Artykuł metodologiczny

Model Gut-on-A-Chip do badania osi mikrobiom jelitowy i układu nerwowego

4.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64483

⸱

28 lipca 2023

 ,  ,  ,  , 
1Luxembourg Centre for Systems Biomedicine, University of Luxembourg, 2Department of Life Sciences and Medicine, Faculty of Science, Technology and Medicine, University of Luxembourg

W tym artykule

Podsumowanie

neuroHuMiX to zaawansowany model jelita na chipie do badania interakcji komórek bakteryjnych, nabłonkowych i neuronalnych w proksymalnych i reprezentatywnych warunkach wspólnej hodowli. Model ten pozwala na rozwikłanie mechanizmów molekularnych leżących u podstaw komunikacji między mikrobiomem jelitowym a układem nerwowym.

Streszczenie

Ciało ludzkie jest skolonizowane przez co najmniej taką samą liczbę komórek mikrobiologicznych, jak składa się z komórek ludzkich, a większość tych mikroorganizmów znajduje się w jelitach. Chociaż wzajemne oddziaływanie między mikrobiomem jelitowym a gospodarzem zostało szeroko zbadane, sposób, w jaki mikrobiom jelitowy oddziałuje z jelitowym układem nerwowym, pozostaje w dużej mierze nieznany. Do tej pory nie istnieje fizjologicznie reprezentatywny model in vitro do badania interakcji mikrobiomu jelitowego z układem nerwowym.

Aby wypełnić tę lukę, rozwinęliśmy model przesłuchu ludzko-mikrobiologicznego (HuMiX) jelita na chipie, wprowadzając do urządzenia indukowane pluripotencjalne neurony jelitowe pochodzące z komórek macierzystych. Powstały w ten sposób model "neuroHuMiX" umożliwia kohodowlę komórek bakteryjnych, nabłonkowych i neuronalnych w kanałach mikroprzepływowych, oddzielonych półprzepuszczalnymi błonami. Pomimo separacji różnych typów komórek, komórki mogą komunikować się ze sobą za pośrednictwem rozpuszczalnych czynników, zapewniając jednocześnie możliwość badania każdego typu komórek z osobna. Ta konfiguracja pozwala na pierwszy wgląd w to, jak mikrobiom jelitowy wpływa na komórki neuronów jelitowych. Jest to kluczowy pierwszy krok w badaniu i zrozumieniu osi mikrobiomu jelitowego człowieka i układu nerwowego.

Wprowadzenie

Mikrobiom jelitowy człowieka odgrywa kluczową rolę w zdrowiu i chorobie człowieka. Był intensywnie badany przez ostatnie półtorej dekady, a jego potencjalna rola w modulowaniu zdrowia i choroby została już ustalona1. Postuluje się, że zaburzenie mikrobiomu prowadzące do niezrównoważonej społeczności drobnoustrojów (dysbiozy) jest zaangażowane w patogenezę wielu przewlekłych zaburzeń, takich jak otyłość, nieswoiste zapalenie jelit i rak jelita grubego, a nawet choroby neurodegeneracyjne, takie jak choroba Parkinsona2,3.

Chociaż mikrobiom jelitowy człowieka jest związany ze schorzeniami neurologicznymi, nadal nie jest jasne, w jaki sposób mikrobiom jelitowy komunikuje się z jelitowym układem nerwowym i wpływa na niego. Ponieważ ludzki jelitowy układ nerwowy nie jest łatwo dostępny do natychmiastowego badania, do tej pory w eksperymentach wykorzystano modele zwierzęce4. Biorąc jednak pod uwagę widoczne różnice między modelami zwierzęcymi a ludzkimi5, rozwój modeli in vitro naśladujących ludzkie jelita jest natychmiastowym zainteresowaniem. W tym kontekście, rozwijająca się i rozwijająca się dziedzina ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) pozwoliła nam uzyskać reprezentatywne neurony jelitowe (ENs)6. EN pochodzące z iPSC pozwalają na badanie jelitowego układu nerwowego w modelach hodowli in vitro, takich jak wkładki do hodowli komórkowych, organoidy lub narządy na chipie7,8.

Model przesłuchu ludzko-mikrobiologicznego (HuMiX) to model jelita na chipie, naśladujący ludzki <[>gut9. Początkowy model HuMiX (zwany dalej urządzeniem początkowym) zawierał komórki nabłonkowe (Caco-2) i komórki bakteryjne10,11. Jednakże, aby zbadać związek między mikrobiomem jelitowym a układem nerwowym, do systemu wprowadzono również ENs6 pochodzące z iPSC (Rysunek 1). Proksymalna kokultura komórek neuronalnych, nabłonkowych i bakteryjnych umożliwia indywidualną analizę różnych typów komórek i badanie interakcji między różnymi typami komórek w środowisku naśladującym ludzkie jelito.

W ostatnich latach poczyniono postępy w rozwoju modeli do badania narządów w bardziej fizjologicznie reprezentatywny sposób, używając modeli organów na chipie (np. gut-on-a-chip). Modele te są bardziej reprezentatywne dla środowiska jelitowego człowieka ze względu na ciągłe dostarczanie składników odżywczych i usuwanie odpadów, a także monitorowanie w czasie rzeczywistym, na przykład poziomu tlenu lub integralności bariery8,12. Modele te umożliwiają w szczególności badanie wpływu bakterii jelitowych na komórki gospodarza. Jednak, aby móc wykorzystać narządy na chipie do badania wzajemnych powiązań między mikrobiomem jelitowym a układem nerwowym, komórki neuronalne muszą zostać zintegrowane z takimi systemami. W związku z tym celem dalszego rozwoju HuMiX i stworzenia systemu neuroHuMiX (zwanego dalej urządzeniem) było opracowanie modelu jelita na chipie, który obejmuje komórki neuronów jelitowych w proksymalnej kohodowli z komórkami nabłonka jelitowego i bakteriami.

