Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ustalanie organoidów endometrialnych 3D z macicy myszy

8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64448

⸱

6 stycznia 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology & Immunology, Baylor College of Medicine, 2Center for Drug Discovery, Baylor College of Medicine, 3Departments of Molecular Virology and Microbiology and Medicine, Baylor College of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje metodologie tworzenia organoidów nabłonka endometrium myszy do ekspresji genów i analiz histologicznych.

Streszczenie

Tkanka endometrium pokrywa wewnętrzną jamę macicy i jest pod cykliczną kontrolą estrogenu i progesteronu. Jest to tkanka składająca się z nabłonka świetlnego i gruczołowego, przedziału zrębu, sieci naczyniowej i złożonej populacji komórek odpornościowych. Modele mysie są potężnym narzędziem do badania endometrium, ujawniając krytyczne mechanizmy kontrolujące implantację, łożysko i raka. Niedawny rozwój 3D hodowli organoidów endometrialnych przedstawia najnowocześniejszy model do analizy szlaków sygnałowych, które leżą u podstaw biologii endometrium. Ustalanie organoidów endometrialnych na podstawie genetycznie modyfikowanych modeli myszy, analiza ich transkryptomów i wizualizacja ich morfologii w rozdzielczości pojedynczej komórki są kluczowymi narzędziami do badania chorób endometrium. W artykule przedstawiono metody tworzenia kultur 3D nabłonka endometrium od myszy i opisano techniki ilościowego określania ekspresji genów i analizy histologii organoidów. Celem jest zapewnienie zasobów, które można wykorzystać do ustanowienia, hodowli i badania ekspresji genów i cech morfologicznych organoidów nabłonka endometrium.

Wprowadzenie

Endometrium - wewnętrzna błona śluzowa jamy macicy - jest unikalną i wysoce dynamiczną tkanką, która odgrywa kluczową rolę w zdrowiu reprodukcyjnym kobiety. W okresie rozrodczym błona śluzowa macicy może przejść setki cykli proliferacji, różnicowania i rozpadu, koordynowanych przez skoordynowane działanie hormonów jajnikowych - estrogenu i progesteronu. Badania na genetycznie modyfikowanych myszach ujawniły podstawowe mechanizmy biologiczne leżące u podstaw odpowiedzi endometrium na hormony i kontrolę implantacji zarodka, decydualizację komórek zrębu i ciążę1. Badania in vitro były jednak ograniczone ze względu na trudności w utrzymaniu nieprzekształconych pierwotnych tkanek endometrium myszy w tradycyjnych hodowlach komórkowych 2D2,3. Ostatnie postępy w hodowli tkanek endometrium jako trójwymiarowych układów narządów lub organoidów stanowią nową okazję do zbadania szlaków biologicznych kontrolujących regenerację i różnicowanie komórek endometrium. Mysie i ludzkie systemy organoidów endometrium zostały opracowane z czystego nabłonka endometrium zamkniętego w różnych matrycach4,5, podczas gdy ludzka endometrium została wyhodowana jako kokultura nabłonkowa/zrębowa bez rusztowań6,7, a ostatnio jako asembloidy nabłonkowe/zrębowe otoczone kolagenem8. Potencjał wzrostu i regeneracji nabłonkowych kultur organoidów jest wspierany przez zdefiniowany koktajl czynników wzrostu i inhibitorów małych cząsteczek, które zostały empirycznie określone w celu maksymalizacji wzrostu i regeneracji organoidów4,5,9. Co więcej, zdolność do zamrażania i rozmrażania organoidów endometrialnych pozwala na długoterminowe przechowywanie organoidów endometrialnych od myszy i ludzi do przyszłych badań.

