Artykuł metodologiczny

In vitro Metoda badania różnic opartych na płci w komórkach kubkowych spojówek

DOI:

10.3791/64456

⸱

28 lipca 2023

 ,  , 
1Department of Ophthalmology Schepens Eye Research Institute, Massachusetts Eye and Ear, Harvard Medical School

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pożywka bez płodowej surowicy bydlęcej bez czerwieni fenolowej jest lepszą opcją niż zaawansowane RPMI, aby wyeliminować egzogenne hormony bez zmiany normalnej funkcji komórek kubkowych spojówki w badaniu różnic związanych z płcią.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Suche oko to wieloczynnikowa choroba wpływająca na zdrowie powierzchni oka, z znacznie częstszym występowaniem u kobiet. Przerwanie mucyny tworzącej żel, która jest wydzielana przez komórki kubkowe spojówki (CGC) na powierzchnię oka, przyczynia się do wielu chorób powierzchni oka. Eliminacja egzogennych hormonów płciowych jest niezbędna do uzyskania spójnych wyników podczas badania in vitro różnic w CGC ze względu na płeć. W pracy opisano metodę minimalizacji obecności hormonów egzogennych w badaniu różnic CGC ze względu na płeć przy zachowaniu ich funkcji fizjologicznej. CGC od pośmiertnych dawców ludzkich obu płci hodowano z fragmentów spojówki w pożywce RPMI z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) (określaną jako kompletna pożywka) aż do zbiegu. Prawie 48 godzin przed rozpoczęciem eksperymentów CGC przeniesiono na pożywkę RPMI bez czerwieni fenolowej lub FBS, ale z 1% BSA (określaną jako pożywka wolna od czerwieni fenolowej). Prawidłową funkcję komórkową badano, mierząc wzrost wewnątrzkomórkowego [Ca2+] ([Ca2+]i) po stymulacji karbacholem (Cch, 1 x 10-4 M) za pomocą mikroskopii fura 2 / acetoksymetylu (AM). Wynik pokazuje, że CGC utrzymywały normalne funkcjonowanie w pożywce wolnej od czerwieni fenolowej po 48 godzinach. Nie zaobserwowano istotnej różnicy w odpowiedzi [Ca2 +] i między pożywką RPMI wolną od czerwieni fenolowej a kompletną pożywką po stymulacji Tch. Dlatego zalecamy stosowanie pożywki RPMI wolnej od czerwieni fenolowej z 1% BSA w celu wyeliminowania hormonów egzogennych bez zmiany normalnej funkcji CGC w badaniu różnic ze względu na płeć.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Różnice oparte na płci wpływają na wiele procesów zachodzących na powierzchni oka1,2,3. Klinicznym przejawem tych różnic związanych z płcią jest różnica w częstości występowania wielu chorób powierzchni oka między mężczyznami i kobietami, takich jak suche oko i zapalenie spojówek4,5,6. Dowody sugerują, że różnice oparte na płci wynikają z wielu poziomów biologicznych, w tym z różnych profili genów na chromosomach X i Y7 oraz wpływu hormonów8. Badanie molekularnych podstaw różnic ze względu na płeć może zapewnić lepsze zrozumienie choroby i ostatecznie ulepszyć medycynę spersonalizowaną.

Powierzchnia oka składa się z leżącego nad nią filmu łzowego, rogówki i spojówki. Różnice związane z płcią obserwuje się w wielu elementach powierzchni oka, w tym w filmie łzowym9,10, cornea11, gruczole łzowym12,13 oraz gruczołach Meiboma, które również wydzielają łzy12. Liczne badania mechanistyczne badały wpływ hormonów płciowych na rogówkę i związane z nią składniki14,15; Jednak niewiele wiadomo na temat różnic opartych na płci w spojówce i jej komórkach kubkowych. Spojówka to błona śluzowa, która pokrywa twardówkę i wewnętrzną powierzchnię powieki. Nabłonek spojówki składa się z nierogowaciejących, wielowarstwowych, warstwowych komórek płaskonabłonkowych16.

