Artykuł metodologiczny

Kwantyfikacja kolistych RNA za pomocą cyfrowego PCR kropelkowego

4.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64464

⸱

16 września 2022

 ,  , 
1Institute of Life Sciences, 2School of Biotechnology, KIIT University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje szczegółową metodę cyfrowego kropelkowego PCR (dd-PCR) do precyzyjnej kwantyfikacji kolistych poziomów RNA (circRNA) w komórkach przy użyciu rozbieżnych starterów.

Streszczenie

Cyfrowa kropelkowa reakcja łańcuchowa polimerazy (dd-PCR) jest jedną z najbardziej czułych metod kwantyfikacji; frakcjonuje reakcję na prawie 20 000 kropelek wody w oleju, a PCR zachodzi w pojedynczych kropelkach. dd-PCR ma kilka zalet w porównaniu z konwencjonalnym qPCR w czasie rzeczywistym, w tym zwiększoną dokładność w wykrywaniu celów o niskiej liczebności, pomijanie genów referencyjnych do oznaczania ilościowego, eliminowanie kontrprób technicznych dla próbek i wykazywanie wysokiej odporności na inhibitory w próbkach. Ostatnio dd-PCR stał się jedną z najpopularniejszych metod dokładnego ilościowego oznaczania docelowego DNA lub RNA do analizy i diagnostyki ekspresji genów. Koliste RNA (circRNA) to duża rodzina niedawno odkrytych kowalencyjnie zamkniętych cząsteczek RNA pozbawionych końców 5' i 3'. Wykazano, że regulują one ekspresję genów, działając jak gąbki dla białek wiążących RNA i mikroRNA. Ponadto circRNA są wydzielane do płynów ustrojowych, a ich odporność na egzonukleazy sprawia, że służą jako biomarkery w diagnostyce chorób. Ten artykuł ma na celu pokazanie, jak przeprowadzić rozbieżne projektowanie starterów, ekstrakcję RNA, syntezę cDNA i analizę dd-PCR w celu dokładnego ilościowego określenia określonych kolistych poziomów RNA (circRNA) w komórkach. Podsumowując, demonstrujemy dokładną kwantyfikację circRNA za pomocą dd-PCR.

Wprowadzenie

Ostatnie postępy w technologiach sekwencjonowania RNA i nowatorskie algorytmy obliczeniowe odkryły nowego członka rosnącej rodziny niekodujących RNA, zwanych okrągłymi RNA (circRNA)1. Jak sama nazwa wskazuje, circRNA to rodzina jednoniciowych cząsteczek RNA bez wolnych końców. Są one tworzone przez niekanoniczne splicing head-to-tail zwany splatingiem wstecznym, w którym miejsce akceptora splicingu w górę łączy się kowalencyjnie z miejscem donora splicingu w dół, tworząc stabilny krąg RNA1,2. W procesie tym może pośredniczyć kilka czynników, w tym odwrócone powtarzalne elementy Alu obecne w górnych i dolnych egzonach kolistych, lub może być pośredniczony przez niektóre czynniki splicingowe lub białka wiążące RNA (RBP)2,3. Koliste RNA generowane wyłącznie z sekwencji egzonicznej lub intronowej są klasyfikowane jako egzoniczne circRNA i koliste intronowe RNA lub ci-RNA, podczas gdy niektóre egzoniczne circRNA zachowują intron i nazywane są ekson-intronami circRNA (EIcircRNAs)3,4. Funkcje circRNA są wieloaspektowe, w tym gąbczaste miRNA i/lub RBP, regulacja transkrypcji i regulacja funkcji komórkowych poprzez translację na peptydy3,5,6,7. Kilka doniesień podkreśliło znaczenie circRNA w różnych chorobach i procesach fizjologicznych8. Co więcej, specyficzne dla tkanek wzorce ekspresji i oporność na trawienie egzonukleazą sprawiają, że jest to funkcjonalny biomarker do diagnozowania chorób i może być również stosowany jako odpowiedni cel terapeutyczny8. Biorąc pod uwagę jego znaczenie w regulacji zdrowia i chorób, dokładna kwantyfikacja ekspresji circRNA jest potrzebą chwili.

