Artykuł metodologiczny

Modelowanie rozwoju móżdżku człowieka in vitro w strukturze 2D

DOI:

10.3791/64462

⸱

16 września 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Psychiatry, University of Iowa, 2Department of Radiology, University of Iowa, 3Carver College of Medicine, University of Iowa, 4Iowa Neuroscience Institute, University of Iowa, 5Pappajohn Biomedical Institute, University of Iowa

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecny protokół wyjaśnia tworzenie monowarstwy 2D komórek móżdżku z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w celu zbadania wczesnych etapów rozwoju móżdżku.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Precyzyjny i terminowy rozwój móżdżku jest kluczowy nie tylko dla dokładnej koordynacji motorycznej i równowagi, ale także dla funkcji poznawczych. Ponadto zakłócenia w rozwoju móżdżku są związane z wieloma zaburzeniami neurorozwojowymi, w tym autyzmem, zespołem nadpobudliwości psychoruchowej z deficytem uwagi (ADHD) i schizofrenią. Badania nad rozwojem móżdżku u ludzi były wcześniej możliwe tylko poprzez badania pośmiertne lub neuroobrazowanie, jednak metody te nie są wystarczające do zrozumienia zmian molekularnych i komórkowych zachodzących in vivo we wczesnym okresie rozwoju, czyli wtedy, gdy powstaje wiele zaburzeń neurorozwojowych. Pojawienie się technik generowania indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) z komórek somatycznych oraz możliwość dalszego różnicowania iPSC w neurony utorowały drogę do modelowania in vitro wczesnego rozwoju mózgu. Niniejsze badanie przedstawia uproszczone kroki w kierunku generowania komórek móżdżku do zastosowań wymagających dwuwymiarowej (2D) struktury monowarstwowej. Komórki móżdżku reprezentujące wczesne stadia rozwojowe są pozyskiwane z ludzkich iPSC w następujących etapach: najpierw ciała embrionoidalne są wytwarzane w kulturze trójwymiarowej (3D), następnie są traktowane FGF2 i insuliną w celu promowania specyfikacji losu móżdżku, a na końcu są ostatecznie różnicowane jako monowarstwa na podłożach pokrytych poli-l-ornityną (PLO) / lamininą. Po 35 dniach różnicowania hodowle komórek móżdżku pochodzące z iPSC wyrażają markery móżdżku, w tym ATOH1, PTF1α, PAX6 i KIRREL2, co sugeruje, że protokół ten generuje glutaminergiczne i GABA-ergiczne prekursory neuronów móżdżku, a także komórki progenitorowe Purkinjego. Co więcej, zróżnicowane komórki wykazują odrębną morfologię neuronów i są dodatnie dla immunofluorescencyjnych markerów tożsamości neuronalnej, takich jak TUBB3. Komórki te wyrażają aksonalne cząsteczki prowadzące, w tym semaforynę-4C, pleksynę-B2 i neuropilinę-1, i mogą służyć jako model do badania molekularnych mechanizmów wzrostu neurytów i połączeń synaptycznych. Metoda ta generuje ludzkie neurony móżdżku przydatne do dalszych zastosowań, w tym ekspresji genów, badań fizjologicznych i morfologicznych wymagających jednowarstwowych formatów 2D.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zrozumienie rozwoju ludzkiego móżdżku i krytycznych okien czasowych tego procesu jest ważne nie tylko dla rozszyfrowania możliwych przyczyn zaburzeń neurorozwojowych, ale także dla identyfikacji nowych celów dla interwencji terapeutycznej. Modelowanie rozwoju ludzkiego móżdżku in vitro było wyzwaniem, jednak z biegiem czasu pojawiło się wiele protokołów różnicujących ludzkie embrionalne komórki macierzyste (hESC) lub iPSC o losach linii móżdżku1,2,3,4,5,6,7,8. Ponadto ważne jest, aby opracować protokoły, które generują powtarzalne wyniki, są stosunkowo proste (w celu zmniejszenia błędów) i nie obciążają kosztami pieniężnymi.

Pierwsze protokoły różnicowania móżdżku zostały wygenerowane z kultur 2D z posianych ciał embrionalnych (EBs), indukując los móżdżku za pomocą różnych czynników wzrostu podobnych do rozwoju in vivo, w tym WNT, BMP i FGFs1,9. Nowsze opublikowane protokoły indukowały różnicowanie głównie w hodowli organoidów 3D z FGF2 i insuliną, a następnie FGF19 i SDF1 dla rombowych struktur podobnych do warg3,4, lub używały kombinacji FGF2, FGF4 i FGF85. Obie metody indukcji organoidów móżdżku dały podobne organoidy móżdżku 3D, ponieważ oba protokoły zgłaszały podobną ekspresję markerów móżdżku w identycznych punktach czasowych. Holmes i Heine rozszerzyli swój protokół 3D5, aby pokazać, że komórki móżdżku 2D mogą być generowane z hESC i iPSC, które zaczynają się jako agregaty 3D. Ponadto Silva i wsp.7 wykazali, że komórki reprezentujące dojrzałe neurony móżdżku w 2D mogą być generowane przy użyciu podobnego podejścia jak Holmes i Heine, wykorzystując inny punkt czasowy do przełączania z 3D na 2D i wydłużając czas wzrostu i dojrzewania.

