnych przygotowano 150 μL 100 μM roztworów histatyny 5 i zmodyfikowanych analogów w sterylnej wodzie.
    UWAGA: Jeśli peptyd nie jest rozpuszczalny w wodzie, przed tym etapem może być konieczne rozpuszczanie w innym rozpuszczalniku. Dimetylosulfotlenek (DMSO) jest powszechnie stosowany do rozpuszczania peptydów w wysokim stężeniu przed rozcieńczeniem do stężenia roboczego. Upewnij się, że końcowe stężenie DMSO wynosi 1% (v/v) lub mniej29 i że alternatywne rozpuszczalniki nie wpływają na wzrost komórek. Upewnij się również, że stężenie rozpuszczalnika jest utrzymywane na stałym poziomie we wszystkich studzienkach w krokach 3.4-3.5.
  3. Dodać 40 μl pożądanych roztworów podstawowych peptydów do pierwszego dołka (kolumna 1) każdego rzędu na 96-dołkowej, okrągłodennej płytce hodowlanej (patrz tabela materiałów). Ta tabliczka to Tablica 1 (Rysunek 1).
    UWAGA: Każda płytka ma osiem rzędów, które są używane do testowania peptydów. Rzędy te mogą być używane dla różnych peptydów lub dla powtórzeń tych samych peptydów. Uwzględnij tylko jeden peptyd w każdym rzędzie.
  4. Dodaj 20 μl sterylnej ultraczystej wody do kolumny 2 do kolumny 12 wierszy zawierających peptyd (Rysunek 1).
    UWAGA: Jeśli zapasy peptydowe zostały przygotowane z rozpuszczalnikiem innym niż czysta woda w kroku 3.2, sterylna woda na tym etapie powinna zostać zastąpiona rozpuszczalnikiem obecnym w suporcie peptydowym dodanym do pierwszej kolumny. Na przykład, jeśli peptyd został rozpuszczony w DMSO, a zapas peptydu zawiera 1% (v/v) DMSO w wodzie, wodę zawierającą 1% DMSO należy dodać do kolumny 2 do kolumny 12.
  5. Seryjnie rozcieńczać roztwory podstawowe peptydów na płytce do kolumny 10 (Rysunek 1).
    UWAGA: Zamiast wykonywać seryjne rozcieńczenia na płytce, jak opisano poniżej, rozcieńczenia można również przeprowadzić w probówkach mikrowirówek i przenieść na płytkę 96-dołkową.
    1. Pobrać 20 μl z kolumny 1, przenieść do kolumny 2 i mieszać, pipetując w górę i w dół. Kolumna 2 zawiera teraz 40 μl roztworu peptydów w rozcieńczeniu 1:2 w stosunku do stężenia podanego w kolumnie 1.
    2. Usunąć 20 μl z kolumny 2, przenieść ją do kolumny 3 i mieszać pipetując w górę i w dół, tak aby kolumna 3 zawierała teraz 40 μl roztworu peptydu w rozcieńczeniu 1:4 stężenia w kolumnie 1.
    3. Powtarzać ten proces do momentu, gdy kolumna 10 będzie zawierała 40 μl roztworu peptydu w rozcieńczeniu 1:512 w stosunku do stężenia podanego w kolumnie 1.
    4. Usunąć 20 μl roztworu peptydu z kolumny 10 i wyrzucić go. Każda kolumna zawiera teraz 20 μl roztworu peptydowego (kolumny 1-10) lub wody (kolumny 11 i kolumny 12).
      UWAGA: Studzienki w kolumnie 11 służą jako kontrole sterylności, a studzienki w kolumnie 12 służą jako kontrole niezawierające peptydu.

4. Rozcieńczenie subkultury C. albicans

UWAGA: Rozpocznij ten krok po osiągnięciu przez subkulturę OD600 ~1.0-1.2 (krok 2.3.3).

