Artykuł metodologiczny

Wieloparametryczne badanie leków na leki w nowotworach organoidalnych z wykorzystaniem obrazowania szerokopolowego z użyciem żywych komórek do analizy objętości i pojedynczych organoidów

6.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64434

⸱

23 grudnia 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Oncological Research (CORE), Integrated Personalized & Precision Oncology Network (IPPON), University of Antwerp, 2Industrial Vision Lab, University of Antwerp, 3Department of Hepatobiliary Transplantation and Endocrine Surgery, University Hospital Antwerp (UZA), 4Department of Oncology, University Hospital Antwerp (UZA), 5Plasma Lab for Applications in Sustainability and Medicine ANTwerp (PLASMANT), University of Antwerp

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół ten opisuje półautomatyczną metodę średnioprzepustowych i wysokoprzepustowych badań leków organoidów oraz niezależne od mikroskopu, zautomatyzowane oprogramowanie do analizy obrazów służące do ilościowej i wizualizacji wieloparametrycznej, pojedynczej odpowiedzi lekowej w celu uchwycenia heterogeniczności wewnątrznowotworowej.

Streszczenie

Organoidy nowotworowe pochodzące od pacjentów (PDTO) mają duże szanse dla badań przedklinicznych i translacyjnych oraz przewidywania odpowiedzi na terapię pacjentów na podstawie badań ex vivo . Jednak obecne testy przesiewowe na bazie trójfosforanu adenozyny (ATP) nie oddają złożoności odpowiedzi na lek (cytostatycznej lub cytotoksycznej) oraz heterogeniczności wewnątrznowa, która wykazano zachowanie w PDTO dzięki odczytowi zbiorczemu. Obrazowanie żywymi komórkami to potężne narzędzie do przezwyciężenia tego problemu i bardziej szczegółowej wizualizacji reakcji na leki. Jednak oprogramowanie do analizy obrazów często nie jest dostosowane do trójwymiarowości PDTO, wymaga fluorescencyjnej żywotności barwników lub nie jest kompatybilne z formatem mikropłyt 384-dołkowy. Artykuł ten opisuje półautomatyczną metodologię seedowania, przetwarzania i obrazowania PDTO w wysokoprzepustowym, 384-dołkownym formacie z wykorzystaniem konwencjonalnych, szerokokątnych systemów obrazowania z żywymi komórkami. Ponadto opracowaliśmy oprogramowanie do analizy obrazów wolnych od markerów żywotności, które ilościowo określa metryki odpowiedzi na leki oparte na tempie wzrostu, poprawiające powtarzalność i korygujące wariacje tempa wzrostu między różnymi liniami PDTO. Korzystając z metryki odpowiedzi na znormalizowany lek, która ocenia odpowiedź na podstawie tempa wzrostu znormalizowanego do warunku kontrolnego dodatniego i ujemnego, oraz barwnika śmierci fluorescencyjnej, można łatwo rozróżnić reakcje cytotoksyczne i cytostatyczne, co znacząco poprawia klasyfikację osób odpowiadających i nieodpowiadających. Ponadto heterogeniczność odpowiedzi lekowej można ilościowo określić na podstawie analizy odpowiedzi lekowej pojedynczych organoidów, aby zidentyfikować potencjalne, oporne klony. Ostatecznie metoda ta ma na celu poprawę przewidywania odpowiedzi klinicznej terapii poprzez uchwycenie wieloparametrycznego podpisu odpowiedzi lekowej, który obejmuje zatrzymanie wzrostu kinetycznego oraz ilościową ilościową śmierć komórki.

Wprowadzenie

W ostatnich latach odkrywanie leków in vitro , badania przesiewowe i badania fundamentalne przechodzą od tradycyjnych dwuwymiarowych (2D) modeli nowotworowych z uwiecznionymi liniami komórkowymi do bardziej fizjologicznie istotnych trójwymiarowych (3D) modeli nowotworowych. To skłoniło do przyjęcia sferoidów nowotworowych z ustalonymi liniami komórek nowotworowych, które odtwarzają bardziej złożone interakcje i struktury komórka-komórka obecne w guzach litych. Obecnie organoidy nowotworowe pochodzące od pacjentów (PDTO) są najbardziej zaawansowanym i fizjologicznie istotnym modelem raka 3D dostępnym dla badań nad rakiem in vitro , ponieważ zapewniają dodatkowe przewagi nad sferoidami nowotworowymi, zwłaszcza heterogeniczność występującą u pacjentów onkologicznych1. PDTO powstają z tkanki nowotworowej pochodzącej od pacjentów onkologicznych, zachowując zarówno fenotyp, jak i genotyp nowotworu. W związku z tym PDTO stają się nieocenione w badaniach podstawowych i translacyjnych nad rakiem i mają potencjał do znacznego ulepszenia onkologii precyzyjnej2.

Pomimo obiecującego potencjału, te zaawansowane modele in vitro raka in vitro są często niedostatecznie wykorzystywane z powodu braku zaawansowanych metod analizy. Najczęściej stosowany test określa liczbę żywotnych komórek w PDTO poprzez ilościowe określenie wewnątrzkomórkowego ATP3. Te testy są zazwyczaj analizą zbiorową opartą na pojedynczym punkcie czasu, pomijając krytyczne odpowiedzi zależne od czasu i pomijając odpowiedzi klonalne. W szczególności możliwość monitorowania wzrostu PDTO (tempa wzrostu) i ich reakcji na konkretne terapie jest szczególnie interesująca 4,5. Normalizowana odpowiedź lekowa (NDR), która ocenia odpowiedź na podstawie tempa wzrostu znormalizowanego do stanu dodatniego (ctrl+) i negatywnego (ctrl-), została ostatnio również uznana za kluczową miarę oceny wrażliwości na leki nowotworowe za pomocą przesiewowego badania komórkowego, choć głównie stosowano to dla linii komórkowych 2D6. Dlatego potrzebne są bardziej zaawansowane metody analizy, aby w pełni wykorzystać te bardziej klinicznie reprezentatywne i złożone modele 3D nowotworów. Mikroskopia jest uważana za potężne podejście do badania złożoności tych modeli organoidów7.

