Artykuł metodologiczny

Mysi model złożonej niestabilności stawu skokowo-podskokowego

DOI:

10.3791/64481

⸱

28 października 2022

 ,  ,  ,  , 
1Department of Orthopaedics, The First Affiliated Hospital of Soochow University, 2Orthopaedic Institute, Soochow University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Złożony staw skokowo-podskokowy (ASCJ) jest rdzeniem stopy i odgrywa kluczową rolę w kontroli równowagi w codziennych czynnościach. Kontuzje sportowe często prowadzą do niestabilności tego stawu. Tutaj opisujemy mysi model niestabilności ASCJ wywołanej przecięciem więzadła.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Skręcenia kostki są prawdopodobnie najczęstszymi urazami sportowymi w codziennym życiu, często skutkują niestabilnością stawu skokowo-podskokowego (ASCJ) i mogą ostatecznie prowadzić do pourazowej choroby zwyrodnieniowej stawów (PTOA) w dłuższej perspektywie. Jednak ze względu na złożoność mechanizmu urazu i objawy kliniczne, takie jak wybroczyny, krwiak lub tkliwość stopy bocznej, nie ma klinicznego konsensusu co do diagnozowania i leczenia niestabilności ASCJ. Ponieważ struktura mięśniowo-szkieletowa kości i więzadeł tylnej części stopy myszy jest porównywalna z ludzką, zwierzęcy model niestabilności ASCJ u myszy został ustalony przez przecięcie więzadeł wokół ASCJ. Model został dobrze zweryfikowany poprzez serię testów behawioralnych i analiz histologicznych, w tym test równoważni, analizę śladów stóp (ocena poziomu ćwiczeń i zdolności do równowagi u myszy), ocenę nocycepcji termicznej (ocena funkcji czuciowych stopy u myszy), skanowanie mikrotomografii komputerowej (CT) i barwienie przekroju chrząstki stawowej (ocena uszkodzenia i zwyrodnienia chrząstki stawowej u myszy). Pomyślne opracowanie mysiego modelu niestabilności ASCJ będzie stanowić cenne odniesienie dla badań klinicznych nad mechanizmem urazu i zaowocuje lepszymi możliwościami leczenia skręcenia stawu skokowego.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Skręcenia kostki są jednym z najczęstszych urazów sportowych na świecie. Szacuje się, że w Stanach Zjednoczonych codziennie 10 000 osób doznaje kontuzji1, z czego urazy związane ze sportem stanowią 15%-45%2. Koszty leczenia skręceń stawu skokowego w Stanach Zjednoczonych wynoszą 4,2 miliarda dolarów rocznie3,4,5. Przewlekła niestabilność stopy jest częstym problemem po skręceniu stawu skokowego i występuje w około 74% skręceń stawu skokowego6, w tym niestabilność stawu skokowego lub podskokowego. Jednak ze względu na podobne objawy kliniczne i oznaki, personelowi medycznemu trudno jest odróżnić, czy przewlekłej niestabilności stawu skokowego towarzyszy również przewlekła niestabilność stawu podskokowego w klinice, w wyniku czego przewlekłą niestabilność podskokową można łatwo przeoczyć. W związku z tym rzeczywista częstość występowania przewlekłej niestabilności stawu skokowo-podskokowego (ASCJ) (specyficzny rodzaj przewlekłej niestabilności stopy, która obejmuje zarówno przewlekłą niestabilność stawu skokowego, jak i przewlekłą niestabilność podskokową) może być wyższa niż podano7,8,9. Nieleczona przewlekła niestabilność stawu skokowo-podskokowego może powodować powtarzające się skręcenia stawu skokowego, prowadzące do błędnego koła skręceń stawu skokowego i przewlekłej niestabilności zespołu stawu skokowo-podskokowego. Długotrwała przewlekła niestabilność kompleksu stawu skokowo-skokowego może prowadzić do zwyrodnienia ASCJ i pourazowej choroby zwyrodnieniowej stawów, która w ciężkich przypadkach może wpływać na sąsiednie stawy10. W przypadku tych chorób obecne leczenie kliniczne jest głównie zachowawcze, oprócz metod leczenia chirurgicznego, takich jak naprawa więzadeł i rekonstrukcja więzadeł11,12.

