Artykuł metodologiczny

Mysi model przejścia Streptococcus pneumoniae z kolonizatora w patogen po koinfekcji wirusowej podsumowuje chorobę zaostrzoną wiekiem

4.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64419

⸱

28 września 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, University at Buffalo School of Medicine, 2Department of Molecular Biology and Microbiology, Tufts University School of Medicine, 3Graduate Program in Immunology, Tufts Graduate School of Biomedical Sciences, 4Department of Translational Medicine, Lund University, 5Stuart B. Levy Center for the Integrated Management of Antimicrobial Resistance, Tufts University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł opisuje nowy model myszy do przejścia pneumokoków z bezobjawowego kolonizatora w patogen chorobotwórczy podczas infekcji wirusowej. Model ten można łatwo zaadaptować do badania interakcji wielodrobnoustrojowych i gospodarz-patogen w różnych fazach progresji choroby i u różnych gospodarzy.

Streszczenie

Streptococcus pneumoniae (pneumokoki) jest bezobjawowym kolonizatorem nosogardzieli u większości osób, ale po zakażeniu wirusem grypy A (IAV) może przekształcić się w patogen płucny i ogólnoustrojowy. Zaawansowany wiek zwiększa podatność gospodarza na wtórne pneumokokowe zapalenie płuc i wiąże się z pogorszeniem wyników choroby. Czynniki gospodarza napędzające te procesy nie są dobrze zdefiniowane, częściowo z powodu braku modeli zwierzęcych, które odtwarzają przejście od bezobjawowej kolonizacji do ciężkiej choroby klinicznej.

Ten artykuł opisuje nowy model myszy, który odtwarza przejście pneumokoków od bezobjawowego nosicielstwa do choroby po infekcji wirusowej. W tym modelu myszom najpierw zaszczepia się donosowo pneumokoki wyhodowane w biofilmie w celu uzyskania bezobjawowego nosicielstwa, a następnie następuje zakażenie IAV zarówno nosogardzieli, jak i płuc. Powoduje to rozprzestrzenianie się bakterii do płuc, zapalenie płuc i oczywiste objawy choroby, które mogą prowadzić do śmierci. Stopień zaawansowania choroby zależy od szczepu bakteryjnego i czynników żywiciela.

Co ważne, ten model odtwarza podatność na starzenie się, ponieważ w porównaniu do młodych myszy, stare myszy wykazują cięższe klinicznie choroby i częściej ulegają chorobom. Rozdzielając nosicielstwo i chorobę na odrębne etapy i zapewniając możliwość analizy wariantów genetycznych zarówno patogenu, jak i gospodarza, ten model koinfekcji S. pneumoniae/IAV pozwala na szczegółowe badanie interakcji ważnego patobionta z gospodarzem na różnych etapach postępu choroby. Model ten może również służyć jako ważne narzędzie do identyfikacji potencjalnych celów terapeutycznych przeciwko wtórnemu pneumokokowemu zapaleniu płuc u podatnych gospodarzy.

Wprowadzenie

Streptococcus pneumoniae (pneumokoki) to bakterie Gram-dodatnie, które bezobjawowo zamieszkują nosogardziel większości zdrowych osób1,2. Wspierane przez czynniki, które nie są do końca zdefiniowane, pneumokoki mogą przekształcać się z łagodnych kolonizatorów nosogardzieli w patogeny, które rozprzestrzeniają się na inne narządy, powodując poważne infekcje, w tym zapalenie ucha środkowego, zapalenie płuc i bakteriemię3. Występowanie choroby pneumokokowej jest częściowo zależne od różnic specyficznych dla szczepu, w tym serotypu, który opiera się na składzie polisacharydów otoczkowych. Do tej pory scharakteryzowano ponad 100 serotypów, a niektóre z nich są związane z bardziej inwazyjnymi infekcjami4,5. Kilka innych czynników zwiększa ryzyko choroby pneumokokowej. Jednym z takich czynników jest infekcja wirusowa, w której ryzyko pneumokokowe zapalenie płuc jest 100-krotnie zwiększone przez IAV6,7. Historycznie rzecz biorąc, S. pneumoniae jest jedną z najczęstszych przyczyn wtórnego bakteryjnego zapalenia płuc po grypie i wiąże się z gorszymi wynikami8. Innym ważnym czynnikiem ryzyka jest zaawansowany wiek. W rzeczywistości S. pneumoniae jest główną przyczyną pozaszpitalnego bakteryjnego zapalenia płuc u osób starszych powyżej 65 roku życia9,10. Osoby w podeszłym wieku odpowiadają za większość (>75%) zgonów z powodu zapalenia płuc i grypy, co wskazuje, że dwa czynniki ryzyka - starzenie się i zakażenie IAV - synergistycznie pogarszają podatność na chorobę11,12,13,14. Jednak mechanizmy, za pomocą których infekcja wirusowa powoduje przejście pneumokoków z bezobjawowego kolonizatora do inwazyjnego patogenu i jak jest to kształtowane przez czynniki gospodarza, pozostają słabo poznane. Wynika to w dużej mierze z braku małego modelu zwierzęcego, który podsumowuje przejście od bezobjawowej kolonizacji pneumokoków do krytycznej choroby klinicznej.

Badania nad koinfekcją były klasycznie modelowane na myszach, którym zaszczepiono pneumokoki bezpośrednio do płuc 7 dni po zakażeniu grypą15,16. Odtwarza to podatność na wtórne bakteryjne zapalenie płuc i jest idealne do badania, w jaki sposób przeciwwirusowe odpowiedzi immunologiczne osłabiają obronę przeciwbakteryjną17. Jednak badania podłużne na ludziach wykazały, że nosicielstwo pneumokoków w nosogardzieli, gdzie bakterie mogą tworzyć bezobjawowe biofilmy18, jest jednolicie związane z chorobami inwazyjnymi19,20. Izolaty bakteryjne z infekcji ucha środkowego, płuc i krwi są genetycznie identyczne z tymi występującymi w nosiogardzieli20. W związku z tym, aby zbadać przejście od bezobjawowego nosicielstwa do choroby inwazyjnej po zakażeniu IAV, stworzono model, w którym myszom podawano donosowo pneumokoki hodowane w biofilmie, a następnie infekcję IAV nosogardzieli21,22. Wirusowa infekcja górnych dróg oddechowych doprowadziła do zmian w środowisku gospodarza, które doprowadziły do rozproszenia pneumokoków z biofilmów i ich rozprzestrzenienia się na dolne drogi oddechowe21. Te rozproszone bakterie miały zwiększoną ekspresję czynników wirulencji ważnych dla infekcji, przekształcając je z kolonizatorów w patogeny21. Obserwacje te podkreślają złożoną interakcję między wirusem, gospodarzem i bakteriami i pokazują, że zmiany w gospodarzu wywołane infekcją wirusową mają bezpośredni wpływ na zachowanie pneumokoków, co z kolei zmienia przebieg infekcji bakteryjnej. Jednak model ten nie podsumowuje poważnych objawów choroby obserwowanych u ludzi, prawdopodobnie dlatego, że wirus jest ograniczony do jamy nosowej, a ogólnoustrojowe skutki infekcji wirusowej na odporność gospodarza i uszkodzenie płuc nie są rekapitulowane.

Niedawno stworzyliśmy model, który obejmuje złożoną interakcję między gospodarzem a patogenami, ale także bardziej naśladuje nasilenie choroby obserwowane u ludzi23. W tym modelu myszy są najpierw zakażone donosowo pneumokokami wyhodowanymi w biofilmie w celu ustanowienia bezobjawowego nosicielstwa, a następnie zakażenie IAV zarówno nosogardzieli, jak i płuc. Spowodowało to rozprzestrzenienie się bakterii do płuc, zapalenie płuc i chorobę, która rozwinęła się do śmiertelności u części młodych myszy23. To poprzednie badanie wykazało, że zarówno infekcja wirusowa, jak i bakteryjna zmieniała obronę gospodarza: infekcja wirusowa sprzyjała rozprzestrzenianiu się bakterii, a wcześniejsza kolonizacja bakteryjna upośledzała zdolność gospodarza do kontrolowania poziomów IAV w płucach23. Badanie odpowiedzi immunologicznej wykazało, że zakażenie IAV zmniejszyło aktywność przeciwbakteryjną neutrofili, podczas gdy kolonizacja bakteryjna stępiła odpowiedź na interferon typu I, krytyczną dla obrony przeciwwirusowej23. Co ważne, model ten odwzorowywał podatność na starzenie. W porównaniu z młodymi myszami, stare myszy wykazywały oznaki choroby wcześniej, wykazywały cięższy przebieg choroby klinicznej i częściej ulegały infekcji23. Praca przedstawiona w tym manuskrypcie pokazuje, że stopień choroby zależy również od szczepu bakteryjnego, ponieważ inwazyjne szczepy pneumokokowe wykazują bardziej efektywne rozprzestrzenianie się po zakażeniu IAV, wykazują bardziej widoczne objawy zapalenia płuc i skutkują przyspieszonym tempem choroby w porównaniu ze szczepami nieinwazyjnymi. W związku z tym ten model koinfekcji S. pneumoniae/IAV pozwala na szczegółowe badanie zarówno czynników patogenu, jak i gospodarza i dobrze nadaje się do badania odpowiedzi immunologicznych na infekcje wielodrobnoustrojowe w różnych fazach progresji choroby.

Protokół

Wszystkie badania na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z zaleceniami zawartymi w Przewodniku dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych. Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez University at Buffalo Institutional Animal Care and Use Committee.

1. Przygotowanie chemicznie zdefiniowanych mediów (CDM)

  1. Przygotuj buliony w następujący sposób:
    1. Rozpuścić mieszaninę związków I wymienionych w tabeli 1 w 100 ml ultraczystej wody, mieszając. Przechowywać w 200 μl podwielokrotności w temperaturze -20 °C.
    2. Rozpuścić mieszaninę związków II wymienionych w tabeli 1 w 20 ml 0,1 M NaOH, mieszając. Przechowywać w 100 μl podwielokrotnościach w temperaturze -20 °C.
    3. Rozpuścić mieszaninę związków III wymienionych w tabeli 1 w 1 ml ultraczystej wody, mieszając. Przechowywać w 10 μl porcji w temperaturze 4 °C.
    4. Rozpuścić mieszaninę związków dożylnych wymienionych w tabeli 1 w 1 ml ultraczystej wody, mieszając. Przechowywać w 10 μl podwielokrotnościach w temperaturze -20 °C.
    5. Związki wymienione w tabeli 2 rozpuścić początkowo w 15 ml ultraczystej wody, mieszając. Dostosuj pH do 7,0 za pomocą kilku kropli 0,1 M NaOH i dostosuj końcową objętość do 20 ml za pomocą ultraczystej wody. Przechowywać w 1 ml porcji w temperaturze -20 °C.
    6. Rozpuścić związki wymienione w tabeli 3 w 90 ml ultraczystej wody na gorącej płycie w temperaturze 50 °C, mieszając. Dostosuj pH do 7,0 za pomocą 0,1 M NaOH, a następnie dostosuj końcową objętość do 100 ml za pomocą ultraczystej wody. Przechowywać w 5 ml porcji w temperaturze -20 °C.
  2. Za każdym razem przygotuj wywar startowy na świeżo, rozpuszczając związki z tabeli 4 w 70 ml ultraczystej wody, mieszając.
  3. Do świeżego bulionu startowego dodać kolejno następujące mieszanki mieszanek: 200 μl bulionu Mix I (tabela 1), 80 μl bulionu Mix II (tabela 1), 10 μl bulionu Mix III (tabela 1), 10 μl bulionu Mix IV (tabela 2), 1 ml bulionu witaminowego (tabela 3) i 5 ml bulionu aminokwasowego (tabela 4).
  4. Po dodaniu bulionów dostosuj końcową objętość do 100 ml, dodając do zlewki 30 ml ultraczystej wody.
  5. Uzupełnić CDM związkami z tabeli 4. Po dokładnym wymieszaniu przefiltrować-wysterylizować i przechowywać w temperaturze 4 °C przez maksymalnie 2 tygodnie.