Obecny protokół indukuje los móżdżku w iPSC bez karmienia, generując swobodnie pływające ciała zarodkowe (EBs) za pomocą insuliny i FGF2, a następnie posiewając EB na szalkach pokrytych PLO/lamininą w dniu 14 dla wzrostu i różnicowania 2D. Do 35 dnia uzyskuje się komórki o tożsamości móżdżku. Możliwość podsumowania wczesnych etapów rozwoju móżdżku, zwłaszcza w środowisku 2D, pozwala badaczom odpowiedzieć na konkretne pytania wymagające eksperymentów ze strukturą jednowarstwową. Protokół ten jest również podatny na dalsze modyfikacje, takie jak powierzchnie z mikrowzorami, testy wzrostu aksonów i sortowanie komórek w celu wzbogacenia pożądanych populacji komórek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania na ludziach zostały zatwierdzone na podstawie numeru zatwierdzenia 201805995 przez University of Iowa Institutional Review Board oraz Komitetu ds. Ludzkich Pluripotencjalnych Komórek Macierzystych Uniwersytetu Iowa pod numerem 2017-02. Biopsje skóry pobrano od badanych po uzyskaniu pisemnej świadomej zgody. Fibroblasty hodowano w DMEM z 15% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% roztworem aminokwasów endogennych MEM w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Fibroblasty przeprogramowano za pomocą zestawu do przeprogramowania episomalnego zgodnie z protokołem producenta (patrz tabela materiałów) przy użyciu nukleofektora do elektroporacji. Wszystkie zabiegi zostały przeprowadzone w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II typu A2 (w skrócie "kaptur"). Wszystkie pożywki do hodowli komórkowych były wolne od antybiotyków; Dlatego każdy element, który dostał się do maski, został oczyszczony 70% etanolem. Wszystkie pożywki i składniki do hodowli komórkowych zostały sterylnie przefiltrowane lub otwarte w kapturze, aby zachować ich sterylność.

