Artykuł metodologiczny

Metoda badania toksyczności i agregacji α-synukleiny przy użyciu humanizowanego modelu drożdży

DOI:

10.3791/64418

⸱

25 listopada 2022

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, Ajou University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fizjologiczny model in vivo α-synukleiny jest niezbędny do zbadania i zrozumienia patogenezy choroby Parkinsona. Opisujemy metodę monitorowania cytotoksyczności i tworzenia agregatów α-synukleiny przy użyciu humanizowanego modelu drożdży.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Choroba Parkinsona jest drugim najczęściej występującym zaburzeniem neurodegeneracyjnym i charakteryzuje się postępującą śmiercią komórkową spowodowaną powstawaniem ciał Lewy'ego zawierających nieprawidłowo sfałdowane i zagregowane α-synukleiny. α-synukleina jest obfitym białkiem presynaptycznym, które reguluje transport pęcherzyków synaptycznych, ale nagromadzenie jej inkluzji białkowych powoduje neurotoksyczność. Ostatnie badania wykazały, że różne czynniki genetyczne, w tym opiekuńcze bakterie, mogą zmniejszać tworzenie się agregatów α-synukleiny in vitro. Jednak ważne jest również monitorowanie efektu antyagregacji w komórce, aby zastosować go jako potencjalne leczenie dla pacjentów. Idealnie byłoby użyć komórek neuronalnych, ale te komórki są trudne w obsłudze i potrzebują dużo czasu, aby wykazać fenotyp antyagregacji. W związku z tym potrzebne jest szybkie i skuteczne narzędzie in vivo do dalszej oceny aktywności antyagregacyjnej in vivo. Opisana tutaj metoda została wykorzystana do monitorowania i analizy fenotypu antyagregacji u humanizowanych drożdży Saccharomyces cerevisiae, które wykazywały ekspresję ludzkiej α-synukleiny. Protokół ten demonstruje narzędzia in vivo, które można wykorzystać do monitorowania toksyczności komórkowej indukowanej α-synukleiną, a także tworzenia agregatów α-synukleiny w komórkach.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Choroba Parkinsona (PD) jest poważnym problemem dla starzejących się społeczeństw na całym świecie. Agregacja α-synukleiny jest ściśle związana z chorobą Parkinsona, a agregaty białkowe α-synukleiny są szeroko stosowane jako biomarker molekularny do diagnozowania choroby1. α-synukleina jest małym kwaśnym białkiem (o długości 140 aminokwasów) z trzema domenami, a mianowicie N-końcową α-helisą wiążącą lipidy, centralną domeną wiążącą amyloid (NAC) i C-końcowym kwaśnym ogonem2. Nieprawidłowe fałdowanie α-synukleiny może wystąpić spontanicznie i ostatecznie prowadzi do powstania agregatów amyloidowych zwanych ciałami Lewy'ego3. α-synukleina może przyczyniać się do patogenezy choroby Parkinsona na kilka sposobów. Ogólnie uważa się, że jego nieprawidłowe, rozpuszczalne oligomeryczne formy zwane protofibrylami są gatunkami toksycznymi, które powodują śmierć komórek neuronalnych, wpływając na różne cele komórkowe, w tym funkcję synaptyczną3.