  1. Przenieś subkulturę do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i odwiruj przy 3 900 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej w celu osadzenia komórek. Usunąć supernatant przez pipetowanie lub dekantację.
  2. Zawiesić osad z 1 ml 2 mM NaPB (krok 1.1) i przenieść zawiesinę do probówki wirówkowej o pojemności 1,7 ml.
  3. Zawiesić komórki (jak w kroku 4.1), odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml 2 mM NaPB.
  4. Powtórzyć krok 4.3 jeszcze dwa razy, aby pozostawić umyte komórki w 1 ml 2 mM NaPB.
  5. Określić gęstość komórek przemytej zawiesiny i obliczyć współczynnik rozcieńczenia potrzebny do uzyskania gęstości komórek 5 x 105 komórek/ml. To stężenie ostatecznie doprowadzi do dodania 1 x 104 komórek do każdego dołka 96-dołkowej płytki.
    UWAGA: Gęstość komórek zawiesiny można określić za pomocą wielu metod, w tym hemocytometru lub automatycznego licznika komórek. W niniejszym badaniu wykorzystano standardową krzywą gęstości komórek w funkcji OD600 dla szczepu będącego przedmiotem zainteresowania uprawianego w odpowiednich warunkach. Krzywą tę przygotowano za pomocą hemocytometru (patrz tabela materiałów) w celu określenia gęstości komórek zawiesin o różnych wartościach OD600.
  6. Rozcieńczyć zawiesinę komórkową do 5 x 105 komórek/ml w 2 mM NaPB. Przygotowanie 10 ml tej rozcieńczonej zawiesiny będzie więcej niż wystarczające do ukończenia tego badania.

5. Inkubacja C. albicans z roztworami peptydów i przygotowanie komórek do ilościowego określenia żywotności

  1. Dodać 20 μl rozcieńczonej zawiesiny C. albicans (krok 4.6) do kolumn 1-10 i kolumny 12 każdego rzędu (Rysunek 1).
    UWAGA: Końcowe stężenie peptydu w pierwszej kolumnie wynosi teraz połowę stężenia podstawowego peptydu. W niniejszym badaniu końcowe stężenie peptydu wynosiło w tym momencie 50 μM. Końcowa zawiesina komórek w każdym dołku zawiera 2,5 x 105 komórek/ml. Kolumny 1-10 służą jako studzienki eksperymentalne do oceny aktywności przeciwgrzybiczej przy różnych stężeniach peptydów, a kolumna 12 służy jako kontrola wzrostu bez peptydu.
  2. Dodać 20 μl 2 mM NaPB do kolumny 11. Wszystkie studzienki mają teraz końcowe stężenie 1 mM NaPB. Kolumna 11 służy jako kontrola sterylności.
  3. Przykryć płytkę 1 (zawierającą zarówno komórki, jak i peptyd) i inkubować w temperaturze 30 °C przez 30 min.
    UWAGA: Czas inkubacji wynoszący 30 minut jest wystarczający dla wielu peptydów17,21,22,30, ale czas inkubacji można zwiększyć do 60 minut, jeśli jest to pożądane, aby uwzględnić peptydy, które mogą wymagać dłuższego czasu, aby wywrzeć swoją aktywność przeciwgrzybiczą25,31,32.
  4. Przygotuj nową 96-dołkową płytkę hodowlaną (Tabliczka 2) do wykorzystania do ilościowego określenia żywotności (Rysunek 2).
    UWAGA: Płytkę hodowlaną należy przygotować podczas inkubacji płytki 1.
    1. Dodać 100 μl YPD (krok 1.2) do wszystkich dołków płytki.
    2. Dodać 100 μl 2 mM NaPB (krok 1.1) do wszystkich studzienek płytki.
  5. Rozcieńczyć próbki na płytce 1 (zawierającej komórki i peptydy) i przenieść na płytkę 2 (zawierającą pożywkę i bufor).