Opracowano kilka metod biochemicznych do ilościowego oznaczania circRNA w próbkach biologicznych9. Jedną z najwygodniejszych i najszerzej akceptowanych metod oznaczania ilościowego circRNA jest odwrotna transkrypcja, a następnie ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy (RT-qPCR) przy użyciu rozbieżnych par starterów10. Jednak większość circRNA występuje w niskiej obfitości w porównaniu z liniowymi mRNA, co sprawia, że ich ilościowe określenie jest trudne11. Aby przezwyciężyć ten problem, staraliśmy się użyć cyfrowego kropelkowego PCR (dd-PCR) do dokładnego określenia ilościowego liczby circRNA w danej próbce. dd-PCR to zaawansowana technologia PCR, która jest zgodna z zasadą mikrofluidyki; generuje wiele kropelek wody wodnej w oleju, a PCR zachodzi w każdej kropli jako indywidualna reakcja12. Reakcja zachodzi w pojedynczych kropelkach i jest analizowana za pomocą czytnika kropelk, który podaje liczbę dodatnich lub ujemnych kropel dla interesującego genu12. Jest to najbardziej czuła technika pozwalająca na dokładne określenie ilościowe genu będącego przedmiotem zainteresowania, nawet jeśli w danej próbce znajduje się tylko jedna kopia. Zmniejszona czułość na inhibitory, lepsza precyzja i pominięcie genu referencyjnego do oznaczania ilościowego sprawiają, że jest on bardziej korzystny niż konwencjonalny qPCR13,14,15. Jest szeroko stosowany jako narzędzie badawcze i diagnostyczne do bezwzględnej kwantyfikacji genu będącego przedmiotem zainteresowania16,17. W tym miejscu opisujemy szczegółowy protokół dd-PCR do kwantyfikacji circRNA w różnicowaniu mysich miotub C2C12 i proliferacji mysich mioblastów C2C12 przy użyciu rozbieżnych starterów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

RNA jest wrażliwe na RNazy; dlatego wszystkie odczynniki, instrumenty i miejsca pracy powinny być wolne od RNaz i traktowane ostrożnie.

1. Rozbieżny projekt startera dla circRNA (zobacz Rysunek 1)

  1. Pobierz dojrzałą sekwencję z danych adnotacji circRNA za pomocą BEDTools lub z przeglądarki genomu UCSC, łącząc sekwencję eksonu/intronu obecną między współrzędnymi złącza splicingu wstecznego18,19.
  2. Przygotuj sekwencję matrycy PCR o długości 200 nukleotydów, łącząc ostatnie 100 nukleotydów o całkowitej długości sekwencji circRNA z pierwszymi 100 nukleotydami sekwencji circRNA10.
    UWAGA: Jeśli długość circRNA jest mniejsza niż 200 nukleotydów, podziel ją na dwie równe połowy i połącz nukleotydy od ostatniej połowy do początku pierwszej połowy.
  3. Użyj powyższej sekwencji szablonów do projektowania starterów, korzystając z narzędzia internetowego Primer3 i ustawiając długość produktu PCR w zakresie od 120 do 180 nukleotydów na długość20.
  4. Użyj domyślnych ustawień Primer3 dla innych parametrów, takich jak Tm i długość podkładu. Sekwencje starterów dla circBnc2 są wymienione w tabeli 1.
  5. Zamów rozbieżne sekwencje starterów do syntezy w dowolnej firmie zajmującej się syntezą oligonukleoty
    6. .