Niniejszy artykuł opisuje metodę monitorowania kinetycznych odpowiedzi leków w modelach 3D nowotworów, z wykorzystaniem konwencjonalnych mikroskopów szerokokątnych oraz systemów obrazowania komórek żywych. Wprowadzono dostosowania protokołu opisanego przez Driehuisa i in.4 , aby był kompatybilny z automatyzacją wykorzystującą robota pipetującego, cyfrowego dystrybutora leków oraz systemu obrazowania z żywymi komórkami, co zwiększa powtarzalność i zmniejsza liczbę godzin pracy "bezpośredniej". Metoda ta pozwala na średnio- i wysokoprzepustowe badanie leków zarówno kulistych nowotworów z ustalonymi liniami komórkowymi nowotworowymi (patrz Tabela Uzupełniająca S1 dla testowanych linii komórkowych), jak i PDTO, w formacie mikropłytki z 384 dołkami i wieloorganoidalnym. Dzięki zastosowaniu procesu uczenia maszynowego opartego na sieci splotowej, automatyczna identyfikacja i śledzenie poszczególnych kulistych guzów lub PDTO mogła być wykonywana wyłącznie za pomocą obrazowania w świetle i bez użycia fluorescencjowych barwników do oznakowania żywych komórek8. Jest to bardzo korzystne, ponieważ większość identyfikacji za pomocą obrazowania w świetle wymaga ręcznej adnotacji (co jest pracochłonne i czasochłonne) lub dodania barwników fluorescencji, co może zakłócić reakcje leków związane ze stresem oksydacyjnym wywołanym fotoksycyjnością9.

Powstałe oprogramowanie do analizy obrazów opracowane wewnętrznie rozszerza funkcjonalność konwencjonalnych systemów obrazowania z komórkami żywymi, ponieważ moduły analizy obrazu 3D są albo niedostępne, ograniczone platformowo, albo niekompatybilne z mikropłytkami 384-dołkowymi i obrazowaniem całodołowym. Ponadto moduły te często są wysoko kosztowne i oferują ograniczone odczyty organoidów objętych masowo. Dlatego ta metoda jest bardzo istotna dla naukowców dysponujących szeroko dostępnych systemami obrazowania żywych komórek i dążących do wydobycia większej ilości informacji o odpowiedzi na lek w porównaniu do standardowego, lecz prymitywnego testu ATP. Dzięki dodaniu specyficznych wskaźników śmierci komórkowej, odpowiedzi na cytostatyczne leki można odróżnić od odpowiedzi cytotoksycznych, co daje dodatkowy wgląd w działanie leków mechanistycznych, które obecnie nie są możliwe do osiągnięcia z analizy pojedynczych punktów czasu. Wreszcie, obrazowanie żywych komórek pozwala śledzić pojedyncze organoidy w celu uzyskania pojedynczych wskaźników odpowiedzi na leki, które pozwalają uchwycić heterogeniczność odpowiedzi i zidentyfikować potencjalnie oporne podklony.

Celem tej metody oraz powiązanego oprogramowania do analizy obrazów jest wdrożenie taniej automatyzacji w przesiewie leków organoidów, aby ograniczyć interwencję użytkownika i zmniejszyć zmienność w obsłudze, analizie obrazów i analizie danych. Aby udostępnić to oprogramowanie badaczom, jest ono niezależne od mikroskopu i platformy, a aplikacja oparta na chmurze jest udostępniana. Wspierając więc konwencjonalne systemy obrazowania z komórkami żywymi, dążymy również do poprawy ich funkcjonalności w zastosowaniach i analizie hodowli 3D.

Protokół

Zastosowano organoidy pochodzące od pacjentów z ludzkim gruczolakorakiem przewodu trzustki (PDAC). Fragmenty resekcji tkanek pobrano od pacjentów poddawanych operacjom leczniczym w Szpitalu Uniwersyteckim w Antwerpii. Wszyscy pacjenci uzyskali pisemną świadomą zgodę, a badanie zostało zatwierdzone przez Komitet Etyczny UZA (ref. 14/47/480). Szczegóły dotyczące wszystkich materiałów, odczynników, sprzętu i oprogramowania używanego w tym protokole znajdują się w Tabeli Materiałów. Przegląd przepływu pracy przedstawiono na Rysunku 1. Przykładowe dane są udostępnione w materiałach uzupełniających, aby odtworzyć protokół.

1. Dzień 0: Przygotowanie organoidów mających 2 lub 3 dni

  1. Rozgrzej mikropłytki w 37 °C przez noc i rozmraź macierz zewnątrzkomórkową (ECM) w 4 °C.
  2. Przygotuj pełne medium hodowlane organoidów PDAC: uzupełnij ADF+++ (Advanced DMEM/F12, 1% suplement glutaminy, 1% HEPES oraz 1% penicyliny/streptomycyny) o 0,5 nM białko zastępcze FC-Fuzyjne WNT, 4% podłoże kondycjonowane białkiem Noggin-Fc, medium kondycjonowane Rpso3-Fc Fusion Protein, 1x B27, 1 mM N-acetylocysteiny (NAC), 5 mM nikotynamidu, 500 nM A83-01, 100 ng/mL FGF10 oraz 10 nM gastryny.
  3. Ustal PDTO według wybranej metody.
    UWAGA: Szczegółowy protokół został przedstawiony przez Driehuisa i in., który opisuje konwencjonalną metodę ustanawiania, hodowania i przekazywania PDTO w kopułach ECM4.
  4. Enzymatycznie dysocjują organoidy w kopułach ECM.
    1. Aspiruj podłoże i myj 1 razy solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS). Dodaj enzym dysocjacyjny (np. 2 mL w mikropłycie z 6 dołkami) i pipetuj 10 razy w górę i w dół pipetą 1 mL, aby mechanicznie rozdzielić organoidy i kopuły ECM.
    2. Inkubuj przez 10 minut w temperaturze 37 °C, pipetuj w górę i w dół, i sprawdzaj, czy organoidy nie są rozdzielone z pojedynczymi komórkami. Powtórz ten krok, jeśli zajdzie taka potrzeba.
    3. Zbierz zawiesinę ogniwa w probówce 15 mL, dodaj ADF+++ do objętości 10 mL, wiruj przez 5 minut przy 450 × g w temperaturze pokojowej i zasysaj supernatant pipetą Pasteura i pompą ssącą.
    4. Ponownie zawiesij pellet w 100-200 μL pełnego medium, w zależności od wielkości pelletu i policz liczbę komórek według wybranej metody. Na przykład: wymieszaj 10 μL zawiesiny ogniwa + 10 μL Trypan Blue i licz z automatycznym licznikiem ogniw.
  5. Płytkowanie pojedynczych komórek w kopułach ECM.
    1. Rozcieńcz zawiesinę ogniwa i dodaj 2/3 ECM zgodnie z Tabelą 1. Pipetować do dziesięciu kropel po 20 μL na odwór w podgrzanej płycie z 6 dołkami. Odwróć płytę i inkubuj przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
    2. Nałóż pełny nośnik uzupełniony 10 μM Y-27632 i inkubuj przez 2-3 dni w inkubatorze.
      UWAGA: Dziesięć kopuł zawierających po 75 000 komórek każda zwykle wystarcza do wypełnienia jednej mikropłytki z 384 dołkami w stężeniu 200 organoidów na odwierć, z wyłączeniem dołków na krawędzi.