Genetycznie modyfikowane myszy odkryły skomplikowane szlaki sygnałowe, które kontrolują wczesną ciążę i decydualizację, i były używane jako modele utraty ciąży, raka endometrium i endometriozy. Te badania genetyczne zostały w dużej mierze osiągnięte dzięki specyficznej dla komórki delecji alleli flankowanych loxP ("floxed") przy użyciu rekombinaz cre, które są specyficznie aktywne w żeńskich tkankach rozrodczych. Te modele myszy obejmują szeroko stosowany receptor progesteronu-cre10, który ma silną aktywność rekombinazy w tkankach nabłonka endometrium i zrębu, laktoferynę i-cre, która indukuje rekombinację nabłonka endometrium u dorosłych myszy11, lub Wnt7a-cre, która wyzwala specyficzną dla nabłonka delecję w tkankach pochodzących z Müllera12. Hodowla tkanek endometrium z genetycznie modyfikowanych modeli myszy jako organoidów 3D stworzyła doskonałą okazję do zbadania biologii endometrium i ułatwienia identyfikacji czynników wzrostu i szlaków sygnałowych, które kontrolują odnowę i różnicowanie komórek endometrium13,14. Metody izolacji i hodowli tkanki endometrium myszy są opisane w literaturze i opisują zastosowanie różnych strategii enzymatycznych do izolacji nabłonka macicy w celu późniejszego wyhodowania organoidów nabłonka endometrium4. Podczas gdy poprzednia literatura zapewnia krytyczne ramy dla protokołów hodowli organoidów nabłonka endometrium4,5,6, ten artykuł zapewnia jasną, kompleksową metodę generowania, utrzymywania, przetwarzania i analizowania tych organoidów. Standaryzacja tych technik jest ważna dla przyspieszenia postępu w dziedzinie biologii rozrodu kobiet. W tym miejscu przedstawiamy szczegółową metodologię enzymatycznego i mechanicznego oczyszczania tkanki nabłonka endometrium myszy w celu późniejszej hodowli organoidów endometrialnych w rusztowaniu z matrycą żelową. Opisano również metodologie dalszych analiz histologicznych i molekularnych organoidów nabłonka endometrium myszy w żelowej matrycy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Badania eksperymentalne i obchodzenie się z myszami zostały przeprowadzone zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Baylor College of Medicine oraz wytycznymi ustanowionymi przez NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.

1. Izolacja nabłonka macicy od myszy za pomocą metod enzymatycznych i mechanicznych

UWAGA: Ta sekcja opisuje kroki wymagane do ustanowienia, przejścia, zamrożenia i rozmrożenia organoidów nabłonkowych endometrium od myszy za pomocą rusztowania z matrycą żelową. Wcześniejsze badania wykazały, że optymalne hodowle organoidów endometrialnych myszy są tworzone na podstawie myszy w fazie rui4, co można określić za pomocą badania cytologicznego wymazu z pochwy15. Do wszystkich eksperymentów wykorzystano dorosłe samice myszy WT (6-8 tygodni, hybryda C57BL/6J i 129S5/SvEvBrd). Myszy zostały humanitarnie poddane eutanazji zgodnie z wytycznymi IACUC przy użyciu sedacji izofluranem, a następnie dezartykulacji szyjki macicy. Po uśmierceniu myszy należy postępować zgodnie z następującymi krokami. Szczegółowe informacje na temat materiałów i rozwiązań stosowanych w tym protokole można znaleźć w Tabeli Materiałów.

  1. Przed użyciem pozostaw matrycę żelową do rozmrożenia na lodzie przez około 1-2 godziny.
  2. Aby wypreparować mysz, użyj nożyczek, aby wykonać nacięcie w linii środkowej na brzuchu i delikatnie oderwij skórę, aby odsłonić leżącą pod spodem warstwę otrzewnej. Użyj kleszczy, aby przytrzymać warstwę otrzewnej i wykonaj boczne nacięcia nożyczkami, aby odsłonić zawartość brzucha.
    1. Zlokalizuj rogi macicy, delikatnie odsuwając na bok poduszeczki tłuszczowe brzucha. Wypreparuj je, najpierw trzymając je na skrzyżowaniu szyjki macicy i używając nożyczek do przecięcia wzdłuż tłuszczu krezkowego. Po rozbiorze macicy myszy dokładnie usuń tkankę tłuszczową z rogu macicy małymi nożyczkami.
      UWAGA: Zachowaj sterylność podczas izolacji komórek, sterylizując wszystkie narzędzia chirurgiczne przed użyciem, spryskaj brzuch myszy 70% etanolem i wykonaj wszystkie czynności po sekcji pod sterylnym kapturem do hodowli tkanek.
  3. Pokrój każdy róg macicy na małe fragmenty, z których każdy mierzy około 4-5 mm.
  4. Umieść wszystkie fragmenty macicy z jednej macicy w jednym dołku 24-dołkowej płytki zawierającej 0,5 ml 1% trypsyny. Pozwól, aby roztwór enzymatyczny dostał się do światła macicy, powodując enzymatyczne oddzielenie nabłonka endometrium od leżącego poniżej zrębu.
  5. Inkubować 24-dołkową płytkę w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C przez około 1 godzinę.
  6. Po 1 godzinnej inkubacji przenieść fragmenty macicy na 35-milimetrową płytkę do hodowli tkankowej zawierającą 1 ml buforowanego fosforanem roztworu (DPBS) firmy Dulbecco.
  7. Pod mikroskopem preparacyjnym użyj cienkich kleszczyków i pipety o pojemności 1 ml, aby mechanicznie oddzielić nabłonek macicy od jajowodu. Przytrzymując kleszczami jeden koniec fragmentu macicy, delikatnie przesuń końcówkę pipety wzdłuż fragmentu, wyciskając nabłonek z drugiego końca jajowodu. Obserwuj oddzielone arkusze nabłonka od fragmentu macicy pod mikroskopem preparacyjnym
    8. .
  8. Za pomocą pipety o pojemności 1 ml zebrać i delikatnie przenieść arkusze nabłonka do probówki o pojemności 1,5 ml.
  9. Powtórz ten proces dla pozostałych fragmentów macicy, przenosząc wszystkie arkusze nabłonka do tej samej probówki zbiorczej.
  10. Zdysocjowane arkusze nabłonka osadzać przez odwirowywanie przez 5 minut w temperaturze 375 × g.
  11. Ostrożnie usunąć supernatant, aby uniknąć naruszenia osadu komórkowego.
  12. Zawiesić osad komórkowy w 0,5 ml roztworu kolagenazy o stężeniu 2,5 mg/ml + 2 mg/ml roztworu DNazy. Pipetować w górę i w dół około 10 razy lub do uzyskania zawiesiny jednokomórkowej.
  13. Dodać 0,5 ml DMEM/F12 + 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) + antybiotyki i odwirowywać komórki przez 5 minut w temperaturze 375 × g.
    UWAGA: Dodatkowe informacje na temat antybiotyku o szerokim spektrum działania stosowanego w hodowli komórkowej znajdują się w Tabeli materiałów.
  14. Ostrożnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1 ml DMEM/F12 + 10% FBS + antybiotyki. Odwirowywać komórki przez 5 minut w temperaturze 375 × g.

