Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Kwantyfikacja aktywności przeciwgrzybiczej peptydów przeciwko Candida albicans

3.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64416

⸱

13 stycznia 2023

 ,  , 
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of Maryland

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje metodę uzyskiwania danych ilościowych na temat przeciwgrzybiczej aktywności peptydów i innych związków, takich jak małocząsteczkowe środki przeciwgrzybicze, przeciwko Candida albicans. Wykorzystanie gęstości optycznej zamiast liczenia jednostek tworzących kolonie w celu ilościowego określenia zahamowania wzrostu oszczędza czas i zasoby.

Streszczenie

Tradycyjne metody testowania wrażliwości na leki przeciwgrzybicze Candida albicans są czasochłonne i nie dają ilościowych wyników. Na przykład powszechne podejście polega na posiewaniu komórek potraktowanych różnymi stężeniami cząsteczek przeciwgrzybiczych na płytkach agarowych, a następnie zliczaniu kolonii w celu określenia związku między stężeniem cząsteczek a zahamowaniem wzrostu. Ta metoda wymaga wielu płytek i znacznej ilości czasu na policzenie kolonii. Inne powszechne podejście eliminuje płytki i liczenie kolonii poprzez wizualną kontrolę kultur poddanych działaniu środków przeciwgrzybiczych w celu określenia minimalnego stężenia wymaganego do zahamowania wzrostu; Jednak oględziny dają tylko wyniki jakościowe, a informacje o wzroście w stężeniach subhamujących są tracone. Protokół ten opisuje metodę pomiaru podatności C. albicans na peptydy przeciwgrzybicze. Opierając się na pomiarach gęstości optycznej kultur, metoda ta skraca czas i ilość materiałów potrzebnych do uzyskania ilościowych wyników wzrostu kultur przy różnych stężeniach peptydów. Inkubację grzyba z peptydami przeprowadza się na 96-dołkowej płytce przy użyciu odpowiedniego buforu, przy czym kontrole reprezentują brak zahamowania wzrostu i całkowite zahamowanie wzrostu. Po inkubacji z peptydem, powstałe zawiesiny komórek są rozcieńczane w celu zmniejszenia aktywności peptydów, a następnie hodowane przez noc. Po nocnym wzroście mierzy się gęstość optyczną każdej studzienki i porównuje ją z kontrolami pozytywnymi i ujemnymi w celu obliczenia wynikowego zahamowania wzrostu przy każdym stężeniu peptydu. Wyniki przy użyciu tego testu są porównywalne z wynikami przy użyciu tradycyjnej metody posiewu kultur na płytkach agarowych, ale protokół ten zmniejsza ilość odpadów z tworzyw sztucznych i czas poświęcony na liczenie kolonii. Chociaż zastosowania tego protokołu koncentrowały się na peptydach przeciwgrzybiczych, metoda będzie miała również zastosowanie do testowania innych cząsteczek o znanej lub podejrzewanej aktywności przeciwgrzybiczej.

Wprowadzenie

Candida albicans jest członkiem ludzkiej mikrobioty, która kolonizuje wiele miejsc, w tym jamę ustną, skórę, przewód pokarmowy i pochwę1. W przypadku pacjentów, którzy mają obniżoną odporność z powodu chorób, takich jak ludzki wirus niedoboru odporności (HIV) i leczenie immunosupresyjne, kolonizacja C. albicans może prowadzić do miejscowej lub ogólnoustrojowej kandydozy2,3. Stosowanie obecnie dostępnych małocząsteczkowych leków przeciwgrzybiczych, takich jak amfoterycyna B, azole lub echinokandyny, może być skomplikowane ze względu na problemy z rozpuszczalnością i toksycznością oraz oporność infekcji na środki terapeutyczne4,5. Ze względu na ograniczenia obecnych środków przeciwgrzybiczych, naukowcy nieustannie poszukują nowych cząsteczek przeciwgrzybiczych o działaniu przeciwko C. albicans.

Peptydy przeciwdrobnoustrojowe (AMPs) są potencjalną alternatywą dla obecnych małocząsteczkowych środków przeciwgrzybiczych6,7,8 i są proponowane jako mniej podatne na rozwój oporności w porównaniu do leków małocząsteczkowych9. AMP to zróżnicowany zestaw peptydów, ale często są kationowe, o szerokim spektrum działania10,11,12. AMP o aktywności przeciwko C. albicans obejmują dobrze znane peptydy z rodzin histatyny i cekropiny13,14,15, wraz z nowszymi opisanymi peptydami, takimi jak ToAP2, NDBP-5.7 i wariant histatyny 5 K11R-K17R16,17. Ze względu na ich potencjał w leczeniu zakażeń Candida, identyfikacja i projektowanie nowych AMP ukierunkowanych na C. albicans jest ważnym celem dla wielu grup badawczych.