2. Izolacja RNA

UWAGA: Wyizoluj całkowite RNA z mysich komórek C2C12 za pomocą dowolnych dostępnych na rynku zestawów lub własnej metody izolacji RNA. Zastosowana tutaj metoda izolacji RNA została opisana wcześniej21. Magnetyczne kulki krzemionkowe są przygotowywane w laboratorium przy użyciu wcześniej opublikowanego protokołu22. Te koraliki magnetyczne można również nabyć u różnych dostawców.

  1. Weź jedno 10-centymetrowe naczynie zawierające około 5 x 106 proliferujących komórek mioblastów C2C12 i jedną 4-dniową różnicowaną miorurkę C2C12 do izolacji RNA.
  2. Umyj komórki trzykrotnie 10 ml 1x PBS i wyrzuć PBS za pomocą pipety.
  3. Zeskrobać komórki w 1 ml 1x PBS za pomocą skrobaka do komórek, odwirować je w temperaturze 4 °C przez 5 minut przy 750 x g i wyrzucić PBS za pomocą pipety.
  4. Dodać 1 ml odczynnika do izolacji RNA (RIR) i poddać komórki lizie przez energiczne pipetowanie21.
  5. Dodać 200 μl (1/5 objętości RIR) chloroformu i wirować przez 15 s. Odwirować probówkę w temperaturze 4 °C przez 10 minut przy 12 000 x g.
  6. Weź 400 μl górnej warstwy wodnej, załaduj ją na kolumnę krzemionkową i odwiruj przez 1 minutę przy 12 000 x g w temperaturze pokojowej. Przenieś przepływ do nowej rurki i dodaj 600 μl 100% etanolu.
  7. Dodać 20 μl magnetycznych kulek krzemionkowych i umieścić probówkę na termomikserze ustawionym na 25 °C i 1 200 obr./min na 5 min.
    UWAGA: Objętość kulek można zwiększać lub zmniejszać w zależności od początkowej liczby komórek pobranych do lizy. Magnetyczne kulki krzemionkowe można nabyć u komercyjnych dostawców.
  8. Umieść probówkę na stojaku magnetycznym na 30 s lub do momentu, gdy roztwór stanie się klarowny. Ostrożnie odrzucić supernatant za pomocą pipety.
  9. Zawiesić magnetyczne kulki krzemionkowe w 500 μl buforu płuczącego zawierającego 90% etanolu. Umieść rurkę na stojaku magnetycznym na 30 sekund. Obróć rurkę dwukrotnie na stojaku magnetycznym, aby umyć koraliki. Pozwól kulkom osiąść w kierunku magnesu i wyrzuć bufor za pomocą pipety.
  10. Powtórz krok 2.9 dwa razy. Po umyciu krótko zakręć rurką i umieść ją z powrotem na stojaku magnetycznym na 30 sekund. Wyrzuć pozostały bufor do mycia. Suszyć probówkę na powietrzu w temperaturze 50 °C przez 3 minuty na termomikserze, trzymając pokrywę otwartą.
  11. Dodać 20 μl wody wolnej od nukleaz i ponownie zawiesić kulki.
    UWAGA: Objętość elucji RNA można zmniejszyć do 10 μl, aby zwiększyć stężenie RNA.
  12. Umieść probówki na 2-3 minuty w temperaturze pokojowej. Umieść rurkę z powrotem na stojaku magnetycznym i pozostaw ją na 30 sekund. Zebrać rozpuszczone RNA w nowej probówce w celu oceny ilości i jakości za pomocą spektrofotometru.
    UWAGA: RNA może być przechowywane w temperaturze -20 °C lub -80 °C w celu długotrwałego przechowywania. Aby uzyskać optymalny wynik, zaleca się przystąpienie do etapu syntezy cDNA następnego dnia.