Wśród warstwowych komórek płaskonabłonkowych spojówki znajdują się komórki kubkowe (CGC) przeplatane na wierzchołkowej powierzchni nabłonka. Te komórki kubkowe charakteryzują się dużą liczbą granulek wydzielniczych znajdujących się na wierzchołkowym biegunie17. CGC syntetyzują i wydzielają tworzącą żel mucynę MUC5AC, która nawilża powierzchnię oka i smaruje ją podczas mrugania17. Wydzielanie mucyny jest ściśle regulowane przez wewnątrzkomórkowy [Ca2+] ([Ca2+]i) i aktywację zależnej od Ras kinazy regulowanej sygnałem zewnątrzkomórkowym (ERK1/2)18. Niezdolność do wydzielania mucyny skutkuje suchością powierzchni oka i następstwami nieprawidłowości patologicznych. Jednak na powierzchni oka w stanie zapalnym intensywne wydzielanie mucyny stymulowane przez mediatory stanu zapalnego prowadzi do odczuwania lepkości i swędzenia oka19. Te stany z zaburzonym wydzielaniem mucyny ostatecznie doprowadzą do pogorszenia powierzchni oka.

Rola komórek kubkowych jako głównego źródła mucyny w oku została już dawno uznana20, jednak różnice w regulacji mucyny oparte na płci zarówno w stanach fizjologicznych, jak i patologicznych pozostają nieodkryte. System in vitro byłby przydatny do monitorowania funkcji komórek kubkowych bez efektu hormonalnego lub z precyzyjnie kontrolowanym poziomem hormonów płciowych. Mimo że rozwinęła się linia komórek nabłonka spojówek21, nie ma dostępnej linii komórkowej kubkowej z funkcjonalnym wydzielaniem mucyny. W związku z tym zmodyfikowaliśmy naszą opracowaną pierwotną ludzką hodowlę CGC, aby ustalić metodę analizy różnic opartych na płci w in vitro16 i przedstawić ją jak poniżej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie ludzkie tkanki zostały przekazane do banku oczu za uprzednią świadomą zgodą i upoważnieniem dawcy do wykorzystania w badaniach naukowych. Wykorzystanie ludzkiej tkanki spojówki zostało ocenione przez Komitet Badań nad Oczami i Uchami w Massachusetts i uznane za wyłączone i niespełniające definicji badań z udziałem ludzi.

1. Pierwotna ludzka hodowla komórek kubkowych

  1. Z banku oczu pobierz ludzką tkankę spojówkową16.
  2. Przygotować pożywkę, pożywkę hodowlaną RPMI-1640 uzupełnioną 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 2 mM glutaminy, 2 mM aminokwasów endogennych (NEAA), 2 mM pirogronianu sodu, 100 μg/ml penicyliny-streptomycyny i 2 mM kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES).
  3. Przeprowadź pierwotną hodowlę komórkową zgodnie z poniższym opisem.
    1. Zmielić tkankę na 1 mm3 kawałki za pomocą sterylnego skalpela i nasiona na płytkach hodowlanych w kapturze hodowlanym. Wysiewać cztery kawałki w każdym dołku 6-dołkowej płytki w 1 ml kompletnego podłoża RPMI. Chociaż orientacja fragmentu tkanki nie ma wpływu na wzrost komórek, upewnij się, że kawałki przylegają do płytki hodowlanej, aby zapewnić wzrost za pomocą ostrza skalpela.
    2. Umieścić fragmenty tkanek w inkubatorze zawierającym 95% powietrza i 5% CO2 w temperaturze 37 °C. Odświeżać tę samą pożywkę co drugi dzień, aż komórki kubkowe osiągną zlewność 70%-80% w ciągu około 14 dni. Usunąć zatyczkę tkankową około 72 godziny po wysiewie.
      UWAGA: Ludzki nabłonek spojówek zawiera głównie warstwowe komórki płaskonabłonkowe i komórki kubkowe. RPMI jest selektywnym podłożem dla komórek kubkowych. Rzadko w ludzkiej hodowli CGC fibroblasty mogą rosnąć około 7 dnia. Metoda oczyszczania kultury została opisana w poprzedniej publikacji 22.
    3. Sprawdzić czystość kultury GC za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej (IFM) ukierunkowanej na cytokeratynę (CK)7 i lektynę Helix pomatia-1 (HPA-1)22 zgodnie ze standardową metodą IFM opisaną w19; patrz reprezentatywne wyniki.

