Mysi model przejścia Streptococcus pneumoniae z kolonizatora w patogen po koinfekcji wirusowej podsumowuje chorobę zaostrzoną wiekiem

Podsumowanie

Ten artykuł opisuje nowy model myszy do przejścia pneumokoków z bezobjawowego kolonizatora w patogen chorobotwórczy podczas infekcji wirusowej. Model ten można łatwo zaadaptować do badania interakcji wielodrobnoustrojowych i gospodarz-patogen w różnych fazach progresji choroby i u różnych gospodarzy.

Streszczenie

Streptococcus pneumoniae (pneumokoki) jest bezobjawowym kolonizatorem nosogardzieli u większości osób, ale po zakażeniu wirusem grypy A (IAV) może przekształcić się w patogen płucny i ogólnoustrojowy. Zaawansowany wiek zwiększa podatność gospodarza na wtórne pneumokokowe zapalenie płuc i wiąże się z pogorszeniem wyników choroby. Czynniki gospodarza napędzające te procesy nie są dobrze zdefiniowane, częściowo z powodu braku modeli zwierzęcych, które odtwarzają przejście od bezobjawowej kolonizacji do ciężkiej choroby klinicznej.

Ten artykuł opisuje nowy model myszy, który odtwarza przejście pneumokoków od bezobjawowego nosicielstwa do choroby po infekcji wirusowej. W tym modelu myszom najpierw zaszczepia się donosowo pneumokoki wyhodowane w biofilmie w celu uzyskania bezobjawowego nosicielstwa, a następnie następuje zakażenie IAV zarówno nosogardzieli, jak i płuc. Powoduje to rozprzestrzenianie się bakterii do płuc, zapalenie płuc i oczywiste objawy choroby, które mogą prowadzić do śmierci. Stopień zaawansowania choroby zależy od szczepu bakteryjnego i czynników żywiciela.

Co ważne, ten model odtwarza podatność na starzenie się, ponieważ w porównaniu do młodych myszy, stare myszy wykazują cięższe klinicznie choroby i częściej ulegają chorobom. Rozdzielając nosicielstwo i chorobę na odrębne etapy i zapewniając możliwość analizy wariantów genetycznych zarówno patogenu, jak i gospodarza, ten model koinfekcji S. pneumoniae/IAV pozwala na szczegółowe badanie interakcji ważnego patobionta z gospodarzem na różnych etapach postępu choroby. Model ten może również służyć jako ważne narzędzie do identyfikacji potencjalnych celów terapeutycznych przeciwko wtórnemu pneumokokowemu zapaleniu płuc u podatnych gospodarzy.

Wprowadzenie

Streptococcus pneumoniae (pneumokoki) to bakterie Gram-dodatnie, które bezobjawowo zamieszkują nosogardziel większości zdrowych osób^1,2. Wspierane przez czynniki, które nie są do końca zdefiniowane, pneumokoki mogą przekształcać się z łagodnych kolonizatorów nosogardzieli w patogeny, które rozprzestrzeniają się na inne narządy, powodując poważne infekcje, w tym zapalenie ucha środkowego, zapalenie płuc i bakteriemię³. Występowanie choroby pneumokokowej jest częściowo zależne od różnic specyficznych dla szczepu, w tym serotypu, który opiera się na składzie polisacharydów otoczkowych. Do tej pory scharakteryzowano ponad 100 serotypów, a niektóre z nich są związane z bardziej inwazyjnymi infekcjami^4,5. Kilka innych czynników zwiększa ryzyko choroby pneumokokowej. Jednym z takich czynników jest infekcja wirusowa, w której ryzyko pneumokokowe zapalenie płuc jest 100-krotnie zwiększone przez IAV^6,7. Historycznie rzecz biorąc, S. pneumoniae jest jedną z najczęstszych przyczyn wtórnego bakteryjnego zapalenia płuc po grypie i wiąże się z gorszymi wynikami⁸. Innym ważnym czynnikiem ryzyka jest zaawansowany wiek. W rzeczywistości S. pneumoniae jest główną przyczyną pozaszpitalnego bakteryjnego zapalenia płuc u osób starszych powyżej 65 roku życia^9,10. Osoby w podeszłym wieku odpowiadają za większość (>75%) zgonów z powodu zapalenia płuc i grypy, co wskazuje, że dwa czynniki ryzyka - starzenie się i zakażenie IAV - synergistycznie pogarszają podatność na chorobę^11,12,13,14. Jednak mechanizmy, za pomocą których infekcja wirusowa powoduje przejście pneumokoków z bezobjawowego kolonizatora do inwazyjnego patogenu i jak jest to kształtowane przez czynniki gospodarza, pozostają słabo poznane. Wynika to w dużej mierze z braku małego modelu zwierzęcego, który podsumowuje przejście od bezobjawowej kolonizacji pneumokoków do krytycznej choroby klinicznej.

Badania nad koinfekcją były klasycznie modelowane na myszach, którym zaszczepiono pneumokoki bezpośrednio do płuc 7 dni po zakażeniu grypą15^,16. Odtwarza to podatność na wtórne bakteryjne zapalenie płuc i jest idealne do badania, w jaki sposób przeciwwirusowe odpowiedzi immunologiczne osłabiają obronę przeciwbakteryjną¹⁷. Jednak badania podłużne na ludziach wykazały, że nosicielstwo pneumokoków w nosogardzieli, gdzie bakterie mogą tworzyć bezobjawowe biofilmy¹⁸, jest jednolicie związane z chorobami inwazyjnymi^19,20. Izolaty bakteryjne z infekcji ucha środkowego, płuc i krwi są genetycznie identyczne z tymi występującymi w nosiogardzieli²⁰. W związku z tym, aby zbadać przejście od bezobjawowego nosicielstwa do choroby inwazyjnej po zakażeniu IAV, stworzono model, w którym myszom podawano donosowo pneumokoki hodowane w biofilmie, a następnie infekcję IAV nosogardzieli^21,22. Wirusowa infekcja górnych dróg oddechowych doprowadziła do zmian w środowisku gospodarza, które doprowadziły do rozproszenia pneumokoków z biofilmów i ich rozprzestrzenienia się na dolne drogi oddechowe²¹. Te rozproszone bakterie miały zwiększoną ekspresję czynników wirulencji ważnych dla infekcji, przekształcając je z kolonizatorów w patogeny²¹. Obserwacje te podkreślają złożoną interakcję między wirusem, gospodarzem i bakteriami i pokazują, że zmiany w gospodarzu wywołane infekcją wirusową mają bezpośredni wpływ na zachowanie pneumokoków, co z kolei zmienia przebieg infekcji bakteryjnej. Jednak model ten nie podsumowuje poważnych objawów choroby obserwowanych u ludzi, prawdopodobnie dlatego, że wirus jest ograniczony do jamy nosowej, a ogólnoustrojowe skutki infekcji wirusowej na odporność gospodarza i uszkodzenie płuc nie są rekapitulowane.

Niedawno stworzyliśmy model, który obejmuje złożoną interakcję między gospodarzem a patogenami, ale także bardziej naśladuje nasilenie choroby obserwowane u ludzi²³. W tym modelu myszy są najpierw zakażone donosowo pneumokokami wyhodowanymi w biofilmie w celu ustanowienia bezobjawowego nosicielstwa, a następnie zakażenie IAV zarówno nosogardzieli, jak i płuc. Spowodowało to rozprzestrzenienie się bakterii do płuc, zapalenie płuc i chorobę, która rozwinęła się do śmiertelności u części młodych myszy²³. To poprzednie badanie wykazało, że zarówno infekcja wirusowa, jak i bakteryjna zmieniała obronę gospodarza: infekcja wirusowa sprzyjała rozprzestrzenianiu się bakterii, a wcześniejsza kolonizacja bakteryjna upośledzała zdolność gospodarza do kontrolowania poziomów IAV w płucach²³. Badanie odpowiedzi immunologicznej wykazało, że zakażenie IAV zmniejszyło aktywność przeciwbakteryjną neutrofili, podczas gdy kolonizacja bakteryjna stępiła odpowiedź na interferon typu I, krytyczną dla obrony przeciwwirusowej²³. Co ważne, model ten odwzorowywał podatność na starzenie. W porównaniu z młodymi myszami, stare myszy wykazywały oznaki choroby wcześniej, wykazywały cięższy przebieg choroby klinicznej i częściej ulegały infekcji²³. Praca przedstawiona w tym manuskrypcie pokazuje, że stopień choroby zależy również od szczepu bakteryjnego, ponieważ inwazyjne szczepy pneumokokowe wykazują bardziej efektywne rozprzestrzenianie się po zakażeniu IAV, wykazują bardziej widoczne objawy zapalenia płuc i skutkują przyspieszonym tempem choroby w porównaniu ze szczepami nieinwazyjnymi. W związku z tym ten model koinfekcji S. pneumoniae/IAV pozwala na szczegółowe badanie zarówno czynników patogenu, jak i gospodarza i dobrze nadaje się do badania odpowiedzi immunologicznych na infekcje wielodrobnoustrojowe w różnych fazach progresji choroby.

Protokół

Wszystkie badania na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z zaleceniami zawartymi w Przewodniku dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych. Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez University at Buffalo Institutional Animal Care and Use Committee.

