Artykuł metodologiczny

Ocena integralności punktu kontrolnego zespołu wrzeciona w oocytach myszy

DOI:

10.3791/64459

⸱

13 września 2022

 ,  , 
1Department of Genetics, Rutgers, The State University of New Jersey, 2Human Genetics Institute of New Jersey, 3Department of Theriogenology, Faculty of Veterinary Medicine, Mansoura University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Błąd w segregacji chromosomów jest powszechną cechą oocytów. Dlatego badanie punktu kontrolnego montażu wrzeciona daje ważne wskazówki na temat mechanizmów potrzebnych do produkcji zdrowych jaj. Niniejszy protokół opisuje trzy uzupełniające się testy do oceny integralności punktu kontrolnego montażu wrzeciona w oocytach myszy.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aneuploidia jest główną nieprawidłowością genetyczną powodującą wczesne poronienia i niepowodzenia ciąży u ludzi. Większość błędów w segregacji chromosomów, które powodują aneuploidię, występuje podczas mejozy w oocytach, ale dlaczego mejoza oocytów jest podatna na błędy, nadal nie jest w pełni zrozumiałe. Podczas podziału komórki zapobiegają błędom w segregacji chromosomów poprzez aktywację punktu kontrolnego montażu wrzeciona (SAC). Ten mechanizm sterowania opiera się na wykrywaniu przyczepów kinetochoru (KT) i mikrotubul (MT) i wykrywaniu napięcia generowanego przez włókna wrzeciona. Gdy KT są odczepione, SAC jest aktywowany i zapobiega progresji cyklu komórkowego. SAC jest najpierw aktywowany przez kinazę MPS1, która wyzwala rekrutację i tworzenie kompleksu mitotycznych punktów kontrolnych (MCC), składającego się z MAD1, MAD2, BUB3 i BUBR1. Następnie MCC dyfunduje do cytoplazmy i sekwestruje CDC20, aktywator kompleksu/cyklosomu promujący anafazę (APC/C). Gdy KT zostaną przyłączone do mikrotubul, a chromosomy zostaną wyrównane na płytce metafazowej, SAC jest wyciszany, CDC20 jest uwalniany, a APC/C jest aktywowany, wywołując degradację cykliny B i sekuryny, umożliwiając w ten sposób początek anafazy. W porównaniu z komórkami somatycznymi, SAC w oocytach nie jest tak skuteczny, ponieważ komórki mogą ulegać anafazie pomimo nieprzyłączonych KT. Zrozumienie, dlaczego SAC jest bardziej pobłażliwy i czy ta permisywność jest jedną z przyczyn błędów segregacji chromosomów w oocytach, nadal wymaga dalszych badań. Niniejszy protokół opisuje trzy techniki kompleksowej oceny integralności SAC w oocytach myszy. Techniki te obejmują stosowanie nokodazolu do depolimeryzacji MT w celu oceny odpowiedzi SAC, śledzenie wyciszania SAC poprzez śledzenie kinetyki niszczenia sekuryny oraz ocenę rekrutacji MAD2 do KT za pomocą immunofluorescencji. Łącznie techniki te badają mechanizmy potrzebne do produkcji zdrowych komórek jajowych, zapewniając pełną ocenę integralności SAC.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aneuploidia, która wynika z błędów w segregacji chromosomów, jest główną przyczyną wczesnych poronień i jest silnie związana z błędami w mejozie1. Mejoza różni się od mitozy, ponieważ składa się z dwóch rund podziału komórki bez etapu replikacji DNA. W mejozie I chromosomy homologiczne rozdzielają się, podczas gdy chromatydy siostrzane pozostają razem. W oocytach ten etap jest podatny na błędy, co prowadzi do produkcji aneuploidalnych komórek jajowych2.