1. Przygotowanie eksperymentalne

  1. Przygotuj płyty pokryte matrycą membrany podstawnej (BMM).
    UWAGA: BMM krzepnie szybciej w cieplejszych temperaturach. Płytki należy przygotować szybko i natychmiast umieścić w temperaturze 4 °C w celu przechowywania.
    1. Rozmrażać BMM (patrz tabela materiałów) na lodzie w temperaturze 4 °C przez co najmniej 2 godziny lub przez noc.
    2. Wymieszać DMEM/F12 i BMM do końcowego stężenia 80 μg/ml. Rozprowadzić roztwór BMM na szalkach do hodowli tkankowych (1 ml dla szalek 35 mm i 2 ml dla szalek 60 mm) i inkubować w temperaturze 37 °C przez co najmniej 1 godzinę lub przez noc przed posiewem komórek.
      UWAGA: Niewykorzystane naczynia można przechowywać w temperaturze 4 °C przez 2 tygodnie.
  2. Przygotować płytki pokryte poli-L-ornityną/lamininą (PLO/laminina).
    1. Przygotować 20 μg/ml PLO (patrz Tabela materiałów) w sterylnym DPBS+/+ i dodać 1 ml do każdego dołka na 6-dołkowej płytce. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C w inkubatorze.
    2. Następnego dnia odessać PLO za pomocą aspiratora próżniowego i umyć dwa razy DPBS+/+. Suszyć na powietrzu w kapturze.
      UWAGA: Talerze wysuszone na powietrzu można przechowywać w temperaturze 4 °C do 2 tygodni, zawinięte w folię aluminiową, do wykorzystania w przyszłości.
    3. Przygotować 10 μg/ml lamininy (patrz tabela materiałów) w DPBS+/+ i dodać 1 ml do każdego dołka na 6-dołkowej płytce. Inkubować w inkubatorze przez co najmniej 3 godziny lub przez noc w temperaturze 37 °C.
    4. Odessać lamininę za pomocą aspiratora próżniowego i dodać 1 ml pożywki lub sterylnego DPBS+/+.
      UWAGA: Powłoka z lamininy nie może wyschnąć. Aby temu zapobiec, należy natychmiast dodać PBS lub odpowiednią pożywkę. Powlekane talerze można przechowywać w temperaturze 4 °C do 2 tygodni.
  3. Przygotuj roztwór do pasowania PSC.
    UWAGA: Osmometr (patrz Tabela materiałów) jest wymagany do wykonania rozwiązania do pasowania PSC10.
    1. Rozpuścić 11,49 g chlorku potasu (KCl) i 0,147 g dwuwodnego cytrynianu sodu (HOC(COONa)(CH,2, COONa)2*2H2O) w 400 ml sterylnej wody o czystości do hodowli komórkowych (patrz tabela materiałów).
    2. Zmierzyć objętość roztworu i zapisać ją jako objętość początkową (Vi).
    3. Zmierz osmolarność i dostosuj ją do 570 mOsm, dodając sterylną wodę klasy do hodowli komórkowych przy użyciu wzoru Vi × Oi = Vf × 570 mOsm.
    4. Przefiltruj i wysterylizuj roztwór za pomocą filtra 0,20 μm i przygotuj 10 ml porcji. Podwielokrotności należy przechowywać w temperaturze pokojowej (RT) przez okres do 6 miesięcy.
  4. Przygotować podłoże z pluripotencjalnych komórek macierzystych (PSC).
    UWAGA: iPSC są utrzymywane w pożywce zawierającej stabilny termicznie FGF2 (patrz Tabela materiałów), zapewniając harmonogram karmienia bez weekendów. Inne dostępne na rynku nośniki PSC nie zostały wypróbowane pod kątem tego protokołu.
    1. Rozmrozić suplement pożywki PSC przez noc w temperaturze 4 °C.
    2. Dodać 10 ml pożywki PSC do 500 ml podstawowej pożywki PSC. Przygotować 25 ml porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C.
      UWAGA: Zamrożone porcje można przechowywać w temperaturze -20 °C przez 6 miesięcy. Rozmrożone podwielokrotności muszą być przechowywane w temperaturze 4 °C i zużyte w ciągu 2 tygodni. Komórki można zamrozić w celu długotrwałego przechowywania w pożywce PSC z 10% (v/v) dimetylosulfotlenkiem (DMSO).
  5. Przygotować podłoże do rozmrażania PSC.
    1. Suplement PSC z 50 nM chroman, 1,5 μM emricasan, 1x suplementem poliaminowym i 0,7 μM trans-ISRIB (CEPT cocktail11) (patrz Tabela Materiałów).
    2. Filtrować-sterylizować filtrem 0,20 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C do 4 tygodni.
  6. Przygotuj pipety z wyciągniętego szkła.
    1. Przeciągnij szklane pipety Pasteura o długości 22,9 cm (9 cali) na dwie części nad palnikiem Bunsena, ~2 cm poniżej szyjki, tworząc dwie pipety, przy czym cieńsza strona jest ~4 cm krótsza od drugiej.
    2. Za pomocą płomienia zegnij końcówki ciągniętej strony, aby uzyskać gładkie "r".
    3. Umieść wyciągnięte pipety w rękawach autoklawu i autoklawie do sterylizacji.
  7. Przygotuj pożywkę do różnicowania móżdżku (CDM).
    1. Wymieszaj IMDM i mieszankę odżywczą F12 szynki w stosunku 1:1. Uzupełnij mieszankę 1x suplementem L-alaniny-L-glutaminy, 1% (v/v) chemicznie zdefiniowanym koncentratem lipidowym, 0,45 mM 1-tio-glicerolu, 15 μL/ml apo-transferyny, 5 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i 7 μg/ml insuliny (patrz Tabela Materiałów).
    2. Filtrować-sterylizować filtrem 0,20 μm, przechowywać w temperaturze 4 °C i zużyć w ciągu 1 miesiąca.
  8. Przygotuj pożywkę do dojrzewania móżdżku (CMM).
    1. Uzupełnij podłoże neuropodstawowe 1x suplementem L-alaniny-L-glutaminy i 1x suplementem N-2 (patrz Tabela Materiałów).
    2. Filtrować-sterylizować filtrem 0,20 μm, przechowywać w temperaturze 4 °C i zużyć w ciągu 2 tygodni.