Modele biologiczne używane do badania chorób neurodegeneracyjnych muszą być istotne dla ludzi pod względem ich genomu i biologii komórkowej. Najlepszymi modelami byłyby ludzkie linie komórkowe neuronów. Jednak te linie komórkowe wiążą się z kilkoma problemami technicznymi, takimi jak trudności w utrzymaniu kultur, niska wydajność transfekcji i wysokie koszty4. Z tych powodów potrzebne jest łatwe i niezawodne narzędzie, które przyspieszy postęp w tej dziedzinie badań. Co ważne, narzędzie powinno być łatwe w obsłudze do analizy zebranych danych. Z tej perspektywy szeroko stosowano różne organizmy modelowe, w tym Drosophila, Caenorhabditis elegans, Danio rerio, drożdże i gryzonie5. Wśród nich drożdże są najlepszym organizmem modelowym, ponieważ manipulacja genetyczna jest łatwa i jest tańsza niż inne organizmy modelowe. Co najważniejsze, drożdże mają duże podobieństwa do komórek ludzkich, takie jak 60% homologii sekwencji do ludzkich ortologów i 25% bliskiej homologii z ludzkimi genami związanymi z chorobami6, a także mają wspólną fundamentalną biologię komórki eukariotycznej. Drożdże zawierają wiele białek o podobnych sekwencjach i analogicznych funkcjach do tych w komórkach ludzkich7. Rzeczywiście, drożdże wyrażające ludzkie geny są szeroko stosowane jako system modelowy do wyjaśniania procesów komórkowych8. Ten szczep drożdży nazywa się drożdżami humanizowanymi i jest użytecznym narzędziem do badania funkcji ludzkich genów9. Humanizowane drożdże mają zalety w badaniu interakcji genetycznych, ponieważ manipulacja genetyczna jest dobrze ugruntowana w drożdżach.

W tym badaniu użyliśmy drożdży Saccharomyces cerevisiae jako organizmu modelowego do badania patogenezy PD, szczególnie do badania tworzenia agregatów α-synukleiny i cytotoksyczności10. Do ekspresji α-synukleiny w pączkujących drożdżach szczep W303a wykorzystano do transformacji z plazmidami kodującymi warianty α-synukleiny typu dzikiego i rodzinnego związane z PD. Ponieważ szczep W303a ma mutację auksotroficzną na URA3, ma zastosowanie do selekcji komórek zawierających plazmidy z URA3. Ekspresja α-synukleiny kodowanej w plazmidzie jest regulowana przez promotor GAL1. W ten sposób można kontrolować poziom ekspresji α-synukleiny. Ponadto fuzja białka zielonej fluorescencji (GFP) w regionie C-końcowym α-synukleiny umożliwia monitorowanie powstawania ognisk α-synukleiny. Aby zrozumieć charakterystykę rodzinnych wariantów α-synukleiny związanych z chorobą Parkinsona, wyraziliśmy również te warianty w drożdżach i zbadaliśmy ich działanie komórkowe. System ten jest prostym narzędziem do badań przesiewowych związków lub genów wykazujących rolę ochronną przed cytotoksycznością α-synukleiny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie pożywek i roztworów

  1. Przygotowanie podłoża
    1. Aby przygotować pożywkę YPD, rozpuść 50 g proszku YPD w dH2O, aby uzyskać końcową objętość 1 l. Autoklaw do sterylizacji. Przechowywać w temperaturze pokojowej (RT).
    2. Aby przygotować podłoże agarowe YPD, rozpuść 50 g proszku YPD i 20 g agaru w 1 L dH2O. Autoklaw do sterylizacji. Po wystudzeniu wylać na szalki Petriego. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
    3. Aby zrobić SC z pożywką rafinozową (SRd)-Ura, rozpuść 6,7 g drożdżowej zasady azotowej z siarczanem amonu i bez aminokwasów w 795 ml dH2O. Autoklaw do sterylizacji. Przed użyciem dodaj 100 ml 20% rafinozy, 5 ml 20% glukozy i 100 ml 10x -Ura dropout.
    4. Aby przygotować pożywkę agarową SD-Ura, rozpuść 6,7 g drożdżowej zasady azotowej z siarczanem amonu i bez aminokwasów oraz 20 g agaru w 800 ml dH2O. Autoklaw w kolbie o objętości ponad 2 l. Dodać 100 ml 20% glukozy i 100 ml 10x -Ura drop-out. Dobrze wymieszaj i wylej na szalki Petriego. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
    5. Aby zrobić SC z pożywką agarową galaktozy (SG)-Ura, rozpuść 6,7 g drożdżowej zasady azotowej z siarczanem amonu i bez aminokwasów oraz 20 g agaru w 800 ml dH2O. Autoklaw w kolbie o objętości ponad 2 l. Dodaj 100 ml 20% galaktozy i 100 ml 10x -Ura drop-out. Dobrze wymieszaj i wlej na szalki Petriego. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
  2. Roztwory podstawowe do użycia z nośnikami SD
    1. Aby uzyskać 20% źródło węgla (glukoza, galaktoza i rafinoza), rozpuść 100 g glukozy, galaktozy lub rafinozy w dH2O, aby uzyskać końcową objętość 500 ml. Autoklaw i przechowywanie w RT.
    2. Aby przygotować 10 syntetycznych pożywek drożdżowych bez uracylu (10x-Ura drop-out), rozpuść 19,2 g "syntetycznych pożywek drożdżowych bez uracylu" w dH2O, aby uzyskać końcową objętość 1 L. Autoklaw i przechowywać w RT.
      UWAGA: W celu przygotowania pożywki zawierającej agar, dodać do kolby mieszadło magnetyczne, aby dobrze wymieszać wszystkie roztwory przed wylaniem na szalki Petriego.

