Artykuł metodologiczny

Mikroinżynieryjne hydrożele kolagenowe 3D z wyrównaniem włókien dalekiego zasięgu

DOI:

10.3791/64457

⸱

7 września 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Kate Gleason College of Engineering, Rochester Institute of Technology

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół demonstruje użycie kanału mikroprzepływowego o zmieniającej się geometrii wzdłuż kierunku przepływu płynu do generowania naprężeń rozciągających (rozciągających) w celu wyrównania włókien w hydrożelu kolagenowym 3D (<250 μm grubości). Wynikowe wyrównanie rozciąga się na kilka milimetrów i ma na nie wpływ szybkość odkształcania rozciągającego.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wyrównane włókna kolagenu I (COL1) kierują ruchliwością komórek nowotworowych, wpływają na morfologię komórek śródbłonka, kontrolują różnicowanie komórek macierzystych i są cechą charakterystyczną tkanek serca i układu mięśniowo-szkieletowego. Aby zbadać reakcję komórek na wyrównane mikrośrodowiska in vitro, opracowano kilka protokołów generowania matryc COL1 ze zdefiniowanym wyrównaniem włókien, w tym metody magnetyczne, mechaniczne, komórkowe i mikroprzepływowe. Spośród nich podejścia mikroprzepływowe oferują zaawansowane możliwości, takie jak dokładna kontrola przepływu płynów i mikrośrodowiska komórkowego. Jednak podejścia mikroprzepływowe do generowania wyrównanych matryc COL1 dla zaawansowanych platform hodowli in vitro zostały ograniczone do cienkich "mat" (o grubości <40 μm) włókien COL1, które rozciągają się na odległości mniejsze niż 500 μm i nie sprzyjają zastosowaniom do hodowli komórkowych 3D. W tym miejscu przedstawiamy protokół wytwarzania matryc 3D COL1 (o grubości 130-250 μm) z obszarami w skali milimetrowej o określonym wyrównaniu włókien w urządzeniu mikroprzepływowym. Platforma ta zapewnia zaawansowane możliwości hodowli komórkowych w celu modelowania ustrukturyzowanych mikrośrodowisk tkankowych, zapewniając bezpośredni dostęp do mikroinżynieryjnej matrycy do hodowli komórek.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki znajdują się w złożonej sieci włóknistej 3D zwanej macierzą zewnątrzkomórkową (ECM), której większość składa się z białka strukturalnego kolagenu typu I (COL1)1,2. Właściwości biofizyczne ECM dostarczają wskazówek do komórek, a w odpowiedzi komórki przebudowują mikroarchitekturę ECM3,4,5. Te wzajemne interakcje komórka-macierz mogą prowadzić do powstania wyrównanych domen włókien COL16, które promują angiogenezę i inwazję komórek w środowisku guza7,8,9 i wpływają na morfologię komórki10,11,12, polarization13 i różnicowanie14. Wyrównane włókna kolagenowe również wspomagają gojenie się ran15, odgrywają kluczową rolę w rozwoju tkanek16 i przyczyniają się do komunikacji komórkowej dalekiego zasięgu17,18. Dlatego replikacja natywnej mikroarchitektury włókien COL1 in vitro jest ważnym krokiem w kierunku opracowania ustrukturyzowanych modeli do badania reakcji komórek na dopasowane mikrośrodowiska.

Mikroprzepływowe systemy hodowli komórkowych zostały uznane za preferowaną technologię do rozwoju systemów mikrofizjologicznych (MPS)19,20,21,22,23. Wykorzystując korzystne efekty skalowania w mikroskali, systemy te zapewniają precyzyjną kontrolę nad przepływem płynów, wspierają kontrolowane wprowadzanie sił mechanicznych i definiują mikrośrodowisko biochemiczne w mikrokanale21,24,25,26,27. Platformy MPS zostały wykorzystane do modelowania mikrośrodowisk specyficznych dla tkanek i badania interakcji wielonarządowych28. Jednocześnie hydrożele były szeroko badane w celu podsumowania mechaniki 3D i biologicznego wpływu ECM, które są obserwowane in vivo29,30. Wraz z rosnącym naciskiem na integrację hodowli 3D z platformami mikroprzepływowymi, wiele podejść może łączyć hydrożele COL1 w urządzeniach mikroprzepływowych31,32,33. Jednak metody wyrównywania hydrożeli COL1 w kanałach mikroprzepływowych zostały ograniczone do cienkich "mat" 2D (o grubości <40 μm) w kanałach o szerokości <1 mm, oferując ograniczony potencjał modelowania odpowiedzi komórek w wyrównanych mikrośrodowiskach 3D31,34,35,36.