2. Hodowla iPSC bez feederów

  1. Rozmrozić komórki, wykonując poniższe czynności.
    1. Umieścić płytkę BMM (krok 1.1) w inkubatorze w temperaturze 37 °C w celu żelowania przez co najmniej 1 godzinę lub przez noc przed rozmrożeniem komórek.
    2. Ogrzać 10 ml pożywki do rozmrażania PSC (krok 1.5) w temperaturze 37 °C.
    3. Przenieść kriowial z komórkami z ciekłego azotu do łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Aby uniknąć generowania źródła zanieczyszczenia w przestrzeni hodowli komórkowej, nie zaleca się stosowania standardowej kąpieli wodnej. Zamiast tego słodką wodę można podgrzać w małej zlewce do temperatury 37 °C, aby uzyskać jednorazową kąpiel wodną.
    4. Gdy w probówce pozostanie mały kawałek lodu, wyjmij go z łaźni wodnej, osusz probówkę i spryskaj 70% etanolem. Przenieść probówkę do kaptura i za pomocą pipety serologicznej o pojemności 2 ml lub 5 ml (patrz tabela materiałów) delikatnie przenieść komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
    5. Dodaj kroplami 8 ml pożywki do rozmrażania PSC do komórek, jednocześnie obracając stożkową probówkę. Wirować przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    6. Ostrożnie odessać supernatant za pomocą aspiratora próżniowego, nie naruszając osadu komórkowego. Ponownie zawiesić komórki w 2 ml pożywki do rozmrażania PSC.
    7. Odessać BMM z płytki i dodawać zawieszone komórki kroplami po całej płytce, aby uzyskać równomierne rozprowadzenie.
    8. Umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Odśwież pożywkę następnego dnia za pomocą pożywki PSC. Następnie codziennie zmieniaj podłoże.
  2. Utrzymuj komórki, wykonując poniższe czynności.
    1. Podgrzej wstępnie niezbędną objętość pożywki PSC w temperaturze 37 °C (np. 1 ml pożywki na płytkę 35 mm).
    2. Zbadać płytki w poszukiwaniu zróżnicowanych komórek lub kolonii i usunąć zróżnicowane komórki za pomocą wyciągniętej szklanej pipety (krok 1.6).
      UWAGA: kolonie iPSC mają gładkie krawędzie z morfologicznie identycznymi komórkami.
    3. Zmieniaj zużyte podłoże codziennie i przechodź co 3-4 dni lub po osiągnięciu 70% zbiegu.
  3. Przejdź przez komórki.
    1. Umieścić niezbędną ilość płytek BMM w inkubatorze na co najmniej 1 godzinę lub na noc przed pasażem. Wstępnie podgrzać niezbędną ilość pożywki PSC (krok 1.3) w temperaturze 37 °C.
    2. Za pomocą wyciągniętej szklanej pipety usuń wszelkie zróżnicowane komórki lub kolonie.
    3. Odessać zużytą pożywkę za pomocą aspiratora próżniowego i dodać pożywkę dysocjacyjną PSC, 1 ml na szalkę 35 mm. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1-3 minuty
      UWAGA: Jeśli kolonie unoszą się w roztworze pasażującym PSC przed dodaniem pożywki PSC, czas inkubacji można skrócić.
    4. Zassać roztwór pasażowy PSC i dodać wstępnie podgrzane podłoże PSC.
    5. Za pomocą sterylnej końcówki do pipet o pojemności 200 μl zarysuj linie równolegle do siebie w jednym kierunku, obróć płytkę o 90° i wykonaj drugi zestaw linii zadrapań prostopadłych do poprzednich (tworząc kreskowany wzór w poprzek płytki).
    6. Odessać roztwór BMM z ustawionych płytek. Zebrać kolonie za pomocą pipety serologicznej i rozprowadzić je na nowych płytkach BMM.
    7. Inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Zmieniaj medium codziennie.
  4. Zamroź komórki.
    1. Przygotuj kriowialisty, oznaczając zawartość i sterylizuj w świetle ultrafioletowym (UV) w kapturze (patrz tabela materiałów) przez 30 minut.
    2. Przygotować pożywkę do zamrażania PSC, uzupełniając pożywkę PSC 10% (v/v) DMSO. Wykonaj kroki 2.3.2-2.3.5.
    3. Przenieść komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml z pipetą serologiczną o pojemności 5 ml i odwirować przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    4. Ostrożnie odessać pożywkę i ponownie zawiesić osad komórek w pożywce do zamrażania PSC.
    5. Rozprowadzić do kriowialiów. Umieścić fiolki w pojemniku do zamrażania i umieścić pojemnik w zamrażarce o temperaturze -80 °C.
    6. Następnego dnia przenieś kriowiale do ciekłego azotu w celu długotrwałego przechowywania.

3. Różnicowanie móżdżku

UWAGA: Przed rozpoczęciem różnicowania, iPSC są przenoszone do sześciu szalek 35 mm i są gotowe do różnicowania, gdy są przy 70% zbieżności. Każda płytka o średnicy 35 mm zostanie przeniesiona do jednego dołka płytki 6-dołkowej.