    1. Pobrać płytkę 1 z inkubatora po 30 minutach inkubacji.
    2. Rozcieńczyć każdą studzienkę z płytki 1, dodając 280 μl 1 mM NaPB (krok 1.1) dla całkowitej objętości 320 μl w każdym dołku (Rysunek 2).
    3. Wymieszaj wszystkie studzienki zawierające komórki i peptydy, pipetując w górę iw dół, aby upewnić się, że wszystkie komórki są ponownie zawieszone i na dnie studzienek nie są widoczne żadne osiadłe komórki.
    4. Przenieść 8 μl z każdej studzienki na płytce 1 do odpowiedniego dołka na płytce 2. Objętość ta przenosi około 250 komórek z każdej studzienki Płytki 1 do Płytki 2 (Rysunek 2).
  6. Przykryć płytkę 2 i inkubować na wytrząsarce na płytce do mikromiareczkowania (patrz tabela materiałów) przy 350 obr./min przez 17 godzin w temperaturze 30 °C.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Przygotowanie płytki 1 do inkubacji seryjnych rozcieńczeń peptydów z komórkami. Seryjne rozcieńczenia peptydu wykonuje się w wodzie, a komórki C. albicans dodaje się do płytki 1. Niebieski kolor oznacza, że peptyd jest obecny w studni, a szary oznacza studnię z wodą i bez peptydu. Studzienki zawierające komórki są oznaczone wzorem czarnych kropek. Po tych krokach płytka jest inkubowana, aby peptyd mógł wywierać działanie przeciwgrzybicze. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-protocol-2
Rysunek 2: Przygotowanie płytki 2 do ilościowego określenia spadku żywotności spowodowanego przez peptyd. Pożywkę YPD i NaPB dodaje się do płytki 2. Po rozcieńczeniu zawartości płytki 1, podwielokrotność z każdej studzienki przenosi się z płytki 1 na płytkę 2. Płytka 2 jest następnie inkubowana, aby umożliwić wzrost wszelkich żywotnych komórek w celu oceny ilościowej poprzez pomiar OD600. Dla tabliczki 2 studzienki zawierające tylko YPD i NaPB są pokazane na pomarańczowo. Studzienki zawierające podwielokrotności z tabliczki 1 zmieszane z YPD i NaPB są pokazane na zielono. Zobacz legendę Rysunek 1, aby zapoznać się z opisem kolorów na tablicy 1. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

6. Oznaczanie aktywności przeciwgrzybiczej

  1. Uzyskaj odczyty OD600 dla każdej studzienki na płycie 2.
    1. Wyjąć płytkę 2 z inkubatora po 17 godzinach inkubacji.
    2. Wymieszać wszystkie studzienki na płytce 2, pipetując w górę i w dół, aby upewnić się, że wszystkie komórki są ponownie zawieszone i że na dnie studzienek nie są widoczne żadne osadzone komórki.
      UWAGA: Na tym etapie należy unikać generowania pęcherzyków, ponieważ mogą one zakłócać odczyty OD600. Jeśli tworzą się bąbelki, często można je przebić suchą końcówką pipety lub usunąć za pomocą dwóch końcówek pipety, aby wyjąć je ze studzienki.
    3. Użyj czytnika płytek absorbancji (patrz tabela materiałów) o długości fali 600 nm, aby uzyskać OD600 dla każdej studzienki.
  2. Oblicz zahamowanie wzrostu (w procentach) i wykreśl go, aby określić wpływ peptydów na wzrost C. albicans.
    1. Dla każdego dołka oblicz zmniejszenie żywotności w porównaniu z kontrolą (w procentach), korzystając z następującego równania17,22,23:
      figure-protocol-3
      gdzie ODz peptydem jest OD600 studzienki zawierającej dane stężenie peptydu, tłem OD jest OD 600 w kolumnie 11 w tym samym wierszu (kontrola nie zawiera komórek), i
      Brakpeptydu OD to OD600 w kolumnie 12 w tym samym wierszu (kontrola zawierająca komórki i bez peptydu).