Aby uzyskać wyrównane hydrożele COL1 3D w systemie mikroprzepływowym, wykazano, że gdy samoorganizujący się roztwór COL1 jest wystawiony na lokalne przepływy ekstensywne (zmiana prędkości wzdłuż kierunku strumienia), powstałe hydrożele COL1 wykazują stopień wyrównania włókien, który jest wprost proporcjonalny do wielkości szybkości odkształcania rozciągającego, którego doświadczają37, 38. Konstrukcja mikrokanałów w tym protokole jest wyjątkowa na dwa sposoby; po pierwsze, segmentowa konstrukcja wprowadza lokalne naprężenie rozciągające do rozwiązania COL1, a po drugie, jego "dwuczęściowa" konstrukcja pozwala użytkownikowi wyrównać włókna COL1, a następnie zdemontować kanał, aby uzyskać bezpośredni dostęp do wyrównanych włókien w otwartym formacie. Podejście to można następnie zastosować do opracowania modułowych platform mikroprzepływowych, które opracowują systemy mikrofizjologiczne z uporządkowanymi matrycami COL1. Poniższy protokół opisuje proces wytwarzania segmentowanych mikrokanałów i szczegółowo opisuje wykorzystanie kanałów do wyrównania bydlęcego atelo COL1. Protokół ten zawiera również instrukcje dotyczące hodowli komórek na COL1 w formacie otwartej studni i omawia dodawanie funkcjonalności do platformy za pomocą modułowej, magnetycznej warstwy podstawowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Wykonanie dwuczęściowego kanału i modułowej podstawy platformy

UWAGA: Kanał mikroprzepływowy składa się z dwóch części - "wycięcia" kanału mikroprzepływowego, które jest wycinane jak brzytwa z arkusza polidimetylosiloksanu (PDMS) o określonej grubości, oraz pokrywy kanału, która odwracalnie łączy się z wycięciem i tworzy kanał. Kanał jest otoczony ramą z poli(metakrylanu metylu) (PMMA), która będzie działać jako zbiornik mediów (Rysunek 1). Rama z PMMA może być również używana do magnetycznego zatrzaskiwania specjalistycznych modułów w celu zwiększenia funkcjonalności.

  1. Kanały do cięcia brzytwą z arkuszy PDMS:
    UWAGA: Konstrukcja kanału mikroprzepływowego dla tego etapu jest przedstawiona na rysunku uzupełniającym 1. Kanał składa się z pięciu segmentów o długości 5 mm każdy i szerokości 10 mm, 5 mm, 2,5 mm, 1,25 mm i 0,75 mm. Prędkość roztworu kolagenu, wstrzykiwanego ze stałym natężeniem przepływu (50-400 μL·min−1), wzrasta lokalnie wzdłuż kanału, gdy szerokość kanału jest zmniejszana w celu wytworzenia przepływu rozciągliwego.
    1. Zamontuj arkusz PDMS o grubości 250 μm na plastikowym arkuszu nośnym i wytnij jak brzytwa konstrukcję mikroprzepływową za pomocą noża rzemieślniczego o głębokości ostrza 0,5 mm, prędkości 1 cm·s−1 i dużej sile.
    2. Za pomocą kąpieli ultradźwiękowej czyścić wycięcia kanałów mikroprzepływowych przez 5 minut. Opłucz kanały sonikowane w wodzie dejonizowanej (DI) i wysusz je na czystej płycie grzejnej w temperaturze 100 °C przez 5 minut.
    3. Przechowuj kanały na czystej, przykrytej szalce Petriego do czasu użycia.
  2. Wykonanie pokrywy PDMS i pasywacji powierzchni:
    UWAGA: Wycięcie kanału z sekcji 1.1 wymaga osłony, którą można umieścić na górze, aby utworzyć zamknięty kanał, do którego można wstrzyknąć roztwór COL1 (Rysunek uzupełniający 1). Pokrywę można zdjąć po samodzielnym zmontowaniu COL1. Aby zminimalizować ryzyko związania się COL1 w kanale z pokrywą, osłona jest pasywowana za pomocą albuminy surowicy bydlęcej (BSA). Dostarczony jest projekt formy dla pokrywy PDMS. Forma musi mieć grubość co najmniej 2 mm i powinna mieć powierzchnię równą powierzchni podstawy wycięcia w kanale mikroprzepływowym. W tym protokole powierzchnia podstawy formy wynosiła 35 mm x 15 mm.
    1. Aby przygotować formę, przymocuj arkusz kleju samoprzylepnego (PSA) do arkusza PMMA o grubości 2,5 mm i wytnij laserowo żądany kształt formy.
    2. Wyczyść wycinaną laserowo formę PMMA wilgotną, niestrzępiącą się ściereczką i usuń podkład z folii PSA. Przymocuj formę do wafla silikonowego o średnicy 100 mm, mocno dociskając.
    3. Przygotuj PDMS w stosunku 10:1 (baza:środek sieciujący). Mieszaj energicznie przez 1 minutę, aby zapewnić prawidłowe wymieszanie i odgazuj mieszaninę w komorze próżniowej w celu usunięcia pęcherzyków powietrza.
