Ta praca ma na celu ocenę i przegląd procedury biologicznego testu śmiertelności Artemia salina, również identyfikowanej jako test śmiertelności krewetek solankowych. Ta prosta i tania metoda dostarcza informacji na temat ogólnej toksyczności (traktowanej jako wstępna ocena toksyczności) próbek, a mianowicie produktów naturalnych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Test biologiczny śmiertelności przy użyciu Artemia salina L.
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Produkty naturalne były używane od czasów starożytnych do produkcji leków. W dzisiejszych czasach istnieje wiele leków chemioterapeutycznych pozyskiwanych z naturalnych źródeł i stosowanych przeciwko wielu chorobom. Niestety, większość z tych związków często wykazuje toksyczność ogólnoustrojową i działania niepożądane. Aby lepiej ocenić tolerancję wybranych potencjalnie bioaktywnych próbek, krewetka solankowa (Artemia salina) jest zwykle stosowana jako model w badaniach śmiertelności. Test A. salina opiera się na zdolności badanych związków bioaktywnych do zabijania mikroskorupiaków w stadium larwalnym (nauplii). Metoda ta stanowi dogodny punkt wyjścia do badań cytotoksyczności, a także do ogólnych badań przesiewowych toksyczności produktów syntetycznych, półsyntetycznych i naturalnych. Można go uznać za prosty, szybki i tani test w porównaniu z wieloma innymi testami (komórki in vitro lub szczepy drożdży, danio pręgowany, gryzonie) ogólnie odpowiednie do wyżej wymienionych celów; Co więcej, można go łatwo wykonać nawet bez specjalnego szkolenia. Ogólnie rzecz biorąc, test A. salina stanowi użyteczne narzędzie do wstępnej oceny toksyczności wybranych związków i biosterowanego frakcjonowania ekstraktów produktów naturalnych.
Wprowadzenie
Produkty naturalne pochodzenia roślinnego, zwierzęcego lub mikrobiologicznego stanowią obszar coraz większego zainteresowania w opracowywaniu nowych cząsteczek bioaktywnych ze względu na ich szeroki zakres działań biologicznych i farmakologicznych1. Jednakże związane z nimi działania niepożądane, oporność na leki lub niewystarczająca specyficzność tych czynników, zwłaszcza w zastosowaniu jako leki przeciwnowotworowe, stanowią główne czynniki, które mogą prowadzić do nieskuteczności leczenia1,2.
W ciągu ostatnich kilku dekad odkryto szereg pochodzących z roślin czynników cytotoksycznych, z których niektóre są stosowane jako leki przeciwnowotworowe1,2,3. W tym kontekście paclitaxel jest opisywany jako jeden z najlepiej znanych i najaktywniejszych chemioterapeutyków pochodzenia naturalnego3,4. Obecnie szacuje się, że ponad 35% wszystkich dostępnych na rynku leków pochodzi z produktów naturalnych lub jest nimi inspirowanych5. Potencjalnie wysoka toksyczność tych związków wymaga uwzględnienia na wszystkich etapach badań, ponieważ różne rodzaje zanieczyszczeń, a nawet metaboliczne składniki samej rośliny, mogą wywoływać efekty toksyczne. Z tego powodu na etapie wstępnym należy przeprowadzić analizy farmakologiczne i toksykologiczne, aby ocenić aktywność biologiczną oraz bezpieczeństwo nowych potencjalnych terapii opartych na roślinach. Do oceny toksyczności nowych próbek bioaktywnych za najlepsze modele badawcze można uznać bezkręgowce. Wiążą się one z minimalnymi wymogami etycznymi i umożliwiają przeprowadzenie wstępnych testów in vitro, co pozwala wyłonić najbardziej obiecujące produkty do kolejnej serii badań na kręgowcach1,6.
Powszechnie znane jako solankowce, A. salina to małe halofilne bezkręgowce należące do rodzaju Artemia (rodzina Artemiidae, rząd Anostraca, podtyp Crustacea; Rysunek 1). W morskich i słonowodnych ekosystemach wodnych solankowce pełnią istotną rolę odżywczą, żywiąc się mikroalgami i stanowiąc składnik zooplanktonu wykorzystywanego do karmienia ryb. Ponadto ich larwy (znane jako nauplii) są szeroko stosowane w ocenie ogólnej toksyczności podczas badań wstępnych1,3,7.
