Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Mikroinżynieryjne hydrożele kolagenowe 3D z wyrównaniem włókien dalekiego zasięgu

2.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64457

⸱

7 września 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Kate Gleason College of Engineering, Rochester Institute of Technology

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół demonstruje użycie kanału mikroprzepływowego o zmieniającej się geometrii wzdłuż kierunku przepływu płynu do generowania naprężeń rozciągających (rozciągających) w celu wyrównania włókien w hydrożelu kolagenowym 3D (<250 μm grubości). Wynikowe wyrównanie rozciąga się na kilka milimetrów i ma na nie wpływ szybkość odkształcania rozciągającego.

Streszczenie

Wyrównane włókna kolagenu I (COL1) kierują ruchliwością komórek nowotworowych, wpływają na morfologię komórek śródbłonka, kontrolują różnicowanie komórek macierzystych i są cechą charakterystyczną tkanek serca i układu mięśniowo-szkieletowego. Aby zbadać reakcję komórek na wyrównane mikrośrodowiska in vitro, opracowano kilka protokołów generowania matryc COL1 ze zdefiniowanym wyrównaniem włókien, w tym metody magnetyczne, mechaniczne, komórkowe i mikroprzepływowe. Spośród nich podejścia mikroprzepływowe oferują zaawansowane możliwości, takie jak dokładna kontrola przepływu płynów i mikrośrodowiska komórkowego. Jednak podejścia mikroprzepływowe do generowania wyrównanych matryc COL1 dla zaawansowanych platform hodowli in vitro zostały ograniczone do cienkich "mat" (o grubości <40 μm) włókien COL1, które rozciągają się na odległości mniejsze niż 500 μm i nie sprzyjają zastosowaniom do hodowli komórkowych 3D. W tym miejscu przedstawiamy protokół wytwarzania matryc 3D COL1 (o grubości 130-250 μm) z obszarami w skali milimetrowej o określonym wyrównaniu włókien w urządzeniu mikroprzepływowym. Platforma ta zapewnia zaawansowane możliwości hodowli komórkowych w celu modelowania ustrukturyzowanych mikrośrodowisk tkankowych, zapewniając bezpośredni dostęp do mikroinżynieryjnej matrycy do hodowli komórek.

Wprowadzenie

Komórki znajdują się w złożonej sieci włóknistej 3D zwanej macierzą zewnątrzkomórkową (ECM), której większość składa się z białka strukturalnego kolagenu typu I (COL1)1,2. Właściwości biofizyczne ECM dostarczają wskazówek do komórek, a w odpowiedzi komórki przebudowują mikroarchitekturę ECM3,4,5. Te wzajemne interakcje komórka-macierz mogą prowadzić do powstania wyrównanych domen włókien COL16, które promują angiogenezę i inwazję komórek w środowisku guza7,8,9 i wpływają na morfologię komórki10,11,12, polarization13 i różnicowanie14. Wyrównane włókna kolagenowe również wspomagają gojenie się ran15, odgrywają kluczową rolę w rozwoju tkanek16 i przyczyniają się do komunikacji komórkowej dalekiego zasięgu17,18. Dlatego replikacja natywnej mikroarchitektury włókien COL1 in vitro jest ważnym krokiem w kierunku opracowania ustrukturyzowanych modeli do badania reakcji komórek na dopasowane mikrośrodowiska.

Mikroprzepływowe systemy hodowli komórkowych zostały uznane za preferowaną technologię do rozwoju systemów mikrofizjologicznych (MPS)19,20,21,22,23. Wykorzystując korzystne efekty skalowania w mikroskali, systemy te zapewniają precyzyjną kontrolę nad przepływem płynów, wspierają kontrolowane wprowadzanie sił mechanicznych i definiują mikrośrodowisko biochemiczne w mikrokanale21,24,25,26,27. Platformy MPS zostały wykorzystane do modelowania mikrośrodowisk specyficznych dla tkanek i badania interakcji wielonarządowych28. Jednocześnie hydrożele były szeroko badane w celu podsumowania mechaniki 3D i biologicznego wpływu ECM, które są obserwowane in vivo29,30. Wraz z rosnącym naciskiem na integrację hodowli 3D z platformami mikroprzepływowymi, wiele podejść może łączyć hydrożele COL1 w urządzeniach mikroprzepływowych31,32,33. Jednak metody wyrównywania hydrożeli COL1 w kanałach mikroprzepływowych zostały ograniczone do cienkich "mat" 2D (o grubości <40 μm) w kanałach o szerokości <1 mm, oferując ograniczony potencjał modelowania odpowiedzi komórek w wyrównanych mikrośrodowiskach 3D31,34,35,36.