Protokół

1. Hodowla komórkowa i sortowanie

  1. Indukowane pluripotencjalne neurony jelitowe pochodzące z komórek macierzystych
    UWAGA: Posiew iPSC na 6 tygodni przed rozpoczęciem biegu. Protokół różnicowania dla EN został zaadaptowany z Fattahi et al.6.
    1. Hodować iPSC na 6-dołkowej płytce pokrytej żelem matrycowym w 2 ml / basenik pożywki hodowlanej iPSC uzupełnionej 1% penicyliną-streptomycyną (P/S).
    2. Przy zbiegu 80%-90% przepasuj komórki, wysiewaj nasiona na płytce pokrytej żelem matrycowym przy użyciu tego samego podłoża, inkubuj w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i wilgotności względnej 90% (RH).
    3. W przypadku wyprowadzenia iPSC, po dwóch pasażach po rozmrożeniu, przy 80%-90% konfluencji, wysiewaj komórki na 6-dołkowej płytce pokrytej żelem matrycowym o gęstości 100 000 komórek/dołek. Inkubować w wyżej opisanej pożywce + inhibitor ROCK Y-27632 (1:2 000) przez 24 godziny w temperaturze 37 °C.
    4. Po upływie 24 godzin zastąpić pożywkę sklarowaną nad osadem pożywką dnia 0, zgodnie z tabelą 1. Dołączyć jedną studzienkę kontrolną, która ma być wykorzystana jako kontrola ujemna podczas sortowania komórek w procesie wyprowadzania. Utrzymuj kontrolę dobrze w składzie pożywki dnia 0 przez cały okres derywacji. Zmieniaj pożywkę co drugi dzień od 2 do 10 dnia, zgodnie z tabelą 1.
    5. W dniu 11 posortuj komórki pod kątem komórek CD49d-dodatnich, które zostaną użyte w kolejnych krokach tego protokołu.
      1. Połącz komórki do sortowania na podstawie komórek CD49d-dodatnich, a także studzienki kontrolnej. Odwirowywać komórki przez 3 minuty w temperaturze 300 × g. Zawiesić osad komórkowy w 2% albuminie surowicy bydlęcej (BSA) + 1% P / S w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
      2. Podziel każdą partię komórek (zbiorczą i kontrolną) na dwie części: wybarwić jedną frakcję przeciwciałem anty-ludzkim CD49d, a drugą frakcję przeciwciałem kontrolnym izotypu.
      3. Bramka polega na bramkowaniu głównej populacji komórek, a następnie bramkowaniu pojedynczych komórek, na podstawie których zostaną wybrane komórki prezentujące CD49d na swojej powierzchni. Zbierz te komórki do następnego etapu różnicowania.
        UWAGA: Zwykle 30%-40% posortowanych komórek jest CD49d-dodatnich.
    6. Przenieść od dwóch do czterech milionów posortowanych komórek na jedną 6-dołkową płytkę o bardzo niskim stopniu przylegania w pożywce N2B27 (patrz Tabela 2) + FGF2 + CHIR przez 4 dni, aby umożliwić tworzenie sferoidów.
    7. W dniu 15 ponownie pokryj sferoidy na 6-dołkowej płytce pokrytej poli-L-ornityną/lamininą/fibronektyną (P / L / F) w 2 ml / dołku pożywki N2B27 z GDNF i kwasem askorbinowym (AA). Wymieniaj pożywkę co 2-3 dni.
      UWAGA: Współczynnik powłoki: poli L-ornityna, 15 μg/ml; laminina, 2 μg/ml; fibronektyna, 2 μg/ml w 1x PBS.
    8. Po 3 tygodniach użyj komórek do zaszczepienia w urządzeniu.
  2. Caco-2
    UWAGA: Rozmrozić komórki Caco-2 co najmniej 1 tydzień przed biegiem.
    1. Wysiewać kolbę T75 z 1 ×10 6 komórkami Caco-2 w suplemencie glutaminy RPMI 1640 + HEPES + 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS); inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i 90% wilgotności względnej
      UWAGA: Do tych eksperymentów najlepiej użyć Caco-2 przy ich pierwszym lub drugim przejściu po rozmrożeniu.