2. Przetwarzanie przedziału zrębu

UWAGA: Ta sekcja przedstawia protokoły niezbędne do izolacji zrębu endometrium myszy. Biorąc pod uwagę rosnące zainteresowanie eksperymentami z kokulturą nabłonkową/zrębową, ważne jest, aby móc przetwarzać populacje komórek zrębu oprócz komórek nabłonkowych, które będą generować organoidy.

  1. Gdy cały nabłonek zostanie enzymatycznie i mechanicznie oddzielony od fragmentów macicy, pozostałe struktury przypominające rurki są przedziałami "zrębu/mięśniówki". Zebrać tę tkankę w 2,5 mg/ml kolagenazy + 2 mg/ml DNazy w roztworze HBSS.
  2. Inkubować próbkę zrębu/mięśniówki macicy w wytrząsarce o temperaturze 37 °C przez 15 minut.
  3. Po inkubacji dodać 500 μl DMEM/F12 + 10% FBS + antybiotyki na mysz i przefiltrować niezdysocjowane fragmenty przez filtr komórkowy 40 μm.
  4. Granulować komórki przez odwirowywanie przez 5 minut w temperaturze 375 × g.
  5. Ostrożnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml DMEM/F12 + 10% FBS + antybiotyki. Dodawać mieszaninę kroplami do 10 ml DMEM/F12 + 10% FBS + antybiotyków na 10 cm płytce do hodowli komórkowej. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze do hodowli komórkowych.
  6. Aby wygenerować kohodowle komórek nabłonka endometrium i zrębu myszy, postępuj zgodnie z metodami opisanymi dla ludzkich organoidów endometrium przy użyciu systemów macierzy kolagenowych bez rusztowań lub kolagenowych6,8.
    UWAGA: Chociaż techniki te nie zostały jeszcze opublikowane dla myszy, można je dostosować w oparciu o opublikowane protokoły z ludzkim endometrium.

3. Enkapsulacja nabłonka macicy w matrycy żelowej w celu utworzenia organoidów

UWAGA: Trzymaj matrycę żelową na lodzie, dopóki nie będzie gotowa do użycia.

  1. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w objętości matrycy żelowej 20 razy większej niż objętość osadu komórkowego (tj. jeśli osad komórkowy ma 20 μl, ponownie zawiesić komórki za pomocą 400 μl matrycy żelowej). Ostrożnie zawieś granulkę, aby uniknąć wprowadzenia pęcherzyków.
  2. Pozostawić zawiesinę żelu/komórek do osiądnięcia w temperaturze pokojowej przez ~10 min.
  3. Gdy zawiesina matrycy/komórek żelu stanie się żelem półstałym, użyj mikropipety P200 z końcówką o szerokim otworze 200 μl, aby delikatnie zassać 25 μl zawiesiny matrycy/komórek żelu. Dozować trzy oddzielne kopuły o pojemności 25 μl na dołek 12-dołkowej płytki i pozostawić matrycę żelową do utwardzenia przez 15 minut w wilgotnym inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C.
  4. Po utwardzeniu matrycy żelowej dodać 750 μl pożywki organoidowej do każdej studzienki zawierającej kopułki z matrycy żelowej. Inkubować w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze do hodowli tkankowych.
    UWAGA: Skład podłoża organoidowego jest wymieniony w Tabeli materiałów. Organoidy zwykle tworzą się w ciągu 4 dni od początkowej hodowli.