2. Dni 2 - 3: Zbiory i siewanie organoidów mających 2 lub 3 dni

  1. Zbieraj nienaruszone organoidy z kopuł ECM.
    UWAGA: Organoidy mają tendencję do przyklejania się do powierzchni plastikowych (np. rurek, końcówek pipet). Aby temu zapobiec, można przepłukać plastiki roztworem z zawartością 0,1% albuminy surowicy bydłej (BSA)/PBS.
    1. Aspiruj medium i myj 1 razy PBS. Dodaj 1-2 mL zimnego (4 °C) roztworu organoidowego do płytki z 6 dołkami, w zależności od liczby kopuł ECM, i inkubuj na lodzie na platformie wstrząsającej przez 10 minut.
    2. Pipetuj w górę i w dół pipetą o pojemności 1 mL, aby rozdzielić kopuły ECM, inkubuj przez dodatkowe 10 minut na lodzie i wizualnie sprawdź pod mikroskopem, czy ECM jest dysocjowane.
    3. Opcjonalnie: jeśli preferowany jest bardziej jednolity rozkład rozmiarów, przefiltruj zawiesinę przez sitko ogniw 70 μm przed wirowaniem.
    4. Zbieraj organoidy w probówce o pojemności 15 mL powlekanej 0,1% BSA/PBS, dodaj ADF+++ do 10 mL i wiruj przez 5 minut w dawce 200 × g w temperaturze 4 °C. Aspiruj supernatant i ponownie zawiesij pellet w do 1 000 μL pełnego medium organoidowego PDAC, w zależności od wielkości pelletu, aby uzyskać stężenie >6 000 organoidów/mL.
    5. Policz organoidy dowolną metodą liczenia, najlepiej opartą na obrazach.
  2. Zasiać organoidy.
    UWAGA: Zobacz Tabelę Materiałów , aby poznać minimalną objętość/dołek dla dwóch różnych typów mikropłyt 384-dołkowych używanych w tym protokole.
    1. Wszystkie plastiki schładzać w temperaturze -20 °C lub na lodzie przez co najmniej 20 minut przed użyciem, aby zapobiec zastygnięciu ECM.
    2. Przygotuj roztwór siewny z 1 mL roztworu organoidowego (krok 2.1.4) przy użyciu pełnego medium do zasiewania ~200 organoidów na odwiert w 50 μL, czyli minimalnej objętości potrzebnej do napełnienia dołku. Użyj Pliku Uzupełniającego 1 , aby obliczyć ilość roztworu do siewania organoidów. Dodaj objętość rezydualną 1 500 μL przy użyciu zbiornika 25 mL oraz wielokanałowej pipety lub robota pipetowania.
    3. Zasiewaj organoidy za pomocą robota pipetującego.
      UWAGA: Zarówno roztwór siewny, jak i mikropłytka muszą być chłodzone w temperaturze 4 °C podczas pipetowania, aby uniknąć zastygnięcia ECM. Dlatego zbiornik 25 mL i uchwyt na mikropłytę zostały wydrukowane w 3D, aby mogły być używane w połączeniu z robotem pipetującym, który może przechowywać elementy chłodzące wymienione w Tabeli Materiałów. Dostępne są pliki STL do druku 3D (Plik Uzupełniający 2 i Plik 3) oraz niestandardowe pliki JSON dla robota pipetującego (Plik Uzupełniający 4 i Plik Uzupełniający 5).
      1. Zaprojektuj protokół wydawania za pomocą internetowego narzędzia Protocol Designer Tool. Dostępny jest przykładowy plik JSON (Supplementary File 6), w którym niestandardowe oprogramowanie laboratoryjne jest już załadowane, a używana jest ośmiokanałowa pipeta p300 (Gen2) z odpowiednimi końcówkami do pipet.
      2. Otwórz aplikację sterowania robotem pipetującym, wybierz protokoły, kliknij Import i przeciągnij oraz upuść Plik Uzupełniający 6 do wyznaczonego pola.
      3. Wybierz importowany protokół i umieść całe wyposażenie laboratoryjne, w tym elementy chłodzące i plastikowe, na pokładach zgodnie z układem pokazanym w polu Deck Setup . Użyj lewego szczelina na zbiornik 25 mL i element chłodzący, jak pokazano w Pliku Uzupełniającym 7.
      4. Kliknij na Uruchom protokół i przejdź do konfiguracji. Otwórz zakładkę Setup Labware, kliknij Uruchom Lab Position Check i postępuj zgodnie z instrukcjami, aby skalibrować robot pipetujący do nowego sprzętu.
        UWAGA: Dane offsetu laboratorium można przechowywać na później, ale zaleca się sprawdzanie pozycji laboratorium przed każdym uruchomieniem.
      5. Napełnij zbiornik 25 mL (umieszczony na części chłodzącej) schłodzonym roztworem do siewu organoidów i kliknij Start Run.
        UWAGA: Górne i dolne otwory również są wypełniane roztworem zawieszenia organoidów dzięki zastosowaniu pipety ośmiokanałowej.
      6. Wiruj mikropłytę przez 1 minutę w 100 × g w 4 °C.
      7. Inkubuj w temperaturze 37 °C przez co najmniej 30 minut.
      8. Napełnij zewnętrzne otwory co najmniej 50 μLH2O, aby uniknąć parowania.
      9. Inkubuj w temperaturze 37 °C przez noc, aby usunąć wszelkie pęcherzyki z otworu, które mogą zakłócać analizę obrazu.