    4. Wlej odgazowany roztwór PDMS do formy PMMA/silikonowej i utwardź na płycie grzejnej w temperaturze 100 °C przez 20 minut. Pozostaw formę do ostygnięcia, usuń utwardzony PDMS i odetnij nadmiar żyletką.
      UWAGA: Upewnij się, że boki (płaskie) pokryw PDMS skierowane do płytek krzemowych są skierowane do góry we wszystkich poniższych krokach.
    5. Użyj stempla do biopsji o średnicy 1 mm, aby utworzyć otwory wlotowe i wylotowe, które odpowiadają końcom kanału mikroprzepływowego. Wycięcie w kanale z kroku 1.1 może służyć jako szablon do wyznaczania położenia otworów.
    6. Sonikować pokrywę w izopropanolu (IPA) przez 5 minut, spłukać wodą DI, wysuszyć źródłem sprężonego powietrza, a następnie przechowywać na czystej, przykrytej szalce Petriego. Umieść szalkę Petriego w komorze sterylizacyjnej UV (odkrytą) na 1 minutę w celu sterylizacji.
    7. Przykryj i przenieś do komory bezpieczeństwa biologicznego (BSC).
    8. Odpipetować 300 μl albuminy surowicy bydlęcej (BSA) o stężeniu 40 mg•mL-1 w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) na pokrywy PDMS i równomiernie rozprowadzić roztwór za pomocą końcówki pipety. Przed użyciem umieścić w lodówce w temperaturze 4 °C na co najmniej 4 godziny.
    9. Przenieś pokrywki z lodówki do BSC, umyj 5x 1x PBS i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu przez 10 min.
      UWAGA: Pokrowce PDMS można przechowywać w lodówce do 1 tygodnia po pokryciu ich BSA.
  3. Obróbka szkiełek nakrywkowych aldehydem glutarowym
    UWAGA: Funkcjonalizacja szkiełek nakrywkowych aldehydem glutarowym kowalencyjnie wiąże COL1 ze szkiełkiem nakrywkowym i zapobiega odklejaniu się hydrożelu.
    1. Przygotować 2% (v/v) roztwór aminopropylotrietoksysilanu (APTES) w szklanej zlewce, dodając 1 ml APTES do 49 ml acetonu.
    2. Rozcieńczyć 25% roztworu aldehydu glutarowego do 5% w wodzie DI. Przygotować 2 ml roztworu na każde szkiełko nakrywkowe o wymiarach 24 mm x 50 mm. W przypadku szkiełek nakrywkowych o wymiarach 24 mm x 24 mm lub 22 mm x 22 mm należy przygotować 1 ml roztworu na każde z nich.
    3. Wyczyść szkiełka nakrywkowe w sonikatorze kąpielowym przez 5 minut przy użyciu IPA. Spłucz IPA z szkiełek nakrywkowych za pomocą wody DI. IPA jest całkowicie wypłukany, gdy na szkiełku nakrywkowym widoczna jest gładka warstwa wody.
    4. Suszyć szkiełka nakrywkowe na gorącej płycie przez 5 minut w temperaturze 100 °C. Wysuszone szkiełka nakrywkowe umieścić na czystych szalkach Petriego, upewniając się, że nie zachodzą na siebie.
    5. Za pomocą różdżki do wyładowań koronowych wystawij szkiełka nakrywkowe na działanie wyładowania koronowego przez 1 minutę każde.
      UWAGA: Ten krok należy wykonać w dobrze wentylowanym pomieszczeniu lub okapie chemicznym.
    6. Usuń szkiełka nakrywkowe z szalki Petriego, a następnie zanurz je w roztworze APTES na 10 s w ciągu 5 minut od ekspozycji na koronę, upewniając się, że szkiełko nakrywkowe jest zanurzone.
      UWAGA: Upewnij się, że śledzisz, która strona została potraktowana osoczem i trzymaj ją skierowaną do góry.
    7. Następnie zanurz szkiełko nakrywkowe w acetonie na 10 s i osusz sprężonym powietrzem. Umieść suche szkiełko nakrywkowe z powrotem na szalce Petriego, stroną poddaną obróbce do góry.
      UWAGA: Powtórz kroki 1.3.5-1.3.7 dla wszystkich szkiełek nakrywkowych.
    8. Odpipetować 1 ml roztworu aldehydu glutarowego na powierzchnię każdego szkiełka nakrywkowego. Przykryj jak największą powierzchnię, nie dopuszczając do rozlania roztworu poza krawędź szkiełka nakrywkowego. W razie potrzeby można dodać więcej roztworu aldehydu glutarowego. Uważaj, aby nie zarysować powierzchni końcówką pipety.
    9. Pozostaw szkiełka nakrywkowe w kontakcie z roztworem przez 30 minut, a następnie spłucz wodą DI przez 20 s. Wysusz szkiełka nakrywkowe za pomocą sprężonego powietrza i umieść je z powrotem na szalkach Petriego, stroną poddaną obróbce plazmowej do góry.