Artemia spp. są szeroko stosowane w badaniach letalności i stanowią również wygodny punkt wyjścia do oceny toksyczności poprzez śledzenie toksyczności potencjalnie bioaktywnych związków na podstawie ich zdolności do zabijania naupliusów hodowanych w laboratorium1,8. Z tego powodu zastosowanie A. salina zyskało uznanie w ogólnych badaniach toksyczności, ponieważ jest to metoda bardzo wydajna i łatwa w użyciu w porównaniu z innymi testami na modelach zwierzęcych9.
Dzięki prostej anatomii, niewielkim rozmiarom i krótkiemu cyklowi życiowemu, ogromną liczbę bezkręgowców można zbadać w ramach jednego eksperymentu. W związku z tym łączą one podatność genetyczną i niskie koszty z możliwością przeprowadzania przesiewów na dużą skalę1. W tym kontekście zastosowanie artemii w ogólnym teście toksyczności wykazuje szereg zalet, takich jak szybki wzrost (od wylęgu do pierwszych wyników potrzeba 28-72 h), efektywność kosztową oraz długi termin przydatności komercyjnych jaj, które można wykorzystywać przez cały rok3,10. Z drugiej strony, ponieważ bezkręgowce posiadają prymitywny układ organów i nie mają adaptacyjnego układu odpornościowego, nie stanowią one idealnego i w pełni niezawodnego modelu dla ludzkich komórek1.
Stanowi ono jednak wstępną metodę oceny ogólnej toksyczności wybranych próbek. Ponieważ jest ono powszechnie stosowane jako test letalności, może dostarczać tymczasowych informacji o toksycznym działaniu potencjalnych czynników przeciwnowotworowych. Często służy ono również do uzyskania informacji zwrotnych na temat ogólnej toksyczności związków wykazujących jakiekolwiek inne działanie biologiczne, w przypadku których kluczowe jest wykazanie jak najniższego wskaźnika śmiertelności wśród krewetek Artemia.
W ramach prowadzonego przez naszą grupę badania różne ekstrakty z gatunków Plectranthus wykazały działanie przeciwutleniające i przeciwdrobnoustrojowe (wyniki nieopublikowane). Równolegle, poprzez oczyszczanie ekstraktów, uzyskano izolowane związki, które następnie poddano modyfikacjom chemicznym. Ekstrakty, czyste związki oraz pochodne semisyntetyczne przetestowano pod kątem ogólnej toksyczności. W tym kontekście niniejsza praca ma na celu przedstawienie przeglądu zastosowania bioanalizy letalności Artemia do oceny ogólnej toksyczności oraz potencjalnej aktywności cytotoksycznej bioaktywnych ekstraktów i izolowanych związków z różnych roślin z rodzaju Plectranthus11.
Rycina 1: Artemia salina pod mikroskopem. Nowo wyklute nauplii A. salina widziane pod mikroskopem (powiększenie 12x). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie sprzętu
- Należy nabyć dostępne w sprzedaży komercyjnie urządzenie do wylęgu. Wybrać odpowiednie miejsce do ustawienia urządzenia (Rycina 2A). Umieścić pojemnik w kształcie lejka w czarnym uchwycie (dołączonym do zestawu) i obrócić lejek w taki sposób, aby widoczne były oznaczenia poziomu oraz kranik.
- W celu wykonania własnego urządzenia do migracji, należy odciąć górne części dwóch plastikowych butelek o pojemności 0,5 L (średnica 5,8 cm), tak aby uzyskać końcową wysokość 12 cm. W każdej butelce, na jednej z jej ścianek, należy wykonać otwór o średnicy 1,5 cm w odległości 7 cm od dna, a następnie wsunąć 13 cm gumowej rurki (średnica zewnętrzna 1,3 cm, wewnętrzna 0,9 cm) pomiędzy oba otwory. Uszczelnić otwory klejem na gorąco (Rycina 2B>) i pozostawić do wyschnięcia na 15 min; ustawić butelki na płaskiej powierzchni i napełnić je wodą, aby sprawdzić, czy nie ma wycieków.
2. Przygotowanie sztucznego roztworu soli
- W zlewce szklanej przygotować sztuczny roztwór soli (soli dla solowców) o stężeniu 35 g/L. W tym celu, zgodnie z instrukcją producenta, dodać 28 g soli do 800 mL wody z kranu. Mieszać za pomocą pręta szklanego do całkowitego rozpuszczenia soli.
UWAGA: Dostosować objętość przygotowanego roztworu soli do wielkości dostępnych pojemników.