ASCJ to podstawowa struktura stopy i utrzymuje równowagę ciała podczas ruchu13. Przeprowadzono szeroko zakrojone badania nad strukturą stawu skokowego i stawu podskokowego oddzielnie14,15,16,17. Jednak badania nad całym stawem skokowo-podskokowym są rzadkie. Około jedna czwarta przypadków urazów stawu skokowego jest związana z urazem stawu podskokowego18. Ze względu na złożony mechanizm uszkodzenia niestabilności ASCJ nie ma zgody co do diagnozowania i leczenia jej w warunkach klinicznych. Biorąc pod uwagę obecną sytuację urazów stawu skokowego w klinice, potrzebna jest bardziej naukowa metoda badania stawu skokowego i podskokowego jako całości, zapewniając w ten sposób nowe zrozumienie dla badania chorób stóp.

Ponieważ anatomiczna struktura tylnej części stopy myszy na poziomie mięśniowo-szkieletowym jest porównywalna do ludzkiej stopy19, w kilku badaniach już zaimplementowano mysie modele do badań nad stopą/kostką10,19. Chang i wsp.19 z powodzeniem opracowali trzy różne mysie modele choroby zwyrodnieniowej stawu skokowego. Zainspirowani udanym ustaleniem niestabilności stawu skokowego w modelu myszym, ustaliliśmy mysi model niestabilności złożonej stawu skokowo-podskokowego, stawiając hipotezę, że przecięcie częściowych więzadeł w tylnej części stopy myszy skutkowałoby mechaniczną niestabilnością ASCJ, co doprowadziłoby do pourazowej choroby zwyrodnieniowej stawów (PTOA) ASCJ. Model zwierzęcy niestabilności ASCJ może być stosowany do leczenia zarówno niestabilności stawu skokowego, jak i niestabilności podskokowej, co jest bardziej zgodne z rzeczywistą sytuacją kliniczną niż obecnie stosowany prosty model niestabilności stawu skokowego7,8,9,19. Aby przetestować tę hipotezę, zaprojektowano dwa mysie modele niestabilności ASCJ wywołanej przecięciem więzadła. Wyniki funkcji czuciowo-motorycznej - test równoważni, analiza śladu stopy i ocena nocycepcji termicznej - wykorzystano do oceny wykonalności modelu, a mikrotomografia komputerowa (CT) i barwienie histologiczne wykorzystano do oceny uszkodzenia i zwyrodnienia chrząstki stawowej myszy. Pomyślne opracowanie mysiego modelu niestabilności ASCJ nie tylko dostarcza nowych informacji na temat chorób stóp, ale także stanowi cenne odniesienie do badań klinicznych nad mechanizmami związanymi z urazami, zapewnia lepsze opcje leczenia skręceń stawu skokowego i jest pomocne w dalszych badaniach nad chorobą.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie badania na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z Wytycznymi dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych i zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Soochow.