3. Dzień 4: Leczenie uzależnień i wydawanie odczynników za pomocą cyfrowego dystrybutora leków

  1. Stwórz protokół wydawania leków za pomocą cyfrowego oprogramowania sterującego dystrybutorem leków.
    1. Najedź kursorem na Tablicę 1 nad układem płyty, wybierz edytuj atrybuty płyty i wypełnij typ tablicy: 384 dołek, dodatkowa objętość (μL): 50 oraz limit DMSO (%): 1.
    2. Dodaj płyny, klikając przycisk + obok Płyny. Kliknij dwa razy na nowo utworzony płyn i nazwij go; wybierz klasę (opartą na DMSO lub wodną + Tween 20) oraz koncentrację.
      UWAGA: Wszystkie leki i odczynniki muszą być rozpuszczone w 100% DMSO lub 0,3% Tween-20. Można stosować roztwór zapasowy o pojemności 1-10 mM, uwzględniając maksymalne stężenie DMSO <1%. Tabela 2 przedstawia przykłady wymaganych rozcieńczeń dla powszechnych odczynników fluorescencyjnych i terapii.
    3. Układ tablic
      1. Aby dotrować lek, wybierz dołki i kliknij Titracja. Dla cieczy wybierz interesujący się lek, wybierz najwyższe stężenie (np. 2 000 nM) oraz najniższe stężenie (np. 10 nM); dla replikacji wybierz minimum 2 i wybierz pożądany wzór miareczkowania.
        UWAGA: Wzór miareczkowania będzie zależał od wielu czynników, w tym od ilości związku, który ma się zmieścić na jednej płycie, czy odwierty mają być losowo przydzielone oraz od liczby replikacji i kontroli.
      2. Aby uzyskać pozytywną kontrolę, wybierz trzy dołki, kliknij na Wartość Ustaw i wlej 2 μM staurosporyny z zapasu 10 mM w DMSO, co wywoła maksymalną śmierć komórek.
      3. Dla Cytotox Green wybierz wszystkie używane odwierty, kliknij Wartość Ustaw i wpisz 60 nM/odwiert.
        UWAGA: Fluorescencyjne barwienie Cytotox Green wskazuje na komórki, które umarły, a zatem nie zakłócają monitorowania odpowiedzi na leki. W tym przypadku nie jest wymagany marker fluorescencyjny dla żywych komórek.
      4. Dla kontroli ujemnej i normalizacji DMSO wybierz wszystkie odwierty z dodatkowymi czterema do sterowania pojazdem, kliknij prawym przyciskiem, wybierz normalizację, wybierz normalizację, wybierz normalizację klasy płynu: opartą na DMSO i normalizuj do najwyższej objętości, aby uzyskać równe stężenie DMSO w każdym odwiercie.
        UWAGA: stężenia DMSO powinny wynosić <1%. Dostarczono przykładowy plik miarewki leku TDD (Plik Uzupełniający 8).
      5. Kliknij strzałkę pod Uruchom w lewym górnym rogu, wybierz Zawsze symuluj, a następnie kliknij Symuluj , aby zidentyfikować błędy i uzyskać objętości każdego leku do przygotowania.
        UWAGA: Aby obejść ostrzeżenie, gdy początkowa objętość wydawania jest zbyt niska, zaleca się "Zalecane jest wydawanie ostrzeżeń o wartości 30 nL lub większej dla każdego płynu na każdej płycie", wybierz dwa dołki na krawędzi wypełnione wodą, wybierz Wartość Ustaw i wprowadź 10 μM leku, dla którego pojawia się ostrzeżenie. To przygotowuje wkład lekowy o objętości większej niż 30 nL. Te same wgłębienia można wykorzystać do zapełnienia wkładu DMSO, ustawiając normalizację do % całkowitej wartości objętości (np. 0,5%).
  2. Odznacz Zawsze symuluj pod przyciskiem Biegnij ; kliknij Run , aby rozpocząć protokół wydawania leków i postępować zgodnie z instrukcjami.
  3. Załóż membranę uszczelniającą na mikropłytkę, aby zapobiec parowaniu.
  4. Inkubuj barwnik Cytotox Green 1-2 godziny w temperaturze 37 °C w inkubatorze i przejdź do kroku 4.

4. Pobieranie obrazów za pomocą obrazowania na żywych komórkach

UWAGA: Aby ocenić tempo wzrostu i NDR, skan w punkcie czasowym 0 (T0 = rozpoczęcie leczenia) musi być wykonany 1-2 godziny po dodaniu Cytotox Green.

  1. Otwórz oprogramowanie sterujące obrazowaniem komórek żywych, wybierz Edytor Nowej Metody, przejdź do pliku > import i wybierz przykładowy plik XML metody (Plik Uzupełniający 9). Alternatywnie, utworz nowy plik i wybierz Płyta: (CORE384fb_OpticalImaging) - Corning 384 Flat Black (Corning #4588), No blanket i No humidity kaseta; Zastosowanie: Tylko obrazy; Cel: 4x; Wzór: Central; Sprawdź kanały Brightfield i Green (Natężenie LED (%) = 40; Czas ekspozycji (ms) = 200).
    UWAGA: Ustawienia kanału zielonego dobrze sprawdzają się przy stężeniu 60 nM Cytotox Green. Opcja Live viewer może być używana do regulacji offsetu ostrości i/lub ustawień LED w czasie rzeczywistym.
  2. Kliknij na Start, aby rozpocząć skanowanie od T0.
  3. Powtarzaj skan co 24 godziny przez maksymalnie 5 dni tą samą metodą. Alternatywnie, aby automatycznie wykonać pomiar timelapse, dostosuj metodę w oprogramowaniu Live-cell imager Control do eksperymentu kinetycznego, klikając i przeciągając zakładkę Kinetic Loop do pola metody . Podobnie, zakładki Temperatura i Gaz muszą zostać przeciągnięte do pola metody , aby ustawić system na 37 °C i 5%CO2 , aby zapewnić odpowiednie warunki w obrazowniku z żywymi komórkami podczas eksperymentu.

5. Analiza obrazów i danych

  1. Łączenie i kompresja danych
    1. Oprogramowanie Live-cell imager Control generuje folder dla każdego skanu w każdym punkcie czasowym. Stwórz nowy folder, skopiuj poszczególne foldery eksperymentów do tego nowego folderu nadrzędnego i dodaj _0h, _24h, _48h, _72h, _96h i _120h do odpowiednich nazw folderów eksperymentów.
    2. Przygotuj mapę płyt XLSX z cyfrowego oprogramowania Drug Recepter Control po kliknięciu prawym przyciskiem na układ mapy płyt z protokołu wydawania leków i skopiuj wszystkie dołki; Wklej dane do pliku XLSX. Usuń dane Cytotox Green i staurosporyny oraz dodaj macierz dla linii komórkowej i replikacji. Wprowadź ctrl- i ctrl+. Zobacz Plik Uzupełniający 10 dla przykładowej mapy tablic.
    3. Otwórz narzędzie do kompresji danych, kliknij Przeglądaj, wybierz folder nadrzędny i kliknij Uruchom, aby rozpocząć kompresję danych obrazu. Wszystkie pliki obrazów TIFF dla różnych punktów czasowych są kompresowane do jednego HDF5 dla każdego wstudu w nowym folderze zbiorów danych w folderze rodzicielskim.
  2. Analiza obrazu
    1. Wejdź na platformę aplikacji webowej do analizy obrazów, zaloguj się i kliknij Dodaj nowy projekt w zakładce Home . Wpisz nazwę projektu, kontynuuj, wybierz Dodaj nowy eksperyment i prześlij folder zestawu danych zawierający pliki HDF5.
    2. Po przesłaniu przejdź do folderu projekt i eksperyment i kliknij Upload Platemap, aby uzyskać dodatkowe funkcje. Kliknij Uruchom analizę, wybierz analizę wieloorganoidalną, Domyślne parametry i kliknij Analizuj, aby rozpocząć analizę obrazu.
    3. Kliknij na Pobierz wyniki , aby pobrać surowe tabele danych zawierające pomiary dla każdej studni (np. całkowita powierzchnia jasnego pola, całkowita zielona strefa fluorescencji itp.) oraz segmentowane obrazy/filmy potwierdzające dokładność analizy i dalszego przetwarzania danych.
  3. Metryki odpowiedzi na leki oparte na tempie wzrostu oraz normalizowana odpowiedź lekowa
    1. Wybierz plik Raw_NDR.xlsx z folderu wyników (wymagana mapa płyt) (Plik Uzupełniający 11) i załaduj go do Official_NDR_7point skryptu R-script (Plik Dodatkowy 12), aby automatycznie wygenerować tabele wartości GR (znormalizowane do ctrl-) i NDR (znormalizowane do ctrl- i ctrl+) (Plik Uzupełniający 13, Plik Uzupełniający 14, Plik Uzupełniający 15 oraz Plik Uzupełniający 16). Wartości GR i NDR oblicza się na podstawie parametru pokazanego w równaniu (1) przy użyciu skryptu R (Plik Uzupełniający 12).
      Całkowita powierzchnia przetrwania = Całkowita powierzchnia Brightfield - Całkowita powierzchnia zieleni (1)
      Gdzie 0 < NDR <1 = efekt cytostatyczny (zatrzymanie wzrostu), a NDR < 0 = odpowiedź cytotoksyczna (śmierć komórki).
      UWAGA: Pismo R zostało zaadaptowane z Gupta i in.6.
    2. Z tabeli clonal_data.xlsx pobierz dane odpowiedzi pojedynczych organoidów i wykreśl je jako wykres bańkowej.
    3. Użyj czynnika Z10 do oceny jakości testu na narkotyki w serii (patrz równanie (2)). Odrzuć eksperyment z czynnikiem Z < 0,5.
      figure-protocol-1(2)