1. Przygotowanie chemicznie zdefiniowanych mediów (CDM)

1. Przygotuj buliony w następujący sposób:
   1. Rozpuścić mieszaninę związków I wymienionych w tabeli 1 w 100 ml ultraczystej wody, mieszając. Przechowywać w 200 μl podwielokrotności w temperaturze -20 °C.
   2. Rozpuścić mieszaninę związków II wymienionych w tabeli 1 w 20 ml 0,1 M NaOH, mieszając. Przechowywać w 100 μl podwielokrotnościach w temperaturze -20 °C.
   3. Rozpuścić mieszaninę związków III wymienionych w tabeli 1 w 1 ml ultraczystej wody, mieszając. Przechowywać w 10 μl porcji w temperaturze 4 °C.
   4. Rozpuścić mieszaninę związków dożylnych wymienionych w tabeli 1 w 1 ml ultraczystej wody, mieszając. Przechowywać w 10 μl podwielokrotnościach w temperaturze -20 °C.
   5. Związki wymienione w tabeli 2 rozpuścić początkowo w 15 ml ultraczystej wody, mieszając. Dostosuj pH do 7,0 za pomocą kilku kropli 0,1 M NaOH i dostosuj końcową objętość do 20 ml za pomocą ultraczystej wody. Przechowywać w 1 ml porcji w temperaturze -20 °C.
   6. Rozpuścić związki wymienione w tabeli 3 w 90 ml ultraczystej wody na gorącej płycie w temperaturze 50 °C, mieszając. Dostosuj pH do 7,0 za pomocą 0,1 M NaOH, a następnie dostosuj końcową objętość do 100 ml za pomocą ultraczystej wody. Przechowywać w 5 ml porcji w temperaturze -20 °C.
2. Za każdym razem przygotuj wywar startowy na świeżo, rozpuszczając związki z tabeli 4 w 70 ml ultraczystej wody, mieszając.
3. Do świeżego bulionu startowego dodać kolejno następujące mieszanki mieszanek: 200 μl bulionu Mix I (tabela 1), 80 μl bulionu Mix II (tabela 1), 10 μl bulionu Mix III (tabela 1), 10 μl bulionu Mix IV (tabela 2), 1 ml bulionu witaminowego (tabela 3) i 5 ml bulionu aminokwasowego (tabela 4).
4. Po dodaniu bulionów dostosuj końcową objętość do 100 ml, dodając do zlewki 30 ml ultraczystej wody.
5. Uzupełnić CDM związkami z tabeli 4. Po dokładnym wymieszaniu przefiltrować-wysterylizować i przechowywać w temperaturze 4 °C przez maksymalnie 2 tygodnie.

2. Hodowla biofilmu S. pneumoniae

1. Przygotować pożywkę RP-10, mieszając 445 ml RPMI 1640 z 50 ml inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 5 ml penicyliny/streptomycyny w stężeniach odpowiednio 10 000 U/ml i 10 000 μg/ml.
2. Hoduj linię komórkową raka śluzówkowo-naskórkowego NCI-H292 (H292). Dodać komórki z jednej zakupionej fiolki do 5 ml pożywki RP-10 w kolbie poddanej kulturze tkankowej T-25. Inkubować w temperaturze 37 °C/5% CO₂ przez 3-5 dni, aby osiągnąć 100% konfluencji.
3. Sprawdź komórki pod mikroskopem świetlnym przy użyciu 10-krotnego powiększenia, aby ocenić zbieg.
   UWAGA: Gdy wszystkie komórki stykają się z innymi komórkami i nie ma między nimi przerw, osiągana jest pożądana 100% zbieżność.
4. Umyj komórki 2x w 5 ml PBS o temperaturze pokojowej. Upewnij się, że bufor jest wolny od wapnia, aby uniknąć chelatacji EDTA w następnym kroku.
5. Dodać 1 ml trypsyny-EDTA do kolby i inkubować w temperaturze 37 °C/5% CO₂ przez 5-10 minut, aż komórki się oderwą. Zneutralizować 4 ml pożywki RP-10. Delikatnie wymieszać, pipetując w górę i w dół, a następnie przenieść do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
6. Dodać 500 μl zawiesiny komórkowej na basenik do 24-dołkowej płytki poddanej działaniu kultur tkankowych. Z konfluentującej się kolby T-25 spodziewaj się 2 × 10^6-4 × 10⁶ komórek/ml.
7. Następnego dnia sprawdź komórki pod mikroskopem świetlnym, aby upewnić się, że zlewają się, jak w kroku 2.3. Jeśli tak nie jest, wysiaduj dłużej.
8. Gdy komórki H292 w 100% zlewają się z 24-dołkową płytką, delikatnie umyj komórki 3x 1 ml PBS o temperaturze pokojowej, aby upewnić się, że nie pozostało żadne podłoże zawierające antybiotyki lub zanieczyszczenia.
9. Po umyciu komórek dodaj 250 μl/studzienkę 4% paraformaldehydu, aby utrwalić komórki. Inkubować przez 1 godzinę na lodzie lub przez noc w temperaturze 4 °C.
10. W noc poprzedzającą utrwalenie komórek należy umieścić interesujący szczep S. pneumoniae na płytkach z krwią i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C/5% CO₂,
    UWAGA: Przedstawione tutaj dane dotyczą następujących szczepów S. pneumoniae uzyskanych w wyniku wspólnej wymiany: izolat zapalenia ucha środkowego serotyp 19F EF3030²⁴, klasyczny szczep Avery serotypu 2 D39²⁵ i izolat bakteriemii serotypu 4 TIGR4²⁶. Szczepy są również dostępne w kolekcjach publicznych, do których odwołuje się Tabela Materiałów.
11. Przygotować CDM plus oksyrazę (0,15 U/ml), dodając 100 μl oksyrazy (30 U/ml) do 20 ml CDM.
    UWAGA: Oksyraza jest używana do eliminacji tlenu, aby umożliwić efektywny wzrost S. pneumoniae w płynnej kulturze²⁷.
12. Zaszczepić bakterie z płytki do świeżej CDM + oksyrazy, zmywając bakterie z płytki, dodając 1 ml CDM + oksyrazy i delikatnie podnosząc kolonie bakteryjne za pomocą boku końcówki pipety o pojemności 1 ml, uważając, aby nie zeskrobać agaru. Alternatywnie, użyj pętli zaszczepiającej, aby podnieść bakterie i zaszczepić je w probówce zawierającej 1 ml CDM + oksyrazy.
13. Rozcieńczyć bakterie w CDM + oksyrazie do początkowego OD₆₀₀ 0,05.
14. Hoduj bakterie w luźno zamkniętej stożkowej probówce o pojemności 50 ml stojącej w temperaturze 37 °C/5% CO_{2 ,} aż do osiągnięcia OD₆₀₀ 0,2 (zajmie to od 2 do 5 godzin). Sprawdzaj OD₆₀₀ co godzinę, aby upewnić się, że OD nie przekracza 0.2.
15. Gdy OD osiągnie 0,2, przekręć wirowo probówkę do hodowli bakterii. Wysiewaj 0,5 ml bakterii na utrwalone komórki H292 i dodaj kolejne 0,5 ml pożywki CDM + oksyrazy na studzienkę. Dodaj 1 ml CDM + oksyrazy do studzienek kontrolnych bez bakterii. Inkubować płytkę przez 48 godzin w temperaturze 34 °C/5% CO₂,
    UWAGA: Wzrost w temperaturze 34 °C służy do dokładniejszego naśladowania niższej temperatury w nosogardzieli²¹.
16. Co 12 godzin po pierwszym wysiewie delikatnie usunąć 0,5 ml pożywki i uzupełnić 0,5 ml świeżej CDM + oksyrazy. Uważaj, aby nie zakłócić tworzącego się biofilmu. Sprawdzić, czy na dnie płytki nie ma biofilmu i poszukać narastającego zmętnienia w miarę upływu czasu z powodu wzrostu biofilmu. Aby kontrolować zanieczyszczenie, sprawdź studzienki bez bakterii, aby upewnić się, że studzienki kontrolne pozostają czyste.
17. Po 48 godzinach od inokulacji usunąć supernatant i przemyć 2x bardzo delikatnie 1 ml PBS. Zawiesić ponownie w 1 ml świeżego CDM i energicznie pipetować w górę i w dół, aby podnieść biofilm. Dla każdego szczepu bakteryjnego zbierz bakterie ze wszystkich studzienek w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Dobrze wymieszaj, delikatnie przechylając kilkakrotnie szczelnie zakręconą rurkę w górę iw dół.
18. Do stożkowej probówki o pojemności 50 ml dodać 40% glicerolu w CDM w równych objętościach, aby uzyskać zawiesinę bakteryjną o końcowym stężeniu 20% glicerolu. Podaniec 1 ml do probówek do mikrowirówek, błyskawicznie zamrozić na suchym lodzie i zaoszczędzić w temperaturze -80 °C.
19. Przed użyciem należy wyliczyć bakterie, rozmrażając jedną porcję na lodzie, obracając probówkę na 1,700 × g przez 5 minut, usuwając supernatant, ponownie zawieszając osad w 1 ml PBS i posiewając seryjne rozcieńczenia na płytkach z agarem do krwi²⁸.
20. Hodować płytki agarowe przez noc w temperaturze 37 °C/5% CO₂ i policzyć kolonie w odpowiednich rozcieńczeniach, aby uzyskać stężenie bakterii w jednostkach tworzących kolonie (CFU)/ml.
    UWAGA: Zaleca się spisywanie bakterii w zapasach co najmniej dzień po zamrożeniu lub później, ponieważ w ciągu pierwszych 24 godzin następuje spadek żywotności bakterii. Przechowywane zamrożone porcje mogą być wykorzystywane do późniejszego zakażenia myszy przez maksymalnie 2 miesiące.