Aby uzyskać wyrównane hydrożele COL1 3D w systemie mikroprzepływowym, wykazano, że gdy samoorganizujący się roztwór COL1 jest wystawiony na lokalne przepływy ekstensywne (zmiana prędkości wzdłuż kierunku strumienia), powstałe hydrożele COL1 wykazują stopień wyrównania włókien, który jest wprost proporcjonalny do wielkości szybkości odkształcania rozciągającego, którego doświadczają37, 38. Konstrukcja mikrokanałów w tym protokole jest wyjątkowa na dwa sposoby; po pierwsze, segmentowa konstrukcja wprowadza lokalne naprężenie rozciągające do rozwiązania COL1, a po drugie, jego "dwuczęściowa" konstrukcja pozwala użytkownikowi wyrównać włókna COL1, a następnie zdemontować kanał, aby uzyskać bezpośredni dostęp do wyrównanych włókien w otwartym formacie. Podejście to można następnie zastosować do opracowania modułowych platform mikroprzepływowych, które opracowują systemy mikrofizjologiczne z uporządkowanymi matrycami COL1. Poniższy protokół opisuje proces wytwarzania segmentowanych mikrokanałów i szczegółowo opisuje wykorzystanie kanałów do wyrównania bydlęcego atelo COL1. Protokół ten zawiera również instrukcje dotyczące hodowli komórek na COL1 w formacie otwartej studni i omawia dodawanie funkcjonalności do platformy za pomocą modułowej, magnetycznej warstwy podstawowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Wykonanie dwuczęściowego kanału i podstawy platformy modułowej

UWAGA: Kanał mikrofluidyczny składa się z dwóch części — „wycięcia” kanału mikrofluidycznego, które jest wycinane żyletką z arkusza polidimetylosiloksanu (PDMS) o określonej grubości, oraz pokrywy kanału, która łączy się odwracalnie z wycięciem, tworząc kanał. Kanał jest otoczony ramką z polimetakrylanu metylu (PMMA), która pełni funkcję rezerwuaru pożywki (Rysunek 1). Ramka PMMA może być również wykorzystana do magnetycznego mocowania wyspecjalizowanych modułów w celu rozszerzenia funkcjonalności.