2. Przygotowanie do biegu HuMiX

  1. Przygotowanie i powlekanie pokrywy z poliwęglanu
    1. Autoklawuj parę pokryw z poliwęglanu (PC) (Rysunek 2) wraz z czterema, korzystając z początkowego cyklu urządzenia (szczegóły w Tabeli 3).
    2. W komorze bezpieczeństwa biologicznego włóż cztery w każdym rogu dolnej pokrywy PC (patrz Rysunek 3) i przenieś na sterylną kwadratową szalkę Petriego w celu przeprowadzenia dwuetapowego procesu powlekania.
      1. Pierwszego dnia dodaj 2 ml 1,5% poli-L-ornityny w PBS (1x) na środku pokrywy PC. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i 90% wilgotności względnej.
      2. Następnego dnia usuń roztwór i zastąp go roztworem zawierającym 0,2% lamininy i 0,2% fibronektyny w PBS (1x), aby pokryć powierzchnię komory komórek nerwowych. Inkubować pokrywkę przez noc w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i 90% wilgotności względnej.
    3. Po inkubacji należy umieścić roztwór powlekający na pokrywie PC i zamknąć szalkę Petriego folią uszczelniającą. Umieścić je w temperaturze 4 °C do przechowywania do czasu użycia.
    4. Przed użyciem usuń roztwór powlekający i wysusz na powietrzu w komorze bezpieczeństwa biologicznego przez 30 minut, aż powłoka całkowicie wyschnie.
  2. Przygotowanie i powlekanie uszczelek
    UWAGA: W tej sekcji opisano, jak przygotować uszczelki poprzez przyklejenie membran półprzepuszczalnych do uszczelek silikonowych. Po wstępnym etapie autoklawowania uszczelki są powlekane kolagenem lub mucyną, aby umożliwić przyleganie komórek nabłonka jelitowego lub bakterii. Błona pokryta mucyną naśladuje barierę śluzową obecną w ludzkim jelicie.
    1. Przymocuj membranę poliwęglanową o wielkości porów 1 μm do uszczelki kolagenowej i membranę poliwęglanową o wielkości porów 50 nm pomiędzy dolną i górną uszczelką warstwową. Autoklawować uszczelki z dołączonymi membranami, korzystając z początkowego cyklu urządzenia (patrz Tabela 3).
    2. Aby pokryć membrany, umieść każdą uszczelkę w sterylnym kwadratowym naczyniu.
      UWAGA: Powlekanie odbywa się w sterylnych warunkach w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
      1. Do uszczelki kolagenowej dodać 3 ml kolagenu (50 μg/ml) do membrany i inkubować przez 3 godziny w temperaturze 37 °C.
        UWAGA: Uważaj, aby nie dotknąć membrany końcówką pipety podczas dodawania kolagenu, aby uniknąć uszkodzenia membrany.
      2. W celu nałożenia powłoki mucynowej umieść uszczelkę warstwową górną stroną z uszczelką do góry na szalce Petriego, aby pokryć górną stronę membrany 3 ml mucyny (0,025 mg/ml). Inkubować uszczelki w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
    3. Po czasie inkubacji odessać roztwory kolagenu i mucyny z odpowiednich uszczelek i wysuszyć membranę na powietrzu w komorze bezpieczeństwa biologicznego przez 30 minut. Zamknąć naczynia, uszczelnić laboratoryjną folią uszczelniającą i przechowywać uszczelki w temperaturze 4 °C do czasu użycia.
  3. Zespół przewodów
    UWAGA: W tej sekcji opisano, jak zmontować rurkę do perfuzji urządzenia. Przed montażem należy przelać wszystkie elementy w autoklawie i/lub kupić te, które są pakowane pojedynczo w sterylne opakowanie. Umieść wszystkie elementy w szafie bezpieczeństwa biologicznego.
    1. Stosować trzy rurki dla każdego urządzenia i dla każdej rurki jedną sztukę przewodu pompy, dwa kawałki długich przewodów Marprene (20 cm), dwa kawałki krótkich przewodów Marprene (8 cm), jedną igłę 40 mm do butelki odpływowej, jedną igłę 120 mm do butelek dopływowych 250 ml lub igłę 80 mm do mniejszych butelek dopływowych, trzy męskie i siedem żeńskich złączy Luer do zadziorów, trzy adaptery Luer i dwa trójdrogowe zawory odcinające.
    2. Zmontuj przewody rurowe od lewej do prawej, używając autoklawowanych i sterylizowanych komponentów wymienionych powyżej (Rysunek 4).
      UWAGA: Spryskaj każdy element 70% etanolem między każdym etapem połączenia.
  4. Przygotowanie podłoża
    UWAGA: W tej sekcji opisano, jak przygotować pożywkę dla różnych typów komórek w urządzeniu, a także jak przenieść pożywkę do butelek z surowicą w sterylny sposób.
    1. Uzupełnij RPMI 1640 o 10% filtrowany 0,22 μm, inaktywowany termicznie FBS. Uzupełnij pożywkę N2B27 świeżo o GDNF i AA.
    2. Przenieść pożywkę do butelek z surowicą w sterylnych warunkach. Przenieś 200 ml pożywki RPMI 1640 do butelek o pojemności 250 ml i 30 ml pożywki N2B27 do butelek o pojemności 50 ml.
      1. Przygotuj pożywkę bakteryjną (RPMI 1640 + 10% FBS + 5% pożywki hodowlane De Man, Rogosa i Shapre [MRS]) na późniejszym etapie, ponieważ jest to wymagane tylko podczas ostatnich 24 godzin eksperymentu.
      2. Zamknij butelki przegrodą, zaciśnij je aluminiowie i autoklaw.
      3. Aby przenieść media, należy usunąć aluminiowe zaciskanie za pomocą odpowiedniego odkręcacza (średnica = 20 mm). Usuń również przegrodę. Ostrożnie wlej przygotowane podłoże do butelek z serum, nie dotykając butelki.
    3. Aby wysterylizować, podpal otwór butelki za pomocą przenośnego palnika Bunsena. Uszczelnij butelki, spryskując przegrodę 70% etanolem, dodając go do butelki i zamykając aluminiowym zaciskiem za pomocą zaciskarki do uszczelek.
    4. Umieścić zamknięte butelki w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 24 godziny, aby podgrzać podłoże do 37 °C, a także upewnić się, że nie ma widocznych oznak zanieczyszczenia przed użyciem butelek z pożywką do urządzenia.