Wyniki

Automatyczny protokół pipetowania zapewnia równomierny rozkład PDAC_060 PDTO we wszystkich kolumnach mikropłytki 384-dołkowej (Rysunek 2A). Jak można się spodziewać, zaobserwowano różnice w liczbie i średniej powierzchni PDTO pomiędzy odwiertami (Rysunek 2A,B). Całkowity obszar przeżycia (całkowity obszar jasnego pola – całkowity zielony obszar) łączy segmentację organoidów bez oznakowania z sygnałem śmierci komórkowej opartym na fluorescencji i z naszego doświadczenia jest najbardziej odpornym parametrem do badania odpowiedzi na leki w czasie (rysunek 2C)8. Aby uwzględnić różnice w zasiewaniu komórek i wielkości organoidów, należy stosować wskaźniki oparte na tempie wzrostu w celu ograniczenia różnic między replikacjami, co pokazują zmniejszone paski błędu na Rysunku 2D w porównaniu do Rysunku 2C, oraz wyższy współczynnik Z, co wskazuje na znacznie lepszą jakość badań narkotykowych (Rysunek 2E).

Krzywa dawka-odpowiedź NDR (Rysunek 2G), znormalizowana do ctrl- i ctrl+, jest wyraźnie lepsza od krzywej dawka-odpowiedź GR (Rysunek 2F), znormalizowana do ctrl-, ponieważ zwiększa separację krzywych odpowiedzi leków i dokładniej oddaje odpowiedzi cytotoksyczne. Przykład powiązanych obrazów dla PDTO z gemcitabiną/80 nM paclitakselem leczonym przez ctrl-, ctrl+ oraz 400 nM, przedstawiono na Rysunku 3. Ciekawą obserwacją jest to, że cytotoksyczny efekt gemcytabiny dominował w terapii skojarzonej, ponieważ nie zaobserwowano dodatkowej wartości paklitakselu.

Następnie użyto dwóch dodatkowych linii PDTO, PDAC_052 i PDAC_087. Zaobserwowano wyraźną różnicę w tempie wzrostu między tymi liniami (Rysunek 4A), co wspiera zastosowanie wskaźników GR. Ponownie, krzywe dawka-odpowiedź NDR (rysunek 4C) skutkowały zwiększonym zakresem dynamicznym i rozdzieleniem między trzema różnymi pacjentami w porównaniu do krzywych GR (rysunek 4B). Ponadto protokół pozwala na określenie NDR w czasie i pokazuje, że PDAC_052 i PDAC_060 miały bardzo podobną odpowiedź cytostatyczną na lek do niskiej dawki gem-pac (rysunek 4D), podczas gdy dla średnich (rysunek 4E) i wysokich (rysunek 4F) gem-pac można zaobserwować wyraźną różnicę cytostatyczną i cytotoksyczną. Te odpowiedzi na leki były zgodne z klinicznymi reakcjami obserwowanymi u pacjentów (Rysunek 4G).

Wreszcie, główną zaletą podejścia i oprogramowania jest możliwość ilościowego określenia odpowiedzi leków na pojedyncze organoidy, aby badać heterogeniczność odpowiedzi i identyfikować potencjalnie oporne subklony. Rysunek 5 przedstawia jasny przegląd dynamiki klonalnej różnych pacjentów i pokazuje, że PDAC-087 miał najbardziej oporne podklony po leczeniu, co jest zgodne z agresywną i wysoce oporną chorobą obserwowaną u pacjenta. Co ciekawe, ten pacjent był również najmniej wrażliwy na ctrl+ staurosporin.

figure-results-1
Rysunek 1: Przegląd przepływu pracy. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Dokładność zasiewania i metryki odpowiedzi na leki. (A) Liczba organoidów/dołek PDAC_060 PDTO zasiewanych w mikropłycie z 384 dołkami za pomocą robota pipetowania. Każda kropka reprezentuje liczbę w pojedynczej studni, a wykresy są oddzielone kolumnami mikropłyt z 384 dołkami. (B) Średni obszar/studnia PDTO. (C) całkowita powierzchnia przeżycia (całkowita powierzchnia jasnego pola – całkowita zielona powierzchnia) oraz (D) tempo wzrostu (całkowita powierzchnia przeżycia znormalizowana do T0 = 1) PDAC_060 PDTO leczonych stosunkiem 5:1 gemcytabiny/paklitakselu. (E) Czynnik Z jako miara jakości testu. (F) Krzywa szybkości-dawka odpowiedzi znormalizowana do ctrl- i (G) znormalizowana krzywa odpowiedzi na lek znormalizowana do ctrl- i ctrl+. Paski błędu wskazują średnią ± SD dwóch odwiertów. Skróty: PDAC = gruczolapak przewodów trzustki; PDTO = organoid nowotworowy pochodzący od pacjenta; GR = tempo wzrostu; NDR = znormalizowana odpowiedź na lek. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-3
Rysunek 3: Przykładowe obrazy. Reprezentatywne obrazy PDAC_060 PDTO traktowane vehicleem (ctrl-), 400 nM gemcitabiną/80 nM paklitakselem oraz 2 μM staurosporyną (ctrl+). Lewa kolumna pokazuje obrazy jasnego pola, środkowa kolumna pokazuje sygnał fluorescencyjny Cytotox Green, a prawa kolumna pokazuje bezetykietowe obrazy z adnotacjami jasnymi polami za pomocą modułu analizy organoidów. Pręty skalowe = 100 μm. Skróty: PDAC = gruczolapak przewodów trzustki; PDTO = organoid nowotworowy pochodzący od pacjenta; GemPac = gemcitabina/paklitaksel. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-4
Rysunek 4: Porównanie odpowiedzi na leki międzypacjentów. (A) Porównanie tempa wzrostu (na podstawie całkowitej powierzchni przeżycia) linii PDTO PDAC_052, PDAC_060 i PDAC_087. (B) Krzywa szybkości-dawka odpowiedzi znormalizowana do ctrl- i (C) znormalizowana krzywa odpowiedzi leku znormalizowana do ctrl- i ctrl+. Kinetyczny NDR o (D) niskim, (E) środkowym i (F) wysokiej dawce gemcytabiny/paklitakselu (stosunek 5:1). (G) Cechy kliniczne pacjentów z PDAC. Paski błędu wskazują średnią ± SD dwóch odwiertów. Skróty: PDAC = gruczolapak przewodów trzustki; PDTO = organoid nowotworowy pochodzący od pacjenta; GR = tempo wzrostu; NDR = znormalizowana odpowiedź na lek; FFX = folfirinox. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-5
Rysunek 5: Metryki pojedynczego organoidu. Pojedyncza odpowiedź dawkowa narządowca oparta na śmierci komórki (obszar zielony/obszar jasnego pola) oraz obszarze (brightfield) PDAC_052, PDAC_060 i PDAC_087 PDTO leczonych vehicleem (ctrl-), 400 nM gemcitabiną/80 nM paklitakselem oraz 2 μM staurosporyną (ctrl+). Zielone obszary wskazują na żywotne organoidy; niebieskie obszary wskazują zakres x-as wykresów GemPac i ctrl+. Skróty: PDAC = gruczolapak przewodów trzustki; PDTO = organoid nowotworowy pochodzący od pacjenta; GemPac = gemcitabina/paklitaksel. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Tabor zawiesiny ogniwkowejKomórki/Upadek# Krople (20 μL)Stock (1/3)ECM (2/3)
1,13 × 107 ogniw/mL75,0001075 uL150 μL
1,13 × 107 ogniw/mL75,000540 uL80 μL