3. Donosowe inokulowanie myszy S. pneumoniae wyhodowanym w biofilmie

1. Kup myszy i używaj ich w wybranym wieku.
   UWAGA: Myszy w wieku 3-4 miesięcy są preferowane do modelowania młodych gospodarzy, a myszy w wieku 21-24 miesięcy mogą być używane do modelowania osób starszych w wieku >65 lat²⁹. Przedstawione tutaj dane dotyczą samców myszy C57BL/6.
2. Rozmrozić wyhodowane w biofilmie porcje bakteryjne na lodzie i wirować w temperaturze 1 700 × g przez 5 minut. Ostrożnie usunąć i wyrzucić supernatant bez naruszania osadu, umyć bakterie przez ponowne zawieszenie osadu w 1 ml PBS i ponownie wirować w temperaturze 1 700 × g przez 5 minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w objętości potrzebnej do osiągnięcia pożądanego stężenia (dążyć do 5 × 10⁶ CFU/10 μL do inokulacji donosowej). Potwierdzić ilość podanych bakterii poprzez posiew przygotowanego inokulum na płytkach z agarem z krwią, jak w kroku 2.19.
3. Zaszczepić myszy donosowo 5 × 10⁶ CFU, pipetując 5 μl rozcieńczonego inokulum do każdego naris. Upewnij się, że trzymasz myszy mocno, stabilizując głowę, aż objętość zostanie wdychana (zwykle w ciągu kilku sekund od pipetowania objętości do nozdrzy). Wykonaj ten krok przy braku znieczulenia, aby zapobiec aspiracji płucnej inokulum.

4. Zakażenie wirusem grypy A (IAV)

1. Po 48 godzinach od donosowego inokulacji S. pneumoniae należy rozmrozić na lodzie interesujący szczep IAV.
   UWAGA: Przedstawione tutaj dane dotyczą przystosowanego do myszy szczepu wirusa grypy A A/PR/8/34 H1N1, który został uzyskany w wyniku wspólnej wymiany³⁰.
2. Po rozmrożeniu wirusa należy rozcieńczyć go w PBS do pożądanego stężenia; należy dążyć do uzyskania 20 jednostek tworzących płytkę miażdżycową (PFU)/50 μl w przypadku zakażenia dotchawiczego i 200 PFU/10 μl w przypadku infekcji donosowej. W przypadku grup pozorowanych i zawierających tylko bakterie, użyj PBS do zaszczepienia myszy.
3. Umieść lubrykant okulistyczny na oczach myszy przed znieczuleniem. Znieczulij myszy za pomocą 5% izofluranu i potwierdź znieczulenie mocnym uszczypnięciem palca u nogi.
4. Po znieczuleniu zwierzęcia należy je wyjąć z komory izofluranu i natychmiast zainfekować znieczulone myszy 50 μl (20 PFU) IAV dotchachawiczo za pomocą pęsety w celu wyciągnięcia języka z ust i pipetowania objętości płynu w dół tchawicy.
5. Umieść myszy w osobnej klatce i monitoruj aż do całkowitego wyzdrowienia (są w stanie utrzymać leżącą mostek [są w stanie położyć się pionowo na klatce piersiowej]).
6. Po wyzdrowieniu należy natychmiast dodonosowo zaszczepić myszy 10 μl (200 PFU) IAV przy użyciu metody inokulacji opisanej w kroku 3.3.
7. Myszy domowe, które przeszły pojedynczą lub podwójną infekcję bakteryjną i wirusową z tą samą grupą infekcji i oddzielają je od innych grup.

5. Monitorowanie myszy pod kątem objawów choroby

1. Monitoruj myszy codziennie przez co najmniej 10 dni i ślepo oceniaj objawy choroby w następujący sposób:
   1. Wynik dla utraty wagi jest następujący: 0 = 5% lub mniej; 1 = 5%-10%; 2 = 10%-15%; 3 = 20% lub więcej. Poddaj myszy eutanazji za pomocą inhalacji CO_{2 ,} gdy wynik utraty wagi wynosi 3.
   2. Wynik aktywności jest następujący: 0 = normalny/aktywny; 1 = poruszający się, ale nieznacznie zmniejszony; 2 = zmniejszony; 3 = poważnie zmniejszony/ospały (porusza się tylko po dotknięciu), 4 = śpiączka/nieruchomy. Poddaj myszy eutanazji, gdy wynik aktywności wynosi 3.
   3. Wynik postawy jest następujący: 0 = brak przeczucia (normalna); 1 = lekko zgarbiona postawa; 2 = poważne przegarbienie. Poddaj myszy eutanazji, gdy wynik postawy wynosi 2.
   4. Wynik dla oczu jest następujący: 0 = normalne; 1 = wyłupiaste; 1 = zapadnięte; 1 = zamknięte; 1 = wydzielina. Może to być kombinacja. Dodaj sumy, aby uzyskać końcowy wynik oka.
   5. Wynik oddechu jest następujący: 0 = normalny oddech; 1 = nieregularny lub zmieniony (wyższy/niższy wskaźnik); 2 = ciężki (nadmierny wysiłek lub sapanie). Poddaj myszy eutanazji, gdy wynik oddechu wynosi 2.
2. Opierając się na powyższych kryteriach, dodaj indywidualne wyniki, aby uzyskać łączny wynik kliniczny od zdrowego (0) do skrajnie chorego (15). Uznaj, że każda mysz wyświetlająca łączny wynik powyżej 2 jest chora. Humanitarną eutanazję należy przeprowadzić u myszy wykazujących łączny wynik powyżej 9 lub wyniki wskazane dla każdego kryterium i oznaczyć je na krzywej przeżycia.

6. Przetwarzanie zakażonych tkanek do oznaczania liczby bakterii

1. Po 48 godzinach od zakażenia IAV myszy należy poddać eutanazji.
2. Umieść mysz w pozycji leżącej. Używając 70% etanolu, spryskaj klatkę piersiową i brzuch myszy, aby oczyścić futro. Za pomocą kleszczy uszczypnij futro i skórę w środku myszy i przytnij futro nożyczkami do preparowania 4,5 raza, aby odsłonić obszar od wątroby do klatki piersiowej.
3. Pobieranie krwi
   1. Za pomocą nożyczek preparacyjnych delikatnie wciąć jamę otrzewnej, aby odsłonić wątrobę. Za pomocą kleszczy odsłoń żyłę wrotną wątroby w górnej części wątroby w pobliżu przepony. Przeciąć żyłę wrotną wątroby za pomocą nożyczek do rozwarstwiania. Gdy krew zacznie gromadzić się w jamie otrzewnej, należy pobrać 10 μl krwi za pomocą mikropipety i umieścić w 90 μl roztworu antykoagulantu (50 mM roztworu EDTA w PBS) w probówce mikrowirówkowej w celu posiewu pod kątem obciążenia bakteryjnego.
   2. Użyj mikropipety P-1000, aby zebrać resztę krwi, umieść ją w probówce do pobierania krwi i odwiruj przy 7 600 × g przez 2 minuty, aby zebrać surowicę. Przechowywać surowice w probówkach do mikrowirówek w temperaturze -80 °C w celu późniejszej analizy dowolnej pożądanej cytokiny lub metabolitu.
4. Pobieranie płuc
   1. Za pomocą nożyczek preparacyjnych wykonaj cięcie boków odsłoniętej klatki piersiowej i delikatnie pociągnij żebra w kierunku głowy myszy, aby odsłonić serce. Włóż igłę 25 G dołączoną do strzykawki o pojemności 10 ml wypełnionej PBS do prawej komory i rozpocznij powolne perfuzję. Szukaj wybielania płuc jako wskaźnika udanej perfuzji. Spłukiwać powoli, aby uniknąć uszkodzenia tkanki płucnej.
   2. Podnieś serce kleszczami i wykonaj nacięcie, aby oddzielić płuca i serce. Po oddzieleniu podnieś wszystkie płaty płuc za pomocą kleszczy i spłucz w naczyniu sterylnym PBS, aby usunąć resztki krwi. Na szalce Petriego zmiel płuca na małe kawałki i dobrze wymieszaj. Usunąć połowę mieszanki płucnej w celu oznaczenia bakteryjnej CFU lub wirusowej PFU i umieścić ją w okrągłej probówce o pojemności 15 ml wypełnionej 0,5 ml PBS w celu homogenizacji.
      UWAGA: Ważne jest, aby nie brać różnych płatów tego samego płuca do różnych ocen. Zamiast tego wszystkie płaty powinny być zmielone, dobrze wymieszane ze sobą i równomiernie przeanalizowane dla różnych ocen.
   3. Usunąć drugą połowę płuca do cytometrii przepływowej (sekcja 7 poniżej) i umieścić ją na 24-dołkowej płytce niepoddanej hodowli tkankowej, z każdą studzienką wstępnie wypełnioną 0,5 ml RP-10. Pozostaw w temperaturze pokojowej do czasu przetworzenia.
5. Kolekcja Nosogardziel
   1. Na szyi użyj nożyczek preparacyjnych, aby odciąć futro, a następnie odetnij mięsień i odsłoń tchawicę.
      UWAGA: Tchawica jest strukturą przypominającą rurkę znajdującą się pod mięśniem.
   2. Umieść małe kleszcze pod tchawicą w odległości 1 cm od szczęki myszy, aby ją ustabilizować. Za pomocą nożyczek preparacyjnych delikatnie wykonaj 0,1 cm nacięcie na przedniej części tchawicy, unikając całkowitego przecięcia tchawicy.
   3. Przygotować strzykawkę o pojemności 1 ml wypełnioną 0,5 ml PBS z rurką 0,58 mm przymocowaną do igły 25 G. Zbierz płyn do płukania nosa, wkładając rurkę do tchawicy idącą w górę w kierunku nosogardzieli. Gdy wyczujesz opór wchodzący do jamy nosowej, umieść probówkę mikrowirówki przy nosie i powoli przepłucz PBS przez tchawicę, aby zebrać płukanie nosa.
   4. Umieść mysz w pozycji leżącej. Spryskaj głowę myszy etanolem. Użyj nożyczek preparacyjnych, aby przeciąć futro i podkładki mystacialnej, aby odsłonić kość głowy myszy.
   5. Za pomocą nożyczek preparacyjnych wykonaj 1 cm cięcie po bokach żuchwy i między oczami. Za pomocą kleszczy powoli odciągnij kości twarzy od ciała, aby odsłonić jamę nosową.
   6. Za pomocą kleszczy delikatnie usuń tkankę nosa i umieść ją w probówce o okrągłym dnie wypełnionej 0,5 ml PBS w celu homogenizacji.
6. Aby homogenizować pobraną tkankę, najpierw wyczyść sondę homogenizatora, umieszczając ją w 70% etanolu i włączając homogenizator z 60% mocą na 30 sekund. Powtórz ten krok w sterylnej wodzie przez 10 sekund. Homogenizuj każdą tkankę przez 1 minutę. Wyczyść sondę homogenizatora w sterylnej wodzie między każdą próbką oraz w świeżej probówce z 70% etanolem między każdym narządem i grupą próbek.
7. Oznaczanie liczebności bakterii
   1. Po pobraniu i homogenizacji wszystkich narządów, należy je stopniowo rozcieńczyć na płytkach z agarem do krwi. Aby obliczyć całkowitą jtk, użyj 10 μl do płytki i zanotuj końcową objętość w ml dla każdej próbki. Umieść próbki nosogardzieli na płytkach z agarem z krwią uzupełnionych 3 μg / ml gentamycyny, aby wybrać wzrost S. pneumoniae, jednocześnie hamując wzrost innych mikroorganizmów, które kolonizują tę tkankę. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C/5% CO₂ .
   2. Aby wyliczyć bakteryjną CFU dla płuc i nosogardzieli, najpierw policz kolonie na płytkach z krwią. Następnie użyj równania (1) i równania (2), aby obliczyć ilość na ml i liczbę całkowitą.
      Ilość na ml = liczba kolonii × współczynnik rozcieńczenia × 100 (1)
      Całkowita liczba = ilość na ml × całkowita objętość próbki (2)
      UWAGA: W równaniu (1) do mnożenia używa się 100, ponieważ plateruje się 10 μl, co odpowiada 100-krotnemu rozcieńczeniu 1 ml. Całkowita objętość próbki w równaniu (2) pochodzi z kroku 6.7.1, co daje granicę wykrywalności wynoszącą 100 na narząd.
   3. Aby wyliczyć bakteryjną CFU W przypadku bakteriemii najpierw policz kolonie na płytkach z krwią. Następnie użyj równania (3), aby określić ilość na ml krwi.
      Ilość na ml krwi = liczba kolonii × współczynnik rozcieńczenia × 100 × 10 (3)
      UWAGA: W równaniu (3) 100 jest używane jako 10 μl jest platerowane, co jest 100-krotnym rozcieńczeniem 1 ml, a 10 oznacza rozcieńczenie krwi w antykoagulancie 1:10. Daje to granicę wykrywalności wynoszącą 1,000/ml.