3. Przygotowanie próbek
- Przygotować wszystkie próbki w probówkach do mikrocentryfugi, rozpuszczając odpowiednią ilość ekstraktów (ekstrakty z Plectranthus: Pa- P. ambigerus; Pb- P. barbatus; Pc- P. cylindraceus; oraz Pe- P. ecklonii) lub związków 1-5 (dwóch związków naturalnych [1 i 2] otrzymanych z Plectranthus spp. oraz trzech pochodnych półsyntetycznych [3, 4, 5]; Rycina 3) w dimetylosulfotlenku (DMSO)12, aby uzyskać stężenie końcowe 10 mg/mL (jeśli próbka jest rozpuszczalna w wodzie, zastosowanie DMSO nie jest konieczne).
- Rozcieńczyć 10 µL każdej próbki (oraz DMSO dla kontroli negatywnej) w nowej probówce do mikrocentryfugi, używając 990 µL sztucznej soli fizjologicznej przygotowanej w kroku 2.1, aby uzyskać stężenie końcowe 0,1 mg/mL.
- W dygestorium, w kolbie Erlenmeyera, przygotować roztwór dichromianu potasu (K2Cr2O7) w wodzie destylowanej o stężeniu 1 mg/mL13,14,15.
4. Bioanaliza letalności na krewetkach solankowych
UWAGA: Analiza ta została opracowana na podstawie prac kilku autorów z wprowadzonymi modyfikacjami1,16,17,18,19.
- Napełnić naczynie do wylęgania medium przygotowanym w kroku 2.1 do poziomu oznaczonego kreską (500 mL) (Rysunek 2C).
- Umieścić jedną łyżkę (około 0.75 g) cyst artemii w roztworze soli, a następnie zamknąć pojemnik. Ustawić lampę (lampa stołowa, 40 W, 230 V, 50 Hz, z żarówką LED 8 W, 4 000 K, 830 lm) skierowaną bezpośrednio na urządzenie (Rysunek 2A) i włączyć ją.
- Podłączyć system napowietrzania (wyjście 3 W, 50 Hz, 230 V) do złącza znajdującego się na górze urządzenia i włączyć pompę.
- Utrzymywać temperaturę w pomieszczeniu na poziomie 25 ± 3 °C. Cysty artemii wylęgają się w sztucznym roztworze soli, przy intensywnym napowietrzaniu, ciągłym oświetleniu i stabilnej temperaturze, po upływie od 24 h do 48 h.
UWAGA: Alternatywnie można użyć inkubatora pionowego. - Po wykluciu się jaj wyłączyć pompę napowietrzającą i poczekać, aż nauplii (poruszające się w stronę dna lejka) oddzielą się od pustych osłon jajowych (pływających na powierzchni).
- Aby oddzielić niewylęgłe jaja od żywych nauplii, otworzyć kran wylotowy na dnie i spuścić zawartość lejka do jednego z pojemników własnoręcznie wykonanego zestawu do migracji (opisanego w kroku 1.2). Upewnić się, że roztwór zawierający nauplii i pozostałe niewylęgłe jaja znajduje się poniżej poziomu rurki. Do drugiego pojemnika dodać pozostały roztwór soli powyżej wysokości rurki.
- Przykryć pojemnik z nauplii i niewylęgłymi jajami folią aluminiową. Umieścić lampę nad drugim pojemnikiem zawierającym tylko roztwór soli. Artemie zostaną przyciągnięte przez światło i zmigrują z jednego pojemnika do drugiego (pojemnika zbiorczego), co pozwoli na skuteczne oddzielenie jaj (które powoli opadają na dno) od żywych Artemia.
- Następnie umieścić urządzenie w inkubatorze w tych samych warunkach, które zastosowano w kroku 4.4, na 4 h (Rysunek 2E). Z pojemnika zbiorczego pobrać 900 µL roztworu soli zawierającego od 10 do 15 nauplii. Przenieść roztwór soli z nauplii do każdej studni płytki 24-dołkowej (Rysunek 2F); wszystkie próbki badane są w czterech powtórzeniach.
- Do odpowiednich studni (Rysunek 2F) dodać po 100 µL kontroli negatywnej (DMSO), kontroli pozytywnej (K2Cr2O7, dichromian potasu), sztucznego roztworu soli oraz każdej z próbek13,14.