Jako część procesu opracowywania skutecznych AMP (i innych środków przeciwgrzybiczych), które celują w C. albicans, testy in vitro są powszechnie stosowane do identyfikacji obiecujących peptydów. Metody badania aktywności przeciwgrzybiczej przeciwko C. albicans zazwyczaj obejmują inkubację komórek z seryjnymi rozcieńczeniami AMP (w buforze lub pożywce) na 96-dołkowych płytkach. Dostępnych jest kilka metod oceny aktywności przeciwgrzybiczej po inkubacji. Technika opisana przez Clinical Laboratory Standards Institute wykorzystuje czysto wizualną ocenę zmętnienia studzienek w celu określenia minimalnego stężenia (MIC) dla całkowitego zahamowania wzrostu (co najmniej 50% zahamowania dla wybranych środków przeciwgrzybiczych, takich jak azole i echinokandyny) i nie zapewnia ilościowego określenia wzrostu przy stężeniach poniżej MIC18. Inne powszechnie stosowane podejście polega na ilościowym określeniu żywotności po inkubacji z AMP poprzez posiew zawartości studzienek na płytkach agarowych, inkubację płytek, a następnie zliczenie liczby jednostek tworzących kolonie (CFU) na płytce. Metoda ta została wykorzystana do oceny wielu peptydów, w tym peptydów na bazie histatyny 5, LL-37 i ludzkiej laktoferyny19,20,21. Technika ta wymaga stosunkowo dużej objętości agaru i dużej liczby płytek i polega na żmudnym liczeniu CFU na płytkach. Aby uzyskać więcej danych ilościowych przy jednoczesnym generowaniu mniejszej ilości odpadów z tworzyw sztucznych i unikaniu liczenia CFU, zawartość studzienek można wykorzystać do zaszczepienia świeżej pożywki na innej 96-dołkowej płytce. Po inkubacji nowo zaszczepionej płytki, wzrost można określić ilościowo, mierząc gęstość optyczną przy 600 nm (OD600) na czytniku płytek absorbancyjnych. Metoda ta została wykorzystana do określenia aktywności przeciwgrzybiczej histatyny 5 i jej fragmentów degradacyjnych oraz peptydów penetrujących komórki17,22,23,24,25.

Ten protokół opisuje, jak testować przeciwgrzybicze działanie peptydów i wykorzystuje metodę OD600 do ilościowego określenia zmniejszenia żywotności C. albicans przez peptydy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Zgoda na pracę z tymi materiałami została uzyskana od Instytucjonalnego Komitetu Bezpieczeństwa Biologicznego (IBC) Uniwersytetu Maryland w College Park C. albicans w niniejszym protokole (PN 274). *C. albicans* szczep SC5314 (patrz Tabela materiałów) został wykorzystany w niniejszym badaniu; można jednak zastosować dowolny inny szczep.

1. Przygotowanie buforu, wody sterylnej i pożywki hodowlanej

  1. Przygotować sterylny 0,1 M bufor fosforanowy sodu (NaPB)26 o pH 7,4, a następnie rozcieńczyć go sterylną wodą do stężeń 2 mM i 1 mM. Przygotowanie 100 mL buforu NaPB 2 mM oraz 100 mL buforu NaPB 1 mM będzie w zupełności wystarczające dla większości zastosowań niniejszego protokołu.
  2. Przygotować sterylną płynną pożywkę drożdżową YPD (yeast-peptone-dextrose; patrz Tabela materiałów) (10 g/L ekstraktu z drożdży, 20 g/L dekstrozy, 20 g/L peptonu). Przygotowanie 100 mL pożywki YPD będzie w zupełności wystarczające dla większości zastosowań niniejszego protokołu.
  3. Przygotować sterylną wodę ultrapurystyczną. Przygotowanie 100 mL wody będzie w zupełności wystarczające dla większości zastosowań niniejszego protokołu.
    UWAGA: Bufory, pożywki i wodę sterylizuje się w autoklawie w temperaturze 121 °C w cyklu dla cieczy, przez czas dostosowany do objętości zawartości sterylizowanych naczyń27. Na przykład w przypadku butelek o pojemności 500 mL czas ekspozycji powinien wynosić 40 min.