7. Przetwarzanie próbek płuc do cytometrii przepływowej

1. Przygotuj wymagane nośniki w następujący sposób:
   1. Przygotuj RP-10 zgodnie z opisem w kroku 2.1.
   2. Przygotować bufor wytrawiający przez zmieszanie RP-10 z 2 mg/ml kolagenazy i 30 μl/ml DNazy I.
   3. Przygotować bufor do lizy, rozpuszczając 8,29 g NH₄Cl, 1 g_NaHCO3 i 0,038 g EDTA w 1 l_H2O.
   4. Przygotować 10 razy bufor FACS, mieszając 450 ml HBSS z 50 ml inaktywowanego termicznie FBS i 5 g azydku sodu.
   5. Przygotować 1x bufor FACS, rozcieńczając 50 ml 10x buforu FACS w 450 ml HBSS.
2. Pobrać próbki płuc z kroku 6.4.3 i umieścić je na płytce 24-dołkowej. Do każdej studzienki dodać 500 μl buforu wytrawiającego. Inkubować przez 45 minut do 1 godziny w temperaturze 37 °C/5% CO₂ .
3. Napełnij stożkowe probówki o pojemności 50 ml dla każdej próbki 5 ml RP-10. Po zakończeniu inkubacji umieść filtr 100 μm na górze stożkowej probówki o pojemności 50 ml i zwilż go 1 ml RP-10.
4. Za pomocą mikropipety P-1000 przesuń strawione płuca i umieść je na filtrze. Za pomocą tłoka strzykawki o pojemności 3 ml rozgnieć narząd. Za każdym razem spłucz 2x 1 ml RP-10.
5. Wirować próbki w temperaturze 4 °C i o masie 327 × g przez 5 minut. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml buforu do lizy. Pozostaw na 3 minuty, aby umożliwić lizę czerwonych krwinek. Zneutralizować 5 ml RP-10.
6. Wirować próbki w temperaturze 4 °C i o masie 327 × g przez 5 minut. Odessać supernatant, ponownie zawiesić osad w 1 ml RP-10 i pobrać 10 μl do policzenia próbek.
7. Wirować próbki w temperaturze 4 °C i 327 × g przez 5 minut. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w RP-10 w stężeniach 2 × 10^6-4 × 10⁶ komórek/ml. Dodaj 60 μl każdej próbki do 96-dołkowej płytki w celu wybarwienia dla żądanych typów komórek²³ wymienionych w kroku 7.9, Tabela 5 i Tabela 6.
8. Obracać płytkę w temperaturze 4 °C i o masie 327 × g przez 5 minut.
9. W międzyczasie przygotuj główne mieszanki przeciwciał, fluorescencyjne minus jeden (FMO) i kontrole pojedynczego barwienia z pożądanymi przeciwciałami. Do barwienia leukocytów wielojądrzastych (PMN), makrofagów, monocytów, komórek dendrytycznych i limfocytów T należy użyć przeciwciał i końcowych rozcieńczeń wymienionych w Tabeli 5 i Tabeli 6. Użyć całkowitej objętości 100 μl/basenik mieszaniny przeciwciał. Postępować zgodnie z rozcieńczeniami podanymi w tabelach w celu określenia odpowiedniej objętości mieszanki wzorcowej i wymaganych poszczególnych przeciwciał.
10. Po zakończeniu wirowania (krok 7.8) zdekantować supernatant, ponownie zawiesić granulki w 100 μl mieszanin przeciwciał, FMO lub kontrolnych z pojedynczym barwieniem i inkubować na lodzie przez 30 minut w ciemności.
11. Przemyć komórki 2x, dodając 150 μl buforu FACS do studzienek i obracając płytkę w temperaturze 4 °C i 327 × g przez 5 minut.
12. Po zakończeniu wirowania zdekantować supernatant, ponownie zawiesić granulki w 100 μl buforu utrwalającego i inkubować na lodzie przez 20 minut.
13. Przemyć komórki 2x, dodając 150 μl buforu FACS do studzienek i obracając płytkę w temperaturze 4 °C i 327 × g przez 5 minut.
14. Przygotować oznakowane probówki FACS z 200 μl buforu FACS. Zawiesić granulki w 150 μl buforu FACS. Indywidualnie przefiltruj każdą próbkę do odpowiedniej probówki FACS za pomocą filtra 100 μm. Przechowywać na lodzie lub w temperaturze 4 °C i chronić przed światłem do czasu przygotowania do analizy.
15. Przeanalizuj komórki za pomocą cytometru przepływowego.