2. Hodowla biofilmu S. pneumoniae

  1. Przygotować pożywkę RP-10, mieszając 445 ml RPMI 1640 z 50 ml inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 5 ml penicyliny/streptomycyny w stężeniach odpowiednio 10 000 U/ml i 10 000 μg/ml.
  2. Hoduj linię komórkową raka śluzówkowo-naskórkowego NCI-H292 (H292). Dodać komórki z jednej zakupionej fiolki do 5 ml pożywki RP-10 w kolbie poddanej kulturze tkankowej T-25. Inkubować w temperaturze 37 °C/5% CO2 przez 3-5 dni, aby osiągnąć 100% konfluencji.
  3. Sprawdź komórki pod mikroskopem świetlnym przy użyciu 10-krotnego powiększenia, aby ocenić zbieg.
    UWAGA: Gdy wszystkie komórki stykają się z innymi komórkami i nie ma między nimi przerw, osiągana jest pożądana 100% zbieżność.
  4. Umyj komórki 2x w 5 ml PBS o temperaturze pokojowej. Upewnij się, że bufor jest wolny od wapnia, aby uniknąć chelatacji EDTA w następnym kroku.
  5. Dodać 1 ml trypsyny-EDTA do kolby i inkubować w temperaturze 37 °C/5% CO2 przez 5-10 minut, aż komórki się oderwą. Zneutralizować 4 ml pożywki RP-10. Delikatnie wymieszać, pipetując w górę i w dół, a następnie przenieść do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
  6. Dodać 500 μl zawiesiny komórkowej na basenik do 24-dołkowej płytki poddanej działaniu kultur tkankowych. Z konfluentującej się kolby T-25 spodziewaj się 2 × 106-4 × 106 komórek/ml.
  7. Następnego dnia sprawdź komórki pod mikroskopem świetlnym, aby upewnić się, że zlewają się, jak w kroku 2.3. Jeśli tak nie jest, wysiaduj dłużej.
  8. Gdy komórki H292 w 100% zlewają się z 24-dołkową płytką, delikatnie umyj komórki 3x 1 ml PBS o temperaturze pokojowej, aby upewnić się, że nie pozostało żadne podłoże zawierające antybiotyki lub zanieczyszczenia.
  9. Po umyciu komórek dodaj 250 μl/studzienkę 4% paraformaldehydu, aby utrwalić komórki. Inkubować przez 1 godzinę na lodzie lub przez noc w temperaturze 4 °C.
  10. W noc poprzedzającą utrwalenie komórek należy umieścić interesujący szczep S. pneumoniae na płytkach z krwią i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C/5% CO2,
    UWAGA: Przedstawione tutaj dane dotyczą następujących szczepów S. pneumoniae uzyskanych w wyniku wspólnej wymiany: izolat zapalenia ucha środkowego serotyp 19F EF303024, klasyczny szczep Avery serotypu 2 D3925 i izolat bakteriemii serotypu 4 TIGR426. Szczepy są również dostępne w kolekcjach publicznych, do których odwołuje się Tabela Materiałów.
  11. Przygotować CDM plus oksyrazę (0,15 U/ml), dodając 100 μl oksyrazy (30 U/ml) do 20 ml CDM.
    UWAGA: Oksyraza jest używana do eliminacji tlenu, aby umożliwić efektywny wzrost S. pneumoniae w płynnej kulturze27.
  12. Zaszczepić bakterie z płytki do świeżej CDM + oksyrazy, zmywając bakterie z płytki, dodając 1 ml CDM + oksyrazy i delikatnie podnosząc kolonie bakteryjne za pomocą boku końcówki pipety o pojemności 1 ml, uważając, aby nie zeskrobać agaru. Alternatywnie, użyj pętli zaszczepiającej, aby podnieść bakterie i zaszczepić je w probówce zawierającej 1 ml CDM + oksyrazy.
  13. Rozcieńczyć bakterie w CDM + oksyrazie do początkowego OD600 0,05.
  14. Hoduj bakterie w luźno zamkniętej stożkowej probówce o pojemności 50 ml stojącej w temperaturze 37 °C/5% CO2 , aż do osiągnięcia OD600 0,2 (zajmie to od 2 do 5 godzin). Sprawdzaj OD600 co godzinę, aby upewnić się, że OD nie przekracza 0.2.
  15. Gdy OD osiągnie 0,2, przekręć wirowo probówkę do hodowli bakterii. Wysiewaj 0,5 ml bakterii na utrwalone komórki H292 i dodaj kolejne 0,5 ml pożywki CDM + oksyrazy na studzienkę. Dodaj 1 ml CDM + oksyrazy do studzienek kontrolnych bez bakterii. Inkubować płytkę przez 48 godzin w temperaturze 34 °C/5% CO2,
    UWAGA: Wzrost w temperaturze 34 °C służy do dokładniejszego naśladowania niższej temperatury w nosogardzieli21.
  16. Co 12 godzin po pierwszym wysiewie delikatnie usunąć 0,5 ml pożywki i uzupełnić 0,5 ml świeżej CDM + oksyrazy. Uważaj, aby nie zakłócić tworzącego się biofilmu. Sprawdzić, czy na dnie płytki nie ma biofilmu i poszukać narastającego zmętnienia w miarę upływu czasu z powodu wzrostu biofilmu. Aby kontrolować zanieczyszczenie, sprawdź studzienki bez bakterii, aby upewnić się, że studzienki kontrolne pozostają czyste.
  17. Po 48 godzinach od inokulacji usunąć supernatant i przemyć 2x bardzo delikatnie 1 ml PBS. Zawiesić ponownie w 1 ml świeżego CDM i energicznie pipetować w górę i w dół, aby podnieść biofilm. Dla każdego szczepu bakteryjnego zbierz bakterie ze wszystkich studzienek w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Dobrze wymieszaj, delikatnie przechylając kilkakrotnie szczelnie zakręconą rurkę w górę iw dół.
  18. Do stożkowej probówki o pojemności 50 ml dodać 40% glicerolu w CDM w równych objętościach, aby uzyskać zawiesinę bakteryjną o końcowym stężeniu 20% glicerolu. Podaniec 1 ml do probówek do mikrowirówek, błyskawicznie zamrozić na suchym lodzie i zaoszczędzić w temperaturze -80 °C.
  19. Przed użyciem należy wyliczyć bakterie, rozmrażając jedną porcję na lodzie, obracając probówkę na 1,700 × g przez 5 minut, usuwając supernatant, ponownie zawieszając osad w 1 ml PBS i posiewając seryjne rozcieńczenia na płytkach z agarem do krwi28.
  20. Hodować płytki agarowe przez noc w temperaturze 37 °C/5% CO2 i policzyć kolonie w odpowiednich rozcieńczeniach, aby uzyskać stężenie bakterii w jednostkach tworzących kolonie (CFU)/ml.
    UWAGA: Zaleca się spisywanie bakterii w zapasach co najmniej dzień po zamrożeniu lub później, ponieważ w ciągu pierwszych 24 godzin następuje spadek żywotności bakterii. Przechowywane zamrożone porcje mogą być wykorzystywane do późniejszego zakażenia myszy przez maksymalnie 2 miesiące.

3. Donosowe inokulowanie myszy S. pneumoniae wyhodowanym w biofilmie

  1. Kup myszy i używaj ich w wybranym wieku.
    UWAGA: Myszy w wieku 3-4 miesięcy są preferowane do modelowania młodych gospodarzy, a myszy w wieku 21-24 miesięcy mogą być używane do modelowania osób starszych w wieku >65 lat29. Przedstawione tutaj dane dotyczą samców myszy C57BL/6.
  2. Rozmrozić wyhodowane w biofilmie porcje bakteryjne na lodzie i wirować w temperaturze 1 700 × g przez 5 minut. Ostrożnie usunąć i wyrzucić supernatant bez naruszania osadu, umyć bakterie przez ponowne zawieszenie osadu w 1 ml PBS i ponownie wirować w temperaturze 1 700 × g przez 5 minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w objętości potrzebnej do osiągnięcia pożądanego stężenia (dążyć do 5 × 106 CFU/10 μL do inokulacji donosowej). Potwierdzić ilość podanych bakterii poprzez posiew przygotowanego inokulum na płytkach z agarem z krwią, jak w kroku 2.19.
  3. Zaszczepić myszy donosowo 5 × 106 CFU, pipetując 5 μl rozcieńczonego inokulum do każdego naris. Upewnij się, że trzymasz myszy mocno, stabilizując głowę, aż objętość zostanie wdychana (zwykle w ciągu kilku sekund od pipetowania objętości do nozdrzy). Wykonaj ten krok przy braku znieczulenia, aby zapobiec aspiracji płucnej inokulum.

4. Zakażenie wirusem grypy A (IAV)

  1. Po 48 godzinach od donosowego inokulacji S. pneumoniae należy rozmrozić na lodzie interesujący szczep IAV.
    UWAGA: Przedstawione tutaj dane dotyczą przystosowanego do myszy szczepu wirusa grypy A A/PR/8/34 H1N1, który został uzyskany w wyniku wspólnej wymiany30.
  2. Po rozmrożeniu wirusa należy rozcieńczyć go w PBS do pożądanego stężenia; należy dążyć do uzyskania 20 jednostek tworzących płytkę miażdżycową (PFU)/50 μl w przypadku zakażenia dotchawiczego i 200 PFU/10 μl w przypadku infekcji donosowej. W przypadku grup pozorowanych i zawierających tylko bakterie, użyj PBS do zaszczepienia myszy.
  3. Umieść lubrykant okulistyczny na oczach myszy przed znieczuleniem. Znieczulij myszy za pomocą 5% izofluranu i potwierdź znieczulenie mocnym uszczypnięciem palca u nogi.
  4. Po znieczuleniu zwierzęcia należy je wyjąć z komory izofluranu i natychmiast zainfekować znieczulone myszy 50 μl (20 PFU) IAV dotchachawiczo za pomocą pęsety w celu wyciągnięcia języka z ust i pipetowania objętości płynu w dół tchawicy.
  5. Umieść myszy w osobnej klatce i monitoruj aż do całkowitego wyzdrowienia (są w stanie utrzymać leżącą mostek [są w stanie położyć się pionowo na klatce piersiowej]).
  6. Po wyzdrowieniu należy natychmiast dodonosowo zaszczepić myszy 10 μl (200 PFU) IAV przy użyciu metody inokulacji opisanej w kroku 3.3.
  7. Myszy domowe, które przeszły pojedynczą lub podwójną infekcję bakteryjną i wirusową z tą samą grupą infekcji i oddzielają je od innych grup.