4. Analiza ekspresji genów w organoidach endometrium po leczeniu estradiolem

UWAGA: Ta sekcja opisuje metody używane do profilowania ekspresji genów organoidów nabłonka endometrium za pomocą qPCR w czasie rzeczywistym po leczeniu estradiolem (E2; patrz Tabela 1). Ponieważ endometrium znajduje się pod cykliczną kontrolą hormonu jajnikowego E2, badanie reakcji organoidów na E2 jest ważną miarą funkcji fizjologicznych. Uzyskaliśmy wysokiej jakości RNA i wygenerowaliśmy wystarczającą ilość mRNA do profilowania ekspresji genów za pomocą qPCR i/lub sekwencjonowania RNA z naszych organoidów nabłonka endometrium. W tej sekcji opisano, jak zbierać organoidy i przetwarzać je w celu dalszej analizy ekspresji genów. Wybrana pożywka zabiegowa odzwierciedla pożywkę stosowaną w leczeniu hodowanych komórek endometrium. Należy jednak zauważyć, że to podłoże zabiegowe można odpowiednio zoptymalizować, tak jak w przypadku leczenia ludzkich kultur endometrium 3D za pomocą hormonów8,16,17.

  1. Hoduj organoidy endometrialne, jak opisano powyżej.
  2. Usuń pożywkę organoidową i zastąp ją 750 μl pożywki głodowej cztery dni po wysianiu. Inkubować przez noc.
  3. Następnego ranka usuń pożywkę głodową. Dodać 750 μl pożywki zawierającej podłoże lub 10 nM E2. Inkubować przez 48 godzin.
  4. Kontynuuj izolację RNA zgodnie z protokołem producenta zestawu.

5. Analiza histologiczna organoidów endometrialnych

UWAGA: Obrazowanie cech morfologicznych organoidów endometrium jest kluczowe dla oceny efektu komórkowego czynników wzrostu, manipulacji genetycznych lub inhibitorów małych cząsteczek. W tej sekcji opisano techniki stosowane do utrwalania, przetwarzania i obrazowania organoidów nabłonka endometrium za pomocą barwienia histologicznego i barwienia immunofluorescencyjnego przeciwciał.

  1. Przygotować 1,5 ml probówek wirówkowych zawierających 1 ml 4% paraformaldehydu w 1x PBS. Umieść je na lodzie.
  2. Odessać pożywkę z dołków 12-dołkowej płytki zawierającej organoidy.
  3. Za pomocą końcówki do pipety o pojemności 1 ml z odciętą końcówką przenieś 500 μl 4% paraformaldehydu do każdego dołka i delikatnie odłącz kopułki matrycy żelowej od dna płytki.
  4. Delikatnie zassać całe kopułki z matrycą żelową do końcówki pipety i przenieść do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
  5. Utrwalić organoidy, umieszczając je na rotatorze w temperaturze 4 °C na noc.
  6. Następnego ranka odwirować probówkę o stężeniu 600 × g przez 5 minut, aby otopić organoidy. Delikatnie usunąć 4% roztwór paraformaldehydu za pomocą pipety i wyrzucić. Umyj organoidy 2x 70% etanolem.
  7. Po ostatnim praniu usuń z probówki wszystko, z wyjątkiem 50-100 μl. Odłóż rurkę na bok.
  8. Umieść tubkę żelu do przetwarzania próbek w łaźni wodnej i kuchence mikrofalowej na ~30 s, aby stopić żel. Upewnij się, że żel do przetwarzania próbki nie wykipi, monitorując konsystencję żelu.
    UWAGA: Gdy żel do przetwarzania próbek zostanie stopiony, ale nie wrzący gorący, pracuj szybko, aby zamknąć organoidy.
  9. Przenieść wystarczającą ilość żelu do obróbki próbki, aby pokryć całą powierzchnię formy (około 250 μl).
  10. Podczas gdy żel do przetwarzania próbek jest nadal stopiony, szybko przenieś 50 μl 70% roztworu etanolu zawierającego organoidy. Upewnij się, że organoidy są zatopione lub wepchnięte do dolnej części formy.
  11. Umieść formę histologiczną na wiadrze z lodem i pozwól, aby żel do przetwarzania próbki ostygł i zestalił się.
  12. Gdy żel do przetwarzania próbek całkowicie wyschnie, ostrożnie przenieś żel do przetwarzania próbek w kwadracie do worka na próbki, śledząc płaszczyznę, w której znajdują się organoidy.
  13. Umieść worek w kasecie histologicznej i poddaj go procesowi przy użyciu standardowych metod stosowanych do utrwalania formaliny i zatapiania parafiny w tkankach18.
  14. Po utrwaleniu i zatopieniu w parafinie, podziel na skrawki o wielkości 5 μm za pomocą mikrotomu19. Postępuj zgodnie ze standardowymi procedurami barwienia hematoksyliną i eozyną (H&E) lub barwieniem immunologicznym, jak opisano poniżej.