  1. Wycinanie kanałów z arkuszy PDMS za pomocą żyletki:
    UWAGA: Projekt kanału mikrofluidycznego dla tego etapu znajduje się na Ryc. uzupełniającej 1. Kanał składa się z pięciu segmentów o długości 5 mm każdy i szerokościach odpowiednio 10 mm, 5 mm, 2,5 mm, 1,25 mm oraz 0,75 mm. Prędkość roztworu kolagenu, wstrzykiwanego ze stałym przepływem (50-400 µL·min−1), zwiększa się lokalnie wzdłuż kanału wraz ze zmniejszaniem szerokości kanału w celu wygenerowania przepływu rozciągającego.
    1. Zamocuj arkusz PDMS o grubości 250 µm na plastikowym nośniku i wytnij projekt mikrofluidyczny za pomocą nożyka modelarskiego, przy głębokości ostrza 0,5 mm, prędkości 1 cm·s−1 i dużej sile nacisku.
    2. Oczyść wycięte kanały mikrofluidyczne w kąpieli ultradźwiękowej przez 5 min. Przepłucz sonikowane kanały wodą dejonizowaną (DI) i wysusz je na czystej płycie grzejnej w temperaturze 100 ˚C przez 5 min.
    3. Przechowuj kanały w czystej, przykrytej szalce Petriego do momentu użycia.
  2. Sporządzanie pokrywy z PDMS i pasywacja powierzchni:
    UWAGA: Wycięty kanał z sekcji 1.1 wymaga pokrywy, którą można umieścić na jego górze, aby stworzyć zamknięty kanał, do którego można wstrzyknąć roztwór COL1 (Ryc. uzupełniająca 1). Pokrywę można usunąć po samoorganizacji COL1. Aby zminimalizować prawdopodobieństwo wiązania się COL1 w kanale z pokrywą, pokrywa jest pasywowana albuminą surowicy bydlęcej (BSA). Dostarczono projekt formy do pokrywy z PDMS. Forma musi mieć grubość co najmniej 2 mm i obrys równy obrysowi wyciętego kanału mikrofluidycznego. W niniejszym protokole obrys formy wynosił 35 mm x 15 mm.
    1. Aby przygotować formę, przytwierdź arkusz kleju wrażliwego na nacisk (PSA) do arkusza PMMA o grubości 2,5 mm i wytnij laserowo pożądany kształt formy.
    2. Oczyść wyciętą laserowo formę z PMMA wilgotną, beztłuszczową ściereczką i usuń folię zabezpieczającą z filmu PSA. Przymocuj formę do wafla krzemowego o średnicy 100 mm, dociskając ją mocno.
    3. Przygotuj PDMS w stosunku 10:1 (baza:utwardzacz). Mieszaj intensywnie przez 1 min, aby zapewnić właściwe wymieszanie, a następnie odgazuj mieszaninę w komorze próżniowej w celu usunięcia pęcherzyków powietrza.
    4. Wlej odgazowany roztwór PDMS do formy PMMA/krzem i utwardzaj na płycie grzejnej w temperaturze 100 ˚C przez 20 min. Pozostaw formę do ostygnięcia, usuń utwardzony PDMS i odetnij nadmiar żyletką.
      UWAGA: Przez wszystkie kolejne etapy upewnij się, że strony pokryw PDMS przylegające do wafla krzemowego (płaskie strony) są skierowane ku górze.
    5. Użyj wycinaka do biopsji o średnicy 1 mm, aby stworzyć otwory wlotowe i wylotowe odpowiadające końcom kanału mikrofluidycznego. Wycięty kanał z kroku 1.1 może posłużyć jako szablon do wyznaczenia pozycji otworów.
    6. Sonikuj pokrywę w izopropanolu (IPA) przez 5 min, przepłucz wodą DI, wysusz strumieniem sprężonego powietrza, a następnie przechowuj w czystej, przykrytej szalce Petriego. Umieść szalkę Petriego (bez przykrycia) w komorze sterylizacji UV na 1 min w celu sterylizacji.
    7. Przykryj i przenieś do komory z laminarnym przepływem powietrza (BSC).
    8. Nanieś pipetą 300 µL albuminy surowicy bydlęcej (BSA) o stężeniu 40 mg•mL-1 w 1x roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo (PBS) na pokrywy PDMS i rozprowadź roztwór równomiernie za pomocą końcówki pipety. Przechowuj w lodówce w temperaturze 4 ˚C przez co najmniej 4 h przed użyciem.
    9. Przenieś pokrywy z lodówki do BSC, przemyj 5x roztworem 1x PBS i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu przez 10 min.
      UWAGA: Pokrywy PDMS mogą być przechowywane w lodówce do 1 tygodnia po pokryciu ich BSA.
  3. Obróbka szkiełek podstawkowych glutaraldehydem
    UWAGA: Funkcjonalizacja szkiełek podstawkowych glutaraldehydem tworzy wiązania kowalencyjne z COL1 i zapobiega odrywaniu się hydrożelu.
    1. Przygotuj 2% (v/v) roztwór aminopropylotrietoksysilanu (APTES) w zlewce szklanej, dodając 1 mL APTES do 49 mL acetonu.