2. Przemiana drożdży

UWAGA: Plazmid pRS426 został użyty do sklonowania genu α-synukleiny i zawierał gen URA3 jako marker do wyboru. Istnieją rodzinne warianty α-synukleiny związane z chorobą Parkiny, które mają ciężkie fenotypy choroby (np. cytotoksyczność). Warianty te wykorzystano również tutaj do monitorowania ich cytotoksyczności i tworzenia zagregowanych ognisk. Użyj tej samej kolonii transformantów drożdżowych do wszystkich eksperymentów, aby uzyskać spójne wyniki.

  1. Do transformacji plazmidów ekspresyjnych drożdży należy użyć pustego wektora (pRS426) jako plazmidów kontrolnych i plazmidów zawierających α-synukleinę. Odnosząc się do standardowej metody octanu litu (LiAc) 11, przygotuj sześć kompetentnych komórek i 0,5 μg każdego plazmidu i przeprowadź transformację.
  2. Aby wybrać transformanty drożdżowe zawierające plazmidy, należy użyć syntetycznego zdefiniowanego podłoża (pożywki SD) bez uracylu (SD-Ura) i inkubować płytki w temperaturze 30 °C przez 2-3 dni.
  3. Umieść trzy pojedyncze kolonie na płytce agarowej SD-Ura w celu selekcji komórek zawierających plazmidy do dalszych eksperymentów.
    UWAGA: Aby uzyskać dokładne i wiarygodne wyniki, zbadaliśmy co najmniej trzy kontrpróby biologiczne na szczep.

3. Test plamienia

UWAGA: Wiadomo, że ekspresja α-synukleiny znakowanej GFP w plazmidach o dużej liczbie kopii jest związana z cytotoksycznością u drożdży10.