6. Barwienie hematoksyliną i eozyną

  1. Odparafinować skrawki w następujący sposób: ksylen, 2 x 10 min; 100% etanol, 2 x 3 min; 80% etanol, 3 min; 60% etanolu, 3 min; dH2O, 2 x 3 min; 1 min w hematoksylinie; woda z kranu (3 x 5 s); 1 min w eozynie.
  2. Odwodnić sekcje w następujący sposób: 60% etanol, 3 min; 80% etanolu, 3 min; 95% etanolu, 3 min; 100% etanolu, 2 x 3 min; ksylen, 2 x 15 min.
  3. Zamontuj za pomocą medium montażowego.

7. Barwienie immunofluorescencyjne

  1. Odparafinować skrawki zgodnie z opisem w kroku 6.1.
  2. Wykonaj pobieranie antygenu
    1. Zanurz szkiełka w roztworze do pobierania antygenu w pojemniku nadającym się do kuchenki mikrofalowej.
    2. Kuchenkę mikrofalową na dużym ogniu przez 20 minut, w odstępach 5-minutowych, aby upewnić się, że roztwór nie wykipi.
  3. Po zakończeniu 20-minutowego etapu pobierania antygenu pozwól szkiełkom ostygnąć na lodzie przez 40 minut, nadal zanurzając je w buforze do pobierania antygenu.
  4. Myj szkiełka 1x TBST przez 3 minuty
  5. Zablokować szkiełka poprzez inkubację w 3% BSA w TBST przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  6. Inkubacja przeciwciał pierwotnych
    1. Rozcieńczyć przeciwciało w 3% BSA w TBST (1:50-1:1,000, w zależności od Ab).
    2. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C w wilgotnej komorze.
    3. Myć 3 x 5 min z TBST.
  7. Inkubacja przeciwciał wtórnych
    1. Rozcieńczyć przeciwciało w 3% BSA (w TBST) (1:250) lub w 5% normalnej surowicy osła.
    2. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej (RT) w ciemności, ponieważ przeciwciało jest sprzężone z fluoroforem.
  8. Barwienie jądrowe
    1. Rozcieńczyć 4′,6-diamidyno-2-fenyloindol (DAPI) w stosunku 1:1,000 w TBST.
    2. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    3. Myć 2 x 5 min z TBST.
  9. Montażu
    1. Użyj jednej kropli podłoża montażowego, aby zamontować szkiełko nakrywkowe.
    2. Następnego dnia uszczelnij szkiełko nakrywkowe lakierem do paznokci.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Kontrast fazowy obrazów organoidów endometrialnych myszy
Ustaliliśmy organoidy z nabłonka endometrium myszy WT, zgodnie z opisem w załączonym protokole (patrz diagram w Rysunek 1). Po enzymatycznej dysocjacji nabłonka endometrium myszy, arkusze nabłonka zostały mechanicznie oddzielone od komórek zrębu macicy i następnie zdysocjowane za pomocą kolagenazy w celu wytworzenia zawiesiny jednokomórkowej. Jeśli zostanie przeprowadzona prawidłowo, ta metoda separacji komórek nabłonka i zr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym miejscu opisujemy metody generowania organoidów nabłonka endometrium z endometrium myszy oraz protokoły rutynowo stosowane do ich dalszej analizy. Organoidy endometrium są potężnym narzędziem do badania mechanizmów kontrolujących choroby związane z endometrium, takie jak endometrioza, rak endometrium i niepowodzenie implantacji. Przełomowe badania opublikowane w 2017 r. opisały warunki do hodowli długoterminowych i odnawialnych kultur organoidów endometrialnych z nabłonka 4,5