2. Przejście ludzkiej błony kielichowej spojówki i przygotowanie eksperymentalne

  1. Przepłukać komórki PBS (pH = 7,4) i odłączyć komórki trypsynizacją za pomocą 0,05% trypsyny w 1x EDTA. Obserwuj komórki co minutę pod mikroskopem. Gdy komórki oderwą się od dna, dezaktywuj trypsynę za pomocą kompletnych pożywek RPMI.
  2. Odwirować komórki o masie 150 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Zawiesić osad komórkowy w kompletnej pożywce hodowlanej RPMI i ponownie wysiać na szalkach hodowlanych ze szklanym dnem w celu pomiaru [Ca2+]i. Całkowita objętość pożywki wynosi 300 μl na naczynie. Trzymaj nośnik na środku szklanej części naczynia.
  3. Eliminacja hormonów w pożywkach hodowlanych: Pożywka hodowlana może zawierać hormony płciowe, zwłaszcza FBS. Ponieważ czerwień fenolowa zawarta w RPMI-1640 ma aktywność estrogenną 23,24, zastąp pożywkę RPMI pożywką RPMI wolną od czerwieni fenolowej i dostosuj pH do 7,45 za pomocą pasków pH po przygotowaniu kompletnej pożywki. HEPES zawarty w kompletnej pożywce utrzymuje pH w stosunkowo niewielkim zakresie.

3. Test fura-2/acetoksymetylowy (AM) do pomiaru [Ca2+]i

  1. Wykonaj ładowanie Fura-2/AM zgodnie z poniższym opisem.
    1. Inkubować komórki w naczyniach ze szklanym dnem przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C, w atmosferze otoczenia, chronić przed światłem buforem wodorowęglanowym Krebsa-Ringera (KRB; zawierającym 119 mM NaCl, 4,8 mM KCl, 1,0 mM CaCl2, 1,2 mMMgSO4 i 25 mM NaHCO3) z 0,5% HEPES (Tabela 1) plus 0,5% BSA, 0,5 μM fura-2/AM, 8 μM kwasu pluronowego F127 i 250 μM sulfinpirazonu.
    2. Przed użyciem dostosuj pH do 7,45 za pomocą pH-metru. Po załadowaniu fura-2/AM przemyć komórki KRB zawierającym 250 μM sulfinpirazon bezpośrednio przed pomiarem [Ca2+]i.
  2. Wykonaj pomiar [Ca2+]i zgodnie z poniższym opisem.
    1. Umieść szalki zawierające komórki załadowane furą-2 pod mikroskopem, zlokalizuj reprezentatywne pole zawierające od 20 komórek do 50 komórek w 200-krotnym powiększeniu i użyj funkcji Freehand, aby narysować kontur wokół każdej komórki, aby wskazać oprogramowaniu, co jest, a co nie jest fluorescencją tła.
    2. Poczekaj, aż oprogramowanie automatycznie odejmie fluorescencję tła od pomiaru i kliknij przycisk Rozpocznij eksperyment.
    3. Następnie odczekaj od 8 s do 15 s, aby ustalić podstawowy poziom wapnia w komórkach przed ostrożnym pipetowaniem w interesującym Cię agoniście. Kontynuuj pomiar przez co najmniej 120 s po dodaniu agonisty lub do momentu, gdy poziom wapnia powróci do wartości wyjściowej.
  3. Przeprowadź analizę danych zgodnie z poniższym opisem.
    1. Użyj zmiany piku [Ca2+]i, aby przedstawić działanie bodźców. Oblicz średni podstawowy poziom wapnia w każdej komórce z pierwszych 8-15 s pomiarów. Jeśli ta liczba jest równa lub wyższa niż 500 nM, usuń tę komórkę ze zbioru danych, ponieważ przechodzi apoptozę lub martwicę.