8. Test płytki nazębnej do oznaczania IAV

1. Przygotuj wymagane nośniki w następujący sposób:
   1. Przygotować pożywkę infekcyjną, rozpuszczając 2,5 g albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w 40 ml DMEM, mieszając w temperaturze 37 °C przez 10-20 minut, aż do rozpuszczenia. Filtrować-sterylizować do 460 ml DMEM.
   2. Przygotować 2,4% celulozy mikrokrystalicznej, rozpuszczając 1,2 mg celulozy mikrokrystalicznej w 50 ml_H2O. Autoklaw w płynie i przechowywać w temperaturze pokojowej.
   3. Przygotuj 5% BSA DMEM, rozpuszczając 2,5 g BSA w 40 ml DMEM, mieszając w temperaturze 37°C przez 10-20 min. Dodaj pozostałe 10 ml DMEM, aby uzyskać końcową objętość 50 ml. Filtrować-sterylizować i przechowywać w temperaturze 4 °C.
   4. Przygotuj 2x MEM/0,5% BSA, mieszając 1 ml 5% BSA DMEM z 9 ml 2x MEM.
   5. Przygotować podłoże do nakładania o niskiej lepkości, mieszając 2,4% celulozy mikrokrystalicznej w stosunku 1:1 i 2x MEM/0,5% BSA z 1 mg/ml TPCK (inhibitor chymotrypsyny) trypsyną.
   6. Przygotuj EMEM/10% FBS, mieszając 450 ml Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) z 50 ml inaktywowanego termicznie FBS.
2. Hoduj linię komórkową nerek psów Madin-Darby (MDCK). Dodać komórki z jednej zakupionej fiolki do 5 ml EMEM/10% FBS w kolbie poddanej hodowli tkankowej T-25. Inkubować przez 3-5 dni w temperaturze 37 °C/5% CO_{2 ,} aż komórki osiągną 100% zbieżności. Sprawdź konfluencję, jak w kroku 2.3.
3. Usunąć i wyrzucić pożywkę hodowlaną i spłukać 2x 5 ml PBS o temperaturze pokojowej. Dodać 1 ml trypsyny-EDTA do kolby i inkubować w temperaturze 37 °C/ 5% CO₂ przez 10-15 minut, aż komórki się oderwą. Po podniesieniu zneutralizować 4 ml EMEM/10% FBS, aby uzyskać zawiesinę komórek w ilości 2 × 10⁵ komórek/ml.
4. Wysiewaj komórki MDCK na 12-dołkowej płytce poddanej działaniu kultur tkankowych, dodając 1 ml zawieszonych komórek na basenik (przy 2 × 10⁵ komórek/dołku) 1 dzień przed rozpoczęciem testu płytki miażdżycowej.
   UWAGA: Upewnij się, że komórki osiągną 100% zbieżności przed użyciem i inkubuj przez dłuższy czas, jeśli to konieczne, aby osiągnąć zbieżność.
5. Do stosowania jako wzorce należy wykonać 10-krotne seryjne rozcieńczenia (10^{6-10 1}) materiału IAV (o znanym mianie) w pożywce infekcyjnej wymienionej w kroku 8.1.1. Dodać 1,2 ml z każdego rozcieńczenia do trzykrotnego sprawdzenia.
6. Rozmrozić homogenaty narządów na lodzie. Odwirować na wirówce stołowej o masie 2 000 × g i zebrać klarowny supernatant.
7. Powtórzyć krok 8.5, ale z supernatantem z próbek z kroku 8.6.
8. Odessać pożywkę z komórek i przemyć 2x 1 ml PBS, aby usunąć cały FBS.
9. Dodać delikatnie 300 μl każdej wzorcowej rozcieńczonej lub seryjnie rozcieńczonej próbki wzdłuż boku każdej studzienki, zaczynając od najwyższego rozcieńczenia do najniższego, i zrobić to trzykrotnie.
10. Umieścić płytki w inkubatorze w temperaturze 37 °C/5% CO_{2 ,} potrząsając płytką co 10 minut, łącznie przez 50 minut. Upewnij się, że umieściłeś je płasko w inkubatorze i nie układaj ich w stosy.
11. Po upływie 50 minut przemyj komórki 2x 1 ml PBS.
12. Dodać 2 ml pożywki o niskiej lepkości do każdej studzienki, z wyjątkiem studzienek o najniższym rozcieńczeniu i dołków bez wirusów; do nich dodaj pożywkę infekcyjną i trypsynę.
13. Umieść płytkę z powrotem w inkubatorze w temperaturze 37 °C/5% CO₂ na 2-4 dni, aby uzyskać blaszki blaszkowe, które można uwidocznić gołym okiem.
14. Umyj płytki, dodając 2 ml PBS do każdej studzienki szybko z boku i delikatnie wstrząsnąć, aby zawiesić osiadłe podłoże nakładkowe o niskiej lepkości.
15. Wylej całą objętość płynu do studzienki, delikatnie odpipetowując pożywkę.
16. Powtórzyć płukanie jeszcze raz z 2 ml PBS w każdym dołku, a następnie wyrzucić całą objętość płynu przez delikatne pipetowanie.
17. Aby utrwalić blaszki miażdżycowe, dodaj 500 μl 4% paraformaldehydu do każdej studzienki, wstrząśnij i odstaw na 30 minut.
18. Powoli przemyj bok 1 ml PBS, a następnie delikatnie wylej płyn.
19. Dodaj 500 μl 1% fioletu krystalicznego (rozcieńczonego w wodzie) do każdej studzienki, aby pokryć monowarstwę komórki. Inkubować przez 5 minut.
20. Umyć 1 ml wody z kranu. Upewnij się, że wylałeś cały płyn z dołka, delikatnie pipetując. Połóż talerz do góry nogami na podkładce do pieluchy do wyschnięcia przez noc.
21. Policz tabliczki wizualnie i zapisz obrazy na dowolnym dostępnym imagerze.

Wyniki

S. pneumoniae hodowane w biofilmie (Rysunek 1A) zostały użyte do zainfekowania myszy (Rysunek 1B) za pomocą małego 10 μL inokulum podawanego donosowo nieznieczulonym myszom. To inokulum o małej objętości skutkuje konsekwentnym nosicielstwem pneumokoków ograniczonym do nosogardzieli (Rysunek 2A, + grupy sp), unikając jednocześnie rozprzestrzeniania się ogólnoustrojowego (Rysunek 2B, C, +grupy sp). Dwa dni po inokulacji donosowej myszy zostały zakażone mysim wirusem grypy A H1N1 A/PR/8/34 (IAV)^22,30 podawanym zarówno donosowo, jak i dotchachawiczo, aby osiągnąć stałe dostarczanie określonych ilości do nosogardzieli i płuc²³.

Tutaj model został użyty do porównania przebiegu choroby po infekcji wirusowej u myszy z różnymi szczepami S. pneumoniae, w tym TIGR4 i D39, które są szczepami inwazyjnymi, powodującymi zapalenie płuc przechodzące w bakteriemię, oraz EF3030, który jest szczepem zapalenia ucha środkowego^{21,24,25,26,31}. Prezentacja choroby u myszy zakażonych S. pneumoniae/IAV była zależna od szczepu bakteryjnego (Rysunek 2). Chociaż nie stwierdzono znaczącej różnicy w liczbie bakterii w nosogardzieli (Figura 2A) wśród któregokolwiek ze szczepów, S. pneumoniae TIGR4 i D39, ale nie EF3030, rozprzestrzeniły się do płuc w ciągu 48 godzin po zakażeniu IAV (Figura 2B). Czterdzieści procent myszy zakażonych donosowo S. pneumoniae TIGR4 wykazywało rozprzestrzenianie się bakterii do płuc, a spośród nich połowa z nich stała się bakteriemiczna (Rysunek 2C), zgodnie z wcześniejszymi ustaleniami²³.

Myszy donosowo zakażone S. pneumoniae D39 wykazały bardziej efektywne rozprzestrzenianie się, ponieważ rozprzestrzenianie się do płuc zaobserwowano u 100% współzakażonych myszy (Rysunek 2B). Podobnie jak w przypadku S. pneumoniae TIGR4, połowa z nich doświadczyła bakteriemii (Ryc. 2C). Śledząc całkowite przeżycie, niezależnie od szczepu bakteryjnego, wskaźnik przeżycia myszy zakażonych był znacznie niższy niż myszy pojedynczo prowokowanych samym S. pneumoniae dla wszystkich badanych szczepów (Rysunek 2D). W porównaniu z myszami kontrolnymi, u których leczono samym IAV, myszy zakażone donosowo S. pneumoniae TIGR4 i D39, ale nie EF3030, wykazywały przyspieszone tempo choroby. Do 2 dnia po zakażeniu IAV 30% (D39) i 20% (TIGR4) myszy uległo, podczas gdy grupy kontrolne tylko z IAV nie zaczęły ulegać aż do 5 dnia po prowokacji (Figura 2D). Myszy zakażone jednocześnie S. pneumoniae EF3030 i IAV miały opóźnione objawy, bardziej podobne do kontroli tylko IAV (Ryc. 2D). Odkrycia te pokazują, że model koinfekcji powoduje chorobę u młodych, zdrowych myszy, która jest zależna od szczepu bakteryjnego, co czyni go idealnym do badania czynników bakteryjnych wymaganych na każdym etapie postępu choroby.

Ten model został wykorzystany do oceny obecności różnych komórek odpornościowych w płucach (typy komórek i strategia bramkowania w Rysunek 3) po zakażeniu IAV u myszy inokulowanych donosowo różnymi szczepami S. pneumoniae. Szczepy bakteryjne D39 i TIGR4, które rozprzestrzeniły się do płuc po zakażeniu IAV, spowodowały znaczny wzrost powyżej wartości wyjściowej (niezakażonych) napływu zapalnych komórek odpornościowych z krążenia, takich jak neutrofile (PMN) i monocyty, podczas gdy EF3030 nie (Rysunek 4A-C). Samo zakażenie IAV wywołało znaczny wzrost w stosunku do wartości wyjściowej w napływie komórek odpornościowych ważnych dla obrony gospodarza przed infekcją wirusową, takich jak komórki NK i limfocyty T gamma-delta (Figura 4A-C). Te odpowiedzi przeciwwirusowe były znacznie osłabione u myszy donosowo zakażonych S. pneumoniae przed prowokacją wirusową (Figura 4A-C). Jest to zgodne z wcześniejszymi badaniami oceniającymi odpowiedzi cytokin, które wykazały, że nosicielstwo S. pneumoniae stępiło produkcję interferonów typu I i upośledzało zdolność gospodarza do kontrolowania ładunków IAV w płucach²³. Wyniki te pokazują, że model koinfekcji może być wykorzystany do badania, jak zmieniają się odpowiedzi immunologiczne w infekcjach mono- i wielodrobnoustrojowych.

Ten model był również używany do oceny wpływu starzenia się na przebieg choroby po zakażeniu IAV u myszy donosowo zakażonych S. pneumoniae TIGR4. U pojedynczo zakażonych myszy miana wirusa nie różniły się między młodymi i starszymi kohortami ( Rysunek 5A) < sup class = "xref">23. Podobnie jak w poprzednich badaniach²³, stare myszy wykazywały wcześniejsze i znacznie poważniejsze objawy choroby w porównaniu z ich młodymi odpowiednikami, o czym świadczą wyższe wyniki kliniczne (Ryc. 5B). Zgodnie z objawami choroby, stare myszy zaszczepione S. pneumoniae zaczęły umierać szybciej w ciągu 24 godzin po zakażeniu IAV i wszystkie z nich uległy chorobie, podczas gdy młode grupy kontrolne przeżyły infekcję w znacznie wyższym wskaźniku (33%) (Ryc. 5C). Wyniki te pokazują, że model koinfekcji może być używany do wykrywania cięższej choroby u wrażliwych gospodarzy, co czyni go idealnym do badania czynników gospodarza, które nadają oporność lub podatność na koinfekcję.