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Dziękujemy dr Stephanie Pangas i dr Martinowi M. Matzukowi (M.M.M.) za krytyczną lekturę i redakcję naszego rękopisu. Badania były wspierane przez granty Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development R00-HD096057 (D.M.), R01-HD105800 (D.M.), R01-HD032067 (M.M.M.) i R01-HD110038 (M.M.M.) oraz NCI-P30 Cancer Center Support Grant (NCI-CA125123). Dr Diana Monsivais otrzymała nagrodę Next Gen Pregnancy Award przyznawaną przez Burroughs Wellcome Fund.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Organoid Formulacja
NazwaCompanyNumer katalogowyStężenie końcowe
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Matryca membrany podstawnej, *bez LDEVCorning354230100%
Trypsyna z trzustki bydlęcejSigma AldrichT1426-1G1%
Advanced DMEM/F12Life Technologies126340101X
N2 suplementLife Technologies175020481X
B-27&handel; Suplement (50X), bez witaminy ALife Technologies125870101X
PrimocinInvivogenant-pm-1100 &mikro; g / ml
N-acetylo-L-cysteinaSigma AldrichA9165-5G1,25 mM
L-glutaminaLife Technologies250300242 mM
NikotynamidSigma AldrichN0636-100G10 nM
inhibitor ALK-4, -5, -7, A83-01Tocris2939500 nM
Rekombinowany ludzki EGFPeprotechAF-100-1550 ng / ml
Rekombinowany ludzki NogginPeprotech120-10C100 ng / ml
Rekombinowany ludzki Rspondin-1Peprotech120-38500 ng / ml
Rekombinowany ludzki FGF-10Peprotech100-26100 ng / ml
Rekombinowany ludzki HGFPeprotech100-3950 ng / ml
WNT3aR& Systemy D5036-WN200 ng/ml
Inne materiały eksploatacyjne i odczynniki
NazwaFirma>Numer katalogowyStężenie końcowe
Kolagenaza z Clostridium histolyticumSigma AldrichC0130-1G5 mg/ ml
Deoksyrybonukleaza I z trzustki bydlęcejSigma AldrichDN25-100MG2 mg/mL
DPBS, bez wapnia, bez magnezuThermoFisher14190-2501X
HBSS, bez wapnia, bez magnezuThermoFisher141701121X
Falcon  Mikropłytki polistyrenowe (24-dołkowe)Fisher Scientific#08-772-51
Falcon  Mikropłytki polistyrenowe (12-dołkowe)Fisher Scientific#0877229
Sitka do komórek Falcon, 40 i mikro; mFisher Scientific#08-771-1
MiniPrep Bezpośredni zol RNA (50 &mikro; g)Genesee Scientific11-331
Odczynnik TrizolInvitrogen15596026
DMEM/F-12, HEPES, bez czerwieni fenolowejThermoFisher11039021
Płodowa surowica bydlęca, węglowa pozbawionaSigma AldrichF6765-500ML2%
Estratiol (E2)Sigma AldrichE1024-1G10 nM
Formaldehyd 16% w roztworze wodnym roztwór, klasa EMVWR157104%
Kaseta Epredia 1 Kasety szczelinowe na tkankiFisher Scientific1000961
Epredia Formy bazowe ze stali nierdzewnejFisher Scientific64-010-15 
Etanol, 200 proof (100%)Fisher Scientific22-032-601 
HistoclearFisher Scientific50-899-90147
Podłoże montażowe PermountFisher Scientific50-277-97
Nylonowe worki do biopsji EprediaFisher Scientific6774010
HistoGel Żel do przetwarzania próbekVWR83009-992
Roztwór hematoksyliny PremiumVWR95057-844
Roztwór eozyny Y (żółtawy) PremiumVWR95057-848
TBS Bufor 20X, pH 7,4GenDEPORTT80541X
TBST (10X), pH 7,4GenDEPORTT80561X
Kwas cytrynowy Sigma AldrichC0759-1KG
Cytrynian sodu trójzasadowy dwuwodnySigma AldrichS4641-500G
Tween20Fisher ScientificBP337-500 
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Sigma AldrichA2153-100G3%
roztwór DAPI (1 mg / ml)ThermoFisher622481:1000 rozcieńczenie
VECTASHIELD Antifade Mounting MediumVector LabsH-1000-10
Bezbarwny lakier do paznokciFisher ScientificNC1849418
Fisherbrand Szkiełka mikroskopowe Superfrost PlusFisher Scientific22037246
Mikro okulary nakrywkowe VWRVWR48393-106
SuperScript VILO Master MixThermoFisher11755050
SYBR Green PCR Master MixThermoFisher4364346
Przeciwciało Krt8 (TROMA-I) DSHBTROMA-I Rozcieńczenie 1:50
Sygnalizacja komórkowawimentyny Antobody5741SRozcieńczenie 1:200
Przeciwciało anty-szczurze IgG (H + L) Wysoce zaadsorbowane krzyżowo przeciwciało wtórne
, Alexa Fluor 594		ThermoFisherA-212091:250 rozcieńczenie
Osioł anty-Rabbin IgG (H + L) Wysoce zaadsorbowane krzyżowo przeciwciało wtórne
, Alexa Fluor 488		ThermoFisherA-212061:250 rozcieńczenie
ZEISS Stemi 508 Stereo MikroskopZEISS
ZEISS Axio Vert.A1 Odwrócony mikroskop rutynowy z kamerą cyfrowąZEISS
silny>sekwencja starterównaprzód (5'-3')odwrócony (5'-3')_
Lipokalina 2 (Lcn2)GCAGGGTGGTACGTTGTGGGCTCTTGTAGCTCATAGATGGTGC
Laktoferyna (Ltf)TGAGGCCCTTGGACTCTGTACCCACTTTTCTCATCTCTCTTC
Progesteron (Pgr)CCCACAGGAGTTTGTCAAGCTCTAACTTCAGACATCATTTCCGG
Dehydrogenaza fosforanowa 3 aldehydu glicerynowego (Gapdh)CAATGTGTCCGTCGTGGATCTGCCTGCTTCACCACCACCTTCTT
<