    2. Po obliczeniu podstawowego poziomu każdej komórki odejmij tę ilość od maksymalnej zmierzonej [Ca2 + ]i dla tej samej komórki. Uśrednij zmianę piku [Ca2+]I dla wszystkich komórek w danym naczyniu.
    3. Aby zapewnić spójność, należy zapisać reakcje każdego bodźca w dwóch egzemplarzach i obliczyć średnią wartość zmian piku [Ca2 +] i uzyskaną z duplikatów jako jeden punkt danych z pojedynczej próbki ludzkiej. Porównaj dane z różnych grup przy użyciu odpowiedniej metody analizy danych opartej na projekcie badania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ludzkie CGC w kulturze podstawowej osiągają 80% zbieżności w ciągu około 14 dni. Typ komórki został potwierdzony przez barwienie immunofluorescencyjne przeciwciałami przeciwko markerom komórek kubkowych CK7 i HPA-125 (Ryc. 1). Mimo że usunięcie FBS z pożywki może wyeliminować hormony płciowe, brak FBS może potencjalnie wpływać na odpowiedź komórkową. Aby zweryfikować metodę eliminacji hormonów, zastosowano agonistę cholinergicznego (karbachol, Cch 1 × 10-4 M) jako bo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie różnic w tkankach oka ze względu na płeć pomaga zrozumieć procesy zachodzące w chorobach, zwłaszcza zespołu suchego oka i alergicznego zapalenia spojówek, które w nieproporcjonalny sposób dotykają jedną płeć 4,5,6. Mimo że do tych badań można wykorzystać modele zwierzęce, dane uzyskane bezpośrednio z tkanek ludzkich są niezbędne ze względu na najwyższe podobieństwo do komórek ludzkich in vivo. Tkanki spojówek wy...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Praca jest finansowana przez National Eye Institute Grant EY019470 (D.A.D).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,05% trypsyna z 1x EDTAGibco (Grand Island, NY)25300-054
Kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowyBioreagent Fishera (Pittsburgh, PA)BP310-500
Zaawansowane podłoża RPMIGibco (Grand Island, NY)12633020
karbacholCayman Chemical (Ann Arbor, MI)144.86
Surowica płodu BovinR& D (Minneapolis, MN)S11150H
Ester fura-2-acetoksymetylowy Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)F1221
Ludzka tkanka spojówkowaEversight Eye Bank (Ann Arbor, MI)N/A
do buforu KRBSigma-Aldrich (St. Louis, MO)Każda marka będzie działać
L-glutamina Lonza Group (Bazylea, Szwajcaria)17-605F
aminokwasy endogenneGibco (Grand Island, NY)11140-050
penicylina/streptomycynaGibco (Grand Island, NY)15140-122
fenol czerwone pożywki RPMI Gibco (Grand Island, Nowy Jork)11835055
Kwas pluronowy F127MilliporeSigma (Burlington, MA, USA)P2443-250G
Pożywka hodowlana RPMI-1640Gibco (Grand Island, NY)21875034
skalpelThermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)12460451Każdy sterylny skalpel chirurgiczny może działać
pirogronian soduGibco (Grand Island, NY)11360-070
sulfinpirazonMilliporeSigma (Burlington, MA, USA)S9509-5G
Sól nieorganiczna