5. Monitorowanie myszy pod kątem objawów choroby

  1. Monitoruj myszy codziennie przez co najmniej 10 dni i ślepo oceniaj objawy choroby w następujący sposób:
    1. Wynik dla utraty wagi jest następujący: 0 = 5% lub mniej; 1 = 5%-10%; 2 = 10%-15%; 3 = 20% lub więcej. Poddaj myszy eutanazji za pomocą inhalacji CO2 , gdy wynik utraty wagi wynosi 3.
    2. Wynik aktywności jest następujący: 0 = normalny/aktywny; 1 = poruszający się, ale nieznacznie zmniejszony; 2 = zmniejszony; 3 = poważnie zmniejszony/ospały (porusza się tylko po dotknięciu), 4 = śpiączka/nieruchomy. Poddaj myszy eutanazji, gdy wynik aktywności wynosi 3.
    3. Wynik postawy jest następujący: 0 = brak przeczucia (normalna); 1 = lekko zgarbiona postawa; 2 = poważne przegarbienie. Poddaj myszy eutanazji, gdy wynik postawy wynosi 2.
    4. Wynik dla oczu jest następujący: 0 = normalne; 1 = wyłupiaste; 1 = zapadnięte; 1 = zamknięte; 1 = wydzielina. Może to być kombinacja. Dodaj sumy, aby uzyskać końcowy wynik oka.
    5. Wynik oddechu jest następujący: 0 = normalny oddech; 1 = nieregularny lub zmieniony (wyższy/niższy wskaźnik); 2 = ciężki (nadmierny wysiłek lub sapanie). Poddaj myszy eutanazji, gdy wynik oddechu wynosi 2.
  2. Opierając się na powyższych kryteriach, dodaj indywidualne wyniki, aby uzyskać łączny wynik kliniczny od zdrowego (0) do skrajnie chorego (15). Uznaj, że każda mysz wyświetlająca łączny wynik powyżej 2 jest chora. Humanitarną eutanazję należy przeprowadzić u myszy wykazujących łączny wynik powyżej 9 lub wyniki wskazane dla każdego kryterium i oznaczyć je na krzywej przeżycia.

6. Przetwarzanie zakażonych tkanek do oznaczania liczby bakterii

  1. Po 48 godzinach od zakażenia IAV myszy należy poddać eutanazji.
  2. Umieść mysz w pozycji leżącej. Używając 70% etanolu, spryskaj klatkę piersiową i brzuch myszy, aby oczyścić futro. Za pomocą kleszczy uszczypnij futro i skórę w środku myszy i przytnij futro nożyczkami do preparowania 4,5 raza, aby odsłonić obszar od wątroby do klatki piersiowej.
  3. Pobieranie krwi
    1. Za pomocą nożyczek preparacyjnych delikatnie wciąć jamę otrzewnej, aby odsłonić wątrobę. Za pomocą kleszczy odsłoń żyłę wrotną wątroby w górnej części wątroby w pobliżu przepony. Przeciąć żyłę wrotną wątroby za pomocą nożyczek do rozwarstwiania. Gdy krew zacznie gromadzić się w jamie otrzewnej, należy pobrać 10 μl krwi za pomocą mikropipety i umieścić w 90 μl roztworu antykoagulantu (50 mM roztworu EDTA w PBS) w probówce mikrowirówkowej w celu posiewu pod kątem obciążenia bakteryjnego.
    2. Użyj mikropipety P-1000, aby zebrać resztę krwi, umieść ją w probówce do pobierania krwi i odwiruj przy 7 600 × g przez 2 minuty, aby zebrać surowicę. Przechowywać surowice w probówkach do mikrowirówek w temperaturze -80 °C w celu późniejszej analizy dowolnej pożądanej cytokiny lub metabolitu.
  4. Pobieranie płuc
    1. Za pomocą nożyczek preparacyjnych wykonaj cięcie boków odsłoniętej klatki piersiowej i delikatnie pociągnij żebra w kierunku głowy myszy, aby odsłonić serce. Włóż igłę 25 G dołączoną do strzykawki o pojemności 10 ml wypełnionej PBS do prawej komory i rozpocznij powolne perfuzję. Szukaj wybielania płuc jako wskaźnika udanej perfuzji. Spłukiwać powoli, aby uniknąć uszkodzenia tkanki płucnej.
    2. Podnieś serce kleszczami i wykonaj nacięcie, aby oddzielić płuca i serce. Po oddzieleniu podnieś wszystkie płaty płuc za pomocą kleszczy i spłucz w naczyniu sterylnym PBS, aby usunąć resztki krwi. Na szalce Petriego zmiel płuca na małe kawałki i dobrze wymieszaj. Usunąć połowę mieszanki płucnej w celu oznaczenia bakteryjnej CFU lub wirusowej PFU i umieścić ją w okrągłej probówce o pojemności 15 ml wypełnionej 0,5 ml PBS w celu homogenizacji.
      UWAGA: Ważne jest, aby nie brać różnych płatów tego samego płuca do różnych ocen. Zamiast tego wszystkie płaty powinny być zmielone, dobrze wymieszane ze sobą i równomiernie przeanalizowane dla różnych ocen.
    3. Usunąć drugą połowę płuca do cytometrii przepływowej (sekcja 7 poniżej) i umieścić ją na 24-dołkowej płytce niepoddanej hodowli tkankowej, z każdą studzienką wstępnie wypełnioną 0,5 ml RP-10. Pozostaw w temperaturze pokojowej do czasu przetworzenia.
  5. Kolekcja Nosogardziel
    1. Na szyi użyj nożyczek preparacyjnych, aby odciąć futro, a następnie odetnij mięsień i odsłoń tchawicę.
      UWAGA: Tchawica jest strukturą przypominającą rurkę znajdującą się pod mięśniem.
    2. Umieść małe kleszcze pod tchawicą w odległości 1 cm od szczęki myszy, aby ją ustabilizować. Za pomocą nożyczek preparacyjnych delikatnie wykonaj 0,1 cm nacięcie na przedniej części tchawicy, unikając całkowitego przecięcia tchawicy.
    3. Przygotować strzykawkę o pojemności 1 ml wypełnioną 0,5 ml PBS z rurką 0,58 mm przymocowaną do igły 25 G. Zbierz płyn do płukania nosa, wkładając rurkę do tchawicy idącą w górę w kierunku nosogardzieli. Gdy wyczujesz opór wchodzący do jamy nosowej, umieść probówkę mikrowirówki przy nosie i powoli przepłucz PBS przez tchawicę, aby zebrać płukanie nosa.
    4. Umieść mysz w pozycji leżącej. Spryskaj głowę myszy etanolem. Użyj nożyczek preparacyjnych, aby przeciąć futro i podkładki mystacialnej, aby odsłonić kość głowy myszy.
    5. Za pomocą nożyczek preparacyjnych wykonaj 1 cm cięcie po bokach żuchwy i między oczami. Za pomocą kleszczy powoli odciągnij kości twarzy od ciała, aby odsłonić jamę nosową.
    6. Za pomocą kleszczy delikatnie usuń tkankę nosa i umieść ją w probówce o okrągłym dnie wypełnionej 0,5 ml PBS w celu homogenizacji.
  6. Aby homogenizować pobraną tkankę, najpierw wyczyść sondę homogenizatora, umieszczając ją w 70% etanolu i włączając homogenizator z 60% mocą na 30 sekund. Powtórz ten krok w sterylnej wodzie przez 10 sekund. Homogenizuj każdą tkankę przez 1 minutę. Wyczyść sondę homogenizatora w sterylnej wodzie między każdą próbką oraz w świeżej probówce z 70% etanolem między każdym narządem i grupą próbek.
  7. Oznaczanie liczebności bakterii
    1. Po pobraniu i homogenizacji wszystkich narządów, należy je stopniowo rozcieńczyć na płytkach z agarem do krwi. Aby obliczyć całkowitą jtk, użyj 10 μl do płytki i zanotuj końcową objętość w ml dla każdej próbki. Umieść próbki nosogardzieli na płytkach z agarem z krwią uzupełnionych 3 μg / ml gentamycyny, aby wybrać wzrost S. pneumoniae, jednocześnie hamując wzrost innych mikroorganizmów, które kolonizują tę tkankę. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C/5% CO2 .
    2. Aby wyliczyć bakteryjną CFU dla płuc i nosogardzieli, najpierw policz kolonie na płytkach z krwią. Następnie użyj równania (1) i równania (2), aby obliczyć ilość na ml i liczbę całkowitą.
      Ilość na ml = liczba kolonii × współczynnik rozcieńczenia × 100 (1)
      Całkowita liczba = ilość na ml × całkowita objętość próbki (2)
      UWAGA: W równaniu (1) do mnożenia używa się 100, ponieważ plateruje się 10 μl, co odpowiada 100-krotnemu rozcieńczeniu 1 ml. Całkowita objętość próbki w równaniu (2) pochodzi z kroku 6.7.1, co daje granicę wykrywalności wynoszącą 100 na narząd.
    3. Aby wyliczyć bakteryjną CFU W przypadku bakteriemii najpierw policz kolonie na płytkach z krwią. Następnie użyj równania (3), aby określić ilość na ml krwi.
      Ilość na ml krwi = liczba kolonii × współczynnik rozcieńczenia × 100 × 10 (3)
      UWAGA: W równaniu (3) 100 jest używane jako 10 μl jest platerowane, co jest 100-krotnym rozcieńczeniem 1 ml, a 10 oznacza rozcieńczenie krwi w antykoagulancie 1:10. Daje to granicę wykrywalności wynoszącą 1,000/ml.