3. Początek HuMiX

  1. Montaż NeuroHuMiX
    UWAGA: W tej sekcji wyjaśniono, jak złożyć urządzenie. Krótko mówiąc, system zaciskowy jest sterylizowany i ponownie dokręcany, po czym dolna pokrywa PC jest umieszczana na podstawie zacisku. Następnie powlekane uszczelki i górne pokrywy PC są układane jedna na drugiej, a następnie górna część zacisku. Na koniec zacisk jest dokręcany, aby ścisnąć uszczelki i sprawić, że system będzie szczelny i gazoszczelny. Rysunek 4 przedstawia różne części potrzebne do montażu.
    1. Autoklaw clamps i dwie pokrywy PC (górna i dolna) przed montażem.
    2. Dokręć używane do montażu górnej i dolnej części zacisku (Rysunek 4C,D). Otwórz przed procesem autoklawowania i dokręć je ponownie później.
    3. Przenieś pokrytą i wysuszoną (krok 2.2.3) dolną pokrywę PC (Rysunek 4 A1) z kwadratowej szalki Petriego na górę podstawy zacisku, przytrzymując cztery w rogach pokrywy PC.
      UWAGA: Unikaj dotykania pokrywy komputera, aby zmniejszyć ryzyko zanieczyszczenia.
    4. Umieść uszczelkę komory nabłonkowej skierowaną do góry (tj. z membraną na górze) na pokrywie komputera za pomocą sterylnej pęsety. Użyj, aby wyrównać uszczelkę i pokrywę PC, aby upewnić się, że porty wlotowe i wylotowe w rogach pokrywy są wyrównane z otworami w uszczelce (Rysunek 3).
    5. Za pomocą sterylnej pęsety umieść uszczelkę typu sandwich na uszczelce kolagenowej, górną stroną skierowaną do góry.
    6. Umieść górną pokrywę komputera na uszczelce wielowarstwowej. Aby zmniejszyć ryzyko zanieczyszczenia, należy to zrobić, dotykając tylko krawędzi pokrywy (nie dotykaj górnej ani dolnej części pokrywy). Upewnij się, że zadziory na clamp pokrywa jest wyrównana z otworem wlotowym i wylotowym w zespole membrany oraz że z dolnej pokrywy PC pasują do otworu górnej pokrywy PC.
    7. Aby zamknąć urządzenie, umieść clamp pokrywa (górna część clamp) na górze pokrywy komputera. Upewnij się, że otwory pokrywy pokrywają się z króćcami wlotowymi i wylotowymi górnej pokrywy PC. Zamknij zatrzaski. Trzymaj zamknięte urządzenie (Rysunek 5) pod maską, aby podłączyć je do zagruntowanych przewodów rurowych (krok 3.2.6).
  2. Gruntowanie przewodów rurowych
    UWAGA: W tej sekcji opisano, jak podłączyć rurkę do butelek wlotowych i odpływowych, a także do pompy, a następnie zalać rurkę medium w celu usunięcia wszelkich pozostałości produktów używanych podczas czyszczenia i sterylizacji oraz upewnić się, że w rurce nie ma pęcherzyków.
    1. Gruntowanie przewodów rurowych odbywa się w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Umieść igły napowietrzające z filtrami w przegrodzie każdej butelki dopływowej i odpływowej. Za pomocą czystej, sterylnej pęsety włóż igły 120 mm do butelek z surowicą o pojemności 250 ml. Umieścić igły o średnicy 80 mm w butelkach z surowicą o pojemności 50 ml.
    2. Włożyć igły o średnicy 40 mm na końcu każdej rurki do butelki z surowicą odpływową. Na każde urządzenie przypadają dwie butelki odpływowe dla trzech przewodów rurowych. 40-milimetrowe igły przewodów nabłonkowych i neuronalnych są połączone z tą samą butelką odpływową w celu wyrzucenia pożywki. Przewód rurki bakteryjnej przechodzi do drugiej butelki odpływowej.
    3. Włóż przewody rurkowe pompy do kaset pompy. Upewnij się, że wszystkie trójdrogowe zawory odcinające przewodów rurowych są otwarte.
    4. Na początku należy ustawić pompę perystaltyczną tak, aby kierowała media z dopływu do butelki odpływowej z prędkością 5 obr./min (patrz tabela 4).
      UWAGA: Podczas zalewania przewodów rurowych prędkość można zwiększyć do 10 obr./min, aby przyspieszyć proces.
    5. Uruchom pompę, naciskając przycisk start i upewnij się, że kierunek pompowania jest zgodny z ruchem wskazówek zegara. Gdy media wpadną do butelek odpływowych, upewnij się, że nie ma wycieków i nie pozostały pęcherzyki powietrza w przewodach rurowych i punktach połączeń. Usuń wszelkie pozostałe pęcherzyki, stukając w rurki i złącza lub zwiększając prędkość pompy.
    6. Gdy wszystkie przewody rurowe wpadają do butelek odpływowych, ustaw natężenie przepływu na 2 obr./min w celu podłączenia urządzenia początkowego.
  3. Gruntowanie urządzenia
    UWAGA: W tej sekcji opisano, jak zalać urządzenie pożywką do hodowli komórkowych, aby upewnić się, że wszystkie komory są wypełnione i wstępnie pokryte pożywką, tak aby w systemie nie pozostały żadne pęcherzyki, a komórki mogły łatwo przylegać podczas inokulacji.
    1. Napełnianie urządzenia odbywa się w komorze bezpieczeństwa biologicznego w sterylnych warunkach. Aby podłączyć urządzenie, zacznij od połączenia linii neuronalnej, dolnej komory urządzenia.
    2. Aby podłączyć przewód, zamknij trójdrogowe zawory odcinające (Rysunek 5C), zaczynając najpierw od strony odpływowej, gdzie krótka rurka jest odłączana od żeńskiego złącza Luer i podłączana do portu wylotowego z urządzenia, przesuwając rurkę nad zadziorem. Aby zapewnić prawidłowe połączenie i zmniejszyć ryzyko wycieków i/lub zanieczyszczenia, upewnij się, że rurka styka się z pokrywą, wciskając ją całkowicie w dół nad złączem. Podłącz rurkę dopływową w ten sam sposób. Gdy jedna linia jest całkowicie podłączona do urządzenia (dopływ i odpływ), otwórz zawory trójdrogowe.
    3. Powtórz poprzedni krok z linią nabłonka, a następnie z linią bakteryjną. Utrzymuj pompę na poziomie 2 obr./min. Zwiększ prędkość pompy do 2,5 obr./min, ale nie wyżej, aby uniknąć wycieków spowodowanych wzrostem ciśnienia. Pozwól pompie zalać komory w urządzeniu.
    4. Przez cały czas monitoruj butelki z surowicą odpływową. Jeśli pęcherzyki powietrza utkną w komorach, przewodach lub łączniku, przewód rurowy z pęcherzykiem powietrza w środku nie będzie już opadał do komory odpływowej. Aby pozbyć się pęcherzyków powietrza, najpierw pozwól urządzeniom pracować przez kilka minut. Jeśli to nie rozwiąże problemu, zamknij jedną z pozostałych linii, które spadają na krótki czas, zamykając trójdrogowy zawór odcinający odpływu.
    5. Gdy wszystkie komory urządzenia zostaną całkowicie zalane - wszystkie komory zostaną wypełnione pożywką do hodowli komórkowych i w urządzeniu nie pozostaną żadne pęcherzyki - zmniejsz prędkość pompy do 0,5 obr./min. Urządzenie jest teraz gotowe do inokulacji komórkowej.