Tabela 1: Rozcieńczenie powłoki w kopułach ECM. Skrót: ECM = macierz zewnątrzkomórkowa.

ZwiązekStężenie zasobówRozcieńczeniuKoncentracja roboczaRozpuszczalnikStężenie studniKomentarze
Cytotox Green1 mM (DMSO)1/1010 μMDMSO60 nMMarker śmierci komórki
Cytotox Red 1 mM (DMSO)1/1010 μMDMSO250 nMMarker śmierci komórki
Caspase 3/7 Green5 mM (DMSO)1/22,5 mMDMSO2,5 μMMarker apoptotyczny
Hoechst20 mM (H2O)1/200100 μM0,33% Tween/PBS50 nMMarker jądrowy
Staurosporyna10 mM (DMSO)/1 - 10 mM/2 – 5 μMKontrola dodatnia
Gemcitabine10 mM (DMSO)/1 - 10 mM/MiareczkowanieChemioterapia
Paclitaksel10 mM (DMSO)/1 - 10 mM/MiareczkowanieChemioterapia
Cisplatyna5 mM (0,9% NaCl)1/22,5 mM0,6% Tween/PBSMiareczkowanieChemioterapia

Tabela 2: Przykładowe rozcieńczenia często stosowanych leków i fluorescencjowych odczynników. Każdy związek musi być rozpuszczony w 100% DMSO lub 0,3% Tween/PBS.

Tabela uzupełniająca S1: Przegląd kompatybilnych linii komórkowych nowotworowych. Szum: sferoidy nie są migrujące. Połączenie: sferoidy migrują do siebie i łączą się ze sobą. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 1: Narzędzie do obliczania roztworu do siewania organoidów. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 2: Plik STL do drukowania 3D na zamówienie 'Microplate Holder'. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 3: Plik STL do druku 3D na zamówienie '2 x 25 mL Reservoir Holder'. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 4: Plik JSON dla niestandardowego robota pipetującego laboratorium 'Microplate Holder'. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 5: Plik JSON dla niestandardowego robota pipetującego laboratorium '2 x 25 mL Reservoir Holder_WithCooler'. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 6: Plik JSON dla protokołu robota pipetującego 'Plating_ PDO_384well_Cooled_Row2-23'. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 7: Przegląd konfiguracji biurka robota pipetującego. (A) elementy chłodzące oraz (B) zbiornik i mikropłytę. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 8: Plik TDD dotyczący protokołu cyfrowego wydajnika leków. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 9: plik XML dla protokołu obrazowania z żywymi komórkami do obrazowania w świetle i fluorescencji. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 10: Przykładowa mapa płyt. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 11: Przykładowy plik wejściowy dla skryptu NDR R. Skrót: NDR = znormalizowana odpowiedź na lek. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 12: Znormalizowana odpowiedź na lek – recepta NDR R. Skrót: NDR = znormalizowana odpowiedź na lek. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 13: Przykładowy plik wyjściowy wartości GR skryptu NDR R. Skróty: GR = tempo wzrostu; NDR = znormalizowana odpowiedź na lek. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 14: Przykładowy plik wyjściowy skryptu NDR R z transponowanymi wartościami GR. Skróty: GR = tempo wzrostu; NDR = znormalizowana odpowiedź na lek. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik 15: Przykładowy plik wyjściowy z wartościami NDR skryptu NDR. Skrót: NDR = znormalizowana odpowiedź na lek. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 16: Przykładowy plik wyjściowy skryptu NDR R z transponowanymi wartościami NDR. Skrót: NDR = znormalizowana odpowiedź na lek. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Średnio- i wysokoprzepustowe badania PDTO często opierają się na odczytach, które wyciągają jedynie ułamek informacji, które organoidy mogą potencjalnie dostarczyć. Coraz bardziej jasne staje się, że aby szybko rozwijająca się technologia organoidów mogła realizować większy potencjał naukowy i kliniczny, niezbędne są bardziej zaawansowane testy, odczyty i metody analizy 3D. Opisano tutaj zaawansowany proces przesiewowy, który nie tylko zwiększa powtarzalność, ale także znacznie poprawia kliniczną translatowalność dzięki zastosowaniu obrazu obrazowego opartego na AI na żywych komórkach. Oprócz oprogramowania analitycznego opracowanego wewnętrznie, zastosowano także znormalizowaną metrykę odpowiedzi na leki (NDR), która wyraźnie pokazuje zdolność do definiowania specyficznych dla pacjenta różnic w odpowiedzi na leczenie6.