      UWAGA: Szkiełka nakrywkowe można przechowywać do 1 tygodnia w temperaturze pokojowej (RT).
  4. Cięcie laserowe modułowej podstawy magnetycznej
    UWAGA: Konstrukcja modułowej podstawy magnetycznej jest przedstawiona na rysunku uzupełniającym 1. Modułowa podstawa służy jako studnia do przechowywania nośników i może być również używana do magnetycznego mocowania specjalistycznych modułów, zgodnie z opisem we wcześniej opublikowanych pracach22,37,38,39.
    1. Wytnij wzory z warstwy PMMA za pomocą odpowiednich ustawień lasera, takich jak liczba przejść i moc.
      UWAGA: Ustawienia lasera należy dostosować tak, aby magnesy można było wcisnąć w warstwę PMMA. Każdy laser jest inny, a parametry cięcia muszą być zoptymalizowane eksperymentalnie. W przypadku lasera o mocy 45 W zalecana jest 100% prędkość, 100% mocy i 3 przejścia do cięcia PMMA o grubości od 2 mm do 2 mm.
    2. Umyj wyciętą laserowo część wodą z mydłem, aby usunąć zanieczyszczenia z procesu cięcia laserowego.
      UWAGA: Nie używaj rozpuszczalników do czyszczenia części wycinanych laserowo. Rozpuszczalniki mogą powodować rozprzestrzenianie się mikropęknięć na krawędziach wycinanych laserowo.
  5. Montaż platformy
    1. Wsuń magnesy (o średnicy 3/16, grubości 1/16) ręcznie do wyciętej laserowo podstawy. Miękki młotek lub końcówka śrubokręta może być użyta do wsunięcia magnesu. Grubość magnesów musi być mniejsza niż grubość podstawy PMMA, aby zapewnić, że magnesy są zlicowane z powierzchnią podstawy.
      UWAGA: Magnesy pozwalają użytkownikowi na dodanie funkcjonalności do platformy poprzez dołączenie dodatkowych modułów.
    2. Oderwij podkład od arkusza PSA i przymocuj podstawę do szkiełka nakrywkowego poddanego działaniu aldehydu glutarowego, funkcjonalizowaną stroną skierowaną do góry.
    3. Delikatnie umieść wycięcie kanału PDMS we wnęce zdefiniowanej przez ramkę. Dociśnij pęsetą z szeroką końcówką, aby usunąć pęcherzyki powietrza i zapewnić konforemny kontakt.
    4. Umieść osłonę kanału z powłoką BSA na górze wycięcia kanału, stroną BSA skierowaną w dół. Upewnij się, że porty wlotowe i wylotowe płynu są wyrównane z kanałem.
    5. Urządzenie jest gotowe do wstrzyknięcia COL1.

2. Wstrzykiwanie roztworu COL1 do mikrokanału i zdejmowanie pokrywy do zastosowań w hodowlach komórkowych

  1. Przygotowanie roztworu COL1
    1. Umieść wszystkie wymagane odczynniki (roztwór podstawowy COL1 [6 mg·mL−1], woda ultraczysta, 10x PBS, 0,1 M NaOH) na lodzie w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
    2. Obliczyć objętość odczynników w następujący sposób
      figure-protocol-1
      figure-protocol-2
      figure-protocol-3
      figure-protocol-4
      UWAGA: Dlatego, aby uzyskać 1 ml zneutralizowanego kolagenu o stężeniu 2,5 mg·mL−1 z wywaru 6 mg·mL−1, dodaj 416.67 μl kolagenu, 429.16 μl wody DI, 100 μL 10x PBS i 54.16 μL 0.1 M NaOH, aby uzyskać końcowe pH 7. Dodać 20 μl 0,1 M NaOH, aby uzyskać pH 9,0.
    3. Dodaj odczynniki do pustej fiolki o pojemności 5 ml w następującej kolejności: i) bulion COL1, ii) woda DI, iii) 10x PBS, iv) 0,1 M NaOH,
      UWAGA: Użyj pipety wyporowej do obsługi roztworu COL1. W przypadku użycia zwykłej pipety może dojść do znacznego ubytku próbki, co prowadzi do wahań stężenia końcowego roztworu.
    4. Podnieś pH roztworu do pożądanego pH (zwykle między 7-9).
  2. Wstrzykiwanie roztworu COL1
    1. Umieść pompę strzykawkową, schłodzoną sterylną strzykawkę, schłodzony zneutralizowany roztwór COL1 i sterylną igłę Luer lock o gramaturze 20 G 90° w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Załadować roztwór COL1 do strzykawki, uważając, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza.
    2. Przymocować końcówkę igły 90° 20 G do strzykawki, załadować strzykawkę do pompy strzykawkowej igłą skierowaną w dół i zalać igłę roztworem COL1.