    2. Na przykład użyj następującego wyrażenia, aby obliczyć zmniejszenie żywotności w studzience B5 na podstawie wartości OD600 dla wiersza B:
      figure-protocol-4
  3. Wykreślić zmniejszenie żywotności w funkcji stężenia peptydu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Użycie pomiarów OD600 do ilościowego określenia zmniejszenia wzrostu spowodowanego peptydami przeciwgrzybiczymi pozwala zaoszczędzić dużo czasu w porównaniu do posiewu próbek i liczenia CFU. Metoda opisana w tym protokole wymaga wykonania kroków w trzech różnych dniach. Pierwszego dnia potrzeba około 1 godziny na przygotowanie i pożywek (nie wliczając czasu sterylizacji) oraz zaszczepienie wyjściowej kultury C. albicans do inkubacji przez noc. Drugiego dnia etapy wymagają 5-6 godzin (w tym czas subkul...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten opisuje skuteczne podejście do uzyskiwania danych ilościowych na temat aktywności przeciwgrzybiczej AMP przeciwko patogenowi grzybowemu C. albicans. Jednym z powszechnych alternatywnych podejść do testowania peptydów i innych środków przeciwgrzybiczych jest mikrorozcieńczenie bulionu opisane w normie M2718 Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI), ale norma ta koncentruje się na uzyskiwaniu jakościowych wyników wizualnych, a nie ilościowych. Innym alternatywnym podejści...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health (R03DE029270, T32AI089621B), National Science Foundation (CBET 1511718), Departament Edukacji (GAANN-P200A180093) oraz University of Maryland Cross-Campus Seed Grant.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Płytki 96-dołkowe (okrągłe dno)VWR10062-902
Czytnik mikropłytek absorbancyjnychN/AN/DWystarcza każdy dostępny czytnik mikropłytek
C. albicans szczep SC5314ATCC MYA-2876Można również stosować inne C. albicans
HemocytometrN/AN/AMoże być używany do wykonania standardowej krzywej wiążącej numer komórki z OD600
Wytrząsarka do mikropłytekVWR2620-926
Peptyd(y)N/AN/A N/APeptydy mogą być komercyjnie syntetyzowane przez dowolnego wiarygodnego dostawcę; czystość ≥ Zalecane jest usuwanie 95% i soli kwasu trifluorooctowego do soli chlorowodorku
Zbiorniki na odczynniki do pipetorów wielokanałowychVWR18900-320Upraszcza pipetowanie do płytek wielodołkowych za pomocą pipety wielokanałowej
Fosforan sodu, dwuzasadowyFisher ScientificBP332-500Do wytwarzania NaPB
Fosforan sodu, monozasadowyFisher ScientificBP329-500Do wytwarzania NaPB
Spektrofotometr UVN/AN/AKażdy dostępny spektrofotometr UV jest wystarczający
YPD średni proszekBD Life Sciences242820Może być również wytwarzany z ekstraktu drożdżowego, peptonu i dekstrozy

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gulati, M., Nobile, C. J. Candida albicans biofilms: Development, regulation, and molecular mechanisms. Microbes and Infection. 18 (5), 310-321 (2016).
  2. Arya, N. R., Rafiq, N. B. Candidiasis. StatPearls. , StatPearls Publishing. Treasure Island, FL. (2021).
  3. de Oliveira Santos, G. C., et al. Candida infections and therapeutic strategies: Mechanisms of action for traditional and alternative agents. Frontiers in Microbiology. 9, 1351(2018).
  4. Espinel-Ingroff, A. Mechanisms of resistance to antifungal agents: Yeasts and filamentous fungi. Revista Iberoamericana de Micología. 25 (2), 101-106 (2008).