7. Przetwarzanie próbek płuc do cytometrii przepływowej

  1. Przygotuj wymagane nośniki w następujący sposób:
    1. Przygotuj RP-10 zgodnie z opisem w kroku 2.1.
    2. Przygotować bufor wytrawiający przez zmieszanie RP-10 z 2 mg/ml kolagenazy i 30 μl/ml DNazy I.
    3. Przygotować bufor do lizy, rozpuszczając 8,29 g NH4Cl, 1 gNaHCO3 i 0,038 g EDTA w 1 lH2O.
    4. Przygotować 10 razy bufor FACS, mieszając 450 ml HBSS z 50 ml inaktywowanego termicznie FBS i 5 g azydku sodu.
    5. Przygotować 1x bufor FACS, rozcieńczając 50 ml 10x buforu FACS w 450 ml HBSS.
  2. Pobrać próbki płuc z kroku 6.4.3 i umieścić je na płytce 24-dołkowej. Do każdej studzienki dodać 500 μl buforu wytrawiającego. Inkubować przez 45 minut do 1 godziny w temperaturze 37 °C/5% CO2 .
  3. Napełnij stożkowe probówki o pojemności 50 ml dla każdej próbki 5 ml RP-10. Po zakończeniu inkubacji umieść filtr 100 μm na górze stożkowej probówki o pojemności 50 ml i zwilż go 1 ml RP-10.
  4. Za pomocą mikropipety P-1000 przesuń strawione płuca i umieść je na filtrze. Za pomocą tłoka strzykawki o pojemności 3 ml rozgnieć narząd. Za każdym razem spłucz 2x 1 ml RP-10.
  5. Wirować próbki w temperaturze 4 °C i o masie 327 × g przez 5 minut. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml buforu do lizy. Pozostaw na 3 minuty, aby umożliwić lizę czerwonych krwinek. Zneutralizować 5 ml RP-10.
  6. Wirować próbki w temperaturze 4 °C i o masie 327 × g przez 5 minut. Odessać supernatant, ponownie zawiesić osad w 1 ml RP-10 i pobrać 10 μl do policzenia próbek.
  7. Wirować próbki w temperaturze 4 °C i 327 × g przez 5 minut. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w RP-10 w stężeniach 2 × 106-4 × 106 komórek/ml. Dodaj 60 μl każdej próbki do 96-dołkowej płytki w celu wybarwienia dla żądanych typów komórek23 wymienionych w kroku 7.9, Tabela 5 i Tabela 6.
  8. Obracać płytkę w temperaturze 4 °C i o masie 327 × g przez 5 minut.
  9. W międzyczasie przygotuj główne mieszanki przeciwciał, fluorescencyjne minus jeden (FMO) i kontrole pojedynczego barwienia z pożądanymi przeciwciałami. Do barwienia leukocytów wielojądrzastych (PMN), makrofagów, monocytów, komórek dendrytycznych i limfocytów T należy użyć przeciwciał i końcowych rozcieńczeń wymienionych w Tabeli 5 i Tabeli 6. Użyć całkowitej objętości 100 μl/basenik mieszaniny przeciwciał. Postępować zgodnie z rozcieńczeniami podanymi w tabelach w celu określenia odpowiedniej objętości mieszanki wzorcowej i wymaganych poszczególnych przeciwciał.
  10. Po zakończeniu wirowania (krok 7.8) zdekantować supernatant, ponownie zawiesić granulki w 100 μl mieszanin przeciwciał, FMO lub kontrolnych z pojedynczym barwieniem i inkubować na lodzie przez 30 minut w ciemności.
  11. Przemyć komórki 2x, dodając 150 μl buforu FACS do studzienek i obracając płytkę w temperaturze 4 °C i 327 × g przez 5 minut.
  12. Po zakończeniu wirowania zdekantować supernatant, ponownie zawiesić granulki w 100 μl buforu utrwalającego i inkubować na lodzie przez 20 minut.
  13. Przemyć komórki 2x, dodając 150 μl buforu FACS do studzienek i obracając płytkę w temperaturze 4 °C i 327 × g przez 5 minut.
  14. Przygotować oznakowane probówki FACS z 200 μl buforu FACS. Zawiesić granulki w 150 μl buforu FACS. Indywidualnie przefiltruj każdą próbkę do odpowiedniej probówki FACS za pomocą filtra 100 μm. Przechowywać na lodzie lub w temperaturze 4 °C i chronić przed światłem do czasu przygotowania do analizy.
  15. Przeanalizuj komórki za pomocą cytometru przepływowego.

8. Test płytki nazębnej do oznaczania IAV

  1. Przygotuj wymagane nośniki w następujący sposób:
    1. Przygotować pożywkę infekcyjną, rozpuszczając 2,5 g albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w 40 ml DMEM, mieszając w temperaturze 37 °C przez 10-20 minut, aż do rozpuszczenia. Filtrować-sterylizować do 460 ml DMEM.
    2. Przygotować 2,4% celulozy mikrokrystalicznej, rozpuszczając 1,2 mg celulozy mikrokrystalicznej w 50 mlH2O. Autoklaw w płynie i przechowywać w temperaturze pokojowej.
    3. Przygotuj 5% BSA DMEM, rozpuszczając 2,5 g BSA w 40 ml DMEM, mieszając w temperaturze 37°C przez 10-20 min. Dodaj pozostałe 10 ml DMEM, aby uzyskać końcową objętość 50 ml. Filtrować-sterylizować i przechowywać w temperaturze 4 °C.
    4. Przygotuj 2x MEM/0,5% BSA, mieszając 1 ml 5% BSA DMEM z 9 ml 2x MEM.
    5. Przygotować podłoże do nakładania o niskiej lepkości, mieszając 2,4% celulozy mikrokrystalicznej w stosunku 1:1 i 2x MEM/0,5% BSA z 1 mg/ml TPCK (inhibitor chymotrypsyny) trypsyną.
    6. Przygotuj EMEM/10% FBS, mieszając 450 ml Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) z 50 ml inaktywowanego termicznie FBS.
  2. Hoduj linię komórkową nerek psów Madin-Darby (MDCK). Dodać komórki z jednej zakupionej fiolki do 5 ml EMEM/10% FBS w kolbie poddanej hodowli tkankowej T-25. Inkubować przez 3-5 dni w temperaturze 37 °C/5% CO2 , aż komórki osiągną 100% zbieżności. Sprawdź konfluencję, jak w kroku 2.3.
  3. Usunąć i wyrzucić pożywkę hodowlaną i spłukać 2x 5 ml PBS o temperaturze pokojowej. Dodać 1 ml trypsyny-EDTA do kolby i inkubować w temperaturze 37 °C/ 5% CO2 przez 10-15 minut, aż komórki się oderwą. Po podniesieniu zneutralizować 4 ml EMEM/10% FBS, aby uzyskać zawiesinę komórek w ilości 2 × 105 komórek/ml.
  4. Wysiewaj komórki MDCK na 12-dołkowej płytce poddanej działaniu kultur tkankowych, dodając 1 ml zawieszonych komórek na basenik (przy 2 × 105 komórek/dołku) 1 dzień przed rozpoczęciem testu płytki miażdżycowej.
    UWAGA: Upewnij się, że komórki osiągną 100% zbieżności przed użyciem i inkubuj przez dłuższy czas, jeśli to konieczne, aby osiągnąć zbieżność.
  5. Do stosowania jako wzorce należy wykonać 10-krotne seryjne rozcieńczenia (106-10 1) materiału IAV (o znanym mianie) w pożywce infekcyjnej wymienionej w kroku 8.1.1. Dodać 1,2 ml z każdego rozcieńczenia do trzykrotnego sprawdzenia.
  6. Rozmrozić homogenaty narządów na lodzie. Odwirować na wirówce stołowej o masie 2 000 × g i zebrać klarowny supernatant.
  7. Powtórzyć krok 8.5, ale z supernatantem z próbek z kroku 8.6.
  8. Odessać pożywkę z komórek i przemyć 2x 1 ml PBS, aby usunąć cały FBS.
  9. Dodać delikatnie 300 μl każdej wzorcowej rozcieńczonej lub seryjnie rozcieńczonej próbki wzdłuż boku każdej studzienki, zaczynając od najwyższego rozcieńczenia do najniższego, i zrobić to trzykrotnie.
  10. Umieścić płytki w inkubatorze w temperaturze 37 °C/5% CO2 , potrząsając płytką co 10 minut, łącznie przez 50 minut. Upewnij się, że umieściłeś je płasko w inkubatorze i nie układaj ich w stosy.
  11. Po upływie 50 minut przemyj komórki 2x 1 ml PBS.
  12. Dodać 2 ml pożywki o niskiej lepkości do każdej studzienki, z wyjątkiem studzienek o najniższym rozcieńczeniu i dołków bez wirusów; do nich dodaj pożywkę infekcyjną i trypsynę.
  13. Umieść płytkę z powrotem w inkubatorze w temperaturze 37 °C/5% CO2 na 2-4 dni, aby uzyskać blaszki blaszkowe, które można uwidocznić gołym okiem.
  14. Umyj płytki, dodając 2 ml PBS do każdej studzienki szybko z boku i delikatnie wstrząsnąć, aby zawiesić osiadłe podłoże nakładkowe o niskiej lepkości.
  15. Wylej całą objętość płynu do studzienki, delikatnie odpipetowując pożywkę.
  16. Powtórzyć płukanie jeszcze raz z 2 ml PBS w każdym dołku, a następnie wyrzucić całą objętość płynu przez delikatne pipetowanie.
  17. Aby utrwalić blaszki miażdżycowe, dodaj 500 μl 4% paraformaldehydu do każdej studzienki, wstrząśnij i odstaw na 30 minut.
  18. Powoli przemyj bok 1 ml PBS, a następnie delikatnie wylej płyn.
  19. Dodaj 500 μl 1% fioletu krystalicznego (rozcieńczonego w wodzie) do każdej studzienki, aby pokryć monowarstwę komórki. Inkubować przez 5 minut.
  20. Umyć 1 ml wody z kranu. Upewnij się, że wylałeś cały płyn z dołka, delikatnie pipetując. Połóż talerz do góry nogami na podkładce do pieluchy do wyschnięcia przez noc.
  21. Policz tabliczki wizualnie i zapisz obrazy na dowolnym dostępnym imagerze.

Wyniki

Do zakażania myszy (Rysunek 1B>) wykorzystano S. pneumoniae wyhodowane w formie biofilmu (Rysunek 1A>, podając do jam nosowych nieznieczulonych myszy niewielki inokulum o objętości 10 µL. Tak mała objętość inokulum zapewnia spójne niesienie pneumokoków ograniczone do nosogardzieli (Rysunek 2A, grupy +sp), zapobiegając jednocześnie rozsiewowi systemowemu (Rysunek 2B,C, grupy +sp). Dwa dni po inokulacji donosowej myszy zakażono wirusem grypy A H1N1 szczepu A/PR/8/34 (IAV) adaptowanym do myszy22,30, podając go zarówno donosowo, jak i wewnątrztachealnie, aby zapewnić dostarczenie określonych ilości wirusa do nosogardzieli oraz płuc23.

W niniejszym badaniu model ten wykorzystano do porównania przebiegu choroby po infekcji wirusowej u myszy poddanych donosowej ekspozycji na różne szczepy S. pneumoniae, w tym TIGR4 i D39, które są szczepami inwazyjnymi wywołującymi zapalenie płuc postępujące do bakteremii, oraz EF3030, który jest szczepem wywołującym zapalenie ucha środkowego21,24,25,26,31. Obraz kliniczny choroby u myszy z koinfekcją S. pneumoniae/IAV był zależny od szczepu bakterii (Rycina 2). Podczas gdy nie stwierdzono istotnych różnic w liczbie bakterii w nosogardzieli (Rycina 2A) pomiędzy poszczególnymi szczepami, S. pneumoniae TIGR4 i D39, ale nie EF3030, rozprzestrzeniły się do płuc do 48 h po infekcji IAV (Rycina 2B). U czterdziestu procent myszy zainfekowanych donosowo S. pneumoniae TIGR4 wystąpiła dysseminacja bakterii do płuc, a z tej grupy połowa rozwinęła bakteremię (Rycina 2C), co jest zgodne z wcześniejszymi doniesieniami23.

