Fizjologiczny model in vivo α-synukleiny jest niezbędny do zbadania i zrozumienia patogenezy choroby Parkinsona. Opisujemy metodę monitorowania cytotoksyczności i tworzenia agregatów α-synukleiny przy użyciu humanizowanego modelu drożdży.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Metoda badania toksyczności i agregacji α-synukleiny przy użyciu humanizowanego modelu drożdży
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Choroba Parkinsona jest drugim najczęściej występującym zaburzeniem neurodegeneracyjnym i charakteryzuje się postępującą śmiercią komórkową spowodowaną powstawaniem ciał Lewy'ego zawierających nieprawidłowo sfałdowane i zagregowane α-synukleiny. α-synukleina jest obfitym białkiem presynaptycznym, które reguluje transport pęcherzyków synaptycznych, ale nagromadzenie jej inkluzji białkowych powoduje neurotoksyczność. Ostatnie badania wykazały, że różne czynniki genetyczne, w tym opiekuńcze bakterie, mogą zmniejszać tworzenie się agregatów α-synukleiny in vitro. Jednak ważne jest również monitorowanie efektu antyagregacji w komórce, aby zastosować go jako potencjalne leczenie dla pacjentów. Idealnie byłoby użyć komórek neuronalnych, ale te komórki są trudne w obsłudze i potrzebują dużo czasu, aby wykazać fenotyp antyagregacji. W związku z tym potrzebne jest szybkie i skuteczne narzędzie in vivo do dalszej oceny aktywności antyagregacyjnej in vivo. Opisana tutaj metoda została wykorzystana do monitorowania i analizy fenotypu antyagregacji u humanizowanych drożdży Saccharomyces cerevisiae, które wykazywały ekspresję ludzkiej α-synukleiny. Protokół ten demonstruje narzędzia in vivo, które można wykorzystać do monitorowania toksyczności komórkowej indukowanej α-synukleiną, a także tworzenia agregatów α-synukleiny w komórkach.
Wprowadzenie
Choroba Parkinsona (PD) jest poważnym problemem dla starzejących się społeczeństw na całym świecie. Agregacja α-synukleiny jest ściśle związana z chorobą Parkinsona, a agregaty białkowe α-synukleiny są szeroko stosowane jako biomarker molekularny do diagnozowania choroby1. α-synukleina jest małym kwaśnym białkiem (o długości 140 aminokwasów) z trzema domenami, a mianowicie N-końcową α-helisą wiążącą lipidy, centralną domeną wiążącą amyloid (NAC) i C-końcowym kwaśnym ogonem2. Nieprawidłowe fałdowanie α-synukleiny może wystąpić spontanicznie i ostatecznie prowadzi do powstania agregatów amyloidowych z....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie pożywek i roztworów
- Przygotowanie podłoża
- Aby przygotować pożywkę YPD, rozpuść 50 g proszku YPD w dH2O, aby uzyskać końcową objętość 1 l. Autoklaw do sterylizacji. Przechowywać w temperaturze pokojowej (RT).