UWAGA: Próbki w każdej studni będą miały stężenie 0,01 mg/mL. Końcowe stężenie kontroli pozytywnej w roztworze soli wyniesie 0,1 mg/mL, aby upewnić się, że wszystkie nauplii w studni zostaną poddane toksycznemu działaniu dichromianu potasu i zginą. Sztuczny roztwór soli będzie służył jako ślepa próba. - Inkubować płytkę w temperaturze 25 ± 3 °C pod oświetleniem przez 24 h (Rysunek 2G). Po 24 h zarejestrować liczbę martwych larw (nauplii nie wykazujących ruchu przez 5 s) w każdej studni pod mikroskopem binokularowym (12x)20 (Rysunek 2H). Alternatywnie można użyć lupy ręcznej.
- Dodać 100 µL roztworu dichromianu potasu, aby wywołać śmierć pozostałych żywych larw, i odczekać 6 h. Policzyć całkowitą liczbę martwych larw w każdej studni pod mikroskopem. Obliczyć wskaźnik śmiertelności zgodnie z następującym równaniem:
- Wszystkie testy przeprowadzić w trzech powtórzeniach. Obliczyć odchylenia standardowe (SD) i przedstawić wyniki jako średnią z trzech niezależnych eksperymentów, z których każdy obejmował wewnętrzne cztery powtórzenia (n = 12), ± SD. Zgodnie z publikacją Meyer i wsp., ekstrakty surowe i czyste związki z LC50< 1 000 µg/mL należy uznać za toksyczne; należy również wziąć pod uwagę, że wskaźnik śmiertelności artemii jest proporcjonalny do stężenia badanych próbek21.
Rycina 2: Metoda bioanalizy letalności Artemia salina. (A) Dostępny w sprzedaży sprzęt wykorzystywany do wylęgu cyst solnych krewetek; (B) Samodzielnie wykonany zestaw do migracji; (C) Naczynie do wylęgu wypełnione roztworem soli; (D) Zbieranie niewylężonych jaj i naupliów; (E) Samodzielnie wykonany zestaw w inkubatorze podczas etapu migracji. Pojemnik oddalony od lampy powinien być przykryty folią aluminiową; w celu lepszego zobrazowania instalacji została ona tutaj usunięta; (F) Zbieranie Artemia w studzienkach przed wykonaniem analizy. Związki powinny zostać umieszczone w sposób przedstawiony: - oznacza kontrolę negatywną (DMSO), + kontrolę pozytywną (K2Cr2O7), salt sztuczny roztwór soli, a 1 do 3 próbki do przetestowania (w tym przypadku związki 1-3); (G) Inkubacja płytki 24-dołkowej zawierającej Artemia oraz wybrane próbki; (H) Liczenie Artemia pod mikroskopem binokularnym. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 3: Struktury wybranych związków. Struktura związków 1-2, wyekstrahowanych z gatunków Plectranthus, oraz związków 3-5, otrzymanych w drodze semisyntezy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Ogólną toksyczność niektórych produktów naturalnych, badanych niedawno przez naszą grupę, oceniono za pomocą testu letalności z użyciem krewetek solankowych. Przebadano cztery ekstrakty z rodzaju Plectranthus (Pa- P. ambigerus; Pb- P. barbatus; Pc- P. cylindraceus oraz Pe- P. ecklonii), znane z działania antyoksydacyjnego (wyniki nieopublikowane). Dodatkowo zbadano dwa związki naturalne (1 i 2) otrzymane z Plectranthus spp. oraz trzy pochodne półsyntetyczne (3, 4, 5; ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W ostatnich latach społeczność naukowa zwiększyła swoją uwagę na alternatywne modele badań przesiewowych toksyczności21. Oprócz testu biologicznego śmiertelności A. salina zwykle wykonuje się inne metodologie oceny tolerancji próbki i obejmują one testy biologiczne kręgowców (takich jak gryzonie), bezkręgowców (takich jak danio pręgowany), metody in vitro z wykorzystaniem szczepów lub komórek drożdży oraz metody in silico 22,23,24,25
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak konfliktów interesów, finansowych lub innych.
Podziękowania
Pamięci stylu Profesor Amilcar Roberto.