1. Zabiegi chirurgiczne

  1. Podziel 21, 6-tygodniowych samców myszy C57BL / 6 na trzy grupy: grupę poprzecznego więzadła szyjnego i więzadła skokowo-strzałkowego przedniego, grupę poprzecznego więzadła szyjnego i więzadła naramiennego oraz grupę operacji pozorowanej. Upewnij się, że wszystkie myszy były hodowane w środowisku, które spełnia określone standardy wolne od patogenów (SPF).
  2. Zaaklimatyzuj myszy do nowego środowiska hodowlanego (cykl jasny/ciemny 12 godzin/12 godzin oraz stała temperatura i wilgotność odpowiednio 18-22 °C i 40%-70%) przez 2 tygodnie przed eksperymentem. Poddaj myszy ćwiczeniu na równoważni i chodzie, przechodząc z jednego końca równoważni lub rury w kształcie litery U na drugi koniec bez zatrzymywania się, 1 tydzień przed eksperymentem.
  3. W wieku 8 tygodni znieczulij mysz za pomocą inhalacji izofluranu, zwilżając wacik 2 ml izofluranu i umieszczając go w hermetycznym pojemniku w celu pełnego ulatniania się. Monitoruj aktywność myszy i kontynuuj wdychanie, aż aktywność myszy znacznie się zmniejszy. Określ głębokość znieczulenia, ściskając palce u nóg myszy, aby obserwować ich reakcje. Wdychaj odparowany izofluran (2%) przez maskę na twarz, aby utrzymać znieczulenie u myszy podczas kolejnych operacji. Podczas znieczulenia używaj weterynaryjnej maści do oczu, aby zapobiec wysuszeniu oczu.
  4. Po znieczuleniu usuń włosy ze stawu skokowego prawych tylnych kończyn myszy za pomocą golarki i trzykrotnie zdezynfekuj odsłoniętą skórę za pomocą naprzemiennych rund wacików jodowych i wacików nasączonych alkoholem. Karprofen należy podawać w dawce 5 mg/kg mc. we wstrzyknięciu podskórnym. Przenieś mysz na salę operacyjną dla zwierząt mikrochirurgicznych za pomocą sterylnej podkładki chirurgicznej.
  5. W przypadku grupy więzadła poprzecznego szyjnego i więzadła skokowo-piszczowego przedniego (CL + ATFL) należy wykonać 7 mm ukośne w dół podłużne nacięcie skalpelem na skórze powyżej prawego stawu skokowego i sondować mikroskopijnymi prostymi kleszczami przed stawem skokowym.
  6. Upewnij się, że ATFL jest odsłonięty na dolnej granicy kości skokowej i strzałkowej po sondowaniu i delikatnie przetnij go skalpelem. Oddziel długie i krótkie ścięgna strzałkowe oraz ścięgna prostownika długiego palca, odsłoń CL i przetnij go skalpelem.
  7. W przypadku grupy więzadła poprzecznego CL + naramiennego (DL) należy wykonać pionowe nacięcie o średnicy 8 mm na przyśrodkowej skórze prawego stawu skokowego i tępo oddzielić DL od kostki przyśrodkowej, aby ostatecznie ją przeciąć. Następnie odetnij CL zgodnie z opisem w kroku 1.5.
  8. W przypadku grupy pozorowanej (grupa operacji pozorowanej) należy wykonać pozorowaną operację prawego stawu skokowego, ale nie należy przecinać żadnych więzadeł.
  9. Przepłucz nacięcie sterylną solą fizjologiczną i zszyj ją nylonową nicią chirurgiczną 5-0. Na koniec zdezynfekuj zszyte nacięcie wacikiem jodowym.
  10. Trzymaj mysz pod obserwacją, dopóki nie będzie w stanie utrzymać pozycji leżącej mostka, i nadzoruj, aż będzie w pełni przytomna. Dezynfekować nacięcie kostki dwa razy dziennie wacikiem jodowym i podawać karprofen (5 mg/kg, wstrzyknięcie podskórne) raz dziennie przez 1 tydzień. Wróć sam po operacji i zwróć szczególną uwagę na stan pooperacyjny myszy.
  11. Dwa tygodnie po zabiegu, gdy obrzęk stawu skokowego zmniejszy się, zacznij ćwiczyć myszy w rotacyjnej maszynie do zmęczenia myszy przez 1 godzinę każdego dnia.

2. Test równoważni

  1. Zacisnąć okrągłą drewnianą belkę o długości 1 m i średnicy 20 mm, nachyloną pod kątem 15° na jednym końcu, za pomocą klipsa do statywu fotograficznego, a drugi koniec umieścić na powierzchni roboczej połączonej z zamkniętą kasetą.
  2. Wykonaj trening na równoważni 1 tydzień przed operacją, aby upewnić się, że myszy płynnie przechodzą z jednego końca belki na drugi. Wyobraźmy sobie, że mysz zdała test, gdy przechodzi przez wiązkę dwa razy w ciągu 60 sekund bez przerwy.
  3. Wykonaj dwie kolejne próby dla każdej myszy i spryskaj równoważnię 75% alkoholem po każdej próbie, aby zapobiec wpływowi pozostałego zapachu poprzedniej myszy na następną mysz.
  4. Wykonaj test równoważni przed operacją, 3 dni, 1 tydzień, 4 tygodnie, 8 tygodni i 12 tygodni po operacji. Zapisz średni czas, w którym każda mysz mija równoważnię dwa razy z rzędu oraz liczbę przypadków, w których prawa tylna część stopy ześlizguje się z belki jako zmienne zależne.

3. Analiza śladu

  1. Umieść plastikowy kanał w kształcie litery U o długości 50 cm, szerokości 10 cm i wysokości 10 cm na stole doświadczalnym i podłącz jeden koniec plastikowego kanału do zamkniętej kasety.
  2. Umieść zwykły papier pigmentowy płasko w kanale, a następnie przytrzymaj mysz obiema rękami i pomaluj ich przednie i tylne łapy równomiernie nietoksycznym czerwonym i zielonym pigmentem.
  3. Delikatnie umieść pomalowaną mysz na jednym końcu kanału i pozwól im przesunąć się na drugi koniec kasety. Wyjmij pigmentowany papier z odciskami stóp, zaznacz go i umieść na stojaku do wyschnięcia w przewiewnym i zacienionym miejscu.
  4. Po przejściu każdej myszy spryskaj plastikowy kanał w kształcie litery U 75% alkoholem, aby resztki zapachu poprzedniej myszy nie wpływały na następną mysz.
  5. Zaznacz trzy kolejne wyraźne ślady myszy na każdym papierze i użyj linijki, aby zmierzyć długość kroku śladu prawej stopy myszy, a także szerokość kroku między lewym i prawym footprintem.