Aby zapobiec błędom segregacji chromosomów, większość typów komórek aktywuje mechanizm nadzoru, który wstrzymuje cykl komórkowy, zwany punktem....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie myszy użyte w tych protokołach były trzymane i hodowane zgodnie z wytycznymi Rutgers University Institutional Animal Use and Care Committee (Protokół 201702497) oraz National Institutes of Health. Te organy regulacyjne zatwierdziły wszystkie procedury eksperymentalne obejmujące badania na zwierzętach. Wszystkie myszy użyte w niniejszym badaniu były 6-8-tygodniowymi samicami CF-1.

1. Przygotowanie eksperymentalne

  1. Przed rozpoczęciem oceny SAC należy pobrać oocyty myszy zgodnie z wcześniej opublikowanym raportem12. Podziel pobrane oocyty na trzy grupy o równej wielkości i trzymaj j....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ocena reakcji SAC po leczeniu nokodazolem
Celem tego eksperymentu jest ocena aktywacji i siły SAC. Dzięki zastosowaniu nokodazolu do depolimeryzacji mikrotubul wrzeciona, wszystkie kinetochory zostaną odczepione, co spowoduje zatrzymanie cyklu komórkowego za pośrednictwem SAC. W obecnym systemie obrazowania, oocyty kontrolne traktowane DMSO wytłaczały ciało polarne około 14 godzin po uwolnieniu z milrinonu (Ryc. 1, górne panele). Zgodnie z aktywacją SAC, oocyty traktowane nokodazo.......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Punkt kontrolny montażu wrzeciona jest krytycznym mechanizmem kontrolnym podczas podziału komórki, zaprojektowanym w celu zapobiegania błędom segregacji chromosomów. Dzięki temu ogniwo ma wystarczająco dużo czasu na skorygowanie nieprawidłowych nasadek KT-MT. Mejoza w oocytach jest procesem podatnym na błędy, w którym większość nieprawidłowej segregacji chromosomów występuje podczas mejozy I, co prowadzi do powstania aneuploidalnych jaj, które są główną przyczyną wczesnych poronień i niepłodności u ludzi

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają żadnych konfliktów do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Finansowanie tego projektu zostało zapewnione przez National Institutes of Health (R35GM136340 do KS).

....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)SigmaA4503
DAPILife TechnologiesD1306
Dimetylosulfotlenek (DMSO)SigmaD5879
Osioł-anty-królik-Alexa-568Life TechnologiesA10042
EVOS FL System automatycznego obrazowaniaLife TechnologiesMikroskop
fluorescencyjnyInkubator EVOS OnstageLife TechnologiesKomora inkubatora
Szklane dno 96-dołkowe płytki N 1.5 niepowlekaneMatTek CorporationP96G-1.5-5-F
kozio-anty-ludzkie-Alexa-633Life TechnologiesA21091
HEPESSigmaH3537
anty-ACAWłączone15-234Rozcieńczenie 1/30
ImageJNIH
KClSigmaP5405
KH2PO4SigmaP5655
Leica SP8 wyposażona w obiektyw zanurzeniowy 63×, 1.40 NALeica
MgSO4· 7H20SigmaM7774
MilrinoneSigmaM4659
Na2HPO4SigmaS2429
NaClSigmaS5886
NaN3SigmaS2002
NocodazoleSigmaM1404
Paraformaldhyde (PFA)SigmaP6148
RURYSigmaP6757
Królik anty-MAD2Biolegend924601Rozcieńczenie 1/1000; poprzednio Covance #PRB-452C
ReversineCayman Chemical10004412
Triton-XSigma274348
Tween-20SigmaX100
VectashieldVector laboratoriaH-1000
Ludzkie przeciwciała oil immersion

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gruhn, J. R., et al. Chromosome errors in human eggs shape natural fertility over reproductive life span. Science. 365 (6460), 1466-1469 (2019).
  2. Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Segregacja chromosom wmechanizmy aneuploidiiintegralno SACobrazowanie na ywoanaliza immunofluorescencyjnadegradacja sekurynyrekrutacja MAD2mikroskopia konfokalna

Powiązane artykuły