  1. Zaszczepić trzy połatane transformanty drożdżowe na szczep w 3 ml SRd-Ura w celu selektywnego wzrostu drożdży zawierających plazmidy z 2% rafinozą w celu zahamowania indukcji α-synukleiny pod promotorem GAL1 i 0,1% glukozy. Inkubować kulturę komórkową w temperaturze 30 °C pod mieszaniem przy 200 obr./min.
    UWAGA: Powtórzenie wszystkich eksperymentów z różnymi koloniami jest ważne. Uzyskanie tych samych wyników z ponad trzech niezależnych kolonii oznacza, że wynik jest wiarygodny.
  2. Następnego dnia zaszczepić wyhodowane przez noc komórki w 3 ml świeżego SRd-Ura do OD600 0,2 i inkubować przez 6 godzin w temperaturze 30 °C przy mieszaniu przy 200 obr./min.
  3. Gdy OD600 osiągnie 0,6-0,8, rozcieńczyć komórki w 96-dołkowych płytkach do testu plamienia w następujący sposób.
    1. Zmierzyć OD600 wszystkich próbek i rozcieńczyć próbki do OD600 0,5 za pomocą sterylnego dH2O (mieszanina objętości wynosi 100 μl) na torze 1 96-dołkowej płytki w celu wyrównania liczby komórek w każdej hodowli.
    2. Wykonać pięciokrotne seryjne rozcieńczenia komórek drożdży, dodając 160 μl sterylnego dH2O do następnych pięciu pasów. Zapewnić całkowitą objętość 40 μl podczas seryjnego rozcieńczania komórek na każdym pasie.
      UWAGA: Niskie współczynniki rozcieńczenia mogą powodować większe różnice między próbkami. Wymagane jest odpowiednie pipetowanie, aby zapewnić równomierne mieszanie podczas wykonywania rozcieńczeń seryjnych. Końcówkę pipety należy wymieniać w każdym punkcie rozcieńczenia. W przeciwnym razie komórki przyczepione do powierzchni końcówki mogą zostać przeniesione do następnej studzienki i wpłynąć na liczbę komórek.
  4. Użyj pipety wielokanałowej, aby przenieść 10 μl z każdej studzienki, aby wykryć próbki na płytkach agarowych SD-Ura do kontroli i płytkach agarowych SG-Ura do monitorowania toksyczności.
    UWAGA: Płytki należy suszyć do momentu, aż plamiste próbki zostaną całkowicie wchłonięte przez płytki.
  5. Inkubować nakrapiane płytki do góry nogami w temperaturze 30 °C przez 4 dni.
  6. Wykonuj zdjęcia płytek co 24 godziny do 4 dnia, a następnie analizuj dane, porównując różnice we wzroście między szczepami zauważonymi gołym okiem. Policz poszczególne kolonie w najbardziej rozcieńczonej próbce, oblicz liczbę żywotnych komórek w oryginalnej kulturze dla każdego szczepu lub porównaj wielkość pojedynczych kolonii.

4. Pomiar wzrostu drożdży za pomocą czytnika mikropłytek

  1. Zaszczepić trzy połatane transformanty drożdżowe na szczep w 3 ml SRd-Ura i inkubować w temperaturze 30 °C pod mieszaniem przy 200 obr./min przez noc.
    UWAGA: Aby zrozumieć każdy fenotyp kolonii humanizowanego szczepu drożdży wyrażającego α-synukleinę, użyj tych samych transformantów do wszystkich eksperymentów.
  2. Następnego dnia zaszczepij komórki hodowane przez noc w sumie 200 μl świeżych SD-Ura i SG-Ura na 96-dołkowych płytkach. Dostosuj końcową objętość, w tym komórki, do 200 μl i dostosuj początkową średnicę zewnętrzną komórki600 do 0,05.
    1. Dostosuj ustawienia programu na płytce mikromiareczkowej w następujący sposób: ustaw temperaturę docelową na 30 ° C, ustaw czas trwania wytrząsania (liniowy) na 890 s, ustaw amplitudę wytrząsania (liniową) na 5 mm, ustaw czas interwału na 00:15:00 i ustaw pomiar jako absorbancję na 600 nm.
    2. Inkubuj płytkę przez 2-3 dni, aby wszystkie szczepy osiągnęły fazę stacjonarną w czytniku mikropłytek.
  3. Analizuj dane, wykreślając krzywą wzrostu (np. za pomocą skoroszytu). Uzyskać punkty danych, uśredniając wartości absorbancji z trzech kontrprób biologicznych i wskazać słupki błędu. Użyj wartości absorbancji tylko z pożywki jako kontroli i odejmij ją od wartości z hodowanych komórek (opcjonalnie).