Rysunek 1: Oś czasu koinfekcji i przetwarzania narządów w celu oceny napływu komórek odpornościowych i obciążenia patogenami. (A) Streptococcus pneumoniae są hodowane w biofilmach. (B) Myszy zaszczepia się donosowo 5 × 10⁶ CFU wskazanego szczepu S. pneumoniae wyhodowanego w biofilmie w celu ustalenia nosicielstwa nosowo-gardłowego lub pozostawia bez leczenia. Czterdzieści osiem godzin później myszy są albo symulowane leczone PBS, albo otrzymują 200 PFU wirusa grypy A PR8 donosowo i 20 PFU dotchawiczo. Myszy są monitorowane w czasie pod kątem klinicznych wyników choroby i przeżycia. (C) Po 48 godzinach od zakażenia IAV ocenia się bakteryjną CFU lub wirusową PFU w różnych narządach lub napływ komórek odpornościowych do płuc. Skróty: CFU = jednostki tworzące kolonie; PFU = jednostki tworzące płytkę nazębną; IAV = wirus grypy A PR8; IT = dotchawiczo; NP = nosowo-gardłowo. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Podwójne zakażenie IAV donosowo/dotchawiczo myszy zaszczepionych S. pneumoniae prowadzi do rozprzestrzeniania się bakterii i choroby, która jest zależna od szczepu bakteryjnego. Młode (10-12 tygodniowe) samce myszy C57BL/6 (B6) zostały zainfekowane, jak w Rysunek 1. Liczba bakterii w (A) nosogardzieli, (B) płucach i (C) krwi została określona po 48 godzinach od zakażenia IAV. (B,C) Procenty oznaczają frakcję myszy, które wykazywały rozprzestrzenianie się. (D) Przeżycie monitorowano przez 10 dni po zakażeniu IAV. Pokazano zbiorcze dane z (A,B) n = 5, (C) n = 11 i (D) n = 6 myszy na grupę. Każdy okrąg odpowiada jednej myszy, a linie przerywane wskazują granicę wykrywalności. (A-C)*, wskazuje na istotną różnicę (p < 0,05) pomiędzy wskazanymi grupami wyznaczoną testem Kruskala-Wallisa. (D) *, wskazuje na istotną różnicę (p < 0,05) między myszami +sp i Co-inf na szczep bakteryjny, jak określono za pomocą testu log-rank (Mantel-Cox). Skróty: +sp = myszy zakażone donosowo bakteriami tylko przy użyciu wskazanego szczepu; Co-inf = myszy zakażone bakteriami, które zostały zakażone wirusem IAV; IAV = myszy, które otrzymały wirusa grypy A; CFU = jednostki tworzące kolonie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Strategia bramkowania komórek odpornościowych. Pobrano płuca, a napływ komórek odpornościowych określono za pomocą cytometrii przepływowej. Przedstawiono reprezentatywną strategię bramkowania dla różnych typów komórek. (A) CD45⁺, żywe pojedyncze komórki bramkowano i procentową zawartość (B) PMN (Ly6G⁺, CD11b⁺), makrofagów (Ly6G^-, Ly6C^-, F480⁺) i monocytów (Ly6G^-, Ly6C⁺), (C) DC (^Ly6G-, CD11c⁺) i komórek NK (NK1.1⁺, CD3^-), (D) TCR^- γΔ i CD8 (CD8⁺, TCRβ⁺) i oznaczono limfocyty T CD4 (CD4⁺, TCRβ⁺). Skróty: SSC-A = obszar piku bocznego; FSC-A = obszar piku rozproszenia do przodu; FSC-H = wysokość piku rozproszenia do przodu; SSC-W = szerokość piku rozrzutu bocznego; L/D = żywy/martwy; FMO = fluorescencyjna minus jeden; NK = naturalny zabójca; PMN = leukocyty wielojądrzaste; DC = komórka dendrytyczna; TCR = receptor limfocytów T. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Reakcje immunologiczne płuc są zależne od szczepu bakteryjnego. Młode (10-12 tygodniowe) samce myszy C57BL/6 były albo niezakażone, pojedynczo zaszczepione wskazanym szczepem Streptococcus pneumoniae (+sp), pojedynczo prowokowane IAV (IAV), albo jednocześnie zakażone S. pneumoniae i IAV (Co-inf). Czterdzieści osiem godzin po zakażeniu IAV (patrz projekt eksperymentalny w Rysunek 1), płuca zostały pobrane, a napływ komórek odpornościowych określono za pomocą cytometrii przepływowej zgodnie ze strategią bramkowania w Rysunek 3. (A) Średnie wartości procentowe każdego wskazanego typu komórek w bramce CD45 są wyświetlane dla wszystkich grup traktowanych na mapie cieplnej. (B) Reprezentatywne wykresy kropkowe typów komórek, które wykazywały znaczące różnice między traktowaniami, są pokazane dla każdej grupy myszy. (C) Pokazana jest zawartość procentowa wskazanych typów komórek odpornościowych. Każdy okrąg odpowiada jednej myszy. (A,C) Pokazano zbiorcze dane z n = 5 myszy na grupę. *, wskazuje na istotną różnicę (p < 0,05) między Co-inf a niezakażonym; ^$, wskazuje na istotną różnicę między IAV a niezainfekowanymi; #, wskazuje na istotną różnicę między samym Co-inf a IAV. Istotne różnice między grupami prowokacyjnymi dla każdego typu komórki określono za pomocą ANOVA, a następnie testu Tukeya. Skróty: NK = natural killer; PMN = leukocyty wielojądrzaste; DC = komórka dendrytyczna; TCR = receptor limfocytów T; IAV = wirus grypy A. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Starzenie się i zwiększona podatność gospodarza na jednoczesne zakażenie IAV/Streptococcus pneumoniae. Młode (10-12 tygodni) i w wieku (21-22 miesiące) samce myszy C57BL/6 były jednocześnie zakażone S. pneumoniae TIGR4 i.n. i IAV i.n. i i.t. (jak w Rysunek 1) lub pojedynczo prowokowane samym IAV. (A) Miana wirusa oznaczono 48 godzin później. Gwiazdki wskazują istotność statystyczną (p < 0,05) określoną za pomocą testu t-Studenta. Dane są łączone z n = 4 myszy na grupę. (B) Wynik kliniczny i (C) przeżycie były monitorowane w czasie. (B) Pokazano średnią ± SEM zebraną z n = 6 myszy na grupę. Gwiazdki wskazują na istotność statystyczną (p < 0,05) między młodymi i starymi myszami we wskazanym punkcie czasowym, określonym testem Manna-Whitneya. (C) Dane są łączone z n = 6 myszy na grupę. Gwiazdki wskazują istotność statystyczną (p < 0,05) między młodymi i starymi myszami, określoną za pomocą testu log-rank (Mantel-Cox). Skróty: IAV = wirus grypy A; i.n. = donosowo; i.t. = dotchachawiczo; SEM = błąd standardowy średniej. Rysunek 5A jest przedrukowany za zgodą Joma et al.²³. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Kolba Mix I dla CDM
adenina	0,1 grama
D-alanina	0,25 gr
CaCl2 Bezwodny	0,025 gr
Siarczan manganu	0,03 gr
Cyjanokobalamina	100 μl zapasu 10 mg/ml
Kwas para-aminobenzoesowy	400 μl zapasu 5 mg/ml
Pirydoksamina 2HCl	100 μl zapasu 10 mg/ml
Kolba Mix II do CDM
guanina	0,05 gr
Uracyl	0,05 gr
Kolba Mix III do CDM
Azotan żelaza 9H2O	50 mg/ml
Siarczan żelaza7H2O	10 mg/ml
Mieszaj kolbę dożylną do CDM
Dinukleotyd beta-nikotynamidoadeninowy	25 mg/ml

Tabela 1: Mieszanie zapasów I, II, III i IV dla CDM. Skrót: CDM = chemicznie zdefiniowane media.

Mieszanka witamin dla CDM
Chlorowodorek pirydoksalu	0,8 gr
Tiamina Cl2	0,4 grama
ryboflawina	0,4 grama
Ca-pantotenian	0,4 grama
biotyna	0,04 gr
Kwas foliowy	0,4 grama
Niacynamid	0,4 grama

Tabela 2: Mieszanka witamin dla CDM. Skrót: CDM = chemicznie zdefiniowane media.

Zapas aminokwasów dla CDM
L-alanina	0,480 gr
L-arginina	0,250 gr
L-asparagina	0.700 gr
Kwas L-asparaginowy	0.600 gramów
L-cysteina	1.000 gr
L-cystyna	0,100 gr
Kwas L-glutaminowy	0,200 gr
L-glutamina	0,780 gr
L-glicyna	0,350 gr
L-histydyna	0.300 gr
L-izoleucyna	0,430 gr
L-leucyna	0,950 gr
L-lizyna	0,880 gr
L-metionina	0,250 gr
L-fenyloalanina	0,550 gr
L-Prolina	1.350 gr
L-seryna	0,680 gr
L-treonina	0,450 grama
L-tryptofan	0,100 gr
L-walina	0,650 gr

Tabela 3: Zapas aminokwasów dla CDM. Skrót: CDM = chemicznie zdefiniowane media.

Zapas startowy do CDM
Dekstroza	1,0 gr
Siarczan magnezu-7-hydrat	0,070 gr
Fosforan potasu dwuzasadowy	0,02 gr
Fosforan potasu jednozasadowy	0,1 grama
Octan sodu bezwodny	0,45 grama
Wodorowęglan sodu	0,25 gr
Fosforan sodu dwuzasadowy	0,735 gr
Fosforan sodu jednozasadowy	0,32 gr
Dodatki końcowe do CDM
Chlorek choliny	0,1 grama
L-cysteina HCl	0,075 gr
Wodorowęglan sodu	0,25 gr

Tabela 4: Zapasy startowe i końcowe suplementy do CDM. Skrót: CDM = chemicznie zdefiniowane media.

pkt. pkt. powiedział: pkt.

Przeciwciało/Fluorofor	klon	Współczynnik rozcieńczenia
L / D do wzbudzenia UV	N/a	0,38888889
Ly6G AF 488	Pozycja 1A8	0,25
Transporter opancerzony CD11b	Zobacz materiał M1/70	0,25
CD11c PE	N418	Numer katalogowy: 0,18055556
Blok Fc myszy	2.4G2	0.11111111
F4/80 PE Cy7	Zobacz materiał BM8	Numer katalogowy: 0,18055556
Ly6C BV605	AL-21	0,25
CD103 BV 421	Zobacz materiał M290	Numer katalogowy: 0,18055556
CD45 APC-eF-780	30-F11	Numer katalogowy: 0,18055556

Tabela 5: Panel przeciwciał 1.

pkt.