    3. Ustawić pompę strzykawkową na wymagane natężenie przepływu w zakresie 50-2 000 μl/min.
    4. Umieść przygotowane kanały PDMS (sekcja 1) na podnośniku laboratoryjnym i wypoziomuj z igłą.
    5. Włóż igłę do portu wlotowego kanału PDMS (szeroka strona). Wstrzykiwać kanał, aż po stronie wylotowej zbierze się kropla ~30 μl COL1.
    6. Opuść podnośnik laboratoryjny i delikatnie oddziel igłę od nowo napełnionego kanału.
    7. Powtarzaj kroki 2.2.5-2.2.9, aż wszystkie kanały zostaną wypełnione roztworem COL1.
    8. Załaduj wypełnione kanały do szalek Petriego wraz z czystą, niestrzępiącą się chusteczką nasączoną wodą DI, aby zapobiec odwodnieniu nowo powstałego żelu COL1.
    9. Przykryj szalkę Petriego i umieść załadowane kanały w inkubatorze (37 °C, 95% wilgotności) na 2 godziny przed etapem odklejania.
  3. Peel off i równoważenie pożywki
    1. Odsłoń spolimeryzowany żel COL1, zdejmując osłonę PDMS za pomocą pęsety. Obróbka BSA zapobiega przyczepianiu się COL1 do pokrowca.
    2. Dodaj 650 μl EGM do studzienki.
    3. Pozostaw urządzenia w inkubatorze (37 °C, 95% wilgotności) na co najmniej 4 godziny, aby zrównoważyć żel i pożywkę. Zastąp pożywkę przed wysiewem komórkami
  4. Komórki wysiewające
    1. Umieść ciepłą 0,25% trypsynę i pożywkę hodowlaną wraz z wymaganą liczbą pipet o pojemności 5 ml i 10 ml w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
    2. Hodowla ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) do 80% zbiegu w śródbłonkowym pożywce wzrostowej (EGM) w temperaturze 37 °C, przy wilgotności 95%. Umieścić kolbę do hodowli tkankowej zawierającą HUVEC w BSC po sprawdzeniu zbiegu pod mikroskopem.
    3. Wyrzucić pożywkę do kolby T25 i przemyć komórki 2x 1x PBS. Dodać 1 ml trypsyny do kolby i umieścić ją w inkubatorze (37 °C, 95% wilgotności) na 3 minuty.
    4. Po 3 minutach sprawdzić kolbę pod mikroskopem, aby upewnić się, że komórki są całkowicie oderwane od powierzchni.
    5. Dodaj 3 ml EGM (z surowicą) do kolby, aby zneutralizować trypsynę. Następnie przenieś roztwór komórek za pomocą pipety o pojemności 5 ml do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Odwirować stożkową probówkę zawierającą komórki o stężeniu 150 x g przez 5 minut.
    6. Umieścić stożkową rurkę w komorze bezpieczeństwa biologicznego i wyrzucić supernatant bez naruszania osadu komórkowego. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml świeżej pożywki hodowlanej.
    7. Dodać i wymieszać 15 μl błękitu trypanowego i 15 μl roztworu zawieszonych komórek w stożkowej probówce o pojemności 1 ml.
    8. Wstrzyknąć błękit trypanowy i roztwór komórek po obu stronach szkiełka do liczenia komórek i włożyć szkiełko do urządzenia do liczenia komórek.
    9. Rozcieńczyć roztwór komórkowy w pożywce do wzrostu śródbłonka do wymaganego stężenia w oparciu o stężenie komórek uzyskane z urządzenia do liczenia komórek.
      UWAGA: Kolba T25 HUVEC o 80% zbiegu da ~ 750 000 komórek ·ml−1, jeśli zostanie rozcieńczona w 1 ml pożywki. Objętość zawiesiny komórkowej, która ma zostać wysiana, oblicza się jako powierzchnię hodowli × gęstość komórek/stężenie zawiesiny komórkowej. Przykład: Aby zasiać 20 000 komórek·cm−2 w dołku o wymiarach 35 mm x 15 mm, potrzeba ~140 μl zawiesiny komórek.
    10. Zassać pożywkę na specjalnie zaprojektowanej matrycy COL1.
    11. Dodaj wymaganą objętość roztworu komórkowego na substrat COL1 i pozwól komórkom osiąść przez co najmniej 4 godziny przed obrazowaniem.
  5. Znakowanie jądra komórkowego i cytoszkieletu
    1. Odessać pożywkę z komórek i przemyć 3x 1x PBS, 500 μL w każdym płukaniu. Przykryj warstwę komórkową 4% paraformaldehydem przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
    2. Odessać paraformaldehyd i przemyć 1x PBS Tween-20 przez 5 minut.
    3. Przepuszczać błonę komórkową za pomocą 500 μl 0,1% roztworu Triton-X w PBS przez 15 min. Myć 1x PBS Tween-20 przez 5 min.