4. Ocena nocycepcji termicznej

  1. Podczas eksperymentu użyj testu podeszwowego, aby zarejestrować czas reakcji nocycepcji termicznej stopy myszy i czas reakcji myszy odpowiednio podczas aktywności i spoczynku. Zapisz dane pomiarowe w ciągu kilku sekund.
  2. Umieść mysz w przyrządzie pomiarowym, wyrównaj przyrząd z prawą stopą i zacznij podgrzewać przyrząd przy powolnym wzroście temperatury. Obserwuj reakcję myszy. Gdy temperatura wzrośnie powyżej tolerancji, mysz szybko się wycofa lub poliże prawą stopę. Rejestruj czas za pomocą przyrządu i zdefiniuj czas jako czas reakcji podczas aktywności.
  3. Aby zmierzyć czas reakcji w spoczynku, pozwól myszy usiąść na 30 minut na stole do odpoczynku bez podgrzewania, a następnie uzyskaj dane dotyczące czasu, jak wyjaśniono w kroku 4.2. Wykorzystaj te pozyskane dane czasowe do późniejszej analizy.

5. Skanowanie mikro-tomografem komputerowym

  1. Po operacji poddaj 12-tygodniowe myszy eutanazji dwutlenkiem węgla, zdjąj skórę z ich prawych kostek, a następnie przetnij środkową kość piszczelową i strzałkową nożyczkami chirurgicznymi, aby uzyskać pełne próbki kostki. Umieścić próbki w oznaczonych 15 ml probówkach wirówkowych zawierających 10% neutralnej formaliny na 48 godzin.
  2. Po utrwaleniu należy umieścić próbki w partiach (cztery próbki na partię) w specjalnym zbiorniku z gąbką do skanowania mikro-CT. Ustaw parametry maszyny w następujący sposób: napięcie = 50 kV, prąd = 200 mA, filtr = 0,5 mmAl i rozdzielczość = 9 μm. Uruchom mikrotomograf komputerowy.
  3. Po zeskanowaniu użyj oprogramowania do rekonstrukcji, aby wyznaczyć zakres obrazu i wybierz określoną pozycję kąta po dostosowaniu osi XYZ nakreślonego obrazu za pomocą komercyjnego oprogramowania do analizy danych, zgodnie z opisem w Liu et al.10.
  4. Użyj oprogramowania do analizy mikro-CT, aby wybrać ciągłe 10-warstwowe obszary zainteresowania w zrestrukturyzowanych obrazach skorygowanych przez osie XYZ i przeanalizować ilościowo wymagane stawy w celu określenia frakcji objętości kości (BV/TV), zgodnie z opisem w Liu et al.10.
  5. Na koniec użyj oprogramowania do przetwarzania trójwymiarowych obrazów medycznych, aby wykonać trójwymiarowe przetwarzanie obrazu CT stawów skokowych myszy, zgodnie z opisem w Liu et al.10. Po rekonstrukcji obserwuj zużycie i tworzenie się osteofitów w ASCJ.

6. Barwienie przekroju chrząstki stawowej

UWAGA: Wszystkie etapy barwienia są wykonywane w dygestorium, a podczas zabiegu zakładana jest maska.

  1. Użyj mikroskopijnej pęsety i nożyczek, aby usunąć nadmiar tkanki miękkiej wokół próbek kostki, a następnie umieść próbki w probówce wirówkowej zawierającej 10% roztwór odwapniający EDTA przygotowany z 44 g NaOH, dwoma opakowaniami PBS i 400 g EDTA-2Na, przy pH dostosowanym do 7,35-7,45 kwasem solnym i zaznacz różne grupy.
  2. Następnie umieść probówkę wirówkową na stole do wytrząsania (prędkość ustawiona na 20 obr./min) w celu odwapnienia i zmieniaj roztwór odwapniający raz dziennie. Określ odwapnienie próbek.
  3. Po 1 miesiącu odwapnienia odwodnić próbki alkoholem gradientowym, a następnie użyć n-butanolu przez 8 godzin w celu oczyszczenia. Na koniec zanurz oczyszczone próbki w parafinie w pozycji koronalnej w celu zatopienia.
  4. Próbki parafiny umieścić w lodówce o temperaturze 4 °C do późniejszego wykorzystania. Przed cięciem należy pobrać próbki z lodówki o temperaturze 4 °C i umieścić je w zamrażarce o temperaturze -20 °C na około 10 minut, aby ułatwić cięcie całej płaszczyzny.
  5. Umocować próbki na mikrotomie i podzielić je na sekcje o grubości 6 μm. W tym samym czasie należy za pomocą mikroskopu obserwować, czy próbki zostały pocięte na oczekiwanym poziomie - łatwa penetracja igły strzykawki w tkance kostnej.
  6. Wcześniej ustaw temperaturę wody w tabletkarce na 40 °C. Następnie wytnij dwa lub trzy pełne kawałki parafiny z rzędu i przenieś je do tabletkarki w celu pełnego rozprężenia. Następnie usuń skrawki parafiny za pomocą szkiełka i spuść wodę. Na koniec oznacz slajdy grupami i numerami.

7. Barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E)

  1. Umieścić skrawki w inkubatorze o temperaturze 60 °C w taki sposób, aby pod mikroskopem można było zaobserwować nienaruszoną strukturę stawu ASCJ i piec skrawki przez 40-50 minut. Następnie odparafinuj skrawki ksylenem 3x, ponumerowane jako I, II i III dla łatwej identyfikacji, odpowiednio przez 15 minut, 15 minut i 10 minut.
  2. Umieść odparafinowane skrawki w 100% etanolu 2x, ponumerowane jako I i II dla łatwej identyfikacji, 90% etanolu i 80% etanolu odpowiednio na 3 minuty, 3 minuty, 5 minut i 5 minut. Następnie myj sekcje wodą podwójnie destylowaną (ddH2O) przez 5 minut.
  3. Po namoczeniu hematoksyną przez 1 minutę umyć skrawki ddH2O, aż staną się bezbarwne. Namocz skrawki w 1% roztworze do różnicowania kwasów etylowych przez 30 s i myj je 3x przez 1 min z ddH2O. Następnie zabarwić skrawki 1% roztworem amoniaku przez 1 minutę, a następnie umyć 3x po 1 min za pomocą ddH2O.
  4. Następnie zabarwić próbki roztworem barwiącym eozynę przez 1 minutę, a następnie umieścić je w 95% etanolu i 100% etanolu na 1 minutę każda. Na koniec potraktuj skrawki ksylenem IV przez 1 minutę.
  5. Wysuszyć skrawki na powietrzu, wkleić kroplę neutralnej żywicy na próbki na szkiełkach i przykryć je szkiełkiem nakrywkowym. Następnie wykonuj zdjęcia za pomocą pionowego mikroskopu fluorescencyjnego w jasnym polu przy powiększeniu 5x i 20x.

8. Safranina O-szybkie zielone barwienie

  1. Umieść wybrane sekcje w inkubatorze o temperaturze 60 °C i piecz je przez 40-50 minut. Następnie odparafinuj skrawki ksylenem I, II i III odpowiednio przez 15 minut, 15 minut i 10 minut.
  2. Odparafinowane skrawki należy umieścić w 100% etanolu I, II, 90% etanolu i 80% etanolu odpowiednio na 3 minuty, 3 minuty, 5 minut i 5 minut. Następnie myj skrawki preparatem ddH2O przez 5 minut.
  3. Po namoczeniu hematoksyną przez 1 minutę umyć skrawki ddH2O, aż staną się bezbarwne. Namocz skrawki w 1% roztworze do różnicowania kwasów etylowych przez 30 s i myj je 3x przez 1 min z ddH2O. Następnie zabarwić skrawki 1% roztworem amoniaku przez 1 min i umyć je 3x po 1 min za pomocą ddH2O.
  4. Namocz skrawki w 0,05% fast green przez 2 minuty, a następnie namocz je w 1% roztworze kwasu octowego przez 30 s i w 0,1% safraninie przez 5 minut. Umieść wybarwione próbki w 95% etanolu i 100% etanolu na 1 minutę, jedna po drugiej.
  5. Na koniec potraktuj skrawki ksylenem IV przez 1 minutę. Wysusz skrawki na powietrzu, wklej kroplę neutralnej żywicy na próbki na szkiełkach i przykryj je szkiełkiem nakrywkowym. Następnie wykonuj zdjęcia za pomocą pionowego mikroskopu fluorescencyjnego w jasnym polu przy powiększeniu 5x i 20x.