3. synteza cDNA

  1. Zmierz stężenie RNA za pomocą spektrofotometru i weź 1 μg RNA do syntezy cDNA.
  2. Zmieszać 1 μg całkowitego RNA z 1 μl mieszanki dNTP (po 10 mM dATP, dTTP, dGTP i dCTP), 4 μL 5x buforu odwrotnej transkryptazy (RT), 2 μL 10x startera losowego RT, 0,25 μL enzymu odwrotnej transkryptazy (200 U/μL) i 0,5 μL inhibitora RNazy (40 U/μL), i uzupełnić objętość do 20 μl wodą wolną od nukleaz.
    UWAGA: Objętość enzymu odwrotnej transkryptazy może być zmieniona w zależności od początkowego stężenia RNA pobranego do syntezy cDNA.
  3. Postukaj w probówkę, aby wymieszać reakcję i krótko zawirować. Umieścić probówkę w temperaturze 25 °C na 10 minut, a następnie w temperaturze 50 °C na 1 godzinę.
  4. Aby dezaktywować enzym, umieść probówkę w temperaturze 85 °C na 5 minut.
  5. Schłodź probówkę lodem przez 2 minuty i dodaj do niej 480 μl wody wolnej od nukleaz, aby stężenie cDNA wynosiło 2 ng/μL.
    UWAGA: cDNA może być przechowywane w temperaturze -20 °C lub natychmiast wykorzystane do analizy dd-PCR.

4. Przepływ pracy Digital droplet PCR (dd-PCR)

UWAGA: Przebieg pracy dd-PCR składa się z wielu etapów, począwszy od przygotowania próbki, następnie generowania kropel, amplifikacji PCR, liczenia kropel i analizy danych. Każdy krok ma kluczowe znaczenie dla dokładnego generowania danych, ponieważ dd-PCR obejmuje bezwzględną kwantyfikację produktów i nie wymaga żadnej krzywej wzorcowej. W związku z tym każdy z różnych etapów dd-PCR został opisany poniżej.