Przeciwciało/Fluorofor	klon	Współczynnik rozcieńczenia
L / D do wzbudzenia UV	N/a	0.388888889
TCR-β APC Cy7	H57-597	0.180555556
CD4 V450 (Pacyficzny Niebieski)	Zobacz materiał RM4-5	0,25
Płyta CD8 BV650	53-6,7	0.180555556
Blok Fc myszy	2.4G2	0.111111111
CD45 PE	30-F11	0.180555556
Płyta CD3 AF488	Zobacz materiał 145-2C11	0.180555556
TCR- γΔ APC	GL-3	0.180555556
NK1.1 AF 700	Zobacz materiał PK136	0.180555556

Tabela 6: Panel przeciwciał 2.

Dyskusja

Większość istniejących badań eksperymentalnych dotyczących jednoczesnego zakażenia S. pneumoniae/IAV opiera się na dostarczaniu bakterii do płuc myszy wstępnie zakażonych IAV. Modele te pomogły zidentyfikować zmiany w środowisku płucnym i ogólnoustrojowej odpowiedzi immunologicznej, które sprawiają, że gospodarz jest podatny na wtórne zakażenie bakteryjne 15,16,17,32,33,34,35,36,37. Jednak modele te nie były w stanie naśladować przejścia S. pneumoniae z bezobjawowego kolonizatora w patogen zdolny do powodowania poważnych infekcji płuc i ogólnoustrojowych. Co więcej, modele te nie nadają się do badania czynników gospodarza i interakcji gospodarz-patogen w górnych drogach oddechowych, które przyczyniają się do podatności na infekcje. Wcześniejszy model przemieszczania się pneumokoków z nosogardzieli do płuc po zakażeniu IAV opierał się na zakażeniu bakteryjnym nosogardzieli, a następnie zakażeniu wirusowym. Nie udało się jednak odtworzyć poważnych objawów choroby obserwowanych u ludzi²¹. Opisany tutaj zmodyfikowany model infekcji mysiej podsumowuje przejście S. pneumoniae od bezobjawowego nosicielstwa do patogenu, który powoduje ciężką chorobę kliniczną.

Krytycznym etapem tego modelu jest ustalenie zakażenia S. pneumoniae w nosogardzieli. Streptococcus pneumoniae tworzą biofilmy i kolonizują nosogardziel z różną wydajnością ^21,38. Do ustalenia spójnego zakażenia wymagane jest co najmniej 5 × 10⁶ CFU badanych do tej pory szczepów bakterii wyhodowanych w biofilmie²³. Zaleca się, aby każdy nowy szczep bakteryjny został przetestowany pod kątem stabilnego zakażenia nosogardzieli przed infekcją wirusową. W przypadku koinfekcji wirusowej wcześniejsze badania wykazały, że wewnątrznosowe zakażenie IAV jest wymagane do dyspersji bakterii z nosogardzieli 21,22,23. W tych wcześniejszych badaniach zastosowano 500 PFU IAV do podawania donosowego, podczas gdy w tym badaniu 200 PFU wystarczyło do zwiększenia liczby bakterii w nosogardzieli. Zakażenie IAV nie ogranicza się do górnych dróg oddechowych i może rozprzestrzeniać się do płuc^39,40, co ma kluczowe znaczenie dla zwiększenia podatności środowiska płucnego na infekcje bakteryjne 15,16,41. Dostarczenie IAV do płuc można osiągnąć poprzez podanie donosowe lub dotchawiczą znieczulonych myszy. Wcześniejsze prace z myszami BALB/cByJ wykazały, że podawanie donosowe powoduje wirusowe zapalenie płuc²¹; jednak dostęp inokulum do płuc po inokulacji donosowej jest bardziej ograniczony u myszy C57BL / 6. U myszy C57BL/6 instalacja dotchawicza jest wymagana w celu spójnego dostarczania wirusa²³. W tym modelu wcześniejsza kolonizacja bakteryjna przyspiesza prezentację objawów chorobowych po infekcji wirusowej²³. Ponieważ infekcja wirusowa może sama w sobie powodować objawy chorobowe z potencjalnymi różnicami w kinetyce, zaleca się, aby najpierw przetestować zakres dawek dla każdego nowego testowanego szczepu wirusa i wybrać dawkę, która ujawnia przyspieszoną kinetykę u współzakażonych gospodarzy.

Płuca stanowią kolejny krytyczny odczyt dla oceny choroby w tym modelu. Do oceny obciążenia patogenami i napływu komórek odpornościowych można użyć płuca tej samej myszy. Ponieważ jednak nasilenie infekcji i stanu zapalnego może się różnić w zależności od płata, zaleca się, aby nie brać różnych płatów tego samego płuca do różnych ocen. Zamiast tego wszystkie płaty można zmielić na małe kawałki, dobrze wymieszać ze sobą, a następnie równomiernie przeanalizować dla różnych ocen. Podobnie nosogardziel może być używana do oznaczania liczby bakteryjnych CFU lub wirusowych PFU i odpowiedzi immunologicznej. Jednak liczba komórek uzyskanych z płukania i tkanek jest zbyt mała, aby przeprowadzić cytometrię przepływową bez łączenia próbek od myszy w tej samej grupie. Alternatywnie stan zapalny w nosogardzieli można ocenić histologicznie²³.

Kluczową cechą tego modelu jest to, że podsumowuje on chorobę kliniczną obserwowaną u pacjentów. U ludzi wtórne pneumokokowe zapalenie płuc po zakażeniu IAV często powoduje oczywiste objawy choroby, w tym kaszel, duszność, gorączkę i bóle mięśni, które mogą prowadzić do hospitalizacji, niewydolności oddechowej, a nawet śmierci 8,15,42,43. Model ten podsumowuje poważne objawy choroby klinicznej obserwowane u ludzi pod względem trudności w oddychaniu (odzwierciedlonych w wyniku oddychania) i ogólnego złego samopoczucia (odzwierciedlonego w wynikach postawy i ruchu) wykazywanych przez myszy, a także śmierci u niektórych zdrowych młodych osób z grupy kontrolnej. Zaostrzone objawy choroby u współzakażonych myszy są prawdopodobnie wynikiem zarówno rozprzestrzeniania się bakterii do płuc, jak i upośledzonego klirensu wirusa u myszy z nosicielstwem pneumokoków²³. Ograniczeniem modelu jest to, że częstość występowania choroby klinicznej i rozprzestrzeniania się bakterii z nosogardzieli różni się u myszy i zależy od szczepu bakteryjnego, wieku gospodarza i genotypu 21,22,23. Odzwierciedlając to, w przypadku szczepów inwazyjnych, progresja od miejscowego zakażenia (bez wykrywalnej bakteriemii) do śmierci może nastąpić w ciągu 24 godzin. Dlatego, aby uzyskać prawdziwą ocenę rozprzestrzeniania się ogólnoustrojowego, bakteriemię należy obserwować w krótszych odstępach czasu (co 6-12 godzin). Podobnie, ocena choroby może się szybko zmieniać, szczególnie w ciągu pierwszych 72 godzin po kozakażeniu. Dlatego, aby dokładnie śledzić objawy choroby, zaleca się monitorowanie myszy trzy razy dziennie przez 1-3 dni po zakażeniu IAV.