  1. W dniu 0 podnieś zdrowe kolonie iPSC w celu utworzenia EB.
    1. Dodać 1 ml CDM (krok 1.7) uzupełniony 10 μM Y-27632 i 10 μM SB431542 (patrz tabela materiałów) do każdej studzienki 6-dołkowej płytki o bardzo niskim przyłączeniu (ULA) i umieścić w inkubatorze, aż podniesione kolonie będą gotowe do dodania do studzienek.
    2. Oczyść zróżnicowane komórki za pomocą wyciągniętej szklanej pipety. Zassać pożywkę i dodać 1 ml roztworu pasażującego PSC na każdą szalkę o średnicy 35 mm. Inkubować przez 3 minuty w temperaturze 37 °C, aspirować i dodać 2 ml CDM uzupełnionego 10 μM Y-27632 i 10 μM SB431542,
      UWAGA: Jeśli kolonie unoszą się w roztworze pasażującym PSC przed dodaniem CDM, czas inkubacji można skrócić.
    3. Pod mikroskopem odwróconym ze światłem przechodzącym delikatnie podnieś kolonie za pomocą wygiętej krawędzi wyciągniętej szklanej pipety przy 4-krotnym powiększeniu. Po podniesieniu każdej kolonii delikatnie przenieś ją do jednego dołka 6-dołkowej płytki ULA za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml. Powtórz ten proces dla każdej płytki iPSC. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO2,
      UWAGA: Jeśli kolonie są zbyt duże lub są połączone, można je pokroić końcówką wyciągniętej szklanej pipety, aby uzyskać mniejsze EB.
  2. W dniu 2 dodaj FGF2 do każdej studzienki do końcowego stężenia 50 ng/mL.
    UWAGA: FGF2 używany do różnicowania móżdżku nie jest stabilny termicznie. Ten protokół nie został przetestowany z termostabilnym FGF2.
  3. W dniu 7 wykonaj 1/3 średniej zmiany. W przypadku 3 ml całkowitej pożywki w studzience, za pomocą pipetora o pojemności 1 000 μl, delikatnie odessać 1 ml zużytej pożywki i zastąpić ją 1 ml świeżej pożywki. Inkubuj EB przez 7 dni.
  4. W 14 dniu delikatnie odessać prawie całą zużytą pożywkę za pomocą pipetora o pojemności 1 000 μl. Aby zapewnić minimalne uszkodzenie EBs, zakręć płytką, aby zebrać wszystkie EB na środku płytki, a następnie przechyl płytkę i powoli odsysaj od krawędzi.
    1. W miarę zmniejszania się ilości podłoża powoli ułóż płytkę płasko i kontynuuj aspirację. Pozostaw wystarczającą ilość podłoża, aby uniknąć wysuszenia EB. Następnie dodaj 3 ml świeżego CDM uzupełnionego 10 μM Y-27632. Przenieść EBs za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml do naczynia pokrytego PLO/lamininą (krok 1.2).
      UWAGA: W zależności od dalszego zastosowania, EB mogą być przenoszone na 6-dołkową płytkę PLO/lamininową lub pojedyncze EB mogą być przenoszone do pojedynczego dołka 24-dołkowej płytki lub szkiełka nakrywkowego pokrytego PLO/lamininą.
  5. W 15 dniu odessać pożywkę i zastąpić ją świeżym CDM.
    UWAGA: Ważne jest, aby dodać wystarczającą ilość pożywki do studzienek, aby zapewnić wystarczającą ilość pożywki między karmieniami, ponieważ z czasem nastąpi parowanie (np. w przypadku studzienki na płytce 6-dołkowej dodaj 3 ml pożywki). Jeśli podłoże zaczęło się zakwaszać (zmienia kolor na klarowny i żółty), odśwież podłoże, nawet jeśli nie ma go w harmonogramie karmienia do końca protokołu.
  6. W dniu 21 odessać zużytą pożywkę i zastąpić ją maszyną współrzędnościową. W 28 dniu zmień podłoże na świeżą maszynę współrzędnościową. W 35 dniu zbierz komórki do dalszych zastosowań.

4. Przygotowanie próbki do izolacji RNA

  1. Odessać pożywkę i dodać 500 μl odczynnika do dysocjacji komórek (patrz Tabela Materiałów) do każdego dołka płytki 6-dołkowej. Pozostaw go na kilka sekund i aspiruj.
  2. Inkubować płytkę pod pokrywką w temperaturze pokojowej przez 2 minuty. Postukać w boki płytki, aby odłączyć komórki.
  3. Dodać 1 ml CMM (krok 1.8) i zebrać komórki do probówki o pojemności 1,5 ml.
  4. Osadzać komórki przez odwirowanie za pomocą mini wirówki stołowej (patrz Tabela materiałów) przez 30 s w temperaturze pokojowej (maksymalna prędkość 2000 x g), wyrzucić pożywkę i dodać 1 ml 1x PBS pH 7,4 w celu przepłukania osadu komórkowego.
  5. Ponownie opelekować komórki za pomocą mini wirówki stołowej przez 30 s w temperaturze pokojowej i ponownie przemyć PBS.
  6. Sklecić komórki i wyrzucić PBS. Poddać lizie komórki w odczynniku zawierającym fenol i izotiocyjanian guanidyny (patrz tabela materiałów).
    UWAGA: Komórki poddane lizie w odczynniku zawierającym fenol i izotiocyjanian guanidyny mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C przez okres do 1 roku. Komórki mogą być poddawane lizie bezpośrednio w naczyniu, w zależności od metody izolacji RNA i zastosowanych odczynników. Ze względu na małą liczbę komórek w naczyniu, wyizolowanie RNA za pomocą krzemionkowych kolumn wirowych (patrz Tabela materiałów) spowoduje wyższą wydajność RNA.