Uwzględnienie tego wskaźnika normalizacji niewątpliwie będzie miało ogromną wartość, przypominając, że liczne badania mają na celu wyznaczenie odpowiedzi na leczenie na podstawie drobnych różnic w powierzchni pod krzywą (AUC) lub półmaksymalnym stężeniu hamującym (IC50) (ponieważ większość krzywych dawka-odpowiedź nakłada się lub znajduje się blisko siebie)11,12. Metryki tempa wzrostu zostały już wdrożone w protokołach przesiewowych leków organoidów z wykorzystaniem testu opartego na ATP, ale opierają się na normalizacji studni referencyjnych zlikwidowanych w punkcie czasowym0-4. Natomiast ta metoda pozwala na normalizację tempa wzrostu wewnątrz studni, która uwzględnia nie tylko różnice w tempie wzrostu PDTO między pacjentami, ale także różnice między studniami wynikające ze zmian gęstości siewu i zależnych od lokalizacji płytek, co zwiększa powtarzalność. Ponadto dostosowaliśmy NDR, aby jeszcze bardziej zwiększyć rozdzielenie odpowiedzi na PDTO między pacjentami, uwzględniając dodatnią kontrolę dla normalizacji 6,8.

Ponadto analiza, kompatybilna z formatami wysokoprzepustowości i automatyzacji, pozwala dokładnie wykrywać pojedyncze odpowiedzi organoidalne, umożliwiając ilościowe określenie oporności subklonalnej – głównej siły napędowej nawrotu i postępu guza13. Na przykład, chociaż PDAC052 i PDAC060 wykazały dobrą odpowiedź na leczenie in vitro (na podstawie NDR), dodatkowa analiza pojedynczych organoidów pozwoliła wykryć niewielką (większą populację przy PDAC060) populację subklonów, które nie reagują na leczenie. Co ciekawe, bardzo odpowiadało to obserwacji klinicznej, biorąc pod uwagę, że PDAC052 i PDAC060 miały trwałą odpowiedź (nie wykryto aktywności guza), ale ostatecznie oba zdiagnozowano u nich miejscowy postęp guza (ze względu na obecność opornych klonów). W porównaniu z konwencjonalnymi odczytami 3D (test oparty na ATP oraz rozmiar/liczby), ten zaawansowany proces przesiewowy ma zwiększyć wydajność predykcyjną poprzez wydobycie bardziej istotnych informacji klinicznie od tych "pacjentów w laboratorium". Hipoteza ta jest obecnie testowana poprzez przesiewowe próbki kliniczne PDTO w laboratorium autorów tą metodą, aby powiązać ex vivo z odpowiedzią in vivo i wynikami klinicznymi.

Aby uzyskać więcej informacji na temat mechanizmów odpowiedzi na lek, konwencjonalne fluorescencyjne odczynniki obrazujące żywe komórki, oprócz barwników cytotoksycznych, są kompatybilne z tą metodą do badania mechanizmów śmierci komórkowej. Wcześniej wykazaliśmy kompatybilność tej metody z zielonym odczynnikiem Sartorius Caspase 3/7 w badaniu indukcji apoptozy zależnej od kaspazy po leczeniu cisplatyną8. Zgodność z innymi barwnikami do badania stresu oksydacyjnego (odczynniki CellROX) lub hipoksji (odczynniki Image-iT Hypoxia) pozostaje do sprawdzenia. Jednak te odczynniki zostały już skutecznie wykorzystane w modelach 3D in vitro 14,15.

Oprogramowanie do analizy obrazu jest również kompatybilne z innymi formatami płyt lub metodami hodowli (np. płytkami mikrokawitetowymi, kopułami ECM), jeśli można uzyskać wyraźne, ostre obrazy organoidów. Jest to często trudne dla organoidów hodowanych w kopułach, ponieważ rosną w różnych płaszczyznach z, co wymaga funkcjonalności z-stackingu mikroskopu, która nie zawsze jest dostępna. Dlatego zalecamy stosowanie mikropłyt ULA 384-dołków z płaskim dnem, aby zapewnić obrazy o odpowiedniej jakości.

Ponadto analiza jest kompatybilna z innymi systemami obrazowania z żywymi komórkami, co wcześniej pokazano dla obrazów z kontrastem fazowym wykonanych systemem IncuCyte ZOOM8. Ograniczeniem systemu obrazowania żywych komórek Spark Cyto, który został użyty w tym manuskrypie, jest pojemność jednej płyty do pomiarów kinetycznych. Jednak rozszerzenie Spark Motion zwiększa jego pojemność do nawet 40 mikropłyt, które można przesiewać hurtowo. Kompatybilność oprogramowania opracowanego wewnętrznie zostanie rozszerzona na te i inne systemy, oferując rozwiązanie niezależne od platformy, z celem standaryzacji i automatyzacji potoków analizy obrazów i danych. Aplikacja internetowa będzie również zawierać interaktywne narzędzia do grafowania oraz automatyczne obliczenia wskaźników leków, jak pokazano w tym artykule, aby skrócić czas ręcznej analizy.