2. Inokulacja, hodowla i pasażowanie C. albicans

UWAGA: Należy przestrzegać wszystkich instytucjonalnych i rządowych przepisów dotyczących pracy z C. albicans, który jest często klasyfikowany przez akademickie instytucje badawcze jako organizm poziomu bezpieczeństwa biologicznego (BSL) 2, niezależnie od oporności na leki, a przez American Type Culture Collection (ATCC) jako organizm BSL1 lub BSL2, w zależności od oporności szczepu na leki28.

UWAGA: Etapy szczepienia i hodowli w ramach tego kroku (kroki 2.1-2.2) należy przeprowadzić w dniu poprzedzającym rozpoczęcie testów aktywności przeciwgrzybiczej. Jeśli to możliwe, wszystkie etapy protokołu z udziałem komórek (oraz roztworów, które będą inkubowane z komórkami) należy wykonywać w komorze z laminarnym przepływem powietrza.

  1. Zaszczep pożądany szczep C. albicans do 10 mL pożywki YPD w probówce do hodowli.
    UWAGA: Hodowlę można zaszczepić z mrożonego banku lub z płytki agarowej, jednak dla wszystkich porównywanych danych należy stosować spójne źródło.
  2. Inkubuj hodowlę przez noc (~12-16 h) w temperaturze 30 °C przy 230 rpm na wytrząsarce orbitalnej.
  3. Wykonaj przesiew hodowli C. albicans z inkubacji nocnej i namnażaj ją do uzyskania OD600 na poziomie ~1,0-1,2.
    1. Zmierz OD600 hodowli nocnej za pomocą spektrofotometru UV (patrz Tabela materiałów).
    2. Na podstawie OD600 hodowli nocnej, wykorzystaj ją do zaszczepienia subkultury do poziomu OD600 wynoszącego 0,1 w 10 mL pożywki YPD.
    3. Inkubuj subkulturę w temperaturze 30 °C na wytrząsarce orbitalnej przy 230 rpm, aż OD600 osiągnie wartość ~1,0-1,2, co zazwyczaj zajmuje 4-6 h. W czasie wzrostu subkultury wykonaj krok 3 (przygotowanie roztworów peptydów); subkultura zostanie rozcieńczona przed użyciem w teście w kroku 4.

3. Przygotowanie roztworów peptydów na płytce 96-dołkowej

UWAGA: Ten krok można wykonać z wyprzedzeniem, jeśli roztwory zapasowe peptydów są stabilne podczas przechowywania. Zazwyczaj roztwory peptydów przechowuje się w temperaturze −20 °C do momentu użycia. Przed przejściem do następnego kroku można je rozmrozić w kąpieli wodnej w temperaturze pokojowej.