- Aby przygotować podłoże agarowe YPD, rozpuść 50 g proszku YPD i 20 g agaru w 1 L dH2O. Autoklaw do sterylizacji. Po wystudzeniu wylać na szalki Petriego. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
- Aby zrobić SC z pożywką rafinozową (SRd)-Ura, rozpuść 6,7 g drożdżowej zasady azotowej z siarczanem amonu i bez aminokwasów w 795 ml dH2O. Autoklaw do sterylizacji. Pr....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Wiadomo, że wysoka ekspresja α-synukleiny jest powiązana ze śmiercią komórek neuronalnych i chorobą Parkinsona (PD) w systemach modelowych PD. Niniejsze badanie opisuje trzy metody monitorowania cytotoksyczności α-synukleiny oraz tworzenia się ognisk zagregowanej α-synukleiny w drożdżach. W pracy tej zastosowano nadekspresję α-synukleiny w drożdżach i zbadano fenotypy α-synukleiny typu dzikiego oraz trzech wariantów α-synukleiny znanych jako mutacje rodzinne PD (Rysunek 1 oraz Tabela.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Biorąc pod uwagę złożoność różnych układów komórkowych u ludzi, korzystne jest wykorzystanie drożdży jako modelu do badania ludzkich chorób neurodegeneracyjnych. Chociaż prawie niemożliwe jest zbadanie złożonych interakcji komórkowych ludzkiego mózgu za pomocą drożdży, z perspektywy pojedynczej komórki komórki drożdży mają wysoki poziom podobieństwa do komórek ludzkich pod względem homologii sekwencji genomowej i podstawowych eukariotycznych procesów komórkowych 8,13
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Dziękujemy Jamesowi Bardwellowi i Tiago F. Outeiro za uprzejme podzielenie się plazmidami zawierającymi α-synukleinę. Changhan Lee otrzymał dofinansowanie z Narodowej Fundacji Badawczej Korei (NRF) finansowane przez rząd koreański (MSIT) (grant 2021R1C1C1011690), Program Badań Podstawowych za pośrednictwem NRF finansowany przez Ministerstwo Edukacji (grant 2021R1A6A1A10044950) oraz nowy wydziałowy fundusz badawczy Uniwersytetu Ajou.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Płytka 96-dołkowa | SPL | 30096 | |
| Agaroza | TAESHIN | 0158 | |
| Bacto Agar | BD Difco | 214010 | |
| Oddychająca, | zróżnicowana biotechnologia | BEM-1 | Membrana uszczelniająca przepuszczająca gaz do płytek do mikromiareczkowania |
| okularów nakrywkowych | Marienfeld | 24 x 60 mm | |
| Probówka hodowlana | SPL | 40014 | |
| Kuweta | ratiolab | 2712120 | |
| D-(+)-Galactose | sigma | G0625 | |
| D-(+)-Glukoza | sigma | G8270 | |
| D-(+)-Rafinoza pentahydrat | Daejung | 6638-4105 | |
| Inkubator (wytrząsanie) | Model Labtron | : Inkubator SHI1 | |
| (statyczny) | Vision scientific | model: VS-1203PV-O | |
| LiAc | sigma | L6883 | |
| Czytnik mikropłytek | Tecan | 30050303 01 | Model: Pipeta wielokanałowa Infinite 200 pro |
| 20-200 i mikro; L | gilson | FA10011 | |
| pipeta wielokanałowa 2-20 &mikro; L | gilson | FA10009 | |
| mikroskop Olympus | Olympus | IX-53 | |
| PEG | sigma | P4338 | średnia mol wt 3,350 |
| Petridish | SPL | 10090 | |
| pRS426 | Christianson, T. W., Sikorski, R. S., Dante, M., Shero, J. H. & Hieter, P. Wielofunkcyjne wektory wahadłowe drożdży o wysokiej liczbie kopii. Gen. 110 (1), 119-122 (1992). | ||
| pRS426 GAL1 promotor α-synukleina A30P | Outeiro, TF & Lindquist, S. Komórki drożdży zapewniają wgląd w biologię alfa-synukleiny i patobiologię. Nauka. 302 (5651), 1772-1775 (2003) | ||
| pRS426 GAL1 promotor &alfa;-synukleina A53T | Outeiro, TF & Lindquist, S. Komórki drożdży zapewniają wgląd w biologię alfa-synukleiny i patobiologię. Nauka. 302 (5651), 1772-1775 (2003) | ||
| pRS426 GAL1 promotor α-synukleina E46K | Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Komórki drożdży zapewniają wgląd w biologię alfa-synukleiny i patobiologię. Nauka. 302 (5651), 1772-1775 (2003) | ||
| pRS426 GAL1 promotor α-synukleina WT | Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Komórki drożdży zapewniają wgląd w biologię alfa-synukleiny i patobiologię. Nauka. 302 (5651), 1772-1775 (2003) | ||
| Zbiornik | SPL | 23050 | |
| Spektrofotometr | eppendorf | 6131 05560 | |
| W303a | Obecny od Jamesa Bardwella | ||
| Drożdżowa zasada azotowa bez aminokwasów | Difco | 291940 | |
| Syntetyczne suplementy drożdżowe bez uracylu | sigma | Y1501 | |
| YPD | Condalab | 1547.00 |
Bibliografia
- Khurana, V., Lindquist, S. Modelling neurodegeneration in Saccharomyces cerevisiae: Why cook with baker's yeast. Nature Reviews Neuroscience. 11 (6), 436-449 (2010).
- Surguchov, A. Intrac....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