    2. Rozcieńcz 25% roztwór glutaraldehydu do stężenia 5% w wodzie DI. Przygotuj 2 mL roztworu dla każdego szkiełka o wymiarach 24 mm x 50 mm. Dla szkiełek o wymiarach 24 mm x 24 mm lub 22 mm x 22 mm przygotuj 1 mL roztworu dla każdego.
    3. Oczyść szkiełka podstawkowe w myjce ultradźwiękowej przez 5 min, używając IPA. Spłucz IPA ze szkiełek wodą DI. IPA jest całkowicie usunięte, gdy na szkiełku widoczna jest gładka warstwa wody.
    4. Wysusz szkiełka na płycie grzejnej przez 5 min w temperaturze 100 °C. Umieść wysuszone szkiełka w czystych szalkach Petriego, dbając o to, aby się nie nakładały.
    5. Za pomocą urządzenia do wyładowań koronowych poddaj każde szkiełko działaniu wyładowań koronowych przez 1 min.
      UWAGA: Ten etap należy przeprowadzić w dobrze wentylowanym pomieszczeniu lub pod wyciągiem chemicznym.
    6. Wyjmij szkiełka z szalki Petriego i zanurz w roztworze APTES na 10 s w ciągu 5 min od ekspozycji na koronę, upewniając się, że szkiełko jest całkowicie zanurzone.
      UWAGA: Pamiętaj, która strona była traktowana plazmą i trzymaj ją skierowaną ku górze.
    7. Następnie zanurz szkiełko w acetonie na 10 s i wysusz sprężonym powietrzem. Umieść wysuszone szkiełko z powrotem w szalce Petriego stroną traktowaną do góry.
      UWAGA: Powtórz kroki 1.3.5-1.3.7 dla wszystkich szkiełek.
    8. Nanieś pipetą 1 mL roztworu glutaraldehydu na powierzchnię każdego szkiełka. Pokryj jak największą powierzchnię, nie dopuszczając do przelania roztworu przez krawędź szkiełka. W razie potrzeby można dodać więcej roztworu glutaraldehydu. Uważaj, aby nie zarysować powierzchni końcówką pipety.
    9. Pozostaw szkiełka w kontakcie z roztworem przez 30 min, a następnie przepłucz wodą DI przez 20 s. Wysusz szkiełka sprężonym powietrzem i umieść je z powrotem w szalkach Petriego stroną traktowaną plazmą do góry.
      UWAGA: Szkiełka można przechowywać do 1 tygodnia w temperaturze pokojowej (RT).
  4. Wytcinanie laserowe modułowej podstawy magnetycznej
    UWAGA: Projekt modułowej podstawy magnetycznej znajduje się na Ryc. uzupełniającej 1. Modułowa podstawa służy jako wgłębienie do utrzymywania mediów i może być również używana do magnetycznego mocowania wyspecjalizowanych modułów, jak opisano w wcześniej opublikowanych pracach22,37,38,39.
    1. Wytnij projekty z warstwy PMMA, używając odpowiednich ustawień lasera, takich jak liczba przejść i moc.
      UWAGA: Ustawienia lasera powinny być dostosowane tak, aby magnesy można było wcisnąć w warstwę PMMA. Każdy laser jest inny, a parametry cięcia muszą zostać zoptymalizowane eksperymentalnie. Dla lasera 45 W zaleca się 100% prędkości, 100% mocy i 3 przejścia do wycięcia 2 mm przez PMMA o grubości 2 mm.
    2. Umyj wyciętą laserowo część wodą z mydłem, aby usunąć zanieczyszczenia z procesu cięcia laserowego.
      UWAGA: Nie używaj rozpuszczalników do czyszczenia części wyciętych laserowo. Rozpuszczalniki mogą prowadzić do propagacji mikropęknięć na krawędziach cięcia.
  5. Montaż platformy
    1. Wciśnij magnesy (średnica 3/16 cala, grubość 1/16 cala) ręcznie do wyciętej laserowo podstawy. Do pomocy przy wciskaniu magnesu można użyć miękkiego młotka lub końcówki śrubokręta. Grubość magnesów musi być mniejsza niż grubość podstawy z PMMA, aby magnesy licowały się z powierzchnią podstawy.
      UWAGA: Magnesy pozwalają użytkownikowi na dodawanie funkcjonalności do platformy poprzez dołączanie dodatkowych modułów.
    2. Odklej folię zabezpieczającą z arkusza PSA i przymocuj podstawę do szkiełka podstawkowego traktowanego glutaraldehydem, stroną funkcjonalną do góry.
    3. Ostrożnie umieść wycięty kanał z PDMS w zagłębieniu zdefiniowanym przez ramkę. Dociśnij szeroką pęsetą, aby usunąć pęcherzyki powietrza i zapewnić przylegający kontakt.
    4. Umieść traktowaną BSA pokrywę kanału na wierzchu wyciętego kanału, stroną z BSA do dołu. Upewnij się, że otwory wlotowe i wylotowe cieczy są wyrównane z kanałem.
    5. Urządzenie jest gotowe do wstrzyknięcia COL1.