  1. Przygotowanie reakcji dd-PCR.
    1. Ustawić reakcję PCR 22 μl w 0,2 ml probówkach lub paskach PCR wraz z probówką kontroli ujemnej i probówkami NTC (kontrola bez matrycy).
      UWAGA: Każda inna rozbieżna para starterów do wykrywania różnych circRNA musi mieć reakcję NTC wraz z próbkami testowymi.
    2. Dodać 11 μl głównej mieszanki dd-PCR (np. EvaGreen Supermix) i 11 μl wody wolnej od nukleaz, aby ustawić probówkę z reakcją kontroli ujemnej.
      UWAGA: Rozmrozić główną mieszankę dd-PCR w temperaturze pokojowej, a następnie wykonać krótki wir, aby uzyskać jednorodną mieszaninę. Użyj tej samej wody wolnej od nukleaz do ustawienia probówki z reakcją kontroli ujemnej i probówek NTC, które były używane do rozcieńczania cDNA.
    3. Dodać 11 μl master-mixu dd-PCR, 5,5 μl mieszaniny starterów do przodu i do tyłu specyficznej dla circRNA o stężeniu 1 μM i 5,5 μl wody wolnej od nukleaz, aby ustawić probówki reakcyjne NTC.
      UWAGA: Rozcieńczyć rozbieżne startery rozbieżne specyficzne dla RNA do przodu i do tyłu o skrytości 100 μM i wymieszać, aby przygotować 1 μM stężenie robocze mieszanki starterów cyrkulacji do przodu i do tyłu; zatem końcowe stężenie startera wynosi 250 nM w reakcji 22 μl.
    4. Dodać 11 μl master-mixu dd-PCR, 5,5 μl mieszaniny starterów specyficznych dla circRNA do przodu i do tyłu o stężeniu 1 μM i 5,5 μl cDNA (2 ng/μl), aby ustawić probówki reakcyjne.
    5. Dokładnie wymieszać, a następnie krótko odwirować wszystkie probówki reakcyjne, aby uzyskać jednorodną mieszaninę reakcyjną na dnie probówek.
  2. Wytwarzanie kropelk.
    1. Przenieść 20 μl mieszaniny PCR z probówek PCR o pojemności 0,2 ml do dołków na próbki we wkładzie z generatorem kropel.
    2. Ostrożnie dodać 70 μl oleju wytwarzającego kropelki do studzienek olejowych wkładu generatora kropel za pomocą pipety wielokanałowej.
      UWAGA: Przed użyciem inkubować olej do wytwarzania kropelek w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
    3. Przykryj wkład generatora kropel gumową uszczelką i umieść go w maszynie generatora kropel, aby uzyskać mieszaninę kropelek próbki i oleju, wytworzoną w studzienkach kropelkowych wkładu.
  3. Amplifikacja PCR.
    1. Przenieść 40 μl mieszaniny kropli próbki i oleju z dołków kropelkowych wkładu generatora kropel na 96-dołkową płytkę PCR za pomocą pipety wielokanałowej.
      UWAGA: Ostrożnie przenieś mieszaninę kropelek próbki i oleju, robiąc kąt do studzienek przez końcówki pipety wielokanałowej, aby uniknąć rozbijania kropelek podczas przenoszenia ich na 96-dołkową płytkę dd-PCR.
    2. Uszczelnij 96-dołkową płytkę PCR za pomocą zgrzewarki z folii aluminiowej, umieść ją w bloku maszyny do zgrzewania płyt podgrzanym do 80 °C i zatrzaskaj w celu uszczelnienia płytki PCR.
    3. Teraz umieść płytkę w termocyklerze dd-PCR i ustaw program zgodnie z tabelą 2 z temperaturą pokrywy ustawioną na 105 °C i szybkością narastania 2 °C/s.
  4. Liczenie kropel.
    1. Po zakończeniu PCR umieść płytkę na maszynie do liczenia kropel dd-PCR z uchwytem płytki we właściwej pozycji do liczenia kropel.
    2. Otwórz oprogramowanie do analizy kropel i skonfiguruj przebieg, podając dane wejściowe dla informacji o próbce.
    3. Kliknij opcję konfiguracji. Następnie kliknij opcję szablonu, aby otworzyć nowy szablon.
    4. Zdefiniuj każdą studzienkę, podając szczegóły eksperymentu, takie jak nazwa próbki (użyte cDNA lub kontrola ujemna lub NTC), nazwa docelowa (nazwa startera circRNA) i typ (nieznany) oraz typ eksperymentu, taki jak ABS (kwantyfikacja bezwzględna) i Supermix (dd-PCR EvaGreen Supermix) itp.
    5. Na koniec zapisz szablon i rozpocznij uruchamianie, klikając opcję uruchamiania i wybierz liczenie według wierszy lub kolumn. Pozwól maszynie zakończyć liczenie kropel, co zajmuje około 1 minuty/studzienkę.