5. Mikroskopia fluorescencyjna

  1. Zaszczepić połatane transformanty drożdżowe w 3 ml SRd-Ura i hodować je przez noc w temperaturze 30 °C pod mieszaniem przy 200 obr./min.
    UWAGA: Aby określić korelację fenotypu z cytotoksycznością i powstawaniem ognisk, należy użyć tych samych kolonii do eksperymentu.
  2. Następnego dnia ponownie zaockuluj komórki hodowane przez noc w 3 ml świeżego SRd-Ura do OD600 0,003. Inkubować kulturę, aż OD600 osiągnie 0,2 w temperaturze 30 °C pod wpływem mieszania przy 200 obr./min (~18 h).
  3. Po osiągnięciu OD600 wynoszącego 0,2 dodać 300 μl 20% galaktozy, a następnie inkubować przez kolejne 6 godzin w temperaturze 30 °C przy mieszaniu przy 200 obr./min.
  4. Zebrać komórki przez odwirowanie przy 800 x g przez 5 minut i odrzucić supernatant.
  5. Delikatnie zawiesić osad komórkowy w 30 μl wody destylowanej.
  6. Załadować 5 μl zawieszonych komórek na szkiełko szkiełkowe. Przygotuj podkładkę z żelu agarozowego12 i umieść ją na załadowanych komórkach, aby równomiernie się rozprowadziła.
  7. Wykonuj obrazowanie mikroskopowe za pomocą obiektywu 100x, korzystając zarówno z filtrów jasnego pola, jak i fluorescencyjnych GFP.
    1. Najpierw użyj jasnego pola, aby ustawić ostrość komórki za pomocą obiektywu 100x za pomocą olejku immersyjnego. Użyj opcji zrzutu ekranu, aby wygenerować obrazy za pomocą programu.
    2. Przełącz się na filtr fluorescencyjny GFP. Dostosuj czas ekspozycji obrazu w zakresie od 50 ms do 300 ms, aby uzyskać wyraźny obraz, równoważąc stosunek sygnału do szumu. Przechwyć obraz ekranu za pomocą programu.
    3. Obrazuj wiele komórek z wielu punktów, a nie tylko z jednego.
  8. Analizuj obrazy, zliczając procent komórek zawierających ogniska agregatów α-synukleiny za pomocą oprogramowania analitycznego. Obserwuj różnice między sygnałem rozpuszczalnego białka GFP a sygnałem GFP utworzonym przez ogniska, a także dyfuzję GFP z wariantem A30P formy α-synukleiny.
    UWAGA: Powstawanie ognisk będzie obserwowane w przypadku wariantów α-synukleiny typu dzikiego, E46K i A53T.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wiadomo, że wysoka ekspresja α-synukleiny jest związana ze śmiercią komórek neuronalnych i PD w modelowych systemach PD. W pracy opisano trzy metody monitorowania cytotoksyczności α-synukleiny i powstawania ognisk zagregowanej α-synukleiny w drożdżach. Tutaj α-synukleina uległa nadekspresji w drożdżach i zbadano fenotypy α-synukleiny typu dzikiego i trzy warianty α-synukleiny znane jako rodzinne mutanty PD (Rysunek 1 i tabela materiałów).

Ekspresja ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biorąc pod uwagę złożoność różnych układów komórkowych u ludzi, korzystne jest wykorzystanie drożdży jako modelu do badania ludzkich chorób neurodegeneracyjnych. Chociaż prawie niemożliwe jest zbadanie złożonych interakcji komórkowych ludzkiego mózgu za pomocą drożdży, z perspektywy pojedynczej komórki komórki drożdży mają wysoki poziom podobieństwa do komórek ludzkich pod względem homologii sekwencji genomowej i podstawowych eukariotycznych procesów komórkowych 8,13