4. Przygotowanie i inokulacja komórek

UWAGA: Ta sekcja opisuje, jak przygotować różne typy komórek potrzebnych do zaszczepienia urządzenia, a także jak zaszczepić je w urządzeniu w sterylny sposób i bez wprowadzania pęcherzyków powietrza. Ponadto opisano, jak przeprowadzić odświeżenie pożywki dla komórek nerwowych oraz jak przygotować pożywkę do hodowli bakteryjnej w urządzeniu.

  1. Komórki nabłonkowe
    1. Odłączyć komórki Caco-2 od kolby za pomocą kwasu trypsyna-etylenodiaminotetraoctowego (EDTA), ponownie zawiesić w RPMI 1640 + 10% FBS i policzyć w liczniku komórek Neubauera przy użyciu testu wykluczania błękitu trypanowego. Odwirować zawiesinę komórek Caco-2 (3 min, 300 × g) i wyrzucić supernatant w celu usunięcia pozostałej trypsyny-EDTA. Ponownie zawiesić komórki Caco-2 w RMPI 1640 + 10% FBS, aby uzyskać zawiesinę 350 000 komórek/ml. Dla każdego urządzenia potrzebna jest objętość 1,5 ml.
    2. Przenieść 1,5 ml zawiesiny komórek Caco-2 do sterylnej strzykawki o pojemności 2 ml i usunąć powietrze lub pęcherzyki, które pozostały w strzykawce.
    3. Zamknąć trójdrogowe zawory odcinające przewodów komór bakteryjnych i neuronalnych. Odłącz rurki komór bakteryjnych i neuronalnych od pompy, wyjmując kasety z odpowiednimi rurkami z wirnika.
    4. Otwórz nakrętkę trójdrogowego zaworu odcinającego rurki dopływowej prowadzącej do komory nabłonkowej i przekręć trójdrogowy zawór odcinający, aby przekierować przepływ medium z urządzenia do "otwartego złącza" (Rysunek 5C). Pozwól medium płynąć, aż kropla medium pojawi się na otwartym końcu trójdrogowego zaworu odcinającego.
    5. Włożyć strzykawkę zawierającą komórki nabłonka do "otwartego łącznika" metodą połączenia kropla-kropla, aby umożliwić włożenie strzykawki do łącznika bez wprowadzania pęcherzyków powietrza. Przekręcić zawór trójdrogowego zaworu odcinającego, aby zatrzymać przepływ medium z butelki dopływowej (przez pompę) i umożliwić przepływ z podłączonej strzykawki do urządzenia początkowego. Odłącz kanał nabłonkowy od pompy.
    6. Powoli nacisnąć strzykawkę, aby zaszczepić komorę nabłonkową zawiesiną komórkową. Upewnij się, że około jedna kropla na 3 sekundy wpada do butelki odpływowej.
    7. Dodać 1,5 ml zawiesiny komórek, a następnie zamknąć zawór trójdrogowego zaworu odpływowego. Odłączyć strzykawkę i zamknąć otwarty koniec zaworu trójdrogowego za pomocą nakrętki. Trzymaj komorę zamkniętą przez co najmniej 2 godziny. W międzyczasie zaszczepij komórki neuronalne.
  2. Komórki neuronalne
    1. Odłącz komórki nerwowe od studzienki, ponownie zawieszając komórki w pożywce z odpowiednich studzienek za pomocą pipety. Zaszczepić każde urządzenie w pełni zlewającymi się komórkami z jednego dołka (9,6 cm2) z płytki 6-dołkowej.
    2. Zawiesić osad komórkowy w odpowiedniej objętości pożywki N2B27 (1,5 ml pożywki na urządzenie) + 1 μl fibronektyny/ml zawiesiny komórek. Przenieść 1,5 ml zawiesiny zawieszonych komórek do strzykawki o pojemności 2 ml i usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza, które pozostały w strzykawce. Umieść napełnioną strzykawkę w sterylnej stożkowej probówce o pojemności 50 ml i przenieś do szafki bezpieczeństwa biologicznego zawierającej zalany aparat HuMiX.
    3. Postępuj zgodnie z tym samym procesem inokulacji, jak opisano wcześniej dla inokulacji komory nabłonkowej, z wyjątkiem zmiany linii rurki. W tym miejscu odłącz przewody rurki bakteryjnej i nabłonkowej od pompy.
    4. Po inokulacji komórek nerwowych zamknij wszystkie trójdrogowe zawory odcinające przewodów rurowych i odłącz od pompy. Umieścić urządzenie w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Trzymaj wszystkie kanały zamknięte przez 2 godziny, aby umożliwić przyczepienie się komórek.
    5. Po 2 godzinach podłączyć kanały bakteryjne i nabłonkowe do pompy i otworzyć trójdrogowe zawory dopływowe i odpływowe obu przewodów. Utrzymuj komorę neuronalną zamkniętą przez najbliższe 14 dni od pierwszego uruchomienia urządzenia, z wyjątkiem okresu zmiany pożywki.
    6. W ciągu 14 dni należy zmieniać podłoże komory neuronalnej co 3-4 dni. Aby uzyskać odświeżenie, przygotuj 3 ml świeżej pożywki N2B27 na urządzenie i przenieś do sterylnej butelki z surowicą o pojemności 20 ml. Zamknij butelkę serum z pożywką za pomocą sterylnej przegrody i aluminiowej uszczelki zaciskanej.
    7. Włożyć igłę napowietrzającą i igłę 80 mm do przegrody nowej butelki. Wymień starą butelkę z pożywką na nową w inkubatorze, odłączając męski Luer od igły starej butelki do igły nowej butelki.
    8. Podłącz kasetę z rurką pompy komory neuronalnej do pompy i otwórz trójdrogowe zawory odcinające. Pozwól mediom płynąć z prędkością 0,5 obr./min przez 2 godziny, zanim zamkniesz trójdrożne zawory odcinające rurki neuronalnej i odłączysz od pompy, aż do następnej wymiany medium.