Ta praca była wspierana finansowo przez Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT, Portugalia) w ramach projektów UIDB/04567/2020 i UIDP/04567/2020 przypisanych CBIOS i grantu doktoranckiego SFRH/BD/137671/2018 (Vera Isca).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Płytki 24-dołkowe | Thermo Fisher Scientific, Dania | 174899 | Thermo Scientific Nunc Up Cell 24 wielotalerzowa |
| folia aluminiowa | Albal-Można | kupić w supermarkecie | |
| Artemio Set | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Niemcy | 61066000 | Można kupić w sklepach zoologicznych |
| Mikroskop dwuokularowy | Ceti, Belgia | 1700.0000 | Flexum-24AED, 220-240 V, 50 Hz |
| Butelki | - | 0,5 L Średnica: 5,8 cm; Wysokość: 12 cm | |
| Cysty krewetek solankowych | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Niemcy | 3090700 | Można kupić w sklepach zoologicznych |
| Sól krewetkowa solankowa | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Niemcy | 3090600 | Można kupić w sklepach zoologicznych |
| Dimetylosulfotlenek (DMSO) | Chemikalia VWR | CAS: 67-68-5 | 99% czystości |
| Końcówki do bliznowania | Diament | F171500 | Zakres głośności: 100 - 1000 i mikro; L |
| Mikroprobówki Eppendorf | MARKI | 7,80,546 | Mikroprobówki, PP, 2 mL, BIO-CERT JAKOŚĆ PCR |
| Kolba Erlenmeyera | VWR chemicals | 4,47,109 | objętość: 100 ml |
| Szklana zlewka | Normax | 3.2111654N | Objętość: 1000 ml |
| Rękawice | Guantes Luna | GLSP3-GraphPad | |
| Prism | GraphPad Software, San Diego, CA, USA-GraphPad | Prism wersja 5.00 dla systemu Windows, www.graphpad.com, dostęp 5 lutego 2021 r.; statystyka handlowa oprogramowanie analityczne | |
| Domowy hodowca A. salina | - | -Domowej | roboty: dwie plastikowe butelki połączone wężem |
| Gorący klej | Parkside | PHP500E3 | 230 V, 50 Hz, 25 W |
| Inkubator | Heidolph Instruments, Dania | - | Jeden sprzęt Heidolph Unimax 1010 i jeden Heidolph Inkubator 1006 |
| Light | Roblan | SKYC3008FE14 | żarówka LED |
| Mikropipety | VWR chemicals | 613-5265 | Zakres głośności: 100 - 1000 &mikro; L |
| Dwuchromian potasu (K2Cr2O7) | VWR chemicals | CAS: 7778-50-9 | Pompa o czystości 99% |
| ProAir a50 | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Niemcy | - | W zestawie Artemio Set+1 |
| Rurka gumowa | - | średnica zewnętrzna 1,3 cm i średnica wewnętrzna 0,9 cm | |
| Pręt mieszający | VWR chemicals | 441-0147 |  6 mm, 250 mm |
| Termometr | VWR chemicals | 620-0821 | 0 - 100 ° Z |
Bibliografia
- Ntungwe, N. E., et al. Artemia species: An important tool to screen general toxicity samples. Current Pharmaceutical Design. 26 (24), 2892-2908 (2020).
- Cragg, G. M., Newman, D. J. Natural products: A continuing source of novel drug leads. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1830 (6), 3670-3695 (2013).
- Ntungwe, E., et al. General toxicity screening of Royleanone derivatives using an artemia salina model. Journal Biomedical and Biopharmaceutical Research. 18 (1), 114(2021).
- Seca, A., Plant Pinto, D. secondary metabolites as anticancer agents: Successes in clinical trials and therapeutic application. International Journal of Molecular Sciences. 19 (1), 263(2018).
- Calixto, J. B. The role of natural products in modern drug discovery. Anais da Academia Brasileira de Ciências. 91 (3), 1-7 (2019).
- Mandrell, D., et al. Automated zebrafish chorion removal and single embryo placement: optimizing throughput of zebrafish developmental toxicity screens. Journal of Laboratory Automation. 17 (1), 66-74 (2012).
- Zhang, Y., Mu, J., Han, J., Gu, X. An improved brine shrimp larvae lethality microwell test method. Toxicology Mechanisms and Methods. 22 (1), 23-30 (2012).
- Domínguez-Villegas, V., et al. antioxidant and cytotoxicity activities of methanolic extract and prenylated flavanones isolated from leaves of eysehardtia platycarpa. Natural Product Communications. 8 (2), 177-180 (2013).
- Hamidi, M. R., Jovanova, B., Panovska, T. K. Toxicological evaluation of the plant products using Brine Shrimp (Artemia salina L.) model. Macedonian Pharmaceutical Bulletin. 60 (01), 9-18 (2014).