Bibliografia

  1. Wang, H., Dey, S. K. Roadmap to embryo implantation: clues from mouse models. Nature Reviews Genetics. 7 (3), 185-199 (2006).
  2. Hibaoui, Y., Feki, A. Organoid models of human endometrial development and disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 84(2020).
  3. Rawlings, T. M., Makwana, K., Tryfonos, M., Lucas, E. S. Organoids to model the endometrium: implantation and beyond. Reproduction & Fertility. 2 (3), 85-101 (2021).
  4. Boretto, M., et al. Development of organoids from mouse and human endometrium showing endometrial epithelium physiology and long-term expandability. Development. 144 (10), 1775-1786 (2017).
  5. Turco, M. Y., et al. Long-term, hormone-responsive organoid cultures of human endometrium in a chemically defined medium. Nature Cell Biology. 19 (5), 568-577 (2017).
  6. Murphy, A. R., Wiwatpanit, T., Lu, Z., Davaadelger, B., Kim, J. J. Generation of multicellular human primary endometrial organoids. Journal of Visualized Experiments. (152), e60384(2019).
  7. Wiwatpanit, T., et al. Scaffold-free endometrial organoids respond to excess androgens associated with polycystic ovarian syndrome. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 105 (3), 769-780 (2020).
  8. Rawlings, T. M., et al. Modelling the impact of decidual senescence on embryo implantation in human endometrial assembloids. Elife. 10, 69603(2021).
  9. Lou, L., Kong, S., Sun, Y., Zhang, Z., Wang, H. Human endometrial organoids: recent research progress and potential applications. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 844623(2022).
  10. Soyal, S. M., et al. Cre-mediated recombination in cell lineages that express the progesterone receptor. Genesis. 41 (2), 58-66 (2005).
  11. Daikoku, T., et al. Lactoferrin-iCre: a new mouse line to study uterine epithelial gene function. Endocrinology. 155 (7), 2718-2724 (2014).
  12. Winuthayanon, W., Hewitt, S. C., Orvis, G. D., Behringer, R. R., Korach, K. S. Uterine epithelial estrogen receptor alpha is dispensable for proliferation but essential for complete biological and biochemical responses. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (45), 19272-19277 (2010).
  13. Seishima, R., et al. Neonatal Wnt-dependent Lgr5 positive stem cells are essential for uterine gland development. Nature Communications. 10 (1), 5378(2019).
  14. Syed, S. M., et al. Endometrial Axin2(+) cells drive epithelial homeostasis, regeneration, and cancer following oncogenic transformation. Cell Stem Cell. 26 (1), 64-80 (2020).
  15. Caligioni, C. S. Assessing reproductive status/stages in mice. Current Protocols in Neuroscience. , Appendix 4 Appendix 4I (2009).
  16. Fitzgerald, H. C., Schust, D. J., Spencer, T. E. In vitro models of the human endometrium: evolution and application for women's health. Biology of Reproduction. 104 (2), 282-293 (2021).
  17. Hewitt, S. C., et al. Progesterone signaling in endometrial epithelial organoids. Cells. 11 (11), 1760(2022).
  18. Sadeghipour, A., Babaheidarian, P. Making formalin-fixed, paraffin embedded blocks. Methods in Molecular Biology. 1897, 253-268 (2019).
  19. Qin, C., et al. The cutting and floating method for paraffin-embedded tissue for sectioning. Journal of Visualized Experiments. (139), e58288(2018).
  20. Rekhtman, N., et al. Novel modification of HistoGel-based cell block preparation method: improved sufficiency for molecular studies. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 142 (4), 529-535 (2018).
  21. Shidham, V. B. CellBlockistry: Chemistry and art of cell-block making - A detailed review of various historical options with recent advances. Cytojournal. 16, 12(2019).
  22. Ali, A., Syed, S. M., Tanwar, P. S. Protocol for in vitro establishment and long-term culture of mouse vaginal organoids. STAR Protocols. 1 (2), 100088(2020).
  23. Kurihara, I., et al. COUP-TFII mediates progesterone regulation of uterine implantation by controlling ER activity. PLoS Genet. 3 (6), 102(2007).
  24. McMaster, M. T., Teng, C. T., Dey, S. K., Andrews, G. K. Lactoferrin in the mouse uterus: analyses of the preimplantation period and regulation by ovarian steroids. Molecular Endocrinology. 6 (1), 101-111 (1992).
  25. Huang, H. L., Chu, S. T., Chen, Y. H. Ovarian steroids regulate 24p3 expression in mouse uterus during the natural estrous cycle and the preimplantation period. The Journal of Endocrinology. 162 (1), 11-19 (1999).
