Method Article

Metoda badania toksyczności i agregacji α-synukleiny przy użyciu humanizowanego modelu drożdży

DOI:

10.3791/64418

⸱

November 25th, 2022

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, Ajou University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fizjologiczny model in vivo α-synukleiny jest niezbędny do zbadania i zrozumienia patogenezy choroby Parkinsona. Opisujemy metodę monitorowania cytotoksyczności i tworzenia agregatów α-synukleiny przy użyciu humanizowanego modelu drożdży.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Choroba Parkinsona jest drugim najczęściej występującym zaburzeniem neurodegeneracyjnym i charakteryzuje się postępującą śmiercią komórkową spowodowaną powstawaniem ciał Lewy'ego zawierających nieprawidłowo sfałdowane i zagregowane α-synukleiny. α-synukleina jest obfitym białkiem presynaptycznym, które reguluje transport pęcherzyków synaptycznych, ale nagromadzenie jej inkluzji białkowych powoduje neurotoksyczność. Ostatnie badania wykazały, że różne czynniki genetyczne, w tym opiekuńcze bakterie, mogą zmniejszać tworzenie się agregatów α-synukleiny in vitro. Jednak ważne jest również monitorowanie efektu antyagregacji w komórce, aby zastosować go jako potencjalne leczenie dla pacjentów. Idealnie byłoby użyć komórek neuronalnych, ale te komórki są trudne w obsłudze i potrzebują dużo czasu, aby wykazać fenotyp antyagregacji. W związku z tym potrzebne jest szybkie i skuteczne narzędzie in vivo do dalszej oceny aktywności antyagregacyjnej in vivo. Opisana tutaj metoda została wykorzystana do monitorowania i analizy fenotypu antyagregacji u humanizowanych drożdży Saccharomyces cerevisiae, które wykazywały ekspresję ludzkiej α-synukleiny. Protokół ten demonstruje narzędzia in vivo, które można wykorzystać do monitorowania toksyczności komórkowej indukowanej α-synukleiną, a także tworzenia agregatów α-synukleiny w komórkach.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Choroba Parkinsona (PD) jest poważnym problemem dla starzejących się społeczeństw na całym świecie. Agregacja α-synukleiny jest ściśle związana z chorobą Parkinsona, a agregaty białkowe α-synukleiny są szeroko stosowane jako biomarker molekularny do diagnozowania choroby1. α-synukleina jest małym kwaśnym białkiem (o długości 140 aminokwasów) z trzema domenami, a mianowicie N-końcową α-helisą wiążącą lipidy, centralną domeną wiążącą amyloid (NAC) i C-końcowym kwaśnym ogonem2. Nieprawidłowe fałdowanie α-synukleiny może wystąpić spontanicznie i ostatecznie prowadzi do powstania agregatów amyloidowych z....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie pożywek i roztworów

  1. Przygotowanie podłoża
    1. Aby przygotować pożywkę YPD, rozpuść 50 g proszku YPD w dH2O, aby uzyskać końcową objętość 1 l. Autoklaw do sterylizacji. Przechowywać w temperaturze pokojowej (RT).
    2. Aby przygotować podłoże agarowe YPD, rozpuść 50 g proszku YPD i 20 g agaru w 1 L dH2O. Autoklaw do sterylizacji. Po wystudzeniu wylać na szalki Petriego. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
    3. Aby zrobić SC z pożywką rafinozową (SRd)-Ura, rozpuść 6,7 g drożdżowej zasady azotowej z siarczanem amonu i bez aminokwasów w 795 ml dH2O. Autoklaw do sterylizacji. Pr....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wiadomo, że wysoka ekspresja α-synukleiny jest związana ze śmiercią komórek neuronalnych i PD w modelowych systemach PD. W pracy opisano trzy metody monitorowania cytotoksyczności α-synukleiny i powstawania ognisk zagregowanej α-synukleiny w drożdżach. Tutaj α-synukleina uległa nadekspresji w drożdżach i zbadano fenotypy α-synukleiny typu dzikiego i trzy warianty α-synukleiny znane jako rodzinne mutanty PD (Rysunek 1 i tabela materiałów).