9. Immunohistochemia

  1. Dzień 1: Umieść wybrane skrawki w inkubatorze o temperaturze 60 °C, piecz je przez 40-50 minut, a następnie odwoskuj je ksylenem I, II i III odpowiednio przez 15 minut, 15 minut i 10 minut. Odparafinowane skrawki należy umieścić w 100% etanolu I, II, 90% etanolu i 80% etanolu odpowiednio na 3 minuty, 3 minuty, 5 minut i 5 minut. Następnie myj skrawki ddH2O przez 5 minut, za pomocą pisaka histochemicznego zakreśl obszar próbki i umieść je w ciemnym pudełku.
  2. Pobieranie antygenu: Wrzuć 20-50 μl 0,25% trypsyny do zakreślonego obszaru próbki, inkubuj w inkubatorze o temperaturze 37 °C przez 60 minut, a następnie myj próbki 3x przez 2 minuty każda za pomocą PBS. Zablokować endogenną peroksydazę przez dodanie 3%H2O2, inkubować próbki przez 10 minut w temperaturze pokojowej w ciemności, a następnie myć je 3x po 2 minuty za pomocą PBS. Wykonać blokowanie surowicy, dodając 10% surowicy koziej w temperaturze pokojowej przez 20 minut, a następnie inkubować z przeciwciałem pierwszorzędowym (mysim kolagenem anty-mysim typu II, rozcieńczonym 1000 razy) w temperaturze 4 °C przez noc.
  3. Dzień 2: Podgrzej skrawki w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Odzyskaj przeciwciało pierwszorzędowe i przemyj skrawki 3x po 2 minuty każdy PBS. Inkubować z przeciwciałem drugorzędowym przez 40 minut w inkubatorze w temperaturze 37 °C, a następnie przemywać skrawki 3 razy przez 2 minuty każda PBS.
  4. Wywoływanie koloru DAB: Dodaj 5 ml ddH2O, dwie krople buforu, cztery krople DAB i dwie krople H2O2 , aby przygotować odczynnik DAB. Dodać 20-50 μl odczynnika do sekcji, chronić próbki przed światłem przez 5 minut, a następnie myć skrawki przez 2 minuty ddH2O.
  5. Po namoczeniu hematoksyną przez 1 minutę umyć skrawki ddH2O, aż staną się bezbarwne. Namocz skrawki w 1% roztworze do różnicowania kwasów etylowych przez 30 s i umyj je 3x po 1 min za pomocą ddH2O. Zabarwij skrawki przez 1 min 1% roztworem amoniaku, a następnie umyj je 3x po 1 min ddH2O.
  6. Następnie umieść sekcje odpowiednio w 95% etanolu i 100% etanolu na 1 minutę każda. Na koniec inkubować skrawki przez 1 minutę z ksylenem IV. Wysuszyć skrawki na powietrzu, wkleić kroplę neutralnej żywicy na próbki na szkiełkach i przykryć je szkiełkiem nakrywkowym. Następnie wykonuj zdjęcia za pomocą pionowego mikroskopu fluorescencyjnego w jasnym polu przy powiększeniu 5x i 20x.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Analiza statystyczna danych korelacji została przeprowadzona przy użyciu narzędzi do analizy statystycznej online. Dane, które spełniły dwa testy rozkładu normalnego i jednorodności wariancji, wykorzystano do dalszej analizy statystycznej za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji. Jeśli dane nie spełniały obu testów, do analizy statystycznej stosowano test Kruskala-Wallisa. Dane są wyrażone jako średnia ± odchylenia standardowego (SD), a p < 0,05 uznano za statystycznie istotne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym badaniu z powodzeniem skonstruowano dwa mysie modele niestabilności ASCJ poprzez transektację CL + ATFL lub CL + DL. Czas przejścia myszy przez równoważnię znacznie się wydłużył po 8 tygodniach i 12 tygodniach od operacji, co jest podobne do wyników uzyskanych przez zespół Hubbarda-Turnera poprzez przecięcie więzadła bocznego stawu skokowego23,24. W teście ślizgania się prawej stopy zaobserwowaliśmy, że czasy ślizgania się dwóch grup myszy z zerwanymi więza...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Żaden z autorów nie ma sprzecznych interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez program stypendialny rządu prowincji Jiangsu oraz Priorytetowy Program Rozwoju Akademickiego Instytucji Szkolnictwa Wyższego w Jiangsu (PAPD).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