  26. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  27. Bigsby, R. M., Cunha, G. R. Estrogen stimulation of deoxyribonucleic acid synthesis in uterine epithelial cells which lack estrogen receptors. Endocrinology. 119 (1), 390-396 (1986).
  28. Clementi, C., et al. Activin-like kinase 2 functions in peri-implantation uterine signaling in mice and humans. PLoS Genetics. 9 (11), 1003863(2013).
  29. Jeong, J. W., et al. Foxa2 is essential for mouse endometrial gland development and fertility. Biology of Reproduction. 83 (3), 396-403 (2010).
  30. Song, Y., et al. Endometriotic organoids: a novel in vitro model of endometriotic lesion development. bioRxiv. , (2022).
  31. Miyazaki, K., et al. Generation of progesterone-responsive endometrial stromal fibroblasts from human induced pluripotent stem cells: role of the WNT/CTNNB1 pathway. Stem Cell Reports. 11 (5), 1136-1155 (2018).
  32. Yoshimatsu, S., Kisu, I., Qian, E., Noce, T. A new horizon in reproductive research with pluripotent stem cells: successful in vitro gametogenesis in rodents, its application to large animals, and future in vitro reconstitution of reproductive organs such as "Uteroid" and "Oviductoid". Biology. 11 (7), 987(2022).
  33. Cheung, V. C., et al. Pluripotent stem cell-derived endometrial stromal fibroblasts in a cyclic, hormone-responsive, coculture model of human decidua. Cell Reports. 35 (7), 109138(2021).
  34. McGowen, M. R., Erez, O., Romero, R., Wildman, D. E. The evolution of embryo implantation. The International Journal of Development Biology. 58 (2-4), 155-161 (2014).
  35. Carson, D. D., et al. Embryo implantation. Developmental Biology. 223 (2), 217-237 (2000).
  36. Li, Y., Sun, X., Dey, S. K. Entosis allows timely elimination of the luminal epithelial barrier for embryo implantation. Cell Reports. 11 (3), 358-365 (2015).
  37. Jain, V., Chodankar, R. R., Maybin, J. A., Critchley, H. O. D. Uterine bleeding: how understanding endometrial physiology underpins menstrual health. Nature Reviews Endocrinology. 18 (5), 290-308 (2022).
  38. Hayashi, K., et al. Wnt genes in the mouse uterus: potential regulation of implantation. Biology of Reproduction. 80 (5), 989-1000 (2009).
  39. Dunlap, K. A., et al. Postnatal deletion of Wnt7a inhibits uterine gland morphogenesis and compromises adult fertility in mice. Biology of Reproduction. 85 (2), 386-396 (2011).
  40. Ter Steege, E. J., Bakker, E. R. M. The role of R-spondin proteins in cancer biology. Oncogene. 40 (47), 6469-6478 (2021).
  41. Brazil, D. P., Church, R. H., Surae, S., Godson, C., Martin, F. BMP signalling: agony and antagony in the family. Trends in Cell Biology. 25 (5), 249-264 (2015).
  42. Tojo, M., et al. The ALK-5 inhibitor A-83-01 inhibits Smad signaling and epithelial-to-mesenchymal transition by transforming growth factor-beta. Cancer Science. 96 (11), 791-800 (2005).
  43. Zhang, Y., Que, J. BMP signaling in development, stem cells, and diseases of the gastrointestinal tract. Annual Review of Physiology. 82, 251-273 (2020).
  44. Plikus, M. V., et al. Cyclic dermal BMP signalling regulates stem cell activation during hair regeneration. Nature. 451 (7176), 340-344 (2008).
  45. Gurung, S., Werkmeister, J. A., Gargett, C. E. Inhibition of transforming growth factor-β receptor signaling promotes culture expansion of undifferentiated human endometrial mesenchymal stem/stromal cells. Scientific Reports. 5, 15042(2015).
  46. Lucciola, R., et al. Impact of sustained transforming growth factor-β receptor inhibition on chromatin accessibility and gene expression in cultured human endometrial MSC. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 567610(2020).
  47. Hernandez-Gordillo, V., et al. Fully synthetic matrices for in vitro culture of primary human intestinal enteroids and endometrial organoids. Biomaterials. 254, 120125(2020).
  48. Gnecco, J. S., et al. Physiomimetic Models of Adenomyosis. Seminars in Reproductive Medicine. 38 (2-03), 179-196 (2020).
  49. Nikolakopoulou, K., Turco, M. Y. Investigation of infertility using endometrial organoids. Reproduction. 161 (5), 113-127 (2021).
  50. Kim, J. J. Preparing for implantation. Elife. 10, 73739(2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

nab onek macicytr jwymiarowa kultura organoid wdysocjacja mechanicznadysocjacja enzymatycznaekspresja gen wimmunobarwieniekomponentia zr bowmikroskopia fluorescencyjna
Ustalanie organoidów endometrialnych 3D z macicy myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.