5. Hodowla bakterii i inokulacja

UWAGA: W tym badaniu, w dniu 12, płynna kultura Limosilactobacillus reuteri szczep F275 została ożywiona z zapasu glicerolu. W zależności od potrzeb lub projektów badań można stosować inne gatunki bakterii.

  1. Przygotuj trzy probówki z 5 ml bulionu MRS - jedną sterylną probówkę kontrolną i dwie do inokulacji L. reuteri. Za pomocą pętli do zaszczepiania zeskrob górną część bulionu glicerolowego i przenieś go do jednej probówki. Powtórzyć z drugą probówką do zaszczepiania. Inkubować probówki w temperaturze 37 °C, 170 obr./min przez noc.
    UWAGA: Nie pozwól, aby bulion glicerolu rozmroził się.
  2. Przygotuj świeżą pożywkę dla początkowych urządzeń, mieszając Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 + 10% FBS z 5% bulionem MRS. Przygotować 25 ml na urządzenie i przenieść do butelek z surowicą o pojemności 100 ml w sterylnych warunkach. Zamknij butelki sterylną przegrodą i aluminiowym zaciskiem. Umieścić butelki w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez noc.
  3. Przed podłączeniem butelek do przewodu rurki bakteryjnej dodaj igłę napowietrzającą i igłę 80 mm do każdej butelki pożywki RPMI 1640/MRS.
  4. Przygotuj nowe probówki, każda z 3 ml bulionu RPMI 1640 + 10% FBS + 5% MRS. Przygotuj co najmniej dwie probówki, jedną kontrolną i jedną probówkę na urządzenie. Zaszczepić 15 μl nocnej hodowli L. reuteri (gęstość optyczna [OD] > 2) w dwóch nowo przygotowanych probówkach.
  5. Inkubować probówki przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C, 170 obr./min, po czym osiąga się OD 0,05-0,10, co odpowiada ~1 × 107 jednostek tworzących kolonie (CFU)/ml. Przenieść 1,5 ml do strzykawki o pojemności 2 ml (po jednej na urządzenie). Resztę zawiesiny bakteryjnej należy użyć do posiewu CFU i barwienia żywych/martwych.
  6. W przypadku inokulacji bakteryjnej urządzenia należy postępować zgodnie z tą samą procedurą, jak opisano w kroku 4.1, z tą różnicą, że tutaj linie cewy neuronalnej i nabłonkowej są zamknięte.
  7. Po zaszczepieniu zamknij również przewód rurki bakteryjnej, zamykając zawory i odłączając od pompy na 30 minut. Połącz przewody rurki nabłonkowej i bakteryjnej i ponownie otwórz. Pozwól urządzeniom pracować przez kolejne 24 godziny w temperaturze 37 °C i 0.5 obr./min.

6. Otwieranie i próbkowanie HuMiX

UWAGA: Poniższa sekcja opisuje próbkowanie różnych typów komórek. Na przykład granulki komórek neuronalnych są używane do ekstrakcji RNA i późniejszej ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy (qPCR), granulki bakteryjne do ekstrakcji DNA i sekwencjonowania genu 16S rRNA, a supernatanty do testów immunoenzymatycznych (ELISA) i innych testów (np. Testu mleczanu).