Myszy zakażone donosowo S. pneumoniae D39 wykazały bardziej efektywną dysseminację, ponieważ rozprzestrzenianie się bakterii do płuc zaobserwowano u 100% myszy z koinfekcją (Rycina 2B). Podobnie jak w przypadku S. pneumoniae TIGR4, połowa z nich rozwinęła bakteremię (Rycina 2C). W analizie ogólnej przeżywalności, niezależnie od szczepu bakteryjnego, wskaźnik przeżywalności myszy z koinfekcją był znacznie niższy niż u myszy zakażonych pojedynczo samym S. pneumoniae dla wszystkich badanych szczepów (Rycina 2D). W porównaniu z myszami kontrolnymi zakażonymi wyłącznie IAV, myszy zakażone donosowo S. pneumoniae TIGR4 i D39, ale nie EF3030, wykazały przyspieszoną progresję choroby. Do 2. dnia po infekcji IAV śmierć poniosło 30% (D39) i 20% (TIGR4) myszy, podczas gdy w grupach kontrolnych z samym IAV upadki zaczęły występować dopiero w 5. dniu po zakażeniu (Rycina 2D). Myszy z koinfekcją S. pneumoniae EF3030 i IAV wykazały opóźnione objawy, bardziej zbliżone do kontroli z samym IAV (Rycina 2D). Wyniki te pokazują, że model koinfekcji prowadzi u młodych, zdrowych myszy do choroby zależnej od szczepu bakteryjnego, co czyni go idealnym do badania czynników bakteryjnych wymaganych na każdym etapie progresji choroby.

Model ten został wykorzystany do oceny obecności różnych komórek odpornościowych w płucach (typy komórek i strategia bramkowania na Rysunku 3) po zakażeniu IAV u myszy inokulowanych donosowo różnymi szczepami S. pneumoniae. Szczepy bakteryjne D39 i TIGR4, które rozprzestrzeniły się do płuc po zakażeniu IAV, wywołały istotny wzrost powyżej poziomu bazowego (niezakażone) napływu zapalnych komórek odpornościowych z krwiobiegu, takich jak neutrofile (PMN) i monocyty, podczas gdy EF3030 tego nie zrobił (Rysunek 4A-C). Sama infekcja IAV wywołała istotny wzrost powyżej poziomu bazowego napływu komórek odpornościowych ważnych dla obrony gospodarza przed zakażeniem wirusowym, takich jak komórki NK i komórki T gamma-delta (Rysunek 4A-C). Odpowiedzi przeciwwirusowe te były znacznie osłabione u myszy zakażonych donosowo S. pneumoniae przed wyzwaniem wirusowym (Rysunek 4A-C). Jest to zgodne z wcześniejszymi badaniami oceniającymi odpowiedź cytokinową, które wykazały, że obecność S. pneumoniae osłabiała produkcję interferonów typu I i upośledzała zdolność gospodarza do kontrolowania miana IAV w płucach23. Wyniki te pokazują, że model koinfekcji może być wykorzystany do badania zmian w odpowiedziach odpornościowych w przypadku infekcji monomikrobowych w porównaniu do polimikrobowych.

Model ten został wykorzystany również do oceny wpływu starzenia się na przebieg choroby po zakażeniu IAV u myszy zakażonych donosowo S. pneumoniae TIGR4. U myszy zakażonych pojedynczo miana wirusa nie różniły się między kohortami młodych i starych osobników (Rysunek 5A)23. Podobnie jak w poprzednich badaniach23, u starych myszy zaobserwowano wcześniejsze i znacznie cięższe objawy choroby w porównaniu z młodymi osobnikami, co wykazały wyższe wyniki kliniczne (Rysunek 5B). Zgodnie z objawami choroby, myszy stare inokulowane S. pneumoniae zaczęły szybciej ginąć w ciągu 24 h po zakażeniu IAV i wszystkie z nich uległy chorobie, podczas gdy młode zwierzęta kontrolne przeżyły zakażenie ze znacznie wyższym odsetkiem (33%) (Rysunek 5C). Wyniki te dowodzą, że model koinfekcji może być wykorzystany do wykrywania cięższego przebiegu choroby u podatnych gospodarzy, co czyni go idealnym do badania czynników gospodarza, które warunkują oporność lub podatność na koinfekcję.

Protokół zakażania zwierząt: schemat kolonizacji S. pneumoniae, zakażenia IAV, cytometrii przepływowej.
Rysunek 1: Oś czasu koinfekcji i obróbki organów w celu oceny napływu komórek odpornościowych i obciążenia patogenami. (A) Streptococcus pneumoniae są hodowane w biofilmach. (B) Myszy są inokulowane donosowo 5 × 106 CFU wskazanego szczepu S. pneumoniae hodowanego w biofilmie w celu ustanowienia nosicielstwa nosowo-gardłowego lub pozostają nieleczone. Czterdzieści osiem godzin później myszy otrzymują pozorowane leczenie PBS lub 200 PFU wirusa grypy A PR8 donosowo oraz 20 PFU wewnątrztchawicznie. Stan myszy jest monitorowany pod kątem punktacji klinicznej choroby i przeżywalności. (C) W 48 h po zakażeniu IAV oceniane są bakteryjne CFU lub wirusowe PFU w różnych organach lub napływ komórek odpornościowych do płuc. Skróty: CFU = jednostki tworzące kolonie; PFU = jednostki tworzące plaki; IAV = wirus grypy A PR8; IT = wewnątrztchawicznie; NP = nosowo-gardłowo. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Wykresy słupkowe CFU dla nosogardzieli, płuc i bakteriemii; krzywa przeżywalności dla analizy infekcji bakteryjnej.
Rysunek 2: Podwójna infekcja IAV drogą donosową/dotrachealną u myszy inokulowanych S. pneumoniae prowadzi do rozprzestrzeniania się bakterii i choroby zależnej od szczepu bakteryjnego. Młode (10-12 tygodni) samce myszy C57BL/6 (B6) zainfekowano zgodnie z opisem na Rysunku 1. Liczbę bakterii w (A) nosogardzieli, (B) płucach i (C) krwi określono 48 h po infekcji IAV. (B,C) Procenty oznaczają frakcję myszy, u których stwierdzono rozprzestrzenienie bakterii. (D) Przeżywalność monitorowano przez 10 dni po infekcji IAV. Przedstawiono zbiorcze dane dla (A,B) n = 5, (C) n = 11 i (D) n = 6 myszy na grupę. Każde koło odpowiada jednej myszy, a linie przerywane wskazują granicę wykrywalności. (A-C) *, oznacza istotną różnicę (p < 0.05) między wskazanymi grupami, wyznaczoną testem Kruskala-Wallisa. (D) *, oznacza istotną różnicę (p < 0.05) między myszami +sp a Co-inf dla każdego szczepu bakteryjnego, wyznaczoną testem log-rank (Mantela-Coxa). Skróty: +sp = myszy zainfekowane donosowo tylko bakteriami wskazanego szczepu; Co-inf = myszy zainfekowane bakteriami, które zostały również zainfekowane IAV; IAV = myszy, które otrzymały wirusa grypy A; CFU = jednostki tworzące kolonie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat cytometrii przepływowej analizy komórek odpornościowych; wykresy kropkowe przedstawiają markery CD i typy komórek.
Rycina 3: Strategia bramkowania komórek odpornościowych. Pobrano płuca i określono napływ komórek odpornościowych za pomocą cytometrii przepływowej. Przedstawiono reprezentatywną strategię bramkowania różnych typów komórek. (A) Wyselekcjonowano żywe pojedyncze komórki CD45+, a następnie określono procenty (B) PMN (Ly6G+, CD11b+), makrofagów (Ly6G-, Ly6C-, F480+) i monocytów (Ly6G-, Ly6C+), (C) komórek DC (Ly6G-, CD11c+) i komórek NK (NK1.1+, CD3-), (D) limfocytów T TCR- γΔ oraz limfocytów T CD8 (CD8+, TCRβ+) i CD4 (CD4+, TCRβ+). Skróty: SSC-A = pole powierzchni piku rozpraszania bocznego; FSC-A = pole powierzchni piku rozpraszania przedniego; FSC-H = wysokość piku rozpraszania przedniego; SSC-W = szerokość piku rozpraszania bocznego; L/D = żywe/martwe; FMO = fluorescent minus one; NK = natural killer; PMN = leukocyt polimorfojądrowy; DC = komórka dendrytyczna; TCR = receptor limfocytów T. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza komórek metodą cytometrii przepływowej; obejmuje mapę ciepła, wykresy kropkowe i wykresy słupkowe dla podgrup komórek odpornościowych.
Rysunek 4: Odpowiedzi odpornościowe w płucach zależą od szczepu bakteryjnego. Młode (10-12 tygodnie życia) samce myszy C57BL/6 były niezinfekowane, inokulowane pojedynczo wskazanym szczepem Streptococcus pneumoniae (+sp), zakażone pojedynczo IAV (IAV) lub coinfekowane S. pneumoniae i IAV (Co-inf). Czterdzieści osiem godzin po infekcji IAV (patrz projekt eksperymentalny na Rysunku 1) pobrano płuca, a napływ komórek odpornościowych określono metodą cytometrii przepływowej zgodnie ze strategią bramkowania przedstawioną na Rysunku 3. (A) Na mapie ciepła przedstawiono średnie wartości procentowe każdego wskazanego typu komórek w bramce CD45 dla wszystkich grup traktowanych. (B) Dla każdej grupy myszy przedstawiono reprezentatywne wykresy kropkowe typów komórek, które wykazały istotne różnice między grupami. (C) Przedstawiono wartości procentowe wskazanych typów komórek odpornościowych. Każde koło odpowiada jednej myszy. (A,C) Przedstawiono połączone dane z n = 5 myszy na grupę. *, oznacza istotną różnicę (p < 0.05) między grupą Co-inf a niezinfekowaną; $, oznacza istotną różnicę między grupą IAV a niezinfekowaną; #, oznacza istotną różnicę między grupą Co-inf a grupą z samym IAV. Istotne różnice między grupami zakażonymi dla każdego typu komórek określono za pomocą testu ANOVA, a następnie testu Tukeya. Skróty: NK = komórki natural killer; PMN = leukocyty polimorfonuклеarne; DC = komórki dendrytyczne; TCR = receptor komórki T; IAV = wirus grypy A. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Wykresy infekcji płuc; miano wirusa, oceny objawów, wskaźniki przeżywalności u osobników młodych i starych.
Rycina 5: Starzenie się a zwiększona podatność gospodarza na koinfekcję IAV/Streptococcus pneumoniae. Młode (10-12 tygodni) i stare (21-22 miesiące) samce myszy C57BL/6 zostały poddane koinfekcji S. pneumoniae TIGR4 i.n. oraz IAV i.n. i i.t. (jak na Rycini 1) lub pojedynczej infekcji samym IAV. (A) Miana wirusa określono po 48 h. Gwiazdki oznaczają istotność statystyczną (p < 0,05) wyznaczoną testem t Studenta. Dane są zbiorcze z n = 4 myszy na grupę. (B) Monitorowano w czasie ocenę kliniczną oraz (C) przeżywalność. (B) Przedstawiono średnią ± SEM z danych zbiorczych z n = 6 myszy na grupę. Gwiazdki oznaczają istotność statystyczną (p < 0,05) pomiędzy myszami młodymi a starymi w wskazanym punkcie czasowym, wyznaczoną testem Manna-Whitneya. (C) Dane są zbiorcze z n = 6 myszy na grupę. Gwiazdki oznaczają istotność statystyczną (p < 0,05) pomiędzy myszami młodymi a starymi, wyznaczoną testem log-rank (Mantel-Cox). Skróty: IAV = wirus grypy A; i.n. = donosowo; i.t. = wewnątrztachealnie; SEM = standardowy błąd średniej. Rycina 5A została przedrukowana za zgodą Joma et al.23. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Mieszanka I (stock) do CDM
Adenina0,1 g
D-alanina0,25 g
CaCl22 Bezwodny0,025 g
Siarczan manganu(II)0,03 g
Cyanokobalamina100 µL z roztworu zapasu o stężeniu 10 mg/ml
Kwas para-aminobenzoowy400 µL stoku o stężeniu 5 mg/ml
Pyridoksamina 2HCl100 µL roztworu stokowego o stężeniu 10 mg/ml
Roztwór stokowy Mieszaniny II do CDM
Guanina0,05 g
Uracyl0,05 g
Roztwór zapasowy Mix III do medium CDM
Azotan żelaza(III) nonahydrat2O50 mg/ml
Siarczan żelaza(III) 7H2O10 mg/ml
Mieszanina IV stock dla CDM
Beta-nikotynamidoadenynodynukleotyd25 mg/ml