2. Wstrzykiwanie roztworu COL1 do mikrokanału i usuwanie pokrywy w zastosowaniach do hodowli komórkowych

  1. Przygotowanie roztworu COL1
    1. Umieścić wszystkie wymagane odczynniki (roztwór stokowy COL1 [6 mg·mL−1], wodę ultrapure, 10x PBS, 0.1 M NaOH) na lodzie w komorze z laminarnym przepływem powietrza.
    2. Obliczyć objętość odczynników w następujący sposób:
      Równanie rozcieńczania kolagenu: wymagana objętość = (stężenie końcowe × objętość końcowa) / stężenie stokowe.
      Równanie rozcieńczania chemicznego, objętość 0.1 M NaOH, obliczenia, układ doświadczalny.
      Wzór obliczania objętości dla rozcieńczenia 10x PBS w laboratoryjnym układzie doświadczalnym.
      Wzór obliczania ilości wody ultrapure do przygotowania roztworu PBS, przedstawiający równanie odejmowania objętości końcowej.
      UWAGA: Zatem, aby przygotować 1 mL zneutralizowanego kolagenu o stężeniu 2.5 mg·mL−1 z roztworu stokowego 6 mg·mL−1, należy dodać 416.67 µL kolagenu, 429.16 µL wody DI, 100 µL 10x PBS oraz 54.16 µL 0.1 M NaOH, aby uzyskać końcowe pH 7. Aby osiągnąć pH 9.0, należy dodać 20 µL 0.1 M NaOH.
    3. Dodać odczynniki do pustej fiolki 5 mL w następującej kolejności: i) stok COL1, ii) woda DI, iii) 10x PBS, iv) 0.1 M NaOH.
      UWAGA: Do pipetowania roztworu COL1 należy używać pipety wypierającej. Stosowanie zwykłej pipety może prowadzić do znacznych strat próbki, co spowoduje wahania stężenia końcowego roztworu.
    4. Podnieść pH roztworu do pożądanej wartości (zazwyczaj między 7 a 9).
  2. Wstrzykiwanie roztworu COL1
    1. Umieścić pompę strzykawkową, schłodzoną sterylną strzykawkę, schłodzony zneutralizowany roztwór COL1 oraz sterylną igłę Luer lock 20 G z kątem 90˚ w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Napełnić strzykawkę roztworem COL1, uważając, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza.
    2. Przymocować igłę 20 G 90˚ do strzykawki, zamocować strzykawkę w pompie strzykawkowej igłą skierowaną w dół i odpowietrzyć igłę roztworem COL1.
    3. Ustawić pompę strzykawkową na wymaganą prędkość przepływu, w zakresie od 50 do 2,000 µL/min.
    4. Umieścić przygotowane kanały PDMS (sekcja 1) na podnośniku laboratoryjnym i wyrównać je z igłą.
    5. Wprowadzić igłę do portu wlotowego kanału PDMS (szersza strona). Wstrzykiwać roztwór do kanału, aż po stronie wylotowej zbierze się kropla COL1 o objętości ok. 30 µL.
    6. Obniżyć podnośnik laboratoryjny i delikatnie oddzielić igłę od nowo wypełnionego kanału.
    7. Powtarzać kroki 2.2.5–2.2.9, aż wszystkie kanały zostaną wypełnione roztworem COL1.
    8. Przenieść wypełnione kanały do szalek Petriego wraz z czystym, niepozostawiającym włókien wipe nasączonym wodą DI, aby zapobiec odwodnieniu nowo powstałego żelu COL1.
    9. Przykryć szalkę Petriego i umieścić wypełnione kanały w inkubatorze (37 ˚C, 95% wilgotności) na 2 h przed etapem odrywania.
  3. Odrywanie i equilibracja z medium
    1. Odsłonić spolimeryzowany żel COL1, zdejmując pokrywę PDMS za pomocą pęsety. Obróbka BSA zapobiega przywieraniu COL1 do pokrywy.
    2. Dodać 650 µL EGM do dołka.
    3. Pozostawić urządzenia w inkubatorze (37 ˚C, 95% wilgotności) przez minimum 4 h w celu equilibracji żelu i medium. Wymienić medium przed wysianiem komórek.
  4. Wysiewanie komórek
    1. Umieścić w komorze z laminarnym przepływem powietrza podgrzaną trypsynę 0.25% i medium hodowlane wraz z wymaganą liczbą pipet 5 mL i 10 mL.
    2. Hodować ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVECs) do 80% konfluencji w medium wzrostowym dla komórek śródbłonka (EGM) w temperaturze 37 ˚C i 95% wilgotności. Po sprawdzeniu konfluencji pod mikroskopem, przenieść kolbę z hodowlą HUVECs do komory z laminarnym przepływem powietrza.
    3. Odessać medium z kolby T25 i przemyć komórki 2x roztworem 1x PBS. Dodać do kolby 1 mL trypsyny i inkubować (37 ˚C, 95% wilgotności) przez 3 min.
    4. Po 3 min. sprawdzić kolbę pod mikroskopem, aby upewnić się, że komórki całkowicie oddzieliły się od powierzchni.