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Jamesowi Bardwellowi i Tiago F. Outeiro za uprzejme podzielenie się plazmidami zawierającymi α-synukleinę. Changhan Lee otrzymał dofinansowanie z Narodowej Fundacji Badawczej Korei (NRF) finansowane przez rząd koreański (MSIT) (grant 2021R1C1C1011690), Program Badań Podstawowych za pośrednictwem NRF finansowany przez Ministerstwo Edukacji (grant 2021R1A6A1A10044950) oraz nowy wydziałowy fundusz badawczy Uniwersytetu Ajou.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Płytka 96-dołkowaSPL30096
AgarozaTAESHIN0158
Bacto AgarBD Difco214010
Oddychająca,zróżnicowana biotechnologiaBEM-1Membrana uszczelniająca przepuszczająca gaz do płytek do mikromiareczkowania
okularów nakrywkowychMarienfeld24 x 60 mm
Probówka hodowlanaSPL40014
Kuwetaratiolab2712120
D-(+)-GalactosesigmaG0625
D-(+)-GlukozasigmaG8270
D-(+)-Rafinoza pentahydratDaejung6638-4105
Inkubator (wytrząsanie)Model Labtron: Inkubator SHI1
(statyczny)Vision scientificmodel: VS-1203PV-O
LiAcsigmaL6883
Czytnik mikropłytekTecan30050303 01Model: Pipeta wielokanałowa Infinite 200 pro
20-200 i mikro; LgilsonFA10011
pipeta wielokanałowa 2-20 &mikro; LgilsonFA10009
mikroskop OlympusOlympusIX-53
PEGsigmaP4338średnia mol wt 3,350
PetridishSPL10090
pRS426Christianson, T. W., Sikorski, R. S., Dante, M., Shero, J. H. & Hieter, P. Wielofunkcyjne wektory wahadłowe drożdży o wysokiej liczbie kopii. Gen. 110 (1), 119-122 (1992).
pRS426 GAL1 promotor α-synukleina A30POuteiro, TF & Lindquist, S. Komórki drożdży zapewniają wgląd w biologię alfa-synukleiny i patobiologię. Nauka. 302 (5651), 1772-1775 (2003)
pRS426 GAL1 promotor &alfa;-synukleina A53TOuteiro, TF & Lindquist, S. Komórki drożdży zapewniają wgląd w biologię alfa-synukleiny i patobiologię. Nauka. 302 (5651), 1772-1775 (2003)
pRS426 GAL1 promotor α-synukleina E46KOuteiro, T. F. & Lindquist, S. Komórki drożdży zapewniają wgląd w biologię alfa-synukleiny i patobiologię. Nauka. 302 (5651), 1772-1775 (2003)
pRS426 GAL1 promotor α-synukleina WTOuteiro, T. F. & Lindquist, S. Komórki drożdży zapewniają wgląd w biologię alfa-synukleiny i patobiologię. Nauka. 302 (5651), 1772-1775 (2003)
ZbiornikSPL23050
Spektrofotometreppendorf6131 05560
W303aObecny od Jamesa Bardwella
Drożdżowa zasada azotowa bez aminokwasówDifco291940
Syntetyczne suplementy drożdżowe bez uracylusigmaY1501
YPDCondalab1547.00