Tabela 1: Roztwory zapasowe Mix I, II, III i IV do CDM. Skrót: CDM = pożywka chemicznie zdefiniowana (chemically defined media).

Roztwór zapasu mieszanki witamin do CDM
Klorowodorek pyridoksalu0,8 g
Chlorek tiaminy20,4 g
Ryboflawina0,4 g
pantotenian wapnia0,4 g
Biotyna0,04 g
Kwas foliowy0,4 g
Niacynamid0,4 g

Tabela 2: Roztwór zapasowy mieszanki witamin do CDM. Skrót: CDM = chemically defined media (pożywka chemicznie zdefiniowana).

Zapas aminokwasów do CDM
L-Alanina0.480 g
L-Arginina0.250 g
L-Asparagina0.700 g
Kwas L-asparaginylowy0.600 g
L-Cysteina1.000 g
L-Cystyna0.100 g
Kwas L-glutaminowy0.200 g
L-Glutamina0.780 g
L-Glicyna0.350 g
L-Histydyna0.300 g
L-Izoleucyna0.430 g
L-Leucyna0.950 g
L-Lizyna0.880 g
L-Metionina0.250 g
L-Fenyloalanina0.550 g
L-Prolina1.350 g
L-Seryna0.680 g
L-Treonina0.450 g
L-Tryptofan0.100 g
L-Walina0.650 g

Tabela 3: Zapas aminokwasów do CDM. Skrót: CDM = pożywka chemicznie zdefiniowana.

Kultura starterowa dla CDM
Dekstroza1,0 g
Siarczan magnezu siedmiowodny0,070 g
Fosforan potasu dwuzasadowy0,02 g
Fosforan potasu jednowodny0,1 g
Octan sodu bezwodny0,45 g
Wodorowęglan sodu0,25 g
Fosforan sodu dwuzasadowy0,735 g
Wodorostrzan sodu0,32 g
Ostateczne uzupełnienia dla CDM
Chlorek choliny0,1 g
L-cysteinian chlorowodorek0,075 g
Węglan sodu (wodorowęglan sodu)0,25 g

Tabela 4: Stok startowy i suplementy końcowe dla CDM. Skrót: CDM = pożywka chemicznie zdefiniowana.

Przeciwciało/FluoroforKlonWspółczynnik rozcieńczenia
L/D do wzbudzenia UVN/A0.38888889
Ly6G AF 4881A80.25
CD11b APCM1/700.25
CD11c PEN4180.18055556
Mouse Fc Block2.4G20.11111111
F4/80 PE Cy7BM80.18055556
Ly6C BV605AL-210.25
CD103 BV 421M2900.18055556
CD45 APC-eF-78030-F110.18055556

Tabela 5: Panel przeciwciał 1.

Przeciwciało/FluoroforKlonowanieWspółczynnik rozcieńczenia
L/D dla wzbudzenia UVPonieważ nie dostarczono tekstu źródłowego do tłumaczenia, proszę o przesłanie treści, którą należy przełożyć na język polski zgodnie z wytycznymi.0.388888889
TCR-β APC Cy7H57-5970.180555556
CD4 V450 (Pacific Blue)RM4-50.25
CD8 BV65053-6.70.180555556
Blokada receptorów Fc u myszy2.4G20.111111111
CD45 PE30-F110.180555556
CD3 AF488145-2C110.180555556
APC z usuniętym TCR-γδGL-30.180555556
NK1.1 AF 700PK1360.180555556

Tabela 6: Panel przeciwciał 2.

Dyskusja

Większość istniejących badań eksperymentalnych dotyczących jednoczesnego zakażenia S. pneumoniae/IAV opiera się na dostarczaniu bakterii do płuc myszy wstępnie zakażonych IAV. Modele te pomogły zidentyfikować zmiany w środowisku płucnym i ogólnoustrojowej odpowiedzi immunologicznej, które sprawiają, że gospodarz jest podatny na wtórne zakażenie bakteryjne 15,16,17,32,33,34,35,36,37. Jednak modele te nie były w stanie naśladować przejścia S. pneumoniae z bezobjawowego kolonizatora w patogen zdolny do powodowania poważnych infekcji płuc i ogólnoustrojowych. Co więcej, modele te nie nadają się do badania czynników gospodarza i interakcji gospodarz-patogen w górnych drogach oddechowych, które przyczyniają się do podatności na infekcje. Wcześniejszy model przemieszczania się pneumokoków z nosogardzieli do płuc po zakażeniu IAV opierał się na zakażeniu bakteryjnym nosogardzieli, a następnie zakażeniu wirusowym. Nie udało się jednak odtworzyć poważnych objawów choroby obserwowanych u ludzi21. Opisany tutaj zmodyfikowany model infekcji mysiej podsumowuje przejście S. pneumoniae od bezobjawowego nosicielstwa do patogenu, który powoduje ciężką chorobę kliniczną.

Krytycznym etapem tego modelu jest ustalenie zakażenia S. pneumoniae w nosogardzieli. Streptococcus pneumoniae tworzą biofilmy i kolonizują nosogardziel z różną wydajnością 21,38. Do ustalenia spójnego zakażenia wymagane jest co najmniej 5 × 106 CFU badanych do tej pory szczepów bakterii wyhodowanych w biofilmie23. Zaleca się, aby każdy nowy szczep bakteryjny został przetestowany pod kątem stabilnego zakażenia nosogardzieli przed infekcją wirusową. W przypadku koinfekcji wirusowej wcześniejsze badania wykazały, że wewnątrznosowe zakażenie IAV jest wymagane do dyspersji bakterii z nosogardzieli 21,22,23. W tych wcześniejszych badaniach zastosowano 500 PFU IAV do podawania donosowego, podczas gdy w tym badaniu 200 PFU wystarczyło do zwiększenia liczby bakterii w nosogardzieli. Zakażenie IAV nie ogranicza się do górnych dróg oddechowych i może rozprzestrzeniać się do płuc39,40, co ma kluczowe znaczenie dla zwiększenia podatności środowiska płucnego na infekcje bakteryjne 15,16,41. Dostarczenie IAV do płuc można osiągnąć poprzez podanie donosowe lub dotchawiczą znieczulonych myszy. Wcześniejsze prace z myszami BALB/cByJ wykazały, że podawanie donosowe powoduje wirusowe zapalenie płuc21; jednak dostęp inokulum do płuc po inokulacji donosowej jest bardziej ograniczony u myszy C57BL / 6. U myszy C57BL/6 instalacja dotchawicza jest wymagana w celu spójnego dostarczania wirusa23. W tym modelu wcześniejsza kolonizacja bakteryjna przyspiesza prezentację objawów chorobowych po infekcji wirusowej23. Ponieważ infekcja wirusowa może sama w sobie powodować objawy chorobowe z potencjalnymi różnicami w kinetyce, zaleca się, aby najpierw przetestować zakres dawek dla każdego nowego testowanego szczepu wirusa i wybrać dawkę, która ujawnia przyspieszoną kinetykę u współzakażonych gospodarzy.

Płuca stanowią kolejny krytyczny odczyt dla oceny choroby w tym modelu. Do oceny obciążenia patogenami i napływu komórek odpornościowych można użyć płuca tej samej myszy. Ponieważ jednak nasilenie infekcji i stanu zapalnego może się różnić w zależności od płata, zaleca się, aby nie brać różnych płatów tego samego płuca do różnych ocen. Zamiast tego wszystkie płaty można zmielić na małe kawałki, dobrze wymieszać ze sobą, a następnie równomiernie przeanalizować dla różnych ocen. Podobnie nosogardziel może być używana do oznaczania liczby bakteryjnych CFU lub wirusowych PFU i odpowiedzi immunologicznej. Jednak liczba komórek uzyskanych z płukania i tkanek jest zbyt mała, aby przeprowadzić cytometrię przepływową bez łączenia próbek od myszy w tej samej grupie. Alternatywnie stan zapalny w nosogardzieli można ocenić histologicznie23.

Kluczową cechą tego modelu jest to, że podsumowuje on chorobę kliniczną obserwowaną u pacjentów. U ludzi wtórne pneumokokowe zapalenie płuc po zakażeniu IAV często powoduje oczywiste objawy choroby, w tym kaszel, duszność, gorączkę i bóle mięśni, które mogą prowadzić do hospitalizacji, niewydolności oddechowej, a nawet śmierci 8,15,42,43. Model ten podsumowuje poważne objawy choroby klinicznej obserwowane u ludzi pod względem trudności w oddychaniu (odzwierciedlonych w wyniku oddychania) i ogólnego złego samopoczucia (odzwierciedlonego w wynikach postawy i ruchu) wykazywanych przez myszy, a także śmierci u niektórych zdrowych młodych osób z grupy kontrolnej. Zaostrzone objawy choroby u współzakażonych myszy są prawdopodobnie wynikiem zarówno rozprzestrzeniania się bakterii do płuc, jak i upośledzonego klirensu wirusa u myszy z nosicielstwem pneumokoków23. Ograniczeniem modelu jest to, że częstość występowania choroby klinicznej i rozprzestrzeniania się bakterii z nosogardzieli różni się u myszy i zależy od szczepu bakteryjnego, wieku gospodarza i genotypu 21,22,23. Odzwierciedlając to, w przypadku szczepów inwazyjnych, progresja od miejscowego zakażenia (bez wykrywalnej bakteriemii) do śmierci może nastąpić w ciągu 24 godzin. Dlatego, aby uzyskać prawdziwą ocenę rozprzestrzeniania się ogólnoustrojowego, bakteriemię należy obserwować w krótszych odstępach czasu (co 6-12 godzin). Podobnie, ocena choroby może się szybko zmieniać, szczególnie w ciągu pierwszych 72 godzin po kozakażeniu. Dlatego, aby dokładnie śledzić objawy choroby, zaleca się monitorowanie myszy trzy razy dziennie przez 1-3 dni po zakażeniu IAV.