    4. Zablokuj niespecyficzne miejsca wiązania za pomocą 500 μl 4% BSA w PBS przez 30 minut w RT.
    5. Rozcieńczyć fluorescencyjny roztwór znakowany falloidyną i aktyną w 4% BSA (1 μl bulionu w 400 μl BSA).
    6. Odessać roztwór BSA, dodać roztwór falloidyny do komórek i odczekać 30 minut w temperaturze pokojowej.
    7. Rozcieńczyć plamę jądrową w 4% BSA (1 μL w 500 μL), odessać falloidynę, dodać działający roztwór barwienia jądrowego i odczekać 15 minut w temperaturze pokojowej.
    8. Odessać roztwór roboczy do barwienia jądrowego, przemyć PBS Tween-20 3x przez 5 minut każdy i zastąpić 1x PBS przed obrazowaniem.
    9. Obraz za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego z wykorzystaniem kanału FITC (ex 491 nm/em 516 nm) i kanału DAPI (ex 360 nm/em 460 nm) z obiektywem 40x. Zobrazuj kolagen za pomocą skaningu laserowego konfokalnego w trybie odbicia za pomocą linii laserowej 488 nm (15% mocy) i 40-krotnego obiektywu zanurzonego w wodzie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gdy samoorganizujący się roztwór COL1 przepływa przez kanał o malejącym polu przekroju, prędkość strumienia (vx) roztworu COL1 wzrasta lokalnie o wielkość, ∂vx, wzdłuż długości zwężenia między dwoma segmentami (∂x), co skutkuje szybkością odkształcania rozciągającego (ε̇), gdzie ε̇ = ∂vx/∂x. Szybkość odkształcania rozciągającego można obliczyć na podstawie prędkości płynu, która jest mierzona za pomocą prędkości obrazu cząstek (PIV), jak widać na Rysunek 2.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokoły generowania matryc COL1 z wyrównanymi włóknami zostały opisane przy użyciu metod magnetycznych, bezpośredniego zastosowania odkształceń mechanicznych i technik mikroprzepływowych47. Podejścia mikroprzepływowe są powszechnie stosowane do tworzenia systemów mikrofizjologicznych ze względu na ich dobrze zdefiniowaną charakterystykę przepływu i transportu, która umożliwia precyzyjną kontrolę nad mikrośrodowiskiem biochemicznym. Ponieważ wyrównane włókna COL1 dostarczają kluczowych wskazówek ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszyscy autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była częściowo wspierana przez National Institute of Health w ramach grantu numer R21GM143658 oraz przez National Science Foundation w ramach grantu numer 2150798. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentują one oficjalne poglądy agencji finansujących.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
(3-aminopropylo)trietoksysilan, 99% (APTES)Sigma Aldrich440140-100ML
20 Gauge serii IT Kątowa końcówka dozującaJensen GlobalJG-20-1.0-90
Magnes niklowany o średnicy 3/16" x grubości 1/16"KJ MagneticsD31
3M (TC) 12X12-6-467MPDigiKey3M9726-ND
ACETON ODCZYNNIK ACS ≥ 99.5%Signa Aldrich179124-4L
DB-20AC LABORATORYJNA OBRÓBKA KORONOWAProdukty elektrotechniczne12051A Albumina
surowicy bydlęcej (BSA), frakcja V, 98%, klasa odczynnika, Alfa AesarVWRAAJ64100-09
Przezroczysty odlew akrylowyMcMaster-Carr8560K181
Corning 100 mL Trypsyna 10x, 2,5% trypsyna w HBSS [-] wapń, magnez, czerwień fenolowa, testowany na parwowirusieVWR45000-666
Countess II Automatyczny licznik komórekThermo Fisher ScientificAMQAX1000
Oprogramowanie CT-FIRELOCI - University of Wisconsin
EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit, (CC-3156 i CC-4176), Lonza CC-3162, 500 mlLonzaCC-3162
Aldehyd glutarowy 50% w roztworze wodnym, klasa odczynnika, Opakowanie = Butelka HDPE, Rozmiar = 100 mlVWRVWRV0875-100ML
Graphtec CELITE-50GraphtecCE LITE-50
HEPES (1 m)Thermo Fisher Scientific15-630-080
Guma silikonowa o wysokiej czystości .010" Grubość, 6" x 8" Arkusz, twardość 55AMcMaster-Carr87315K62
Ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowejThermo Fisher ScientificC0035C
Invitrogen  Niebieska plama trypanowa (0,4%)Thermo Fisher ScientificT10282
IzopropanolFisher ScientificA4154
Wycinarka laserowaFull Spectrum20x12
Pompa strzykawkowaPompy strzykawkowe New EraNE-1002X
Pipet jednokanałowy Microman E, Gilson, model M1000EGilsonFD10006
Sondy molekularne Alexa Fluor 488 PhalloidinThermo Fisher ScientificA12379
Sondy molekularne Hoechst 33342, trichlorowodorek, trójwodzianThermo Fisher ScientificH3570
Nutragen bydlęcy Atelo CollagenAdvanced BioMatrix5010-50ML
Pbs (10x), pH 7,4VWR70011044.00
PBS pH 7,4Thermo Fisher Scientific10010049.00
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS, 10x), z Triton X-100Alfa AesarJ63521
Wymienny arkusz nośny do jednostki graphtec ROBO CC330L-20USCUTTERGRPCARSHTN
Restek Norm-Ject Plastikowa strzykawka 1 ml Luer SlipRestek22766.00
Wafelkrzemowy Wafel uniwersytecki452
Wodorotlenek sodu, ACS, opakowanie=butelka polietylenowa, rozmiar=500 gVWRBDH9292-500G
Sylgard 184VWR102092-312
Thermo Scientific  Pierce 20x PBS Tween 20Thermo Fisher Scientific28352.00
świń Mikrofluidyka serii H

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
  2. Bosman, F. T., Stamenkovic, I. Functional structure and composition of the extracellular matrix. The Journal of Pathology. 200 (4), 423-428 (2003).