  1. Wyznacz najwyższe stężenie każdego peptydu do przetestowania w analizie. Będzie ono zależeć od wybranych peptydów. W przypadku danych przedstawionych w sekcji wyników reprezentatywnych testowano histatynę 5 oraz analogi zmodyfikowane22, a najwyższym przetestowanym stężeniem było 50 µM.
    UWAGA: Najwyższe stężenie do przetestowania wyznacza się na podstawie danych opisanych w literaturze lub poprzez przeprowadzenie wstępnych eksperymentów w szerokim zakresie stężeń peptydów. Jeśli to możliwe, najwyższe stężenie powinno zostać dobrane tak, aby zaobserwować plateau dla całkowitego spadku żywotności przy najwyższych testowanych stężeniach oraz plateau dla braku spadku żywotności przy najniższych testowanych stężeniach, co pozwala na ilościowe określenie pełnego zakresu aktywności peptydu.
  2. Rozpuść każdy peptyd w sterylnej wodzie w dwukrotnie większym stężeniu niż pożądane najwyższe stężenie. Dla danych przedstawionych w sekcji wyników reprezentatywnych przygotowano w sterylnej wodzie 150 µL roztworów histatyny 5 oraz analogów zmodyfikowanych o stężeniu 100 µM.
    UWAGA: Jeśli peptyd nie jest rozpuszczalny w wodzie, przed tym krokiem może być konieczne rozpuszczenie go w innym rozpuszczalniku. Do rozpuszczania peptydów w wysokim stężeniu przed rozcieńczeniem do stężenia roboczego powszechnie stosuje się dimetylosulfotlenek (DMSO). Należy upewnić się, że końcowe stężenie DMSO wynosi 1% (v/v) lub mniej29 i że alternatywne rozpuszczalniki nie wpływają na wzrost komórek. Należy również zadbać o to, aby stężenie rozpuszczalnika pozostawało stałe we wszystkich studzienkach w krokach 3.4-3.5.
  3. Dodaj 40 µL pożądanych roztworów zapasowych peptydów do pierwszej studzienki (Kolumna 1) każdego rzędu w 96-dołkowej płytce hodowlanej z okrągłym dnem (patrz Tabela materiałów). Płytka ta jest Płytką 1 (Rysunek 1).
    UWAGA: Każda płytka ma osiem rzędów służących do testowania peptydów. Rzędy te mogą być wykorzystane dla różnych peptydów lub dla powtórzeń tych samych peptydów. W każdym rzędzie umieść tylko jeden peptyd.
  4. Dodaj 20 µL sterylnej wody ultraczystej do Kolumny 2 do Kolumny 12 w rzędach zawierających peptyd (Rysunek 1).
    UWAGA: Jeśli w kroku 3.2 roztwory zapasowe peptydów przygotowano z rozpuszczalnikiem innym niż czysta woda, sterylną wodę w tym kroku należy zastąpić rozpuszczalnikiem obecnym w roztworze zapasowym peptydu dodanym do pierwszej kolumny. Na przykład, jeśli peptyd został rozpuszczony w DMSO i roztwór zapasowy peptydu zawiera 1% (v/v) DMSO w wodzie, do Kolumny 2 do Kolumny 12 należy dodać wodę zawierającą 1% DMSO.
  5. Wykonaj rozcieńczenia szeregowe roztworów zapasowych peptydów w płytce do Kolumny 10 (Rysunek 1).
    UWAGA: Zamiast wykonywać rozcieńczenia szeregowe w płytce, jak opisano poniżej, można je wykonać w probówkach do mikrocentryfugi i przenieść do płytki 96-dołkowej.
    1. Pobierz 20 µL z Kolumny 1, przenieś do Kolumny 2 i wymieszaj, pipetując w górę i w dół. Kolumna 2 zawiera teraz 40 µL roztworu peptydu w rozcieńczeniu 1:2 względem stężenia w Kolumnie 1.
    2. Pobierz 20 µL z Kolumny 2, przenieś do Kolumny 3 i wymieszaj, pipetując w górę i w dół, tak aby Kolumna 3 zawierała teraz 40 µL roztworu peptydu w rozcieńczeniu 1:4 względem stężenia w Kolumnie 1.
    3. Powtarzaj ten proces, aż Kolumna 10 będzie zawierać 40 µL roztworu peptydu w rozcieńczeniu 1:512 względem stężenia w Kolumnie 1.
    4. Pobierz 20 µL roztworu peptydu z Kolumny 10 i odrzuć go. Każda kolumna zawiera teraz 20 µL roztworu peptydu (Kolumny 1-10) lub wody (Kolumna 11 i Kolumna 12).
      ​UWAGA: Studzienki w Kolumnie 11 służą jako kontrole sterylności, a studzienki w Kolumnie 12 służą jako kontrole bez dodatku peptydu.

4. Rozcieńczanie subkultury C. albicans

UWAGA: Rozpocznij ten etap, gdy subkultura osiągnie OD600 na poziomie ~1,0-1,2 (krok 2.3.3).

  1. Przenieś subkulturę do probówki wirówkowej o pojemności 15 mL i wiruj przy 3,900 x g przez 3 min w temperaturze pokojowej, aby osadzić komórki. Usuń nadsącz za pomocą pipety lub przez odlanie.
  2. Resuspenduj osad w 1 mL 2 mM NaPB (krok 1.1) i przenieś zawiesinę do probówki wirówkowej o pojemności 1,7 mL.
  3. Osadź komórki (jak w kroku 4.1), odrzuć nadsącz i ponownie resuspenduj osad w 1 mL 2 mM NaPB.
  4. Powtórz krok 4.3 jeszcze dwa razy, aby pozostawić przemyte komórki w 1 mL 2 mM NaPB.
  5. Wyznacz gęstość komórek w przemytej zawiesinie i oblicz czynnik rozcieńczenia potrzebny do uzyskania gęstości komórek 5 x 105 komórek/mL. Stężenie to pozwoli ostatecznie na dodanie 1 x 104 komórek do każdej studzienki płytki 96-dołkowej.
    UWAGA: Gęstość komórek w zawiesinie można wyznaczyć za pomocą wielu metod, w tym przy użyciu hemocytometru lub automatycznego licznika komórek. W niniejszym badaniu wykorzystano krzywą wzorcową gęstości komórek w funkcji OD600 dla badanego szczepu hodowanego w odpowiednich warunkach. Krzywa ta została przygotowana przy użyciu hemocytometru (patrz Tabela materiałów) w celu wyznaczenia gęstości komórek w zawiesinach o różnych wartościach OD600.
  6. Rozcieńcz zawiesinę komórkową do poziomu 5 x 105 komórek/mL w 2 mM NaPB. Przygotowanie 10 mL tej rozcieńczonej zawiesiny będzie w zupełności wystarczające do przeprowadzenia badania.