5. Przygotowanie komórek do barwienia immunofluorescencyjnego

UWAGA: Dla płytki 24-dołkowej wystarczy jedna EB na studzienkę.

  1. W dniu 35 odessać zużytą pożywkę i umyć komórki, dodając 1 ml DPBS+/+ na dołek (na jeden dołek z 24-dołkowej płytki).
  2. Odessać DPBS+/+ i dodać 500 μl zimnego 4% paraformaldehydu (PFA, patrz Tabela Materiałów) przygotowanego w DPBS+/+ do dołka. Inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Usuń 4% PFA i umyj komórki dwukrotnie za pomocą DPBS+/+, jak w kroku 5.1. Dodać 1 ml DPBS+/+ i przechowywać komórki w temperaturze 4 °C do czasu zakończenia barwienia.
    UWAGA: Zaleca się barwienie immunofluorescencyjne w ciągu 1 tygodnia po utrwaleniu, aby uniknąć oderwania komórek i utraty antygenów. Jednak w zależności od przeciwciała i lokalizacji komórkowej celu, barwienie można wykonać w późniejszym czasie do 4 tygodni po utrwaleniu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przegląd różnicowania móżdżku 3D do 2D
Komórki móżdżku są generowane z komórek iPSC. Rysunek 1A pokazuje ogólny przebieg pracy i dodanie głównych komponentów dla zróżnicowania. W dniu 0 EB są wytwarzane przez delikatne podnoszenie kolonii iPSC (Rysunek 1B) za pomocą wyciągniętej szklanej pipety w CDM zawierającej SB431542 i Y-27632 i umieszczone na płytkach o bardzo niskim mocowaniu. FGF2 jest dodawany w dniu 2. W dniu 7 jedna trzecia pożywki jest zmi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Możliwość modelowania rozwoju ludzkiego móżdżku in vitro jest ważna dla modelowania chorób, a także dla lepszego zrozumienia prawidłowego rozwoju mózgu. Mniej skomplikowane i opłacalne protokoły stwarzają więcej możliwości generowania powtarzalnych danych i szerokiego wdrożenia w wielu laboratoriach naukowych. Opisano tutaj protokół różnicowania móżdżku przy użyciu zmodyfikowanej metody generowania EB, która nie wymaga enzymów ani środków dysocjacyjnych, przy użyciu czynników wzrostu opisanych przez Mugurumę i w...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Jenny Gringer Richards za jej dokładną pracę w walidacji naszych obiektów kontrolnych, z których wygenerowaliśmy kontrolne iPSC. Praca ta była wspierana przez NIH T32 MH019113 (do D.A.M. i K.A.K.), Nellie Ball Trust (do T.H.W. i A.J.W.), NIH R01 MH111578 (do V.A.M. i J.A.W.), NIH KL2 TR002536 (do A.J.W.) oraz Roy J. Carver Charitable Trust (do V.A.M., J.A.W. i A.J.W.). Figury zostały stworzone przy użyciu BioRender.com.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Pipeta serologiczna 10 mlFisher Scientific13-678-26D
1-tio-glicerolSigmaM6145
Pipeta serologiczna 2 mlFisher Scientific13-678-26B
250 ml Jednostka filtrująca, 0,2 i mikro; m aPES, średnica 50 mmFisher ScientificFB12566502