Algorytm segmentacji PDTO bez oznak został wytrenowany i przetestowany na różnych wewnętrznych modelach sferoidnych i PDTO z wyraźnymi różnicami morfologicznymi (stałe, półstałe, torbielowate), i w związku z tym może je wykrywać z dużą dokładnością8. Ograniczeniem modelu jest to, że obecność torbielowatych PDTO zwiększyła niepożądane wykrywanie pęcherzyków obecnych w dołku po zasiewaniu. Jednak inkubacja nocna wystarczyła, by usunąć większość tych bąbelków, co pozwoliło na jakościowe skanowanie punktu 0. Dokładność segmentacji obrazów organoidów oraz metody muszą być weryfikowane przez innych użytkowników, a na podstawie ich informacji zwrotnej oprogramowanie może być dalej trenowane, aby uzyskać solidny i zautomatyzowany algorytm analizy obrazów. Ponadto dążymy do uzyskania większej liczby danych klinicznych, aby powiązać odpowiedź ex vivo na leki zidentyfikowaną tą metodą z odpowiedzią kliniczną pacjenta, aby zidentyfikować najlepsze parametry przewidywania odpowiedzi na terapię oraz dalej rozwijać tę metodę w funkcjonalnej precyzyjnej medycynie nowotworów16.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Część tych badań została sfinansowana z darowizn od różnych darczyńców, w tym Dederta Schilde vzw i pana Willy'ego Florena. Prace te są częściowo finansowane przez Flandrijską Fundację Badawczą, 12S9221N (A.L.), G044420N (S.V., A.L., E.G), 1S27021N (M.L) oraz przez Industrial Research Fund Uniwersytetu w Antwerpii, PS ID 45151 (S.V., A.L., C.D.). Rysunek 1 został stworzony za pomocą BioRender.com.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Płyta 6-dołkowaGreiner657160
8-kanałowa pipeta p300 (GEN 2)Opentrony
300 &mikro; L TipsOpentrony
Mikropłytka ULA z płaskim dnem z 384 dołkamiCorning4588minimalna objętość 50 & mikro; L 
Płytka ULA z płaskim dnem z 384 dołkamiPerkin Elmer6057802minimalna objętość 75 & micro; L 
A8301Tocris Bioscience2939
ADF+++Zaawansowane DMEM/F12, 1% glutaMAX, 1% HEPES, 1% penicylina/streptomycyna
Zaawansowany DMEM/F-12ThermoFisher Scientific12634
B27ThermoFisher Scientific17504044
Membrana uszczelniająca Breathe EasySigma-AldrichZ380059
Caspase 3/7 Green Sartorius4440
Slajdy do liczenia komórek dla TC10/TC20Laboratoria Bio-Rad1450017
CellTiter-Glo 3DPromegaG9681Badanie ATP
Chłodzenie do zbiornika 25 mLVWR (Zdywersyfikowana Biotechnologia)490006-908
Element chłodzący 12 x 8 x 3 cmBol.com9200000107744702Dla niestandardowego uchwytu na mikropłyty OT-2
Roztwór do pozyskiwania organoidów CultrexR& Układy D3700-100-01
Ścieżka kultrexuOczyszczony obniżony czynnik wzrostu BME, typ 2 R& Układy D3533-010-02macierz zewnątrzkomórkowa (ECM)
Cytotox GreenSartorius4633
Cytotox RedSartorius4632
D300eTecanCyfrowy dystrybutor leków
D300e Control v3.3.5TecanOprogramowanie sterujące D300e
FGF10Peprotech100-26
Pełne mediumADF+++ uzupełnione 0,5 nM białkiem zastępczym Fc-Fuzji, medium kondycjonowanym białkiem Noggin-Fc Fuzyjnym, medium kondycjonowanym białkiem Frfo3-Fc o 4% Rpso3-Fc Fusion Protein, 1x B27, 1 mM N-acetylocysteiny (NAC), 5 mM nikotynamidu, 500 nM A83-01, 100 ng/mL FGF10 oraz 10 nM gastryny
GastrynaSigma-AldrichG9145
GemcitabineSelleck ChemicalsS1714
GlutaMAXThermoFisher Scientific35050
HEPESThermoFisher Scientific15630056
Roztwór Hoechst 33342 (20 mM)ThermoFisher Scientific62259
Ludzkie organoidy wywodzące się od pacjentów z gruczolakorakiem przewodu trzustki (PDAC)Biobank@uza (Antwerpia, Belgia; ID: BE71030031000; Belgijski Wirtualny Tumorbank finansowany przez Narodowy Plan Walki z Rakiem)
N-acetylocysteinaSigma-AldrichA9165-25G
NikotynamidSigma-AldrichN0636-100G
Noggin-Fc Fusion Protein conditioned mediumImmunoprecyzyjneN002
Aplikacja Opentrons v6.0.1OpentronyOprogramowanie sterujące OT-2
Narzędzie do projektowania protokołów OpentronsOpentronyhttps://designer.opentrons.com/
Narzędzie do kompresji danych Orbitswww.orbits-oncology.com lub skontaktuj się z autorem korespondencyjnym
Aplikacja internetowa do analizy obrazów orbitsUniwersytet w Antwerpiiwww.orbits-oncology.com lub skontaktuj się z autorem korespondencyjnym
OT-2OpentronyRobot pipetujący
PaclitakselSelleck ChemicalsS1150
Pasteur Pipette 230 mm NovolabA33696
Penicylina-StreptomycynaThermoFisher Scientific15140
Prism 9GraphPad
Rspo3-Fc Fusion Protein kondycjonowane mediumImmunoprecyzyjneN003
Spark Cyto 600TecanObrazowanie na żywych komórkach i wielomodowy czytnik płyt
SparkControl v3.1TecanOprogramowanie sterujące Spark Cyto
StaurosporynaTocris Bioscience1285
Zbiornik sterylny 25 mLVWR (Zdywersyfikowana Biotechnologia)10141-922
T8 plus kasetaTecan
TC20Laboratoria Bio-RadAutomatyczny licznik komórek
TrypLEThermoFisher Scientific12604-021Enzym dysocjacyjny
Tween-20Acros Organics233360010
Białko WNT Surrogate-Fc-FusionImmunoprecyzyjneN001
Y-27632Selleck ChemicalsS1049

Bibliografia

  1. Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
  2. Veninga, V., Voest, E. E. Tumor organoids: Opportunities and challenges to guide precision medicine. Cancer Cell. 39 (9), 1190-1201 (2021).
  3. Le Compte, M., et al. Patient-derived organoids as individual patient models for chemoradiation response prediction in gastrointestinal malignancies. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 157, 103190(2021).
  4. Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications. Nature Protocols. 15 (10), 3380-3409 (2020).
  5. Hafner, M., Niepel, M., Chung, M., Sorger, P. K. Growth rate inhibition metrics correct for confounders in measuring sensitivity to cancer drugs. Nature Methods. 13 (6), 521-527 (2016).
  6. Gupta, A., Gautam, P., Wennerberg, K., Aittokallio, T. A normalized drug response metric improves accuracy and consistency of anticancer drug sensitivity quantification in cell-based screening. Communications Biology. 3 (1), 42(2020).
  7. Rios, A. C., Clevers, H. Imaging organoids: a bright future ahead. Nature Methods. 15 (1), 24-26 (2018).
  8. Deben, C., Cardenas, E., et al. OrBITS: label-free and time-lapse monitoring of patient derived organoids for advanced drug screening. Cellular Oncology. , (2022).
  9. Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. Bioessays. 39 (8), (2017).
  10. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
  11. Engel, R. M., et al. Patient-derived colorectal cancer organoids upregulate revival stem cell marker genes following chemotherapeutic treatment. Journal of Clinical Medicine. 9 (1), 128(2020).
  12. Hennig, A., et al. Detecting drug resistance in pancreatic cancer organoids guides optimized chemotherapy treatment. The Journal of Pathology. 257 (5), 607-619 (2022).
  13. D'Alterio, C., Scala, S., Sozzi, G., Roz, L., Bertolini, G. Paradoxical effects of chemotherapy on tumor relapse and metastasis promotion. Seminars in Cancer Biology. 60, 351-361 (2020).
  14. Njoroge, R. N., et al. Organoids model distinct Vitamin E effects at different stages of prostate cancer evolution. Scientific Reports. 7 (1), 16285(2017).
  15. Godet, I., et al. Fate-mapping post-hypoxic tumor cells reveals a ROS-resistant phenotype that promotes metastasis. Nature Communications. 10 (1), 4862(2019).
  16. Letai, A. Functional precision cancer medicine-moving beyond pure genomics. Nature Medicine. 23 (9), 1028-1035 (2017).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Przesiewowe badania organoid w nowotworowychanaliza odpowiedzi na lekiorganoidy pochodz ce od pacjent wobrazowanie szerokopolowewska niki tempa wzrostuwysokoprzepustowe badania przesiewoweoprogramowanie do analizy obrazuodpowied na leki cytostatyczne
Wieloparametryczne badanie leków na leki w nowotworach organoidalnych z wykorzystaniem obrazowania szerokopolowego z użyciem żywych komórek do analizy objętości i pojedynczych organoidów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.