5. Inkubacja C. albicans z roztworami peptydów i przygotowanie komórek do oceny żywotności

  1. Dodaj 20 µL rozcieńczonego C. albicans zawiesinę (krok 4.6) do kolumn 1–10 oraz kolumny 12 każdego rzędu (Rycina 1).
    UWAGA: Końcowe stężenie peptydów w pierwszej kolumnie stanowi obecnie połowę stężenia roztworu zapasu peptydów. W niniejszym badaniu końcowe stężenie peptydów wynosiło 50 µM w tym momencie. Końcowa zawiesina komórkowa w każdej studzience zawiera 2,5 x 105 komórek/ml. Kolumny 1–10 służą jako studzienki doświadczalne do oceny aktywności przeciwgrzybiczej przy różnych stężeniach peptydów, a kolumna 12 służy jako kontrola wzrostu bez dodatku peptydów.
  2. Dodaj 20 µL do kolumny 11. We wszystkich dołkach końcowe stężenie NaPB wynosi teraz 1 mM. Kolumna 11 służy jako kontrola sterylności.
  3. Płytka przykrywna 1 (zawierająca zarówno komórki, jak i peptyd), a następnie inkubować w temperaturze 30 °C przez 30 min.
    UWAGA: Czas inkubacji wynoszący 30 min jest wystarczający dla wielu peptydów17,21,22,30czas inkubacji można jednak wydłużyć do 60 min, jeśli jest to pożądane, aby uwzględnić peptydy, które mogą wymagać więcej czasu na wykazanie swojej aktywności przeciwgrzybiczej25,31,32.
  4. Przygotuj nową 96-dołkową płytkę hodowlaną (Płytka 2) do wykorzystania w oznaczaniu żywotności (Rycina 2).
    UWAGA: Płytkę hodowlaną należy przygotować podczas inkubacji płytki 1.
    1. Dodaj 100 µL pożywki YPD (krok 1.2) do wszystkich dołków płytki.
    2. Dodaj 100 µL 2 mM NaPB (Krok 1.1) do wszystkich dołków płytki.
  5. Rozcień próbki na płytce 1 (zawierającej komórki i peptydy), a następnie przenieś je na płytkę 2 (zawierającą medium i bufor).
    1. Po 30 min inkubacji wyjmij Płytkę 1 z inkubatora.
    2. Rozcieńczyć zawartość każdego dołka Płytki 1 poprzez dodanie 280 µL 1 mM NaPB (krok 1.1) do uzyskania całkowitej objętości wynoszącej 320 µL w każdym dołku (Rysunek 2).
    3. Wymieszaj zawartość wszystkich studzienek zawierających komórki i peptydy, pipetując ciecz w górę i w dół, aby upewnić się, że wszystkie komórki zostały resuspendowane i nie widać żadnych osadzonych komórek na dnie studzienek.
    4. Transfer 8 µL z każdej studzienki Płytki 1 do odpowiadającej jej studzienki Płytki 2. Taka objętość przenosi około 250 komórek z każdej studzienki Płytki 1 do Płytki 2 (Rycina 2).
  6. Przykryć płytką Cover Plate 2 i inkubować na wstrząsarce do płytek mikrotitracyjnych (patrz Tabela materiałów) przy 350 obr./min przez 17 h w temperaturze 30 °C.

Eksperyment rozcieńczania peptydów; schemat płytki; kroki: dodawanie peptydów, rozcieńczanie wodą, dodawanie komórek.
Rycina 1: Przygotowanie Płytki 1 do inkubacji seryjnych rozcieńczeń peptydów z komórkami. Seryjne rozcieńczenia peptydów są sporządzane w wodzie, a następnie do Płytki 1 dodawane są komórki C. albicans. Kolor niebieski oznacza obecność peptydu w dołku, natomiast kolor szary oznacza dołek z samą wodą, bez peptydu. Dołki zawierające komórki są oznaczone wzorem czarnych kropek. Po wykonaniu tych kroków płytka jest inkubowana, aby umożliwić peptydowi wykazanie aktywności przeciwgrzybiczej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat testu wzrostu drobnoustrojów; proces stopniowego rozcieńczania i przenoszenia na płytkę.
Rysunek 2: Przygotowanie płytki 2 w celu ilościowego oznaczenia spadku żywotności wywołanego przez peptyd. Do płytki 2 dodaje się pożywkę YPD oraz NaPB. Po rozcieńczeniu zawartości płytki 1, alikwot z każdej studni jest przenoszony z płytki 1 do płytki 2. Następnie płytkę 2 inkubuje się, aby umożliwić wzrost żywych komórek w celu ich ilościowego oznaczenia poprzez pomiar OD600. W przypadku płytki 2 studnie zawierające tylko YPD i NaPB są zaznaczone na pomarańczowo. Studnie zawierające alikwoty z płytki 1 zmieszane z YPD i NaPB są zaznaczone na zielono. Opis kolorów na płytce 1 znajduje się w legendzie do Rysunku 1. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