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gao, Y., et al. Female-specific downregulation of tissue polymorphonuclear neutrophils drives impaired regulatory T cell and amplified effector T cell responses in autoimmune dry eye disease. Journal of Immunology. 195, 3086-3099 (2015).
  2. Wang, S. B., et al. Estrogen negatively regulates epithelial wound healing and protective lipid mediator circuits in the cornea. FASEB Journal. 26, 1506-1516 (2012).
  3. Sullivan, D. A., Block, L., Pena, J. D. Influence of androgens and pituitary hormones on the structural profile and secretory activity of the lacrimal gland. Acta Ophthalmologica Scandinavica. 74, 421-435 (1996).
  4. Schaumberg, D. A., Dana, R., Buring, J. E., Sullivan, D. A. Prevalence of dry eye disease among US men: estimates from the Physicians' Health Studies. Archives of Ophthalmology. 127, 763-768 (2009).
  5. Tellefsen Nøland, S., et al. Sex and age differences in symptoms and signs of dry eye disease in a Norwegian cohort of patients. The Ocular Surface. 19, 68-73 (2021).
  6. Sullivan, D. A., et al. TFOS DEWS II Sex, gender, and hormones report. The Ocular Surface. 15, 284-333 (2017).
  7. Meester, I., et al. SeXY chromosomes and the immune system: reflections after a comparative study. Biology of Sex Differences. 11, 3(2020).
  8. Yang, J. -H., et al. Hormone replacement therapy reverses the decrease in natural killer cytotoxicity but does not reverse the decreases in the T-cell subpopulation or interferon-gamma production in postmenopausal women. Fertility and Sterility. 74, 261-267 (2000).
  9. Orucoglu, F., Akman, M., Onal, S. Analysis of age, refractive error and gender related changes of the cornea and the anterior segment of the eye with Scheimpflug imaging. Contact Lens & Anterior Eye. 38, 345-350 (2015).
  10. Strobbe, E., Cellini, M., Barbaresi, U., Campos, E. C. Influence of age and gender on corneal biomechanical properties in a healthy Italian population. Cornea. 33, 968-972 (2014).
  11. Sullivan, D. A., Jensen, R. V., Suzuki, T., Richards, S. M. Do sex steroids exert sex-specific and/or opposite effects on gene expression in lacrimal and meibomian glands. Molecular Vision. 15, 1553-1572 (2009).
  12. Bukhari, A. A., Basheer, N. A., Joharjy, H. I. Age, gender, and interracial variability of normal lacrimal gland volume using MRI. Ophthalmic Plastic and Reconstructive Surgery. 30, 388-391 (2014).
  13. Sullivan, B. D., Evans, J. E., Dana, M. R., Sullivan, D. A. Influence of aging on the polar and neutral lipid profiles in human meibomian gland secretions. Archives of Ophthalmology. 124, 1286-1292 (2006).
  14. Ebeigbe, J. A., Ebeigbe, P. N. The influence of sex hormone levels on tear production in postmenopausal Nigerian women. African Journal of Medicine and Medical Sciences. 43, 205-211 (2014).
  15. Suzuki, T., et al. Estrogen's and progesterone's impact on gene expression in the mouse lacrimal gland. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47, 158-168 (2006).
  16. Shatos, M. A., et al. Isolation and characterization of cultured human conjunctival goblet cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44, 2477-2486 (2003).
  17. Huang, A. J., Tseng, S. C., Kenyon, K. R. Morphogenesis of rat conjunctival goblet cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 29, 969-975 (1988).
  18. Li, D., et al. Resolvin D1 and aspirin-triggered resolvin D1 regulate histamine-stimulated conjunctival goblet cell secretion. Mucosal Immunology. 6, 1119-1130 (2013).
  19. Dartt, D. A., Masli, S. Conjunctival epithelial and goblet cell function in chronic inflammation and ocular allergic inflammation. Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 14, 464-470 (2014).
  20. Mantelli, F., Argüeso, P. Functions of ocular surface mucins in health and disease. Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 8, 477-483 (2008).
  21. García-Posadas, L., et al. Characterization and functional performance of a commercial human conjunctival epithelial cell line. Experimental Eye Research. 223, 109220(2022).
  22. Shatos, M. A., et al. Isolation, characterization, and propagation of rat conjunctival goblet cells in vitro. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 42, 1455-1464 (2001).
  23. Welshons, W. V., Wolf, M. F., Murphy, C. S., Jordan, V. C. Estrogenic activity of phenol red. Molecular and Cellular Endocrinology. 57, 169-178 (1988).
  24. Berthois, Y., Katzenellenbogen, J. A., Katzenellenbogen, B. S. Phenol red in tissue culture media is a weak estrogen: implications concerning the study of estrogen-responsive cells in culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83, 2496-2500 (1986).
  25. García-Posadas, L., et al. Interaction of IFN-γ with cholinergic agonists to modulate rat and human goblet cell function. Mucosal Immunology. 9, 206-217 (2016).
  26. Li, D., Jiao, J., Shatos, M. A., Hodges, R. R., Dartt, D. A. Effect of VIP on intracellular [Ca2 ], extracellular regulated kinase 1/2, and secretion in cultured rat conjunctival goblet cells. Investigative Opthalmology & Visual Science. 54, 2872-2884 (2013).
  27. Contrò, V., et al. Sex steroid hormone receptors, their ligands, and nuclear and non-nuclear pathways. AIMS Molecular Science. 2, 294-310 (2015).
  28. Valley, C. C., Solodin, N. M., Powers, G. L., Ellison, S. J., Alarid, E. T. Temporal variation in estrogen receptor-alpha protein turnover in the presence of estrogen. Journal of Molecular Endocrinology. 40, 23-34 (2008).
  29. Campen, C. A., Gorski, J. Anomalous behavior of protein synthesis inhibitors on the turnover of the estrogen receptor as measured by density labeling. Endocrinology. 119, 1454-1461 (1986).
  30. Yang, M., et al. Sex-based differences in conjunctival goblet cell responses to pro-inflammatory and pro-resolving mediators. Scientific Reports. 12, 16305(2022).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Conjunctival Goblet CellsSex Based DifferencesDry Eye DiseaseIntracellular Calcium MeasurementPrimary Cell CulturePhenol Red Free MediumMucin SecretionImmunofluorescent StainingCarbachol StimulationHuman Conjunctiva

Powiązane artykuły