Podsumowując, model ten odtwarza przemieszczanie się S. pneumoniae z bezobjawowego kolonizatora nosogardzieli do patogenu zdolnego do wywoływania chorób płuc i ogólnoustrojowych po zakażeniu IAV. W tym modelu IAV wyzwala przejście S. pneumoniae poprzez modyfikację zachowania bakterii w nosogardzieli, zwiększając rozprzestrzenianie się bakterii do płuc i zmieniając odporność przeciwbakteryjną23. Podobnie, nosicielstwo bakteryjne stępia przeciwwirusową odpowiedź immunologiczną i upośledza klirens IAV z płuc23. To sprawia, że model ten jest idealny do analizowania zmian w odpowiedziach immunologicznych w pojedynczych i wielodrobnoustrojowych infekcjach. Ponadto przebieg choroby po koinfekcji jest częściowo zależny od szczepu pneumokoków obecnego w nosogardzieli. W związku z tym model nadaje się do analizy czynników bakteryjnych wymaganych do bezobjawowej kolonizacji w porównaniu z patogennym przejściem S. pneumoniae. Wreszcie, model ten odtwarza podatność starzenia się na koinfekcje i chociaż nie zostało to tutaj przetestowane, można go łatwo wykorzystać do oceny wpływu tła gospodarza na przebieg choroby. Podsumowując, rozdzielenie nosicielstwa i choroby na odrębne etapy daje możliwość analizy wariantów genetycznych zarówno patogenów, jak i gospodarza, umożliwiając szczegółowe zbadanie interakcji ważnego patobionta z gospodarzem w różnych fazach postępu choroby. Idąc dalej, model ten może być wykorzystany do dostosowania opcji leczenia dla wrażliwych gospodarzy.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować Nickowi Lenhardowi za krytyczne przeczytanie i zredagowanie tego rękopisu. Chcielibyśmy również podziękować Andrew Camilli i Anthony'emu Campagnari za szczepy bakteryjne oraz Bruce'owi Davidsonowi za szczepy wirusowe. Praca ta była wspierana przez National Institute of Health Grant (R21AG071268-01) dla J.L. oraz National Institute of Health Grants (R21AI145370-01A1), (R01AG068568-01A1), (R21AG071268-01) dla E.N.B.G.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kwas 4-aminobenzoesowy FisherAAA1267318Mix I stock
96-dołkowe okrągłe płyty denneGreiner Bio-One650101
100 µ m FiltryFisher07-201-432
AdeninaFisherAC147440250Mix I stock
AvicelFisher501785325Celuloza mikrocyrstalinowa 
Bufor utrwalający BD Cytofix Bufor utrwalającyFisherBDB554655
BD FortessaCytometr przepływowy
Rurki polietylenowe BD Intramedic Fisher427410Rurka do płukania nosa
BD  Jednorazowe strzykawki z końcówkami Luer-Lok (1 ml)Fisher14-823-30
BD  Mikrotainer Kapilarny kolektor krwi i zamknięcie BD MicrogardFisher02-675-185Probówki do pobierania krwi
Beta-nikotynamidoadeninowy dinukleotydFisherAAJ6233703Mix IV zapas
BiotynaFisherAC230090010Zapas witamin
Myszy C57BL / 6JThe Jackson Laboratory#000644Myszy użyte w tym badaniu
Bezwodny chlorek wapniaFisher ChemicalC77-500Mix I zapasy
CD103 BV 421BD BioscienceBDB562771Klon: M290 DF 1:200
CD11b APCInvitrogen50-112-9622Klon: M1/70, DF 1:300
CD11c PEBD BioscienceBDB565592Klon: N418 DF 1:200
CD3 AF 488BD BioscienceOB153030Klon: 145-2C11 DF 1:200
CD4 V450BD HorizonBDB560470Klon: RM4.5 DF 1:300
CD45 APC eF-780BD Bioscience50-112-9642Klon: 30-F11 DF 1:200
CD45 PEInvitrogen50-103-70Klon: 30-F11 DF 1:200
CD8&alfa; BV 650BD HorizonBDB563234Klon: 53-6,7 DF 1:200
Chlorek cholinyFisherAC110290500Końcowy dodatek do CDM
Corning Jednorazowe systemy próżniowych filtrów/magazynowaniaFisher09-761-107Aparatura do sterylizacji filtrów 
Kolby T-25 poddane hodowli tkankowej CorningFisher10-126-9
Corning  Płytki wielodołkowe Costar ClearFisher07-201-590
Corning  DMEM z L-glutaminą i 4,5 g/l glukozy; Bez pirogronianu soduFisherMT10017CM
cyjanokobalaminaFisherAC405925000Mix I zapas
D39Krajowa Kolekcja Kultur Typu (NCTC)NCTC 7466Streptococcus pneumoniae szczep
D-AlaninaFisherAAA1023114Mix I zapas
D-pantotenian wapniaFisherAC243301000Zapas witamin
DextroseFisher ChemicalD16-500Zapas startowy
Dnase Worthington Biochemiczny 
Eagles Minimum Essential MediumATCC30-2003
EDTAVWRBDH4616-500G
EF3030Centrum Kontroli i Zapobiegania Chorobom Dostępne za pośrednictwem banku izolatów na żądanieszczepu Streptococcus pneumoniae, żądanie przy użyciu nazwy szczepu
F480 PE Cy7BD Bioscience50-112-9713Klon: BMB DF 1:200
Falcon 50 mL stożkowe probówki wirówkoweFisher14-432-2250 ml probówka z okrągłym dnem
Falcon  Probówki polipropylenowe z okrągłym dnem z nakrętkąFisher14-959-11B15 mL probówka z okrągłym dnem
Falcon  Probówki z polistyrenu okrągłodennego (5 ml)ProbówkiFACS Fisher14-959-5 
FBSThermofisher10437-028
Azotan żelaza NiewodnyFisherI110-100Mix III
kolba Fisherbrand Delikatne nożyczki preparacyjneFisher08-951-5Instrumenty używane do zbioru
Fisherbrand Jednorazowe pętle do zaszczepiania Fisher22-363-602Pętle inokulacyjne 
Kleszcze do tkanek preparacyjnychFisherbrandFisher 13-812-38Kleszcze do zbioru
Probówki do mikrowirówek Fisherbrand Premium: 1,5 mlFisher05-408-137Probówki do mikowirówki
Fisherbrand  Sterylne strzykawki jednorazowego użytku (10 ml)Fisher14-955-459
Kwas foliowyFisherAC216630500Zapas witamin
Gibco RPMI 1640 (ATCC)FisherA1049101
Gibco  DPBS, bez wapnia, bez magnezuFisher14190250
Gibco  HBSS, wapń, magnez, bez czerwieni fenolowejFisher14025134
Gibco  MEM (modyfikacja Temina) (2x), bez czerwieni fenolowejFisher11-935-046
Gibco  Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml)Fisher15-140-122
Gibco  Roztwór błękitu trypanowego, 0,4%Fisher15-250-061
Gibco  Trypsyna-EDTA (0,25%), czerwień fenolowaFisher25-200-056
Glicerol (certyfikowany ACS)FisherG33-4
GlicynaFisherAA3643530Zapas aminokwasów
GuaninaFisherAAA1202414Mix II
Invitrogen UltraComp eBeads Koraliki kompensacyjneFisher50-112-9040
Siarczan żelaza (II) siedmiowodnyFisherAAA1517836Mix III zapas
L-AlaninaFisherAAJ6027918Zapas aminokwasów
L-argininaFisherAAA1573814Zapas aminokwasów
L-asparaginaFisherAAB2147322Zapas aminokwasów
Kwas L-asparaginowy FisherAAA1352022Zapas aminokwasów
L-cysteinaFisherAAA1043518Zapas aminokwasów
Monohydrat chlorowodorku L-cysteinyFisherAAA1038914Końcowy suplement do CDM
L-cystynyFisherAAA1376218Zapas aminokwasów
Kwas L-glutaminowy FisherAC156211000Zapas aminokwasów
L-glutaminaFisherO2956-100Zapas aminokwasów
L-histydyna FisherAC166150250Zapas aminokwasów
LIFE TECHNOLOGIES LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, do wzbudzenia UVInvitrogen50-112-1524Klon: N/A DF 1:500
L-izoleucynaFisherAC166170250Zapas aminokwasów
L-LeucineFisherBP385-100Zapas aminokwasów
L-LizynaFisherAAJ6222514Zapas aminokwasów
L-MetioninaFisherAAA1031822Zapas aminokwasów
Niska endotoksyna BSA Sigma AldrichA1470-10G
L-fenyloalaninaFisherAAA1323814Zapas aminokwasów
L-ProlineFisherAAA1019922Zapas aminokwasów
L-SerineFisherAC132660250Zapas aminokwasów
L-treoninaFisherAC138930250Zapas aminokwasów
L-tryptofanFisherAAA1023014Zapas aminokwasów
L-walina FisherAAA1272014Zapas aminokwasów
Ly6C BV 605BD BioscienceBDB563011Klon: AL-21 DF 1:300
Ly6G AF 488 BiolegendNC1102120Klon: IA8, DF 1:300
Komórki nerki psów Madin-Darby (MDCK) American Type Culture Collection (ATCC)CCL-34Linia komórkowa MDCK do analizy PFU 
Siarczan magnezu 7-hydratFisher60-019-68CDM zapas startowy
Siarczan manganuFisherM113-500Mix I zapas
WodaUltraczysta woda
Mysz Fc BlockBD BioscienceBDB553142Klon: 2.4G2 DF 1:100
MWI WETERYNARIA  PURALUBE VET MAŚĆFisherNC1886507Smar do oczu na infekcje
NCI-H292 linia komórkowa raka śluzowo-naskórkowego ATCCCRL-1848H292 linia komórkowa nabłonka płuc do wzrostu biofilmu
NiacynamidFisher18-604-792Zapas witamin
NK 1.1 AF 700BD Bioscience50-112-4692Klon: PK136 DF 1:200
Oxyrase do bulionu 50Ml Butelka 1/PkFisher50-200-5299Do usuwania tlenu z płynnych kultur
Paraformaldehyd 4% w PBSThermoscientificJ19932-K2
Izofluran pivetal Patterson Veterinary07-893-8440Izofluran do znieczulenia podczas infekcji 
Fosforan potasu dwuzasadowyFisher ChemicalP288-500Zapas startowy
Fosforan potasu jednozasadowyFisher ChemicalP285-500Zapas startowy
Chlorowodorek pirydoksalu FisherAC352710250Zapas witamin
Dichlorowodorek pirydoksaminyFisherAAJ6267906Mix I zapas
RyboflawinaFisherAC132350250Zapas witamin
Octan soduVWR0530-500GZapas startowy
Azek sodu Bioodczynniki FisherBP922I-500Do buforu FACS
Wodorowęglan soduFisher ChemicalS233-500Zapas startowy i końcowy dodatek do CDM
Dwuzasadowy fosforan soduFisher ChemicalS374-500Zapas startowy
Fosforan sodu jednozasadowyFisher ChemicalS369-500Zapas startowy
TCR APC BD Bioscience50-112-8889Klon: GL-3 DF 1:200
TCRβ APC-Cy7BD PharmigenBDB560656klon: H57-597 DF 1:200
Thermo Scientific Agar do krwi z gentamycynąFisherR01227Płytki agarowe z antybiotykiem gentamycyną 
Thermo Scientific  Trypsyna, Fisher PI20233
Chlorowodorek tiaminyFisherAC148991000Zapas witamin
TIGR4ATCCBAA-334Streptococcus pneumoniae
szczep UracilFisherAC157300250Mix II
Worthington Biochemical Corporation  Kolagenaza, Typ 2, 1 gFisherNC9693955
 LS002147 MilQ traktowany TPCK