6. Ocena aktywności przeciwgrzybiczej

  1. Wyznacz wartości OD600 dla każdego dołka na Płytce 2.
    1. Wyjmij Płytkę 2 z inkubatora po 17 h inkubacji.
    2. Wymieszaj zawartość wszystkich dołków na Płytce 2, pipetując ciecz w górę i w dół, aby upewnić się, że wszystkie komórki zostały resuspensowane i nie są widoczne osady komórkowe na dnie dołków.
      UWAGA: Unikaj powstawania pęcherzyków powietrza podczas tego kroku, ponieważ mogą one zakłócić odczyty OD600. Jeśli powstaną pęcherzyki, często można je przebić suchą końcówką pipety lub usunąć, używając dwóch końcówek do ich wyjęcia z dołka.
    3. Użyj płytkowego czytnika absorbancji (patrz Tabela materiałów) przy długości fali 600 nm, aby wyznaczyć OD600 dla każdego dołka.
  2. Oblicz hamowanie wzrostu (w procentach) i przedstaw je na wykresie, aby określić wpływ peptydów na wzrost C. albicans.
    1. Dla każdego dołka oblicz spadek żywotności w porównaniu z kontrolą (w procentach), korzystając z następującego równania17,22,23:
      Wzór na spadek żywotności dla wpływu peptydów na żywotność komórek, wyrażenie matematyczne.
      gdzie ODwith peptide to OD600 dołka zawierającego daną stężenie peptydu, ODbackground to OD600 kolumny 11 w tym samym rzędzie (kontrola bez komórek), a
      ODno peptide to OD600 kolumny 12 w tym samym rzędzie (kontrola zawierająca komórki bez peptydu).
    2. Na przykład użyj następującego wyrażenia, aby obliczyć spadek żywotności w dołku B5 na podstawie wartości OD600 dla rzędu B:
      Wzór na równowagę statyczną, obliczenie procentowego spadku żywotności, przedstawione jako równanie.
  3. Przedstaw spadek żywotności jako funkcję stężenia peptydu na wykresie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wykorzystanie pomiarów OD600 do ilościowego określenia redukcji wzrostu wywołanej przez peptydy przeciwgrzybicze pozwala zaoszczędzić znaczną ilość czasu w porównaniu z wysiewaniem próbek i liczeniem CFU. Metoda opisana w niniejszym protokole wymaga wykonania poszczególnych etapów w ciągu trzech różnych dni. Pierwszego dnia potrzeba około 1 h na przygotowanie buforów i pożywek (nie licząc czasu sterylizacji) oraz zaszczepienie kultury wyjściowej C. albicans do inkubacji nocnej. Drugiego dnia etapy te ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół ten opisuje skuteczne podejście do uzyskiwania danych ilościowych na temat aktywności przeciwgrzybiczej AMP przeciwko patogenowi grzybowemu C. albicans. Jednym z powszechnych alternatywnych podejść do testowania peptydów i innych środków przeciwgrzybiczych jest mikrorozcieńczenie bulionu opisane w normie M2718 Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI), ale norma ta koncentruje się na uzyskiwaniu jakościowych wyników wizualnych, a nie ilościowych. Innym alternatywnym podejści...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health (R03DE029270, T32AI089621B), National Science Foundation (CBET 1511718), Departament Edukacji (GAANN-P200A180093) oraz University of Maryland Cross-Campus Seed Grant.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Płytki 96-dołkowe (okrągłe dno)VWR10062-902
Czytnik mikropłytek absorbancyjnychN/AN/DWystarcza każdy dostępny czytnik mikropłytek
C. albicans szczep SC5314ATCC MYA-2876Można również stosować inne C. albicans
HemocytometrN/AN/AMoże być używany do wykonania standardowej krzywej wiążącej numer komórki z OD600
Wytrząsarka do mikropłytekVWR2620-926
Peptyd(y)N/AN/A N/APeptydy mogą być komercyjnie syntetyzowane przez dowolnego wiarygodnego dostawcę; czystość ≥ Zalecane jest usuwanie 95% i soli kwasu trifluorooctowego do soli chlorowodorku
Zbiorniki na odczynniki do pipetorów wielokanałowychVWR18900-320Upraszcza pipetowanie do płytek wielodołkowych za pomocą pipety wielokanałowej
Fosforan sodu, dwuzasadowyFisher ScientificBP332-500Do wytwarzania NaPB
Fosforan sodu, monozasadowyFisher ScientificBP329-500Do wytwarzania NaPB
Spektrofotometr UVN/AN/AKażdy dostępny spektrofotometr UV jest wystarczający
YPD średni proszekBD Life Sciences242820Może być również wytwarzany z ekstraktu drożdżowego, peptonu i dekstrozy