  3. Cox, T. R., Erler, J. T. Remodeling and homeostasis of the extracellular matrix: Implications for fibrotic diseases and cancer. Disease Models & Mechanisms. 4 (2), 165-178 (2011).
  4. Cross, V. L., et al. Dense type I collagen matrices that support cellular remodeling and microfabrication for studies of tumor angiogenesis and vasculogenesis in vitro. Biomaterials. 31 (33), 8596-8607 (2010).
  5. Lu, P., Takai, K., Weaver, V. M., Werb, Z. Extracellular matrix degradation and remodeling in development and disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (12), 005058(2011).
  6. Piotrowski-Daspit, A. S., Nerger, B. A., Wolf, A. E., Sundaresan, S., Nelson, C. M. Dynamics of tissue-induced alignment of fibrous extracellular matrix. Biophysical Journal. 113 (3), 702-713 (2017).
  7. Provenzano, P. P., et al. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Medicine. 4 (1), 38(2006).
  8. Provenzano, P. P., et al. Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression. BMC Medicine. 6 (1), 11(2008).
  9. Szulczewski, J. M., et al. Directional cues in the tumor microenvironment due to cell contraction against aligned collagen fibers. Acta Biomaterialia. 129, 96-109 (2021).
  10. Aubin, H., et al. Directed 3D cell alignment and elongation in microengineered hydrogels. Biomaterials. 31 (27), 6941-6951 (2010).
  11. Gruschwitz, R., et al. Alignment and cell-matrix interactions of human corneal endothelial cells on nanostructured collagen type I matrices. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (12), 6303-6310 (2010).
  12. Wang, W. Y., et al. Extracellular matrix alignment dictates the organization of focal adhesions and directs uniaxial cell migration. APL Bioengineering. 2 (4), 046107(2018).
  13. Wang, W. Y., Lin, D., Jarman, E. H., Polacheck, W. J., Baker, B. M. Functional angiogenesis requires microenvironmental cues balancing endothelial cell migration and proliferation. Lab on a Chip. 20 (6), 1153-1166 (2020).
  14. Lanfer, B. The growth and differentiation of mesenchymal stem and progenitor cells cultured on aligned collagen matrices. Biomaterials. 30 (30), 5950-5958 (2009).
  15. Brauer, E., et al. Collagen fibrils mechanically contribute to tissue contraction in an in vitro wound healing scenario. Advanced Science. 6 (9), 1801780(2019).
  16. Ingber, D. E. From mechanobiology to developmentally inspired engineering. PhilosophicalTransactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373 (1759), 20170323(2018).
  17. Wang, H., Abhilash, A. S., Chen, C. S., Wells, R. G., Shenoy, V. B. Long-range force transmission in fibrous matrices enabled by tension-driven alignment of fibers. Biophysical Journal. 107 (11), 2592-2603 (2014).
  18. Reinhart-King, C. A., Dembo, M., Hammer, D. A. Cell-cell mechanical communication through compliant substrates. Biophysical Journal. 95 (12), 6044-6051 (2008).
  19. Ahadian, S., et al. Organ-on-a-chip platforms: A convergence of advanced materials, cells, and microscale technologies. Advanced Healthcare Materials. 7 (2), 1700506(2018).
  20. Hou, X., et al. Interplay between materials and microfluidics. Nature Reviews Materials. 2 (5), 17016(2017).
  21. Abhyankar, V. V., et al. A platform for assessing chemotactic migration within a spatiotemporally defined 3D microenvironment. Lab on a Chip. 8 (9), 1507-1515 (2008).
  22. Abhyankar, V. V., Wu, M., Koh, C. Y., Hatch, A. V. A reversibly sealed, easy access, modular (SEAM) microfluidic architecture to establish in vitro tissue interfaces. PLoS One. 11 (5), 0156341(2016).
  23. Williams, M. J., et al. A low-cost, rapidly integrated debubbler (RID) module for microfluidic cell culture applications. Micromachines. 10 (6), 360(2019).