    6. Kliknij przycisk Analizuj, aby przeanalizować dane po zakończeniu odczytu kropli.
    7. Kliknij przycisk Amplituda 1D, aby zobaczyć dodatnie i ujemne krople
    8. Aby oddzielić krople dodatnie od kropel ujemnych, należy wyznaczyć wspólną linię progową dla wszystkich próbek o tym samym celu.
      UWAGA: Całkowita liczba kropel w każdej próbce powinna przekraczać 10 000, aby można ją było uwzględnić przy bezwzględnym oznaczaniu ilościowym. NTC nie powinien pokazywać dodatniej liczby kropel. Obecność dodatnich kropelek w NTC wskazuje na zanieczyszczenie odczynników lub amplifikację dimerów starterów. Trudno jest dowiedzieć się, czy dodatnie kropelki mają dimery starterów, czy produkty niespecyficzne w NTC. Zaleca się sprawdzenie starterów i unikanie jakiegokolwiek zanieczyszczenia odczynników, co jest ogólną praktyką w przypadku każdego PCR, w tym dd-PCR.
    9. Kliknij przycisk Eksportuj, aby wyeksportować dane dotyczące zliczania circRNA jako plik .csv. Wyeksportowane dane pokazują liczbę circRNA obecnych w każdej próbce.
    10. Ręcznie oblicz liczbę circRNA w każdej próbce na nanogram RNA, biorąc pod uwagę całkowitą ilość cDNA użytego w każdej reakcji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Bezwzględna liczba circRNA w każdej próbce może być uzyskana z eksportowanych danych dd-PCR. Ilościowa analiza PCR w czasie rzeczywistym sugerowała różnicową ekspresję circBnc2 w zróżnicowanych miotubach C2C12 (dane nie pokazane). Tutaj chcieliśmy sprawdzić bezwzględną liczbę kopii circBnc2 w proliferujących mioblastach i miotubach C2C12. Ponieważ ekspresja circBnc2 jest porównywana w dwóch warunkach, bardzo ważne jest, aby przetwarzać wszystkie próbki do izolacji RNA, syntezy cDNA i PCR jednoc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Badania nad CircRNA rozwinęły się w ciągu ostatniej dekady wraz z odkryciem technologii sekwencjonowania o wysokiej przepustowości. W rezultacie została uznana za potencjalną cząsteczkę dla przyszłych terapii RNA. Ponadto wiadomo, że działa jako biomarker w wielu chorobach, w tym w nowotworach i chorobach układu krążenia 4,8. Jednak identyfikacja circRNA jest trudna ze względu na jego niską liczebność i posiadanie tylko jednej specyficznej sekwencji złącza backsp...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez fundusze z Instytutu Nauk Przyrodniczych, grant badawczy DBT (BT/PR27622/MED/30/1961/2018) oraz stypendium Wellcome Trust/DBT India Alliance Fellowship [IA/I/18/2/504017] przyznane Amareshowi C. Pandzie. Dziękujemy pozostałym członkom laboratorium za korektę artykułu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówka mikrocentyfugowa 1,5 mlTarson500010
0,2 ml Paski probówki z nakrętkąTarson610020, 510073
Końcówki filtrująceTarson528104
Woda destylowana bez DNaz/RNazThermo Fisher Scientific10977023
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)SigmaP4417
Komórka scrapperHiMediaTCP223
ChloroformSRL96764
Rozcieńczalnik DNAHiMediaMB228
Losowe starteryThermo Fisher Scientific48190011
zestaw dNTPThermo Fisher ScientificR0181
Mysi inhibitor RNazyNEBM0314S
Maxima odwrotny transkryptazaThermo Fisher ScientificEP0743
QX200 dd-PCR Evagreen SupermixBio-Rad1864033
Olej do wytwarzania kropelek do EvagreenBio-Rad1864006
PCR Płytka zgrzewana, folia, przebijalnaBio-Rad1814040
DG8 Wkłady i uszczelkiBio-Rad1864007
DG8 Cartridge uchwytBio-Rad1863051
QX200 Generator kropelBio-Rad1864002
ddPCR 96-dołkowe płytkiBio-Rad12001925
PX1 Uszczelniacz płytek PCRBio-Rad1814000
C1000 Dotykowy termocykler z 96– Moduł Deep Well ReactionBio-Rad1851197
QX200 Czytnik kropelBio-Rad1864003
Oprogramowanie QuantasoftKolumna krzemionkowa Bio-Rad1864011
Parasol Nauki przyrodnicze38220090
UCSC Przeglądarkahttps://genome.ucsc.edu/
Primer 3
genomu https://primer3.ut.ee/