35 mm Easy Grip Naczynie do tkanekFalcon353001
4D Jednostka rdzeniowa NucleofectorLonza276885Nucleofector
5 ml Pipeta serologicznaFisher Scientific13-678-25D
60 mm Easy Grip Naczynie do hodowli tkankowychFalcon353004
6-dołkowe ultra-niskie płytki mocująceCorning3471
9-calowe jednorazowe pipety PasteuraFisher Scientific13-678-20D
Apo-transferynaSigmaT1147
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)SigmaA9418
Woda klasy hodowlanejCytivaSH30529.02
Chemicznie zdefiniowany koncentrat lipidowyGibco11905031
Chroman 1Cayman34681
Klasa II, Typ A2, Szafa Bezpieczeństwa BiologicznegoNuAire, Inc.NU-540-600Kaptur, światło UV
Płytka 24-dołkowa Costar, płytka 6-dołkowaCorning3526
Costar poddana działaniu TC,Corning3516
Thermo Scientific62248
DMEMGibco11965092
DMEM/F12Gibco11320033
DMSO (dimetylosulfotlenek)SigmaD2438
DPBS+/+Gibco14040133
EmricasanCayman22204
Epi5 zestaw do przeprogramowania episomalnego iPSCLife TechnologiesA15960
Essential 8-FlexGibcoA2858501PSC medium ze stabilnym termicznie systemem obrazowania rdzeniowego FGF2
EVOS XLLife TechnologiesAMEX1000
Płodowa surowica bydlęca - Premium SelectAtlanta BiologicalsS11150
FGF2Peprotech100-18B
GlutaMAX suplementGibco35050061Suplement L-alaniny-L-glutaminy
Mieszanka składników odżywczych Ham's F12Gibco11765054
HERAcell VIOS 160iThermo Scientific50144906
Ludzki anty-EN2, myszSanta Cruz Biotechnologysc-293311
Ludzki anty-Ki67 / MKI67, królikR& Systemy DMAB7617
Ludzki anty-PTF1a, królikNovus BiologicalsNBP2-98726
Ludzki anty-TUBB3, myszBiolegend801213
IMDMGibco12440053
InsulinaGibco12585
Laminin Mysz BiałkoGibco23017015
Matrigel MatrixCorning354234Matryca membrany podstawnej
MEM-NEAAGibco11140050
Mini wirówkaLabnet InternationalC1310Mini wirówka
stołowa Zestaw do czyszczenia RNA Monarch (50 &mikro; g)New England BioLabsT2040Kolumny wirujące z krzemionki
Zestaw Monarch Total RNA Miniprep NewEngland BioLabsT2010Kolumny wirujące z krzemionki
Suplement N-2Gibco17502-048
Pożywka neuropodstawowaGibco21103049
PBS, pH 7,4Gibco10010023
PFA 16%Mikroskopia elektronowa Nauki15710
Suplement poliaminowySigmaP8483
Poli-L-ornityna (PLO)Sigma3655
Chlorek potasuSigma746436
SB431542Sigma54317
Przezroczyste torebki samozamykająceSterikingSS-T2 (90x250)Woreczki autoklawowe
Sód Cytrynian dwuwodny Fisher ScientificS279-500
Filtry strzykawkowe, sterylne, PES 0,22 i mikro; m, średnica 30 mmResearch Products International256131
Trans-ISRIBCayman16258
Odczynnik TRIzolInvitrogen15596018Izotiocyjanian fenolu i guanidyny
Enzym ekspresowy TrypLE (1x)Gibco12604039Odczynnik do dysocjacji komórek 
Osmometr ciśnienia paryWescor, Inc.Model 5520Osmometr
Y-27632Biogems1293823
roztwór DAPI poddanego działaniu TC Inkubator CO2