5-0 Chirurgiczny szew nylonowyNingbo Medical Needle Co., Ltd.
Kwaśny roztwór do różnicowania etanolu (1%)Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd.R20778
Szkiełka samoprzylepneJiangsu Shitai Company
Roztwór amoniaku (1%)Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd.R20788
Bezwodny etanolShanghai Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd.
Wodny roztwór kwasu octowego (1%)Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd.R20773
kaseta sześciennaShanghai Yizhe Instrument Co., Ltd.
Probówka wirówkowa 15mlBeijing Soleibo Technology Co., Ltd.YA0476
Probówka wirówkowa 50mlBeijing Soleibo Technology Co., Ltd.YA0472
Szkło osłonoweJiangsu Shitai Company
Oprogramowanie CTAnNiebieskie naukoweoprogramowanie do analizy mikro-tomografii komputerowej
Oprogramowanie DataviewInstrumenty AEMC Oprogramowaniedo analizy danych komercyjnych
Etylenodiaminotetraoctan disodowy (EDTA-2Na)Beijing Soleibo Technology Co., Ltd.E8490
Inkubator elektrycznySuzhou Huamei Equipment Factory
Osadzanie parafinyLeica, Niemcy39001006
Roztwór do barwienia Eosin (rozpuszczalny w alkoholu, 1%)Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd.R30117
Szybki roztwór do barwienia na zielonoSigma-Aldrich, USAF7275
Papier do choduBaoding Huarong Paper Factory
GraphPad Prism 8.0OprogramowanieGraphpad Narzędzia do analizy statystycznej online
Waciki jodoforoweQingdao Hainuo Bioengineering Co., Ltd.
Leica 818 bladeLeica, Niemcy
Micro-CTSkyscan, BelgiaSkyScan 1176
Mikroskop mikromanipulacyjnySuzhou Omet Optoelectronics Co., Ltd.
Oprogramowanie naśladująceMaterialise Oprogramowanie do przetwarzania obrazów medycznych 3D 
Zmodyfikowana barwie hematoksyliny HarrisShanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd.R20566
Mysi kolagen przeciw myszom typu IIAmerican Abcam Company
NaOHShanghai Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd.
N-butanolShanghai Sinopharm Group Odczynnik chemiczny Co., Ltd.
Neutralny utrwalacz formaliny (10%)Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd.
Żywica neutralnaSigma-Aldrich, USA
Oprogramowanie do rekonstrukcji Nrecon Micro Photonics Inc.
Maszynka do strzyżenia włosów OaksGroup Co., Ltd.
Maszyna do zatapiania parafinyLeica, Niemcy
Miernik pHShanghai Leitz Company
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)American Biosharp
Sól fizjologiczna (dla ssaków, sterylna)Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd.R22172
Safranin O-barwiącySigma-Aldrich, USAHT90432
Sól fizjologiczna (0,9%)Shanghai Baxter Medical Drug Co., Ltd.
ShakerHaimen Qilin Bell Instrument Manufacturing Co., Ltd.
SPSS 23Narzędzia do analizy statystycznejonline IBM
TabletkarkaLeica, Niemcy
Krajalnica do tkanekLeica, Niemcy
Ugo BasileUgo Basile Biological Research Company
Pionowy mikroskop fluorescencyjnyZeiss Axiovert, Niemcy
Kanał z tworzywa sztucznego w kształcie litery UShanghai Yizhe Instrument Co., Ltd.
Weterynaryjna maść do oczuPfizer
XyleneShanghai Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd.
YLS-10B Tester zmęczenia kółJinan Yiyan Technology Development Co., Ltd.
191104 roztwór 3091072008779