Bibliografia

  1. Gulati, M., Nobile, C. J. Candida albicans biofilms: Development, regulation, and molecular mechanisms. Microbes and Infection. 18 (5), 310-321 (2016).
  2. Arya, N. R., Rafiq, N. B. Candidiasis. StatPearls. , StatPearls Publishing. Treasure Island, FL. (2021).
  3. de Oliveira Santos, G. C., et al. Candida infections and therapeutic strategies: Mechanisms of action for traditional and alternative agents. Frontiers in Microbiology. 9, 1351(2018).
  4. Espinel-Ingroff, A. Mechanisms of resistance to antifungal agents: Yeasts and filamentous fungi. Revista Iberoamericana de Micología. 25 (2), 101-106 (2008).
  5. Wang, X., et al. Delivery strategies of amphotericin B for invasive fungal infections. Acta Pharmaceutica Sinica B. 11 (8), 2585-2604 (2021).
  6. Struyfs, C., Cammue, B. P. A., Thevissen, K. Membrane-interacting antifungal peptides. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 649875(2021).
  7. Huan, Y., Kong, Q., Mou, H., Yi, H. Antimicrobial peptides: Classification, design, application and research progress in multiple fields. Frontiers in Microbiology. 11, 582779(2020).
  8. Sarkar, T., Chetia, M., Chatterjee, S. Antimicrobial peptides and proteins: From nature's reservoir to the laboratory and beyond. Frontiers in Chemistry. 9, 691532(2021).
  9. Mahlapuu, M., Bjorn, C., Ekblom, J. Antimicrobial peptides as therapeutic agents: Opportunities and challenges. Critical Reviews in Biotechnology. 40 (7), 978-992 (2020).
  10. Lei, J., et al. The antimicrobial peptides and their potential clinical applications. American Journal of Translational Research. 11 (7), 3919-3931 (2019).
  11. Mercer, D. K., O'Neil, D. A. Innate inspiration: Antifungal peptides and other immunotherapeutics from the host immune response. Frontiers in Immunology. 11, 2177(2020).
  12. Bin Hafeez, A., Jiang, X., Bergen, P. J., Zhu, Y. Antimicrobial peptides: An update on classifications and databases. International Journal of Molecular Sciences. 22 (21), 11691(2021).
  13. Xu, T., Levitz, S. M., Diamond, R. D., Oppenheim, F. G. Anticandidal activity of major human salivary histatins. Infection and Immunity. 59 (8), 2549-2554 (1991).
  14. Helmerhorst, E. J., et al. Amphotericin B- and fluconazole-resistant Candida spp., Aspergillus fumigatus, and other newly emerging pathogenic fungi are susceptible to basic antifungal peptides. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 43 (3), 702-704 (1999).
  15. Andra, J., Berninghausen, O., Leippe, M. Cecropins, antibacterial peptides from insects and mammals, are potently fungicidal against Candida albicans. Medical Microbiology and Immunology. 189, 169-173 (2001).
  16. do Nascimento Dias, J., et al. Mechanisms of action of antimicrobial peptides ToAP2 and NDBP-5.7 against Candida albicans planktonic and biofilm cells. Scientific Reports. 10, 10327(2020).
  17. Ikonomova, S. P., et al. Effects of histatin 5 modifications on antifungal activity and kinetics of proteolysis. Protein Science. 29, 480-493 (2020).
  18. Clinical Laboratory Standards Institute. M27-A3. Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts; Approved standard - Third edition. , Clinical Laboratory Standards Institute. (2008).
  19. Lupetti, A., et al. Candidacidal activities of human lactoferrin peptides derived from the N terminus. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 44 (12), 3257-3263 (2000).
  20. Han, J., Jyoti, M. A., Song, H. Y., Jang, W. S. Antifungal activity and action mechanism of histatin 5-halocidin hybrid peptides against Candida ssp. PLoS One. 11 (2), 0150196(2016).
  21. den Hertog, A. L., et al. Candidacidal effects of two antimicrobial peptides: histatin 5 causes small membrane defects, but LL-37 causes massive disruption of the cell membrane. Biochemical Journal. 388, 689-695 (2005).