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Erceg, S., Lukovic, D., Moreno-Manzano, V., Stojkovic, M., Bhattacharya, S. S. Derivation of cerebellar neurons from human pluripotent stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. , Chapter 1, Unit 1H.5 (2012).
  2. Erceg, S., et al. Efficient differentiation of human embryonic stem cells into functional cerebellar-like cells. Stem Cells and Development. 19 (11), 1745-1756 (2010).
  3. Muguruma, K. 3D culture for self-formation of the cerebellum from human pluripotent stem cells through induction of the isthmic organizer. Methods in Molecular Biology. 1597, 31-41 (2017).
  4. Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. Self-organization of polarized cerebellar tissue in 3D culture of human pluripotent stem cells. Cell Reports. 10 (4), 537-550 (2015).
  5. Holmes, D. B., Heine, V. M. Streamlined 3D cerebellar differentiation protocol with optional 2D modification. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (130), e56888(2017).
  6. Holmes, D. B., Heine, V. M. Simplified 3D protocol capable of generating early cortical neuroepithelium. Biology Open. 6 (3), 402-406 (2017).
  7. Silva, T. P., et al. Maturation of human pluripotent stem cell-derived cerebellar neurons in the absence of co-culture. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 70(2020).
  8. Nayler, S., Agarwal, D., Curion, F., Bowden, R., Becker, E. B. E. High-resolution transcriptional landscape of xeno-free human induced pluripotent stem cell-derived cerebellar organoids. Scientific Reports. 11, 12959(2021).
  9. Salero, E., Hatten, M. E. Differentiation of ES cells into cerebellar neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (8), 2997-3002 (2007).
  10. Nie, Y., Walsh, P., Clarke, D. L., Rowley, J. A., Fellner, T. Scalable passaging of adherent human pluripotent stem cells. PLoS One. 9 (1), 88012(2014).
  11. Chen, Y., et al. A versatile polypharmacology platform promotes cytoprotection and viability of human pluripotent and differentiated cells. Nature Methods. 18 (5), 528-541 (2021).
  12. Machold, R., Fishell, G. Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors. Neuron. 48 (1), 17-24 (2005).
  13. Wang, V. Y., Rose, M. F., Zoghbi, H. Y. Math1 expression redefines the rhombic lip derivatives and reveals novel lineages within the brainstem and cerebellum. Neuron. 48 (1), 31-43 (2005).
  14. Hoshino, M., et al. Ptf1a, a bHLH transcriptional gene, defines GABAergic neuronal fates in cerebellum. Neuron. 47 (2), 201-213 (2005).
  15. Mizuhara, E., et al. Purkinje cells originate from cerebellar ventricular zone progenitors positive for Neph3 and E-cadherin. Developmental Biology. 338 (2), 202-214 (2010).
  16. Ferreira, A., Caceres, A. Expression of the Class III β-tubulin isotype in developing neurons in culture. Journal of Neuroscience Research. 32 (4), 516-529 (1992).
  17. Sullivan, K. F., Cleveland, D. W. Identification of conserved isotype-defining variable region sequences for four vertebrate beta tubulin polypeptide classes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (12), 4327-4331 (1986).
  18. Joyner, A. L. Engrailed, Wnt and Pax genes regulate midbrain-hindbrain development. Trends in Genetics. 12 (1), 15-20 (1996).
  19. Joyner, A. L., Liu, A., Millet, S. Otx2, Gbx2 and Fgf8 interact to position and maintain a mid-hindbrain organizer. Current Opinion in Cell Biology. 12 (6), 736-741 (2000).
  20. Minaki, Y., Nakatani, T., Mizuhara, E., Inoue, T., Ono, Y. Identification of a novel transcriptional corepressor, Corl2, as a cerebellar Purkinje cell-selective marker. Gene Expression Patterns. 8 (6), 418-423 (2008).
  21. Aldinger, K. A., et al. Spatial and cell type transcriptional landscape of human cerebellar development. Nature Neuroscience. 24 (8), 1163-1175 (2021).
  22. Fossat, N., Courtois, V., Chatelain, G., Brun, G., Lamonerie, T. Alternative usage of Otx2 promoters during mouse development. Developmental Dynamics. 233 (1), 154-160 (2005).
  23. Akbarian, S., et al. The PsychENCODE project. Nature Neuroscience. 18 (12), 1707-1712 (2015).
  24. Aijaz, S., et al. Expression analysis of SIX3 and SIX6 in human tissues reveals differences in expression and a novel correlation between the expression of SIX3 and the genes encoding isocitrate dehyhrogenase and cadherin 18. Genomics. 86 (1), 86-99 (2005).
  25. Conte, I., Morcillo, J., Bovolenta, P. Comparative analysis of Six3 and Six6 distribution in the developing and adult mouse brain. Developmental Dynamics. 234 (3), 718-725 (2005).
  26. Andreasen, N. C., Pierson, R. The role of the cerebellum in schizophrenia. Biological Psychiatry. 64 (2), 81-88 (2008).
  27. Nopoulos, P. C., Ceilley, J. W., Gailis, E. A., Andreasen, N. C. An MRI study of cerebellar vermis morphology in patients with schizophrenia: Evidence in support of the cognitive dysmetria concept. Biological Psychiatry. 46 (5), 703-711 (1999).
  28. Jacobsen, L. K., et al. Quantitative morphology of the cerebellum and fourth ventricle in childhood-onset schizophrenia. American Journal of Psychiatry. 154 (12), 1663-1669 (1997).
  29. Saywell, V., Cioni, J. -M., Ango, F. Developmental gene expression profile of axon guidance cues in Purkinje cells during cerebellar circuit formation. The Cerebellum. 13 (3), 307-317 (2014).
  30. Kim, D., Ackerman, S. L. The UNC5C netrin receptor regulates dorsal guidance of mouse hindbrain axons. Journal of Neuroscience. 31 (6), 2167-2179 (2011).
  31. Maier, V., et al. Semaphorin 4C and 4G are ligands of Plexin-B2 required in cerebellar development. Molecular and Cellular Neuroscience. 46 (2), 419-431 (2011).
  32. Telley, L., et al. Dual function of NRP1 in axon guidance and subcellular target recognition in cerebellum. Neuron. 91 (6), 1276-1291 (2016).
  33. Wang, S., et al. Differentiation of human induced pluripotent stem cells to mature functional Purkinje neurons. Scientific Reports. 5, 9232(2015).
  34. Shabanipour, S., et al. Primary culture of neurons isolated from embryonic mouse cerebellum. Journal of Visualized Experiments. (152), e60168(2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Human iPSCs2D Monolayer CultureEmbryoid BodiesCerebellar DifferentiationNeuronal ProgenitorsPurkinje Cell ProgenitorsImmunofluorescence MarkersAxonal Guidance MoleculesNeurodevelopmental Disorders

Powiązane artykuły