Podsumowując, model ten odtwarza przemieszczanie się S. pneumoniae z bezobjawowego kolonizatora nosogardzieli do patogenu zdolnego do wywoływania chorób płuc i ogólnoustrojowych po zakażeniu IAV. W tym modelu IAV wyzwala przejście S. pneumoniae poprzez modyfikację zachowania bakterii w nosogardzieli, zwiększając rozprzestrzenianie się bakterii do płuc i zmieniając odporność przeciwbakteryjną²³. Podobnie, nosicielstwo bakteryjne stępia przeciwwirusową odpowiedź immunologiczną i upośledza klirens IAV z płuc²³. To sprawia, że model ten jest idealny do analizowania zmian w odpowiedziach immunologicznych w pojedynczych i wielodrobnoustrojowych infekcjach. Ponadto przebieg choroby po koinfekcji jest częściowo zależny od szczepu pneumokoków obecnego w nosogardzieli. W związku z tym model nadaje się do analizy czynników bakteryjnych wymaganych do bezobjawowej kolonizacji w porównaniu z patogennym przejściem S. pneumoniae. Wreszcie, model ten odtwarza podatność starzenia się na koinfekcje i chociaż nie zostało to tutaj przetestowane, można go łatwo wykorzystać do oceny wpływu tła gospodarza na przebieg choroby. Podsumowując, rozdzielenie nosicielstwa i choroby na odrębne etapy daje możliwość analizy wariantów genetycznych zarówno patogenów, jak i gospodarza, umożliwiając szczegółowe zbadanie interakcji ważnego patobionta z gospodarzem w różnych fazach postępu choroby. Idąc dalej, model ten może być wykorzystany do dostosowania opcji leczenia dla wrażliwych gospodarzy.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kwas 4-aminobenzoesowy	Fisher	AAA1267318	Mix I stock
96-dołkowe okrągłe płyty denne	Greiner Bio-One	650101
100 µ m Filtry	Fisher	07-201-432
Adenina	Fisher	AC147440250	Mix I stock
Avicel	Fisher	501785325	Celuloza mikrocyrstalinowa
Bufor utrwalający BD Cytofix	Bufor utrwalający	Fisher	BDB554655
BD Fortessa	Cytometr przepływowy
Rurki polietylenowe BD Intramedic	Fisher	427410	Rurka do płukania nosa
BD  Jednorazowe strzykawki z końcówkami Luer-Lok (1 ml)	Fisher	14-823-30
BD  Mikrotainer Kapilarny kolektor krwi i zamknięcie BD Microgard	Fisher	02-675-185	Probówki do pobierania krwi
Beta-nikotynamidoadeninowy dinukleotyd	Fisher	AAJ6233703	Mix IV zapas
Biotyna	Fisher	AC230090010	Zapas witamin
Myszy C57BL / 6J	The Jackson Laboratory	#000644	Myszy użyte w tym badaniu
Bezwodny chlorek wapnia	Fisher Chemical	C77-500	Mix I zapasy
CD103 BV 421	BD Bioscience	BDB562771	Klon: M290 DF 1:200
CD11b APC	Invitrogen	50-112-9622	Klon: M1/70, DF 1:300
CD11c PE	BD Bioscience	BDB565592	Klon: N418 DF 1:200
CD3 AF 488	BD Bioscience	OB153030	Klon: 145-2C11 DF 1:200
CD4 V450	BD Horizon	BDB560470	Klon: RM4.5 DF 1:300
CD45 APC eF-780	BD Bioscience	50-112-9642	Klon: 30-F11 DF 1:200
CD45 PE	Invitrogen	50-103-70	Klon: 30-F11 DF 1:200
CD8&alfa; BV 650	BD Horizon	BDB563234	Klon: 53-6,7 DF 1:200
Chlorek choliny	Fisher	AC110290500	Końcowy dodatek do CDM
Corning Jednorazowe systemy próżniowych filtrów/magazynowania	Fisher	09-761-107	Aparatura do sterylizacji filtrów
Kolby T-25 poddane hodowli tkankowej Corning	Fisher	10-126-9
Corning  Płytki wielodołkowe Costar Clear	Fisher	07-201-590
Corning  DMEM z L-glutaminą i 4,5 g/l glukozy; Bez pirogronianu sodu	Fisher	MT10017CM
cyjanokobalamina	Fisher	AC405925000	Mix I zapas
D39	Krajowa Kolekcja Kultur Typu (NCTC)	NCTC 7466	Streptococcus pneumoniae szczep
D-Alanina	Fisher	AAA1023114	Mix I zapas
D-pantotenian wapnia	Fisher	AC243301000	Zapas witamin
Dextrose	Fisher Chemical	D16-500	Zapas startowy
Dnase	Worthington Biochemiczny
Eagles Minimum Essential Medium	ATCC	30-2003
EDTA	VWR	BDH4616-500G
EF3030	Centrum Kontroli i Zapobiegania Chorobom	Dostępne za pośrednictwem banku izolatów na żądanie	szczepu Streptococcus pneumoniae, żądanie przy użyciu nazwy szczepu
F480 PE Cy7	BD Bioscience	50-112-9713	Klon: BMB DF 1:200
Falcon 50 mL stożkowe probówki wirówkowe	Fisher	14-432-22	50 ml probówka z okrągłym dnem
Falcon  Probówki polipropylenowe z okrągłym dnem z nakrętką	Fisher	14-959-11B	15 mL probówka z okrągłym dnem
Falcon  Probówki z polistyrenu okrągłodennego (5 ml)Probówki	FACS Fisher	14-959-5
FBS	Thermofisher	10437-028
Azotan żelaza Niewodny	Fisher	I110-100	Mix III
kolba Fisherbrand Delikatne nożyczki preparacyjne	Fisher	08-951-5	Instrumenty używane do zbioru
Fisherbrand Jednorazowe pętle do zaszczepiania	Fisher	22-363-602	Pętle inokulacyjne
Kleszcze do tkanek preparacyjnych	Fisherbrand	Fisher 13-812-38	Kleszcze do zbioru
Probówki do mikrowirówek Fisherbrand Premium: 1,5 ml	Fisher	05-408-137	Probówki do mikowirówki
Fisherbrand  Sterylne strzykawki jednorazowego użytku (10 ml)	Fisher	14-955-459
Kwas foliowy	Fisher	AC216630500	Zapas witamin
Gibco RPMI 1640 (ATCC)	Fisher	A1049101
Gibco  DPBS, bez wapnia, bez magnezu	Fisher	14190250
Gibco  HBSS, wapń, magnez, bez czerwieni fenolowej	Fisher	14025134
Gibco  MEM (modyfikacja Temina) (2x), bez czerwieni fenolowej	Fisher	11-935-046
Gibco  Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml)	Fisher	15-140-122
Gibco  Roztwór błękitu trypanowego, 0,4%	Fisher	15-250-061
Gibco  Trypsyna-EDTA (0,25%), czerwień fenolowa	Fisher	25-200-056
Glicerol (certyfikowany ACS)	Fisher	G33-4
Glicyna	Fisher	AA3643530	Zapas aminokwasów
Guanina	Fisher	AAA1202414	Mix II
Invitrogen UltraComp eBeads Koraliki kompensacyjne	Fisher	50-112-9040
Siarczan żelaza (II) siedmiowodny	Fisher	AAA1517836	Mix III zapas
L-Alanina	Fisher	AAJ6027918	Zapas aminokwasów
L-arginina	Fisher	AAA1573814	Zapas aminokwasów
L-asparagina	Fisher	AAB2147322	Zapas aminokwasów
Kwas L-asparaginowy	Fisher	AAA1352022	Zapas aminokwasów
L-cysteina	Fisher	AAA1043518	Zapas aminokwasów
Monohydrat chlorowodorku L-cysteiny	Fisher	AAA1038914	Końcowy suplement do CDM
L-cystyny	Fisher	AAA1376218	Zapas aminokwasów
Kwas L-glutaminowy	Fisher	AC156211000	Zapas aminokwasów
L-glutamina	Fisher	O2956-100	Zapas aminokwasów
L-histydyna Fisher		AC166150250	Zapas aminokwasów
LIFE TECHNOLOGIES LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, do wzbudzenia UV	Invitrogen	50-112-1524	Klon: N/A DF 1:500
L-izoleucyna	Fisher	AC166170250	Zapas aminokwasów
L-Leucine	Fisher	BP385-100	Zapas aminokwasów
L-Lizyna	Fisher	AAJ6222514	Zapas aminokwasów
L-Metionina	Fisher	AAA1031822	Zapas aminokwasów
Niska endotoksyna BSA	Sigma Aldrich	A1470-10G
L-fenyloalanina	Fisher	AAA1323814	Zapas aminokwasów
L-Proline	Fisher	AAA1019922	Zapas aminokwasów
L-Serine	Fisher	AC132660250	Zapas aminokwasów
L-treonina	Fisher	AC138930250	Zapas aminokwasów
L-tryptofan	Fisher	AAA1023014	Zapas aminokwasów
L-walina Fisher		AAA1272014	Zapas aminokwasów
Ly6C BV 605	BD Bioscience	BDB563011	Klon: AL-21 DF 1:300
Ly6G AF 488	Biolegend	NC1102120	Klon: IA8, DF 1:300
Komórki nerki psów Madin-Darby (MDCK)	American Type Culture Collection (ATCC)	CCL-34	Linia komórkowa MDCK do analizy PFU
Siarczan magnezu 7-hydrat	Fisher	60-019-68	CDM zapas startowy
Siarczan manganu	Fisher	M113-500	Mix I zapas
Woda			Ultraczysta woda
Mysz Fc Block	BD Bioscience	BDB553142	Klon: 2.4G2 DF 1:100
MWI WETERYNARIA  PURALUBE VET MAŚĆ	Fisher	NC1886507	Smar do oczu na infekcje
NCI-H292 linia komórkowa raka śluzowo-naskórkowego	ATCC	CRL-1848	H292 linia komórkowa nabłonka płuc do wzrostu biofilmu
Niacynamid	Fisher	18-604-792	Zapas witamin
NK 1.1 AF 700	BD Bioscience	50-112-4692	Klon: PK136 DF 1:200
Oxyrase do bulionu 50Ml Butelka 1/Pk	Fisher	50-200-5299	Do usuwania tlenu z płynnych kultur
Paraformaldehyd 4% w PBS	Thermoscientific	J19932-K2
Izofluran pivetal	Patterson Veterinary	07-893-8440	Izofluran do znieczulenia podczas infekcji
Fosforan potasu dwuzasadowy	Fisher Chemical	P288-500	Zapas startowy
Fosforan potasu jednozasadowy	Fisher Chemical	P285-500	Zapas startowy
Chlorowodorek pirydoksalu	Fisher	AC352710250	Zapas witamin
Dichlorowodorek pirydoksaminy	Fisher	AAJ6267906	Mix I zapas
Ryboflawina	Fisher	AC132350250	Zapas witamin
Octan sodu	VWR	0530-500G	Zapas startowy
Azek sodu	Bioodczynniki Fisher	BP922I-500	Do buforu FACS
Wodorowęglan sodu	Fisher Chemical	S233-500	Zapas startowy i końcowy dodatek do CDM
Dwuzasadowy fosforan sodu	Fisher Chemical	S374-500	Zapas startowy
Fosforan sodu jednozasadowy	Fisher Chemical	S369-500	Zapas startowy
TCR APC	BD Bioscience	50-112-8889	Klon: GL-3 DF 1:200
TCRβ APC-Cy7	BD Pharmigen	BDB560656	klon: H57-597 DF 1:200
Thermo Scientific Agar do krwi z gentamycyną	Fisher	R01227	Płytki agarowe z antybiotykiem gentamycyną
Thermo Scientific  Trypsyna, Fisher PI20233
Chlorowodorek tiaminy	Fisher	AC148991000	Zapas witamin
TIGR4	ATCC	BAA-334	Streptococcus pneumoniae
szczep Uracil	Fisher	AC157300250	Mix II
Worthington Biochemical Corporation  Kolagenaza, Typ 2, 1 g	Fisher	NC9693955