  22. Ikonomova, S. P., Moghaddam-Taaheri, P., Jabra-Rizk, M. A., Wang, Y., Karlsson, A. J. Engineering improved variants of the antifungal peptide histatin 5 with reduced susceptibility to Candida albicans secreted aspartic proteases and enhanced antimicrobial potency. The FEBS Journal. 285 (1), 146-159 (2018).
  23. Moghaddam-Taaheri, P., Leissa, J. A., Eppler, H. B., Jewell, C. M., Karlsson, A. J. Histatin 5 variant reduces Candida albicans biofilm viability and inhibits biofilm formation. Fungal Genetics and Biology. 149, 103529(2021).
  24. Gong, Z., Doolin, M. T., Adhikari, S., Stroka, K. M., Karlsson, A. J. Role of charge and hydrophobicity in translocation of cell-penetrating peptides into Candida albicans cells. AIChE Journal. 65 (12), 16768(2019).
  25. Gong, Z., Karlsson, A. J. Translocation of cell-penetrating peptides into Candida fungal pathogens. Protein Science. 26 (9), 1714-1725 (2017).
  26. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Fourth edition. 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Long Island, NY. (2012).
  27. Consolidated Sterilizer Systems. Laboratory and Research Autoclaves. , Available from: https://consteril.com/wp-content/uploads/2020/12/CSS-Product-Brochure.pdf (2022).
  28. American Type Culture Collection. , Available from: www.atcc.org (2022).
  29. Rodriguez-Tudela, J. L., Cuenca-Estrella, M., Diaz-Guerra, T. M., Mellado, E. Standardization of antifungal susceptibility variables for a semiautomated methodology. Journal of Clinical Microbiology. 39 (7), 2513-2517 (2001).
  30. Mbuayama, K. R., Taute, H., Strmstedt, A. A., Bester, M. J., Gaspar, A. R. M. Antifungal activity and mode of action of synthetic peptides derived from the tick OsDef2 defensin. Journal of Peptide Science. 28 (5), 3383(2022).
  31. Rossignol, T., Kelly, B., Dobson, C., d'Enfert, C. Endocytosis-mediated vacuolar accumulation of the human ApoE apolipoprotein-derived ApoEdpL-W antimicrobial peptide contributes to its antifungal activity in Candida albicans. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (10), 4670-4681 (2011).
  32. Helmerhorst, E. J., Reijnders, I. M., van't Hof, W., Veerman, E. C., Nieuw Amerongen, A. V. A critical comparison of the hemolytic and fungicidal activities of cationic antimicrobial peptides. FEBS Letters. 449 (2-3), 105-110 (1999).
  33. Kerenga, B. K., et al. Salt-tolerant antifungal and antibacterial activities of the corn defensin ZmD32. Frontiers in Microbiology. 10, 795(2019).
  34. Lee, I. H., Cho, Y., Lehrer, R. I. Effects of pH and salinity on the antimicrobial properties of clavanins. Infection and Immunity. 65 (7), 2898-2903 (1997).
  35. Li, X. S., Reddy, M. S., Baev, D., Edgerton, M. Candida albicans Ssa1/2p is the cell envelope binding protein for human salivary histatin 5. Journal of Biological Chemistry. 278 (31), 28553-28561 (2003).
  36. Rothstein, D. M., et al. Anticandida activity is retained in P-113, a 12-amino-acid fragment of histatin 5. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (5), 1367-1373 (2001).
  37. Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: Volume transfers with serological pipettes and micropipettors. Journal of Visualized Experiments. (63), e2754(2012).
  38. Mansoury, M., Hamed, M., Karmustaji, R., Al Hannan, F., Safrany, S. T. The edge effect: A global problem. The trouble with culturing cells in 96-well plates. Biochemistry and Biophysics Report. 26, 100987(2021).
  39. Goughenour, K. D., Balada-Llasat, J. M., Rappleye, C. A. Quantitative microplate-based growth assay for determination of antifungal susceptibility of Histoplasma capsulatum yeasts. Journal of Clinical Microbiology. 53 (10), 3286-3295 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Peptydy przeciwgrzybiczeg sto optycznahamowanie wzrostuoznaczanie ilo ci peptyd wp ytka 96 do kowarozcie czenia seryjnejednostki tworz ce koloniezawiesina dro d ypodatno na rodki przeciwgrzybicze
Kwantyfikacja aktywności przeciwgrzybiczej peptydów przeciwko Candida albicans
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.