  24. Hsu, M. C., et al. A miniaturized 3D printed pressure regulator (µPR) for microfluidic cell culture applications. Scientific Reports. 12, 10769(2022).
  25. Huh, D., Torisawa, Y. S., Hamilton, G. A., Kim, H. J., Ingber, D. E. Microengineered physiological biomimicry: organs-on-chips. Lab on a Chip. 12 (12), 2156-2164 (2012).
  26. Abhyankar, V. V., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A., Beebe, D. J. Characterization of a membrane-based gradient generator for use in cell-signaling studies. Lab on a Chip. 6 (3), 389-393 (2006).
  27. Hasan, M. R., et al. One-step fabrication of flexible nanotextured PDMS as a substrate for selective cell capture. Biomedical Physics & Engineering Express. 4 (2), 025015(2018).
  28. Meyvantsson, I., Beebe, D. J. Cell culture models in microfluidic systems. Annual Review of Physical Chemistry. 1, 423-449 (2008).
  29. Ma, Y., et al. Viscoelastic cell microenvironment: Hydrogel-based strategy for recapitulating dynamic ECM mechanics. Advanced Functional Materials. 31 (24), 2100848(2021).
  30. Ma, Y., et al. 3D spatiotemporal mechanical microenvironment: A hydrogel-based platform for guiding stem cell fate. Advanced Materials. 30 (49), 1705911(2018).
  31. Lee, P., Lin, R., Moon, J., Lee, L. P. Microfluidic alignment of collagen fibers for in vitro cell culture. Biomedical Microdevices. 8 (1), 35-41 (2006).
  32. Del Amo, C., Borau, C., Movilla, N., Asín, J., García-Aznar, J. M. Quantifying 3D chemotaxis in microfluidic-based chips with step gradients of collagen hydrogel concentrations. Integrative Biology. 9 (4), 339-349 (2017).
  33. Shi, N., et al. A 3D, magnetically actuated, aligned collagen fiber hydrogel platform recapitulates physical microenvironment of myoblasts for enhancing myogenesis. Small Methods. 5 (6), 2100276(2021).
  34. Lanfer, B., et al. Aligned fibrillar collagen matrices obtained by shear flow deposition. Biomaterials. 29 (28), 3888-3895 (2008).
  35. Saeidi, N., Sander, E. A., Ruberti, J. W. Dynamic shear-influenced collagen self-assembly. Biomaterials. 30 (34), 6581-6592 (2009).
  36. Saeidi, N., Sander, E. A., Zareian, R., Ruberti, J. W. Production of highly aligned collagen lamellae by combining shear force and thin film confinement. Acta Biomaterialia. 7 (6), 2437-2447 (2011).
  37. Ahmed, A., et al. Microengineered 3D collagen gels with independently tunable fiber anisotropy and directionality. Advanced Materials Technologies. 6 (4), 2001186(2021).
  38. Ahmed, A., et al. Local extensional flows promote long-range fiber alignment in 3D collagen hydrogels. Biofabrication. 14 (3), 035019(2022).
  39. Mansouri, M., et al. The modular µSiM reconfigured: Integration of microfluidic capabilities to study in vitro barrier tissue models under flow. Advanced Healthcare Materials. , (2022).
  40. Paten, J. A., et al. Flow-induced crystallization of collagen: a potentially critical mechanism in early tissue formation. ACS Nano. 10 (5), 5027-5040 (2016).
  41. Liu, Y., Eliceiri, K. W. Quantifying fibrillar collagen organization with curvelet transform-based tools. Journal of Visualized Experiments. (165), e61931(2020).
  42. Bredfeldt, J. S., et al. Automated quantification of aligned collagen for human breast carcinoma prognosis. Journal of Pathology Informatics. 5 (1), 28(2014).
  43. Bredfeldt, J. S., et al. Computational segmentation of collagen fibers from second-harmonic generation images of breast cancer. Journal of Biomedical Optics. 19 (1), 016007(2014).
  44. Carey, S. P., et al. Local extracellular matrix alignment directs cellular protrusion dynamics and migration through Rac1 and FAK. Integrative Biology. 8 (8), 821-835 (2016).
  45. Carey, S. P., Kraning-Rush, C. M., Williams, R. M., Reinhart-King, C. A. Biophysical control of invasive tumor cell behavior by extracellular matrix microarchitecture. Biomaterials. 33 (16), 4157-4165 (2012).
  46. Ahmed, A., et al. Engineering fiber anisotropy within natural collagen hydrogels. AmericanJournal of Physiology-Cell Physiology. 320 (6), 1112-1124 (2021).
  47. Mohammadi, H., Janmey, P. A., McCulloch, C. A. Lateral boundary mechanosensing by adherent cells in a collagen gel system. Biomaterials. 35 (4), 1138-1149 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Collagen HydrogelsFiber AlignmentMicrofluidic Device3D Cell CultureCollagen I MatrixTumor MicroenvironmentEndothelial CellsPDMS ChannelMagnetic AlignmentCell Motility

Powiązane artykuły