Ekspresja .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biorąc pod uwagę złożoność różnych układów komórkowych u ludzi, korzystne jest wykorzystanie drożdży jako modelu do badania ludzkich chorób neurodegeneracyjnych. Chociaż prawie niemożliwe jest zbadanie złożonych interakcji komórkowych ludzkiego mózgu za pomocą drożdży, z perspektywy pojedynczej komórki komórki drożdży mają wysoki poziom podobieństwa do komórek ludzkich pod względem homologii sekwencji genomowej i podstawowych eukariotycznych procesów komórkowych 8,13

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Jamesowi Bardwellowi i Tiago F. Outeiro za uprzejme podzielenie się plazmidami zawierającymi α-synukleinę. Changhan Lee otrzymał dofinansowanie z Narodowej Fundacji Badawczej Korei (NRF) finansowane przez rząd koreański (MSIT) (grant 2021R1C1C1011690), Program Badań Podstawowych za pośrednictwem NRF finansowany przez Ministerstwo Edukacji (grant 2021R1A6A1A10044950) oraz nowy wydziałowy fundusz badawczy Uniwersytetu Ajou.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Płytka 96-dołkowaSPL30096
AgarozaTAESHIN0158
Bacto AgarBD Difco214010
Oddychająca,zróżnicowana biotechnologiaBEM-1Membrana uszczelniająca przepuszczająca gaz do płytek do mikromiareczkowania
okularów nakrywkowychMarienfeld24 x 60 mm
Probówka hodowlanaSPL40014
Kuwetaratiolab2712120
D-(+)-GalactosesigmaG0625
D-(+)-GlukozasigmaG8270
D-(+)-Rafinoza pentahydratDaejung6638-4105
Inkubator (wytrząsanie)Model Labtron: Inkubator SHI1
(statyczny)Vision scientificmodel: VS-1203PV-O
LiAcsigmaL6883
Czytnik mikropłytekTecan30050303 01Model: Pipeta wielokanałowa Infinite 200 pro
20-200 i mikro; LgilsonFA10011
pipeta wielokanałowa 2-20 &mikro; LgilsonFA10009
mikroskop OlympusOlympusIX-53
PEGsigmaP4338średnia mol wt 3,350
PetridishSPL10090
pRS426Christianson, T. W., Sikorski, R. S., Dante, M., Shero, J. H. & Hieter, P. Wielofunkcyjne wektory wahadłowe drożdży o wysokiej liczbie kopii. Gen. 110 (1), 119-122 (1992).
pRS426 GAL1 promotor α-synukleina A30POuteiro, TF & Lindquist, S. Komórki drożdży zapewniają wgląd w biologię alfa-synukleiny i patobiologię. Nauka. 302 (5651), 1772-1775 (2003)
pRS426 GAL1 promotor &alfa;-synukleina A53TOuteiro, TF & Lindquist, S. Komórki drożdży zapewniają wgląd w biologię alfa-synukleiny i patobiologię. Nauka. 302 (5651), 1772-1775 (2003)
pRS426 GAL1 promotor α-synukleina E46KOuteiro, T. F. & Lindquist, S. Komórki drożdży zapewniają wgląd w biologię alfa-synukleiny i patobiologię. Nauka. 302 (5651), 1772-1775 (2003)
pRS426 GAL1 promotor α-synukleina WTOuteiro, T. F. & Lindquist, S. Komórki drożdży zapewniają wgląd w biologię alfa-synukleiny i patobiologię. Nauka. 302 (5651), 1772-1775 (2003)
ZbiornikSPL23050
Spektrofotometreppendorf6131 05560
W303aObecny od Jamesa Bardwella
Drożdżowa zasada azotowa bez aminokwasówDifco291940
Syntetyczne suplementy drożdżowe bez uracylusigmaY1501
YPDCondalab1547.00

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Khurana, V., Lindquist, S. Modelling neurodegeneration in Saccharomyces cerevisiae: Why cook with baker's yeast. Nature Reviews Neuroscience. 11 (6), 436-449 (2010).
  2. Surguchov, A. Intrac....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Alpha Synuclein AggregationYeast ModelParkinson s DiseaseSynuclein ToxicityHumanized YeastProtein AggregationFluorescence MicroscopyWestern BlottingGenetic ScreeningSynaptic Vesicle Trafficking

Related Articles