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Khurana, V., Lindquist, S. Modelling neurodegeneration in Saccharomyces cerevisiae: Why cook with baker's yeast. Nature Reviews Neuroscience. 11 (6), 436-449 (2010).
  2. Surguchov, A. Intracellular dynamics of synucleins: "Here, there and everywhere". International Review of Cell and Molecular Biology. 320, 103-169 (2015).
  3. Soto, C., Pritzkow, S. Protein misfolding, aggregation, and conformational strains in neurodegenerative diseases. Nature Neuroscience. 21 (10), 1332-1340 (2018).
  4. Gordon, J., Amini, S. General overview of neuronal cell culture. Methods in Molecular Biology. 2311, 1-8 (2021).
  5. Dawson, T. M., Golde, T. E., Lagier-Tourenne, C. Animal models of neurodegenerative diseases. Nature Neuroscience. 21 (10), 1370-1379 (2018).
  6. Bassett, D. E., Boguski, M. S., Hieter, P. Yeast genes and human disease. Nature. 379 (6566), 589-590 (1996).
  7. Koteliansky, V., Glukhova, M., Bejanian, M., Surguchov, A., Smirnov, V. Isolation and characterization of actin-like protein from yeast Saccharomyces cerevisiae. FEBS Letters. 102 (1), 55-58 (1979).
  8. Botstein, D., Chervitz, S. A., Cherry, M. Yeast as a model organism. Science. 277 (5330), 1259-1260 (1997).
  9. Kachroo, A. H., Vandeloo, M., Greco, B. M., Abdullah, M. Humanized yeast to model human biology, disease and evolution. Disease Models & Mechanisms. 15 (6), (2022).
  10. Outeiro, T. F., Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003).
  11. Dunham, M., Gartenberg, M., Brown, G. Methods in Yeast Genetics and Genomics. , Cold Spring Harbour Laboratory Press. Woodbury, New York. (2015).
  12. Skinner, S. O., Sepúlveda, L. A., Xu, H., Golding, I. Measuring mRNA copy number in individual Escherichia coli cells using single-molecule fluorescent in situ hybridization. Nature Protocols. 8 (6), 1100-1113 (2013).
  13. Tenreiro, S., Munder, M. C., Alberti, S., Outeiro, T. F. Harnessing the power of yeast to unravel the molecular basis of neurodegeneration. Journal of Neurochemistry. 127 (4), 438-452 (2013).
  14. Nielsen, J. Yeast systems biology: Model organism and cell factory. Biotechnology Journal. 14 (9), 1800421(2019).
  15. Eleutherio, E., et al. Oxidative stress and aging: learning from yeast lessons. Fungal Biology. 122 (6), 514-525 (2018).
  16. Rencus-Lazar, S., DeRowe, Y., Adsi, H., Gazit, E., Laor, D. Yeast models for the study of amyloid-associated disorders and development of future therapy. Frontiers in Molecular Biosciences. 6, 15(2019).
  17. Franco, R., Rivas-Santisteban, R., Navarro, G., Pinna, A., Reyes-Resina, I. Genes implicated in familial Parkinson's disease provide a dual picture of nigral dopaminergic neurodegeneration with mitochondria taking center stage. International Journal of Molecular Sciences. 22 (9), 4643(2021).
  18. Wan, O. W., Chung, K. K. The role of alpha-synuclein oligomerization and aggregation in cellular and animal models of Parkinson's disease. PLoS One. 7 (6), 38545(2012).
  19. Xu, L., Pu, J. Alpha-synuclein in Parkinson's disease: From pathogenetic dysfunction to potential clinical application. Parkinson's Disease. 2016, 1720621(2016).
  20. Gitler, A. D., et al. The Parkinson's disease protein α-synuclein disrupts cellular Rab homeostasis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (1), 145-150 (2008).
  21. Sampson, T. R., et al. A gut bacterial amyloid promotes α-synuclein aggregation and motor impairment in mice. Elife. 9, 53111(2020).
  22. Evans, M. L., et al. The bacterial curli system possesses a potent and selective inhibitor of amyloid formation. Molecular Cell. 57 (3), 445-455 (2015).
  23. Su, L. J., et al. Compounds from an unbiased chemical screen reverse both ER-to-Golgi trafficking defects and mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease models. Disease Models & Mechanisms. 3 (3-4), 194-208 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Alpha Synuclein AggregationYeast ModelParkinson s DiseaseSynuclein ToxicityHumanized YeastProtein AggregationFluorescence MicroscopyWestern BlottingGenetic ScreeningSynaptic Vesicle Trafficking

Powiązane artykuły