Bibliografia

  1. Salzman, J., Gawad, C., Wang, P. L., Lacayo, N., Brown, P. O. Circular RNAs are the predominant transcript isoform from hundreds of human genes in diverse cell types. PLoS One. 7 (2), 30733(2012).
  2. Chen, L. L., Yang, L. Regulation of circRNA biogenesis. RNA Biology. 12 (4), 381-388 (2015).
  3. Kristensen, L. S., et al. The biogenesis, biology and characterization of circular RNAs. Nature Reviews Genetics. 20 (11), 675-691 (2019).
  4. Chen, X., Zhou, M., Yant, L., Huang, C. Circular RNA in disease: Basic properties and biomedical relevance. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. , (2022).
  5. Sinha, T., Panigrahi, C., Das, D., Chandra Panda, A. Circular RNA translation, a path to hidden proteome. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 13 (1), 1685(2022).
  6. Panda, A. C. Circular RNAs Act as miRNA Sponges. Circular RNAs: Biogenesis and Functions. Xiao, J. , Springer. Singapore. 67-79 (2018).
  7. Das, A., Sinha, T., Shyamal, S., Panda, A. C. Emerging role of circular RNA-protein interactions. Non-Coding RNA. 7 (3), 48(2021).
  8. Verduci, L., Tarcitano, E., Strano, S., Yarden, Y., Blandino, G. CircRNAs: Role in human diseases and potential use as biomarkers. Cell Death & Disease. 12 (5), 468(2021).
  9. Pandey, P. R., et al. Methods for analysis of circular RNAs. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 11 (1), 1566(2020).
  10. Das, A., Das, D., Panda, A. C. Validation of circular RNAs by PCR. PCR Primer Design. Methods in Molecular Biology. 2392, Humana. New York, NY. 103-114 (2022).
  11. Jeck, W. R., et al. Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats. RNA. 19 (2), 141-157 (2013).
  12. Pinheiro, L. B., et al. Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification. Analytical Chemistry. 84 (2), 1003-1011 (2012).
  13. Hayden, R. T., et al. Comparison of droplet digital PCR to real-time PCR for quantitative detection of cytomegalovirus. Journal of Clinical Microbiology. 51 (2), 540-546 (2013).
  14. Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: From variable nonsense to publication quality data. Scientific Reports. 7, 2409(2017).
  15. Hindson, B. J., et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Analytical Chemistry. 83 (22), 8604-8610 (2011).
  16. Ishak, A., AlRawashdeh, M. M., Esagian, S. M., Nikas, I. P. Diagnostic, prognostic, and therapeutic value of droplet digital PCR (ddPCR) in COVID-19 patients: A systematic review. Journal of Clinical Medicine. 10 (23), 5712(2021).
  17. Li, H., et al. Application of droplet digital PCR to detect the pathogens of infectious diseases. Bioscience Reports. 38 (6), (2018).
  18. Lee, B. T., et al. The UCSC genome browser database: 2022 update. Nucleic Acids Research. 50, 1115-1122 (2022).
  19. Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: A flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
  20. Untergasser, A., et al. Primer3--new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Research. 40 (15), 115(2012).
  21. Das, A., Das, D., Das, A., Panda, A. C. A quick and cost-effective method for DNA-free total RNA isolation using magnetic silica beads. bioRxiv. , (2020).
  22. Oberacker, P., et al. Simple Synthesis of Functionalized Paramagnetic Beads for Nucleic Acid Purification and Manipulation. Bio-protocol. 9 (20), 3394(2019).
  23. Rački, N., Dreo, T., Gutierrez-Aguirre, I., Blejec, A., Ravnikar, M. Reverse transcriptase droplet digital PCR shows high resilience to PCR inhibitors from plant, soil and water samples. Plant Methods. 10 (1), 42(2014).
  24. Taylor, S. C., Carbonneau, J., Shelton, D. N., Boivin, G. Optimization of droplet digital PCR from RNA and DNA extracts with direct comparison to RT-qPCR: Clinical implications for quantification of Oseltamivir-resistant subpopulations. Journal of Virological Methods. 224, 58-66 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Ilo ciowe oznaczanie RNAanaliza ddPCRprojektowanie starter w dywergentnychekstrakcja RNAsynteza cDNAdiagnostyka molekularnaekspresja gen wgenerowanie kropli

Powiązane artykuły