  1. W dniu 14, w dniu otwarcia, zamknij wszystkie trójdrogowe zawory odcinające, odłącz rurki od pompy i wyjmij urządzenie inkubatora na stół laboratoryjny.
    UWAGA: Podczas przenoszenia urządzenia upewnij się, że rzeczywiste urządzenie jest ustawione poziomo.
  2. Usuń przewody rurowe podłączone do urządzenia przed powolnym otwarciem clamp i zdejmij clamp pokrywa. Ostrożnie zdejmij górną pokrywę komputera, zbierz pożywkę w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i umieść ją na lodzie.
  3. Delikatnie zdejmij uszczelkę typu sandwich, jednocześnie zbierając pożywkę z komory nabłonkowej; uważaj, aby nie dotknąć warstwy komórek. Umieść uszczelkę kanapkową na kwadratowej szalce Petriego i dodaj sterylny 0,9% roztwór NaCl wH2Odo komory bakteryjnej, aż komora zostanie całkowicie pokryta (około 1 ml).
  4. Powoli zdejmij uszczelkę kolagenową, jednocześnie zbierając pożywkę z komory neuronalnej i przenosząc ją do probówki mikrowirówkowej. Umieść wszystkie probówki z mediami na lodzie. Umieść uszczelkę kolagenową w kwadratowym naczyniu i delikatnie dodaj kilka mililitrów 1x PBS do warstwy Caco-2, aż warstwa komórkowa zostanie całkowicie pokryta.
  5. Umieść dolną pokrywę PC na kwadratowej szalce Petriego i delikatnie dodaj około 2 ml 1x PBS na wierzch komórek neuronalnych, aby nie wyschły podczas procesu pobierania próbek.
  6. Odwirować probówkę z pożywką bakteryjną o stężeniu 5 000 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odwirować probówki z pożywką nabłonkową i neuronalną w temperaturze 300 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Po odwirowaniu przenieś supernatant z każdej probówki do nowej probówki do mikrowirówki i natychmiast umieść go na suchym lodzie.
  7. Komórki nabłonkowe
    1. Delikatnie wyjmij PBS z uszczelki i zbierz w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Dodać 2 ml trypsyny do komórek i inkubować uszczelkę przez 5 minut w temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Po inkubacji dodać 2 ml RPMI 1640 do uszczelki, ponownie zawiesić komórki i zebrać w kolejnej stożkowej probówce o pojemności 15 ml.
    2. Odwirować obie probówki przez 5 minut przy stężeniu 300 × g. Odrzucić supernatant. Zawiesić osad z popłuczki PBS w 300 μl PBS, a osad komórkowy w 1 ml PBS.
    3. Przenieść 50 μl każdej probówki do probówki mikrowirówkowej o pojemności 0,5 ml w celu automatycznego liczenia komórek i zliczania komórek w teście wykluczania błękitu trypanowego. Przenieść zawieszony osad komórkowy (1 ml) do probówki o pojemności 1,5 ml i odwirować przy 300 × g przez 5 minut.
    4. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w 250 μl buforu do lizy + 1% beta-merkaptoetanolu i umieścić probówkę na suchym lodzie.
  8. Komórki neuronalne
    1. Wziąć kwadratową szalkę Petriego z dolną, przezroczystą pokrywą z PC z komórkami neuronalnymi z poprzedniego kroku (6.5) do mikroskopu z kontrastem odwróconych faz.
      UWAGA: Podczas przesuwania pokrywy komputera z PBS na wierzchu, bądź bardzo delikatny, ponieważ sieć neuronalna bardzo łatwo się odłącza.
    2. Przeprowadzić ostatnią kontrolę jakości przed inokulacją, obserwując morfologię i gęstość komórek nerwowych za pomocą mikroskopii jasnego pola. Sprawdź, czy komórki migrowały ze sferoid i czy utworzyła się sieć neuronowa. Sieć neuronalna powinna być w około 90% zlewna. Aby uzyskać więcej informacji, zapoznaj się z Fattahi et al.6.
    3. Na stole ponownie zawieś komórki w PBS i zbierz je w probówce o pojemności 1,5 ml. Odwirować probówkę o masie 300 × g przez 3 minuty. Odrzucić supernatant, ponownie zawiesić osad komórek w 250 μl buforu do lizy + 1% beta-merkaptoetanolu i umieścić na suchym lodzie.
      UWAGA: Barwienie immunofluorescencyjne (IF) można przeprowadzić na komórkach neuronalnych na pokrywie PC. Jeśli barwienie IF jest preferowanym testem, aby nie zniszczyć sieci neuronalnej, komórki powinny być utrwalone na pokrywie PC za pomocą 4% paraformaldehydu (PFA), co utrudnia ponowne użycie pokrywy PC w przyszłych eksperymentach.
  9. Komórki bakteryjne
    1. Ponownie zawiesić komórki bakteryjne przyczepione do błony w 0,9% roztworze NaCl. Jeśli komórki są mocno połączone, delikatnie użyj skrobaka do komórek, aby odłączyć komórki bakteryjne od błony.
      UWAGA: Użycie skrobaka może uszkodzić komórki, zwiększając prawdopodobieństwo zobaczenia większej liczby martwych komórek.
    2. Zawiesinę komórkową należy zebrać do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Dodaj osad pozostały po poprzednio zebranym podłożu do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Wirować w temperaturze 5 000 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w 1 ml 0,9% roztworu NaCl.
    3. Podziel tę objętość na trzy części: jedną do zamrożenia osadu bakteryjnego do ekstrakcji kwasów nukleinowych (650 μL), jedną do posiewu CFU (50 μL) na płytkach MRS i jedną do barwienia żywych/martwych (300 μL). W celu przygotowania osadu do ekstrakcji kwasem nukleinowym, zawiesinę komórkową przenieść do probówki mikrowirówkowej, odwirować przy 5 000 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant. Umieść osad komórkowy na suchym lodzie.
    4. Po zakończeniu pobierania próbek przenieść wszystkie probówki z suchym lodem do zamrażarki o temperaturze -80 °C w celu przechowywania do późniejszych analiz.
      UWAGA: Supernatant może być dalej stosowany do analizy metodą chromatografii gazowej ze spektrometrią mas (GC-MS). Ponadto, podczas otwierania, membrana pokryta kolagenem może zostać podzielona na różne części w celu różnych analiz - jedna połowa ma być używana do barwienia okludyny IF, druga część do ekstrakcji RNA do dalszej analizy ekspresji genów, a trzecia część do zliczania komórek.