    5. Dodać do kolby 3 mL EGM (z serum), aby zneutralizować trypsynę. Następnie przenieść zawiesinę komórkową za pomocą pipety 5 mL do probówki stożkowej 15 mL. Wirować probówkę z komórkami przy 150 x g przez 5 min.
    6. Umieścić probówkę stożkową w komorze z laminarnym przepływem powietrza i odessać nadosad z zachowaniem osadu komórkowego. Resuspendować komórki w 1 mL świeżego medium hodowlanego.
    7. W probówce stożkowej 1 mL zmieszać 15 µL błękitu trypanu i 15 µL resuspendowanej zawiesiny komórkowej.
    8. Nanieść błękit trypanu i zawiesinę komórkową na obie strony szkiełka do liczenia komórek i włożyć szkiełko do licznika komórek.
    9. Rozcieńczyć zawiesinę komórkową w medium wzrostowym dla komórek śródbłonka do wymaganego stężenia na podstawie wyników z licznika komórek.
      UWAGA: Kolba T25 z komórkami HUVECs przy 80% konfluencji dostarczy ok. 750,000 komórek·ml−1 po rozcieńczeniu w 1 mL medium. Objętość zawiesiny komórkowej do wysiania oblicza się jako powierzchnia hodowli × gęstość komórek/stężenie zawiesiny komórkowej. Przykład: aby wysiać 20,000 komórek·cm−2 w dołku 35 mm x 15 mm, potrzebne będzie ok. 140 µL zawiesiny komórkowej.
    10. Odessać medium z inżynieryjnej macierzy COL1.
    11. Dodać wymaganą objętość zawiesiny komórkowej na podłoże COL1 i pozostawić komórki do osadzenia przez minimum 4 h przed obrazowaniem.
  5. Barwienie jąder komórkowych i cytoszkieletu
    1. Odessać medium z komórek i przemyć 3x roztworem 1x PBS (po 500 µL na każde przemycie). Przykryć warstwę komórek 4% paraformaldehydem na 15 min w temperaturze pokojowej (RT).
    2. Odessać paraformaldehyd i przemyć roztworem 1x PBS Tween-20 przez 5 min.
    3. Przeprowadzić permeabilizację błony komórkowej za pomocą 500 µL 0.1% roztworu Triton-X w PBS przez 15 min. Przemyć roztworem 1x PBS Tween-20 przez 5 min.
    4. Zablokować nieswoiste miejsca wiązania za pomocą 500 µL 4% BSA w PBS przez 30 min w RT.
    5. Rozcieńczyć fluorescencyjny znacznik faloidyna-aktyna w 4% BSA (1 µL stoku w 400 µL BSA).
    6. Odessać roztwór BSA, dodać roztwór faloidyny do komórek i inkubować przez 30 min w RT.
    7. Rozcieńczyć barwnik jądrowy w 4% BSA (1 µL w 500 µL), odessać faloidynę, dodać roboczy roztwór barwnika jądrowego i inkubować przez 15 min w RT.
    8. Odessać roboczy roztwór barwnika jądrowego, przemyć 3x roztworem PBS Tween-20 (po 5 min na każde przemycie) i zastąpić roztworem 1x PBS przed obrazowaniem.
    9. Wykonać obrazowanie za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego w kanale FITC (ex 491 nm/em 516 nm) i kanale DAPI (ex 360 nm/em 460 nm) z obiektywem 40x. Obrazować kolagen za pomocą konfokalnego mikroskopu skaningowego w trybie refleksyjnym, używając linii lasera 488 nm (moc 15%) i obiektywu imersyjnego w wodzie 40x.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Gdy samoorganizujący się roztwór COL1 przepływa przez kanał o zmniejszającym się przekroju poprzecznym, prędkość wzdłużna (vx) roztworu COL1 wzrasta lokalnie o wartość ∂vx na długości zwężenia między dwoma segmentami (∂x), co prowadzi do powstania szybkości odkształcenia rozciągającego (ε̇), gdzie ε̇ = ∂vx/∂x. Szybkość odkształcenia rozciągającego można obliczyć na podstawie prędkości płynu, która jest mierzona za pomocą cyfrowej welocymetrii obrazowej cząstek (PIV), co przedstawiono na <...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokoły generowania matryc COL1 z wyrównanymi włóknami zostały opisane przy użyciu metod magnetycznych, bezpośredniego zastosowania odkształceń mechanicznych i technik mikroprzepływowych47. Podejścia mikroprzepływowe są powszechnie stosowane do tworzenia systemów mikrofizjologicznych ze względu na ich dobrze zdefiniowaną charakterystykę przepływu i transportu, która umożliwia precyzyjną kontrolę nad mikrośrodowiskiem biochemicznym. Ponieważ wyrównane włókna COL1 dostarczają kluczowych wskazówek ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Wszyscy autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Podziękowania