- Libralato, G., Prato, E., Migliore, L., Cicero, A. M., Manfra, L. A review of toxicity testing protocols and endpoints with Artemia spp. Ecological Indicators. 69, 35-49 (2016).
- Mendes Hacke, A. C., et al. Cytotoxicity of cymbopogon citratus (DC) Stapf fractions, essential oil, citral, and geraniol in human leukocytes and erythrocytes. Journal of Ethnopharmacology. 291, 115147(2022).
- Thangapandi, V., Pushpanathan, T. Comparison of the Artemia salina and Artemia fransiscana bioassays for toxicity of Indian medicinal plants. Journal of Coastal Life Medicine. 2 (6), 453-457 (2014).
- Syahmi, A. R. M., et al. Acute oral toxicity and brine shrimp lethality of Elaeis guineensis Jacq., (Oil Palm Leaf) methanol extract. Molecules. 15 (11), 8111-8121 (2010).
- Sasidharan, S., et al. Acute toxicity impacts of Euphorbia hirta L extract on behavior, organs body weight index and histopathology of organs of the mice and Artemia salina. Pharmacognosy Research. 4 (3), 170(2012).
- Libralato, G. The case of Artemia spp. in nanoecotoxicology. Marine Environmental Research. 101, 38-43 (2014).
- Okumu, M. O., et al. Artemia salina as an animal model for the preliminary evaluation of snake venom-induced toxicity. Toxicon: X. 12, 100082(2021).
- Rajabi, S., Ramazani, A., Hamidi, M., Naji, T. Artemia salina as a model organism in toxicity assessment of nanoparticles. DARU Journal of Pharmaceutical Sciences. 23 (1), 20(2015).
- Svensson, B. -M., Mathiasson, L., Mårtensson, L., Bergström, S. Artemia salina as test organism for assessment of acute toxicity of leachate water from landfills. Environmental Monitoring and Assessment. 102 (1), 309-321 (2005).
- Banti, C., Hadjikakou, S. Evaluation of toxicity with brine shrimp assay. Bio-Protocol. 11 (2), 3895(2021).
- Pecoraro, R., et al. Artemia salina: A microcrustacean to assess engineered nanoparticles toxicity. Microscopy Research and Technique. 84 (3), 531-536 (2021).
- Lillicrap, A., et al. Alternative approaches to vertebrate ecotoxicity tests in the 21st century: A review of developments over the last 2 decades and current status. Environmental Toxicology and Chemistry. 35 (11), 2637-2646 (2016).
- Ribeiro, I. C., et al. Yeasts as a model for assessing the toxicity of the fungicides Penconazol, Cymoxanil and Dichlofulanid. Chemosphere. (10), 1637-1642 (2000).
- Armour, C. D., Lum, P. Y. From drug to protein: using yeast genetics for high-throughput target discovery. Current Opinion in Chemical Biology. 9 (1), 20-24 (2005).
- Modarresi Chahardehi, A., Arsad, H., Lim, V. Zebrafish as a successful animal model for screening toxicity of medicinal plants. Plants. 9 (10), 1345(2020).
- Fischer, I., Milton, C., Wallace, H. Toxicity testing is evolving. Toxicology Research. 9 (2), 67-80 (2020).
- de Araújo, G. L., et al. Alternative methods in toxicity testing: the current approach. Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences. 50 (1), 55-62 (2014).
- Toussaint, M., et al. A high-throughput method to measure the sensitivity of yeast cells to genotoxic agents in liquid cultures. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 606 (1), 92-105 (2006).
- Horzmann, K. A., Freeman, J. L. Making waves: New developments in toxicology with the zebrafish. Toxicological Sciences. 163 (1), 5-12 (2018).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: An introduction. Journal of Visualized Experiments. (69), e4196(2012).
- Cunliffe, V. T. Zebrafish: A Practical Approach. Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. , Oxford University Press. (2002).
- Sitarek, P., et al. Insight the biological activities of selected Abietane Diterpenes isolated from Plectranthus spp. Biomolecules. 10 (2), 194(2020).
- Matias, D., et al. Cytotoxic activity of Royleanone Diterpenes from Plectranthus madagascariensis Benth. ACS Omega. 4 (5), 8094-8103 (2019).
- Garcia, C., et al. Royleanone derivatives from Plectranthus spp. as a novel class of P-glycoprotein inhibitors. Frontiers in Pharmacology. 11, (2020).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