Bibliografia

  1. Kadioglu, A., Weiser, J. N., Paton, J. C., Andrew, P. W. The role of Streptococcus pneumoniae virulence factors in host respiratory colonization and disease. Nature Reviews Microbiology. 6 (4), 288-301 (2008).
  2. Obaro, S., Adegbola, R. The pneumococcus: Carriage, disease and conjugate vaccines. Journal of Medical Microbiology. 51 (2), 98-104 (2002).
  3. Chong, C. P., Street, P. R. Pneumonia in the elderly: A review of the epidemiology, pathogenesis, microbiology, and clinical features. Southern Medical Journal. 101 (11), 1141-1145 (2008).
  4. Kadioglu, A., Andrew, P. W. Susceptibility and resistance to pneumococcal disease in mice. Briefings in Functional Genomics and Proteomics. 4 (3), 241-247 (2005).
  5. Ganie, F., et al. Structural, genetic, and serological elucidation of Streptococcus pneumoniae serogroup 24 serotypes: Discovery of a new serotype, 24C, with a variable capsule structure. Journal of Clinical Microbiology. 59 (7), 0054021(2021).
  6. Centers for Disease Control and Prevention. Estimates of deaths associated with seasonal influenza --- United States. MMWR. Morbidity and Mortality Weekly Report. 59 (33), 1057-1062 (2010).
  7. Shrestha, S., et al. Identifying the interaction between influenza and pneumococcal pneumonia using incidence data. Science Translational Medicine. 5 (191), (2013).
  8. McCullers, J. A. Insights into the interaction between influenza virus and pneumococcus. Clinical Microbiology Reviews. 19 (3), 571-582 (2006).
  9. Pneumococcal Disease Global Pneumococcal Disease and Vaccine. Centers for Disease Control and Prevention. , Available from: https://www.cdc.gov/pneumococcal/global.html (2018).
  10. Grudzinska, F. S., et al. Neutrophils in community-acquired pneumonia: Parallels in dysfunction at the extremes of age. Thorax. 75 (2), 164-171 (2020).
  11. Boe, D. M., Boule, L. A., Kovacs, E. J. Innate immune responses in the ageing lung. Clinical and Experimental Immunology. 187 (1), 16-25 (2017).
  12. Krone, C. L., van de Groep, K., Trzcinski, K., Sanders, E. A., Bogaert, D. Immunosenescence and pneumococcal disease: An imbalance in host-pathogen interactions. The Lancet Respiratory Medicine. 2 (2), 141-153 (2014).
  13. Cho, S. J., et al. Decreased NLRP3 inflammasome expression in aged lung may contribute to increased susceptibility to secondary Streptococcus pneumoniae infection. Experimental Gerontology. 105, 40-46 (2018).
  14. Disease Burden of Influenza. Centers for Disease Control and Prevention. , Available from: https://www.cdc.gov/flu/about/burden/index.html (2018).
  15. McCullers, J. A. The co-pathogenesis of influenza viruses with bacteria in the lung. Nature Reviews Microbiology. 12 (4), 252-262 (2014).
  16. McCullers, J. A., Rehg, J. E. Lethal synergism between influenza virus and Streptococcus pneumoniae: Characterization of a mouse model and the role of platelet-activating factor receptor. The Journal of Infectious Diseases. 186 (3), 341-350 (2002).
  17. Metzger, D. W., Sun, K. Immune dysfunction and bacterial coinfections following influenza. Journal of Immunology. 191 (5), 2047-2052 (2013).
  18. Chao, Y., Marks, L. R., Pettigrew, M. M., Hakansson, A. P. Streptococcus pneumoniae biofilm formation and dispersion during colonization and disease. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 4, 194(2014).
  19. Bogaert, D., De Groot, R., Hermans, P. W. Streptococcus pneumoniae colonisation: The key to pneumococcal disease. The Lancet Infectious Diseases. 4 (3), 144-154 (2004).
  20. Simell, B., et al. The fundamental link between pneumococcal carriage and disease. Expert Review of Vaccines. 11 (7), 841-855 (2012).
  21. Marks, L. R., Davidson, B. A., Knight, P. R., Hakansson, A. P. Interkingdom signaling induces Streptococcus pneumoniae biofilm dispersion and transition from asymptomatic colonization to disease. mBio. 4 (4), 00438(2013).
  22. Reddinger, R. M., Luke-Marshall, N. R., Sauberan, S. L., Hakansson, A. P., Campagnari, A. A. Streptococcus pneumoniae modulates Staphylococcus aureus biofilm dispersion and the transition from colonization to invasive disease. mBio. 9 (1), 02089(2018).
  23. Joma, B. H., et al. A murine model for enhancement of Streptococcus pneumoniae pathogenicity upon viral infection and advanced age. Infection and Immunity. 89 (8), 0047120(2021).
  24. Andersson, B., et al. Identification of an active disaccharide unit of a glycoconjugate receptor for pneumococci attaching to human pharyngeal epithelial cells. Journal of Experimental Medicine. 158 (2), 559-570 (1983).
  25. Avery, O. T., Macleod, C. M., McCarty, M. Studies on the chemical nature of the substance inducing transformation of pneumococcal types: Induction of transformation by a desoxyribonucleic acid fraction isolated from pneumococcus type III. The Journal of Experimental Medicine. 79 (2), 137-158 (1944).
  26. Tettelin, H., et al. Complete genome sequence of a virulent isolate of Streptococcus pneumoniae. Science. 293 (5529), 498-506 (2001).
  27. Tothpal, A., Desobry, K., Joshi, S. S., Wyllie, A. L., Weinberger, D. M. Variation of growth characteristics of pneumococcus with environmental conditions. BMC Microbiology. 19 (1), 304(2019).
  28. Bou Ghanem, E. N., et al. Extracellular adenosine protects against Streptococcus pneumoniae lung infection by regulating pulmonary neutrophil recruitment. PLoS Pathogens. 11 (8), 1005126(2015).
  29. Bou Ghanem, E. N., et al. The alpha-tocopherol form of vitamin E boosts elastase activity of human PMNs and their ability to kill Streptococcus pneumoniae. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 161(2017).
  30. Tait, A. R., Davidson, B. A., Johnson, K. J., Remick, D. G., Knight, P. R. Halothane inhibits the intraalveolar recruitment of neutrophils, lymphocytes, and macrophages in response to influenza virus infection in mice. Anesthesia & Analgesia. 76 (5), 1106-1113 (1993).
  31. Aaberge, I. S., Eng, J., Lermark, G., Lovik, M. Virulence of Streptococcus pneumoniae in mice: A standardized method for preparation and frozen storage of the experimental bacterial inoculum. Microbial Pathogenesis. 18 (2), 141-152 (1995).
  32. McCullers, J. A., Bartmess, K. C. Role of neuraminidase in lethal synergism between influenza virus and Streptococcus pneumoniae. The Journal of Infectious Diseases. 187 (6), 1000-1009 (2003).
  33. Smith, A. M., McCullers, J. A. Secondary bacterial infections in influenza virus infection pathogenesis. Current Topics in Microbiology and Immunology. 385, 327-356 (2014).
  34. Cundell, D. R., Gerard, N. P., Gerard, C., Idanpaan-Heikkila, I., Tuomanen, E. I. Streptococcus pneumoniae anchor to activated human cells by the receptor for platelet-activating factor. Nature. 377 (6548), 435-438 (1995).
  35. Ballinger, M. N., Standiford, T. J. Postinfluenza bacterial pneumonia: Host defenses gone awry. Journal of Interferon & Cytokine Research. 30 (9), 643-652 (2010).
  36. Sun, K., Metzger, D. W. Inhibition of pulmonary antibacterial defense by interferon-gamma during recovery from influenza infection. Nature Medicine. 14 (5), 558-564 (2008).
  37. Nakamura, S., Davis, K. M., Weiser, J. N. Synergistic stimulation of type I interferons during influenza virus coinfection promotes Streptococcus pneumoniae colonization in mice. Journal of Clinical Investigation. 121 (9), 3657-3665 (2011).
  38. Blanchette-Cain, K., et al. Streptococcus pneumoniae biofilm formation is strain dependent, multifactorial, and associated with reduced invasiveness and immunoreactivity during colonization. mBio. 4 (5), 00745(2013).
  39. Rello, J., Pop-Vicas, A. Clinical review: Primary influenza viral pneumonia. Critical Care. 13 (6), 235(2009).
  40. Torres, A., Loeches, I. M., Sligl, W., Lee, N. Severe flu management: A point of view. Intensive Care Medicine. 46 (2), 153-162 (2020).
  41. Bakaletz, L. O. Viral-bacterial co-infections in the respiratory tract. Current Opinion in Microbiology. 35, 30-35 (2017).
  42. Palacios, G., et al. Streptococcus pneumoniae coinfection is correlated with the severity of H1N1 pandemic influenza. PLoS One. 4 (12), 8540(2009).
  43. Dhanoa, A., Fang, N. C., Hassan, S. S., Kaniappan, P., Rajasekaram, G. Epidemiology and clinical characteristics of hospitalized patients with pandemic influenza A (H1N1) 2009 infections: The effects of bacterial coinfection. Virology Journal. 8, 501(2011).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Zapalenie p uc wywo ane przez pneumokokiwzrost biofilmuwirus grypy typu Arozsiew bakteriistan zapalny p uccytometria przep ywowainterakcja gospodarz patogen
Mysi model przejścia Streptococcus pneumoniae z kolonizatora w patogen po koinfekcji wirusowej podsumowuje chorobę zaostrzoną wiekiem
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.