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Waterman, B. R., Belmont, P. J. Jr, Cameron, K. L., Deberardino, T. M., Owens, B. D. Epidemiology of ankle sprain at the United States Military Academy. American Journal of Sports Medicine. 38 (4), 797-803 (2010).
  2. Fong, D. T., Chan, Y. Y., Mok, K. M., Yung, P. S., Chan, K. M. Understanding acute ankle ligamentous sprain injury in sports. Sports Medicine Arthroscopy Rehabilitation Therapy & Technology. 1 (1), 14(2009).
  3. Herzog, M. M., Kerr, Z. Y., Marshall, S. W., Wikstrom, E. A. Epidemiology of ankle sprains and chronic ankle instability. Journal of Athletic Training. 54 (6), 603-610 (2019).
  4. Medina McKeon, J. M., Hoch, M. C. The ankle-joint complex: A kinesiologic approach to lateral ankle sprains. Journal of Athletic Training. 54 (6), 589-602 (2019).
  5. Jones, M. H., Amendola, A. S. Acute treatment of inversion ankle sprains: immobilization versus functional treatment. Clinical Orthopaedics and Related Research. 455 (463), 169-172 (2007).
  6. Anandacoomarasamy, A., Barnsley, L. Long term outcomes of inversion ankle injuries. British Association of Sport and Medicine. 39 (3), 14(2005).
  7. Ringleb, S. I., Dhakal, A., Anderson, C. D., Bawab, S., Paranjape, R. Effects of lateral ligament sectioning on the stability of the ankle and subtalar joint. Journal of Orthopaedic Research. 29 (10), 1459-1464 (2011).
  8. Mittlmeier, T., Wichelhaus, A. Subtalar joint instability. European Journal of Trauma and Emergency Surgery. 41 (6), 623-629 (2015).
  9. Barg, A., et al. Subtalar instability: Diagnosis and treatment. Foot & Ankle International. 33 (02), 151-160 (2012).
  10. Liu, P., et al. A mouse model of ankle-subtalar joint complex instability induced post-traumatic osteoarthritis. Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 16 (1), 541(2021).
  11. Lui, T. H. Modified arthroscopic Brostrom procedure with bone tunnels. Arthroscopy Techniques. 5 (4), 775-780 (2016).
  12. Wang, W., Xu, G. H. Allograft tendon reconstruction of the anterior talofibular ligament and calcaneofibular Ligament in the treatment of chronic ankle instability. BMC Musculoskeletal Disorders. 18 (1), 150(2017).
  13. Yang, N., Waddington, G., Adams, R., Han, J. Age-related changes in proprioception of the ankle complex across the lifespan. Journal of Sport and Health Science. 8 (6), 548-554 (2019).
  14. Michels, F., et al. Searching for consensus in the approach to patients with chronic lateral ankle instability: Ask the expert. Knee Surgery Sports Traumatology Arthroscopy. 26 (7), 2095-2102 (2017).
  15. Kamada, K., Watanabe, S., Yamamoto, H. Chronic subtalar instability due to insufficiency of the calcaneofibular ligament: A case report. Foot & Ankle International. 23 (12), 1135-1137 (2002).
  16. Kato, T. The diagnosis and treatment of instability of the subtalar joint. The Journal of Bone and Joint Surgery. 77 (3), 400-406 (1995).
  17. Meyer, J. M., Garcia, J., Hoffmeyer, P., Fritschy, D. The subtalar sprain. A roentgenographic study. Clinical Orthopaedics and Related Research. (226), 169-173 (1988).
  18. Mittlmeier, T., Rammelt, S. Update on subtalar joint instability. Foot and Ankle Clinics. 23 (3), 397-413 (2018).
  19. Chang, S. H., et al. Comparison of mouse and human ankles and establishment of mouse ankle osteoarthritis models by surgically-induced instability. Osteoarthritis & Cartilage. 24 (4), 688-697 (2016).
  20. Naito, K., et al. Evaluation of the effect of glucosamine on an experimental rat osteoarthritis model. Life Sciences. 86 (13-14), 538-543 (2010).
  21. Pritzker, K. P. H., et al. Osteoarthritis cartilage histopathology: Grading and staging. Osteoarthritis Cartilage. 14 (1), 13-29 (2006).
  22. Glasson, S. S., et al. The OARSI histopathology initiative - Recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the mouse. Osteoarthritis and Cartilage. 18, Suppl 3 17-23 (2010).
  23. Hubbard-Turner, T., Wikstrom, E. A., Guderian, S., Turner, M. J. Acute ankle sprain in a mouse model. Medicine & Science in Sports & Exercise. 45 (8), 1623-1628 (2013).
  24. Wikstrom, E. A., Hubbard-Turner, T., Guderian, S., Turner, M. J. Lateral ankle sprain in a mouse model: Lifelong sensorimotor dysfunction. Journal of Athletic Training. 53 (3), 249-254 (2018).
  25. Bell-Krotoski, J. A., Fess, E. E., Figarola, J. H., Hiltz, D. Threshold detection and Semmes-Weinstein monofilaments. Journal of Hand Therapy. 8 (2), 155-162 (1995).
  26. Wieland, H. A., Michaelis, M., Kirschbaum, B. J., Rudolphi, K. A. Osteoarthritis - An untreatable disease. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (4), 331-344 (2005).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Niestabilno stawu podskokowegomodel stawu u myszyprzeci cie wi zadetest belki r wnowagianaliza odcisku stopynocycepcja termicznamikrotomografia komputerowa Micro CTbarwienie chrz stki stawowejmodel choroby zwyrodzia ej staw w u myszyuraz wi zade stopy tylnej

Powiązane artykuły