  5. Wang, X., et al. Delivery strategies of amphotericin B for invasive fungal infections. Acta Pharmaceutica Sinica B. 11 (8), 2585-2604 (2021).
  6. Struyfs, C., Cammue, B. P. A., Thevissen, K. Membrane-interacting antifungal peptides. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 649875(2021).
  7. Huan, Y., Kong, Q., Mou, H., Yi, H. Antimicrobial peptides: Classification, design, application and research progress in multiple fields. Frontiers in Microbiology. 11, 582779(2020).
  8. Sarkar, T., Chetia, M., Chatterjee, S. Antimicrobial peptides and proteins: From nature's reservoir to the laboratory and beyond. Frontiers in Chemistry. 9, 691532(2021).
  9. Mahlapuu, M., Bjorn, C., Ekblom, J. Antimicrobial peptides as therapeutic agents: Opportunities and challenges. Critical Reviews in Biotechnology. 40 (7), 978-992 (2020).
  10. Lei, J., et al. The antimicrobial peptides and their potential clinical applications. American Journal of Translational Research. 11 (7), 3919-3931 (2019).
  11. Mercer, D. K., O'Neil, D. A. Innate inspiration: Antifungal peptides and other immunotherapeutics from the host immune response. Frontiers in Immunology. 11, 2177(2020).
  12. Bin Hafeez, A., Jiang, X., Bergen, P. J., Zhu, Y. Antimicrobial peptides: An update on classifications and databases. International Journal of Molecular Sciences. 22 (21), 11691(2021).
  13. Xu, T., Levitz, S. M., Diamond, R. D., Oppenheim, F. G. Anticandidal activity of major human salivary histatins. Infection and Immunity. 59 (8), 2549-2554 (1991).
  14. Helmerhorst, E. J., et al. Amphotericin B- and fluconazole-resistant Candida spp., Aspergillus fumigatus, and other newly emerging pathogenic fungi are susceptible to basic antifungal peptides. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 43 (3), 702-704 (1999).
  15. Andra, J., Berninghausen, O., Leippe, M. Cecropins, antibacterial peptides from insects and mammals, are potently fungicidal against Candida albicans. Medical Microbiology and Immunology. 189, 169-173 (2001).
  16. do Nascimento Dias, J., et al. Mechanisms of action of antimicrobial peptides ToAP2 and NDBP-5.7 against Candida albicans planktonic and biofilm cells. Scientific Reports. 10, 10327(2020).
  17. Ikonomova, S. P., et al. Effects of histatin 5 modifications on antifungal activity and kinetics of proteolysis. Protein Science. 29, 480-493 (2020).
  18. Clinical Laboratory Standards Institute. M27-A3. Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts; Approved standard - Third edition. , Clinical Laboratory Standards Institute. (2008).
  19. Lupetti, A., et al. Candidacidal activities of human lactoferrin peptides derived from the N terminus. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 44 (12), 3257-3263 (2000).
  20. Han, J., Jyoti, M. A., Song, H. Y., Jang, W. S. Antifungal activity and action mechanism of histatin 5-halocidin hybrid peptides against Candida ssp. PLoS One. 11 (2), 0150196(2016).
  21. den Hertog, A. L., et al. Candidacidal effects of two antimicrobial peptides: histatin 5 causes small membrane defects, but LL-37 causes massive disruption of the cell membrane. Biochemical Journal. 388, 689-695 (2005).
  22. Ikonomova, S. P., Moghaddam-Taaheri, P., Jabra-Rizk, M. A., Wang, Y., Karlsson, A. J. Engineering improved variants of the antifungal peptide histatin 5 with reduced susceptibility to Candida albicans secreted aspartic proteases and enhanced antimicrobial potency. The FEBS Journal. 285 (1), 146-159 (2018).