Ta praca była częściowo wspierana przez National Institute of Health w ramach grantu numer R21GM143658 oraz przez National Science Foundation w ramach grantu numer 2150798. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentują one oficjalne poglądy agencji finansujących.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
(3-aminopropylo)trietoksysilan, 99% (APTES)Sigma Aldrich440140-100ML
20 Gauge serii IT Kątowa końcówka dozującaJensen GlobalJG-20-1.0-90
Magnes niklowany o średnicy 3/16" x grubości 1/16"KJ MagneticsD31
3M (TC) 12X12-6-467MPDigiKey3M9726-ND
ACETON ODCZYNNIK ACS ≥ 99.5%Signa Aldrich179124-4L
DB-20AC LABORATORYJNA OBRÓBKA KORONOWAProdukty elektrotechniczne12051A Albumina
surowicy bydlęcej (BSA), frakcja V, 98%, klasa odczynnika, Alfa AesarVWRAAJ64100-09
Przezroczysty odlew akrylowyMcMaster-Carr8560K181
Corning 100 mL Trypsyna 10x, 2,5% trypsyna w HBSS [-] wapń, magnez, czerwień fenolowa, testowany na parwowirusieVWR45000-666
Countess II Automatyczny licznik komórekThermo Fisher ScientificAMQAX1000
Oprogramowanie CT-FIRELOCI - University of Wisconsin
EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit, (CC-3156 i CC-4176), Lonza CC-3162, 500 mlLonzaCC-3162
Aldehyd glutarowy 50% w roztworze wodnym, klasa odczynnika, Opakowanie = Butelka HDPE, Rozmiar = 100 mlVWRVWRV0875-100ML
Graphtec CELITE-50GraphtecCE LITE-50
HEPES (1 m)Thermo Fisher Scientific15-630-080
Guma silikonowa o wysokiej czystości .010" Grubość, 6" x 8" Arkusz, twardość 55AMcMaster-Carr87315K62
Ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowejThermo Fisher ScientificC0035C
Invitrogen  Niebieska plama trypanowa (0,4%)Thermo Fisher ScientificT10282
IzopropanolFisher ScientificA4154
Wycinarka laserowaFull Spectrum20x12
Pompa strzykawkowaPompy strzykawkowe New EraNE-1002X
Pipet jednokanałowy Microman E, Gilson, model M1000EGilsonFD10006
Sondy molekularne Alexa Fluor 488 PhalloidinThermo Fisher ScientificA12379
Sondy molekularne Hoechst 33342, trichlorowodorek, trójwodzianThermo Fisher ScientificH3570
Nutragen bydlęcy Atelo CollagenAdvanced BioMatrix5010-50ML
Pbs (10x), pH 7,4VWR70011044.00
PBS pH 7,4Thermo Fisher Scientific10010049.00
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS, 10x), z Triton X-100Alfa AesarJ63521
Wymienny arkusz nośny do jednostki graphtec ROBO CC330L-20USCUTTERGRPCARSHTN
Restek Norm-Ject Plastikowa strzykawka 1 ml Luer SlipRestek22766.00
Wafelkrzemowy Wafel uniwersytecki452
Wodorotlenek sodu, ACS, opakowanie=butelka polietylenowa, rozmiar=500 gVWRBDH9292-500G
Sylgard 184VWR102092-312
Thermo Scientific  Pierce 20x PBS Tween 20Thermo Fisher Scientific28352.00
świń Mikrofluidyka serii H