  23. Moghaddam-Taaheri, P., Leissa, J. A., Eppler, H. B., Jewell, C. M., Karlsson, A. J. Histatin 5 variant reduces Candida albicans biofilm viability and inhibits biofilm formation. Fungal Genetics and Biology. 149, 103529(2021).
  24. Gong, Z., Doolin, M. T., Adhikari, S., Stroka, K. M., Karlsson, A. J. Role of charge and hydrophobicity in translocation of cell-penetrating peptides into Candida albicans cells. AIChE Journal. 65 (12), 16768(2019).
  25. Gong, Z., Karlsson, A. J. Translocation of cell-penetrating peptides into Candida fungal pathogens. Protein Science. 26 (9), 1714-1725 (2017).
  26. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Fourth edition. 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Long Island, NY. (2012).
  27. Consolidated Sterilizer Systems. Laboratory and Research Autoclaves. , Available from: https://consteril.com/wp-content/uploads/2020/12/CSS-Product-Brochure.pdf (2022).
  28. American Type Culture Collection. , Available from: www.atcc.org (2022).
  29. Rodriguez-Tudela, J. L., Cuenca-Estrella, M., Diaz-Guerra, T. M., Mellado, E. Standardization of antifungal susceptibility variables for a semiautomated methodology. Journal of Clinical Microbiology. 39 (7), 2513-2517 (2001).
  30. Mbuayama, K. R., Taute, H., Strmstedt, A. A., Bester, M. J., Gaspar, A. R. M. Antifungal activity and mode of action of synthetic peptides derived from the tick OsDef2 defensin. Journal of Peptide Science. 28 (5), 3383(2022).
  31. Rossignol, T., Kelly, B., Dobson, C., d'Enfert, C. Endocytosis-mediated vacuolar accumulation of the human ApoE apolipoprotein-derived ApoEdpL-W antimicrobial peptide contributes to its antifungal activity in Candida albicans. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (10), 4670-4681 (2011).
  32. Helmerhorst, E. J., Reijnders, I. M., van't Hof, W., Veerman, E. C., Nieuw Amerongen, A. V. A critical comparison of the hemolytic and fungicidal activities of cationic antimicrobial peptides. FEBS Letters. 449 (2-3), 105-110 (1999).
  33. Kerenga, B. K., et al. Salt-tolerant antifungal and antibacterial activities of the corn defensin ZmD32. Frontiers in Microbiology. 10, 795(2019).
  34. Lee, I. H., Cho, Y., Lehrer, R. I. Effects of pH and salinity on the antimicrobial properties of clavanins. Infection and Immunity. 65 (7), 2898-2903 (1997).
  35. Li, X. S., Reddy, M. S., Baev, D., Edgerton, M. Candida albicans Ssa1/2p is the cell envelope binding protein for human salivary histatin 5. Journal of Biological Chemistry. 278 (31), 28553-28561 (2003).
  36. Rothstein, D. M., et al. Anticandida activity is retained in P-113, a 12-amino-acid fragment of histatin 5. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (5), 1367-1373 (2001).
  37. Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: Volume transfers with serological pipettes and micropipettors. Journal of Visualized Experiments. (63), e2754(2012).
  38. Mansoury, M., Hamed, M., Karmustaji, R., Al Hannan, F., Safrany, S. T. The edge effect: A global problem. The trouble with culturing cells in 96-well plates. Biochemistry and Biophysics Report. 26, 100987(2021).
  39. Goughenour, K. D., Balada-Llasat, J. M., Rappleye, C. A. Quantitative microplate-based growth assay for determination of antifungal susceptibility of Histoplasma capsulatum yeasts. Journal of Clinical Microbiology. 53 (10), 3286-3295 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Peptydy przeciwgrzybiczeg sto optycznahamowanie wzrostuoznaczanie ilo ci peptyd wp ytka 96 do kowarozcie czenia seryjnejednostki tworz ce koloniezawiesina dro d ypodatno na rodki przeciwgrzybicze

Powiązane artykuły