Bibliografia

  1. Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
  2. Bosman, F. T., Stamenkovic, I. Functional structure and composition of the extracellular matrix. The Journal of Pathology. 200 (4), 423-428 (2003).
  3. Cox, T. R., Erler, J. T. Remodeling and homeostasis of the extracellular matrix: Implications for fibrotic diseases and cancer. Disease Models & Mechanisms. 4 (2), 165-178 (2011).
  4. Cross, V. L., et al. Dense type I collagen matrices that support cellular remodeling and microfabrication for studies of tumor angiogenesis and vasculogenesis in vitro. Biomaterials. 31 (33), 8596-8607 (2010).
  5. Lu, P., Takai, K., Weaver, V. M., Werb, Z. Extracellular matrix degradation and remodeling in development and disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (12), 005058(2011).
  6. Piotrowski-Daspit, A. S., Nerger, B. A., Wolf, A. E., Sundaresan, S., Nelson, C. M. Dynamics of tissue-induced alignment of fibrous extracellular matrix. Biophysical Journal. 113 (3), 702-713 (2017).
  7. Provenzano, P. P., et al. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Medicine. 4 (1), 38(2006).
  8. Provenzano, P. P., et al. Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression. BMC Medicine. 6 (1), 11(2008).
  9. Szulczewski, J. M., et al. Directional cues in the tumor microenvironment due to cell contraction against aligned collagen fibers. Acta Biomaterialia. 129, 96-109 (2021).
  10. Aubin, H., et al. Directed 3D cell alignment and elongation in microengineered hydrogels. Biomaterials. 31 (27), 6941-6951 (2010).
  11. Gruschwitz, R., et al. Alignment and cell-matrix interactions of human corneal endothelial cells on nanostructured collagen type I matrices. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (12), 6303-6310 (2010).
  12. Wang, W. Y., et al. Extracellular matrix alignment dictates the organization of focal adhesions and directs uniaxial cell migration. APL Bioengineering. 2 (4), 046107(2018).
  13. Wang, W. Y., Lin, D., Jarman, E. H., Polacheck, W. J., Baker, B. M. Functional angiogenesis requires microenvironmental cues balancing endothelial cell migration and proliferation. Lab on a Chip. 20 (6), 1153-1166 (2020).
  14. Lanfer, B. The growth and differentiation of mesenchymal stem and progenitor cells cultured on aligned collagen matrices. Biomaterials. 30 (30), 5950-5958 (2009).
  15. Brauer, E., et al. Collagen fibrils mechanically contribute to tissue contraction in an in vitro wound healing scenario. Advanced Science. 6 (9), 1801780(2019).
  16. Ingber, D. E. From mechanobiology to developmentally inspired engineering. PhilosophicalTransactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373 (1759), 20170323(2018).
  17. Wang, H., Abhilash, A. S., Chen, C. S., Wells, R. G., Shenoy, V. B. Long-range force transmission in fibrous matrices enabled by tension-driven alignment of fibers. Biophysical Journal. 107 (11), 2592-2603 (2014).
  18. Reinhart-King, C. A., Dembo, M., Hammer, D. A. Cell-cell mechanical communication through compliant substrates. Biophysical Journal. 95 (12), 6044-6051 (2008).
  19. Ahadian, S., et al. Organ-on-a-chip platforms: A convergence of advanced materials, cells, and microscale technologies. Advanced Healthcare Materials. 7 (2), 1700506(2018).
  20. Hou, X., et al. Interplay between materials and microfluidics. Nature Reviews Materials. 2 (5), 17016(2017).
  21. Abhyankar, V. V., et al. A platform for assessing chemotactic migration within a spatiotemporally defined 3D microenvironment. Lab on a Chip. 8 (9), 1507-1515 (2008).
  22. Abhyankar, V. V., Wu, M., Koh, C. Y., Hatch, A. V. A reversibly sealed, easy access, modular (SEAM) microfluidic architecture to establish in vitro tissue interfaces. PLoS One. 11 (5), 0156341(2016).
  23. Williams, M. J., et al. A low-cost, rapidly integrated debubbler (RID) module for microfluidic cell culture applications. Micromachines. 10 (6), 360(2019).
  24. Hsu, M. C., et al. A miniaturized 3D printed pressure regulator (µPR) for microfluidic cell culture applications. Scientific Reports. 12, 10769(2022).
  25. Huh, D., Torisawa, Y. S., Hamilton, G. A., Kim, H. J., Ingber, D. E. Microengineered physiological biomimicry: organs-on-chips. Lab on a Chip. 12 (12), 2156-2164 (2012).
  26. Abhyankar, V. V., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A., Beebe, D. J. Characterization of a membrane-based gradient generator for use in cell-signaling studies. Lab on a Chip. 6 (3), 389-393 (2006).
  27. Hasan, M. R., et al. One-step fabrication of flexible nanotextured PDMS as a substrate for selective cell capture. Biomedical Physics & Engineering Express. 4 (2), 025015(2018).
  28. Meyvantsson, I., Beebe, D. J. Cell culture models in microfluidic systems. Annual Review of Physical Chemistry. 1, 423-449 (2008).
  29. Ma, Y., et al. Viscoelastic cell microenvironment: Hydrogel-based strategy for recapitulating dynamic ECM mechanics. Advanced Functional Materials. 31 (24), 2100848(2021).
  30. Ma, Y., et al. 3D spatiotemporal mechanical microenvironment: A hydrogel-based platform for guiding stem cell fate. Advanced Materials. 30 (49), 1705911(2018).
  31. Lee, P., Lin, R., Moon, J., Lee, L. P. Microfluidic alignment of collagen fibers for in vitro cell culture. Biomedical Microdevices. 8 (1), 35-41 (2006).
  32. Del Amo, C., Borau, C., Movilla, N., Asín, J., García-Aznar, J. M. Quantifying 3D chemotaxis in microfluidic-based chips with step gradients of collagen hydrogel concentrations. Integrative Biology. 9 (4), 339-349 (2017).
  33. Shi, N., et al. A 3D, magnetically actuated, aligned collagen fiber hydrogel platform recapitulates physical microenvironment of myoblasts for enhancing myogenesis. Small Methods. 5 (6), 2100276(2021).
  34. Lanfer, B., et al. Aligned fibrillar collagen matrices obtained by shear flow deposition. Biomaterials. 29 (28), 3888-3895 (2008).
  35. Saeidi, N., Sander, E. A., Ruberti, J. W. Dynamic shear-influenced collagen self-assembly. Biomaterials. 30 (34), 6581-6592 (2009).
  36. Saeidi, N., Sander, E. A., Zareian, R., Ruberti, J. W. Production of highly aligned collagen lamellae by combining shear force and thin film confinement. Acta Biomaterialia. 7 (6), 2437-2447 (2011).
  37. Ahmed, A., et al. Microengineered 3D collagen gels with independently tunable fiber anisotropy and directionality. Advanced Materials Technologies. 6 (4), 2001186(2021).
  38. Ahmed, A., et al. Local extensional flows promote long-range fiber alignment in 3D collagen hydrogels. Biofabrication. 14 (3), 035019(2022).
  39. Mansouri, M., et al. The modular µSiM reconfigured: Integration of microfluidic capabilities to study in vitro barrier tissue models under flow. Advanced Healthcare Materials. , (2022).
  40. Paten, J. A., et al. Flow-induced crystallization of collagen: a potentially critical mechanism in early tissue formation. ACS Nano. 10 (5), 5027-5040 (2016).
  41. Liu, Y., Eliceiri, K. W. Quantifying fibrillar collagen organization with curvelet transform-based tools. Journal of Visualized Experiments. (165), e61931(2020).
  42. Bredfeldt, J. S., et al. Automated quantification of aligned collagen for human breast carcinoma prognosis. Journal of Pathology Informatics. 5 (1), 28(2014).
  43. Bredfeldt, J. S., et al. Computational segmentation of collagen fibers from second-harmonic generation images of breast cancer. Journal of Biomedical Optics. 19 (1), 016007(2014).
  44. Carey, S. P., et al. Local extracellular matrix alignment directs cellular protrusion dynamics and migration through Rac1 and FAK. Integrative Biology. 8 (8), 821-835 (2016).
  45. Carey, S. P., Kraning-Rush, C. M., Williams, R. M., Reinhart-King, C. A. Biophysical control of invasive tumor cell behavior by extracellular matrix microarchitecture. Biomaterials. 33 (16), 4157-4165 (2012).
  46. Ahmed, A., et al. Engineering fiber anisotropy within natural collagen hydrogels. AmericanJournal of Physiology-Cell Physiology. 320 (6), 1112-1124 (2021).
  47. Mohammadi, H., Janmey, P. A., McCulloch, C. A. Lateral boundary mechanosensing by adherent cells in a collagen gel system. Biomaterials. 35 (4), 1138-1149 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Urządzenie mikroprzepływowetrójwymiarowa hodowla komórekmacierz kolagenowa typu Imikrośrodowisko guzakomórki śródbłonkakanał PDMSwyrównanie magnetycznemobilność komórek
Mikroinżynieryjne hydrożele kolagenowe 3D z wyrównaniem włókien dalekiego zasięgu
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.