Wyniki

W neuroHuMiX wspólnie hodowaliśmy trzy różne typy komórek - komórki bakteryjne, nabłonkowe i neuronalne (Rysunek 1). Aby upewnić się, że wszystkie komórki są zdolne do życia, przeprowadziliśmy różne testy na różnych typach komórek. Na przykład przeprowadziliśmy zliczanie CFU na komórkach bakteryjnych, testy liczby komórek i żywotności komórek na komórkach nabłonkowych, podczas gdy komórki neuronalne oceniano za pomocą analiz mikroskopowych.

Diagram interakcji jelito-mózg; Wielokomorowy system hodowli do analizy eksperymentów biologicznych.
Rysunek 1: Schematyczne przedstawienie neuroHuMiX i jego eksperymentalnej konfiguracji. (A) Trzy komory są trzymane pomiędzy dwoma pokrywami PC, aby utrzymać je w zamknięciu. Każda komora jest wypełniona specyficznym podłożem dla wyhodowanych w niej komórek. Poszczególne komory są oddzielone półprzepuszczalnymi błonami, które umożliwiają komunikację komórkową za pośrednictwem rozpuszczalnych czynników przechodzących przez błony. (B) Reprezentacja konfiguracji neuroHuMiX. Każda komora jest podłączona do różnych butelek z mediami. W przypadku komory bakteryjnej przez pierwsze 12,5 dnia komora jest podłączona do RPMI + 10% FBS, po czym na ostatnie 36 godzin jest zmieniana na RPMI + 10% FBS + 5% MRS. Skróty: PC = poliwęglan; P/L/F = poli L-ornityna/laminina/fibronektyna; RPMI = pożywka do hodowli komórkowej Roswell Park Memorial Institute; MRS = pożywka hodowlana De Man, Rogosa i Shapre. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Aby ustalić, czy komórki były odpowiednio przymocowane, po otwarciu urządzeń, oceniliśmy tworzenie się warstwy komórek na membranie pokrytej kolagenem (Rysunek 6A). Aby upewnić się, że komórki w urządzeniu są zdolne do działania, przeprowadzono automatyczne zliczanie komórek (Rysunek 6B) i test wykluczania błękitu trypana ( Rysunek 6C). Testy przeprowadzono na komórkach Caco-2 z trzech różnych konfiguracji HuMiX: (i) Caco-2 w hodowli z ENs, (ii) Caco-2 w hodowli z L. reuteri oraz (iii) urządzeniu obejmującym kokulturę wszystkich trzech typów komórek. Testy statystyczne z użyciem jednoczynnikowej ANOVA nie przyniosły żadnych znaczących różnic między typami komórek, co sugeruje, że komórki Caco-2 pozostały żywotne we wszystkich tych początkowych konfiguracjach urządzeń i warunkach testowanych w tym badaniu. Podkreśla to fakt, że gęstość bakteryjna osiągnięta podczas kohodowli L. reuteri i dwóch typów komórek ludzkich nie ma działania cytotoksycznego na komórki ludzkie.

Hodowla komórkowa na stanowisku biodruku z wynikami żywotności; Wykresy pudełkowe testów Casy i Trypan Blue.
Rysunek 6: Ocena komórek Caco-2 na błonie pokrytej kolagenem. (A) Warstwa komórek Caco-2 na membranie pokrytej kolagenem po otwarciu. Strzałka wskazuje membranę pokrytą kolagenem, która jest otoczona przerywanym okręgiem. Komórki Caco-2 rosły na spiralnym kształcie membrany. Żywotność komórek Caco-2 po 14 dniach w HuMiX. Liczbę komórek uzyskano przy użyciu (B) automatycznego licznika komórek i (C) liczby komórek w teście wykluczania błękitu trypanowego. Liczbę komórek Caco-2 oznaczono na podstawie różnych konfiguracji hodowli w początkowym urządzeniu: kohodowla z neuronami jelitowymi (EN) (), kohodowla z L. reuteri (pomarańczowa) oraz w urządzeniu (EN i L. reuteri) (niebieska). Przeprowadzono jednoczynnikową ANOVA, która wykazała, że nie ma znaczącej różnicy między różnymi konfiguracjami hodowli (jednoczynnikowa ANOVA, p = 0,1234 [ns]; słupki błędów wskazują błąd standardowy). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Aby móc hodować L. reuteri z komórkami ssaków, najpierw zoptymalizowaliśmy i dostosowaliśmy pożywkę hodowlaną do użytku w urządzeniu. Odkryliśmy, że 5% mieszanina MRS w RPMI 1640 (uzupełniona 10% FBS) była optymalnie dostosowana do wzrostu L. reuteri, a jednocześnie nie była cytotoksyczna dla komórek ssaków stosowanych w tych testach. Następnie przeprowadzono liczenie CFU w celu oceny wzrostu L. reuteri po hodowli w urządzeniu przez 24 godziny. Liczba CFU została oceniona dla dwóch różnych początkowych konfiguracji urządzenia (Rysunek 7) - L. reuteri współhodowany z Caco-2 i L. reuteri w urządzeniu. W obu konfiguracjach liczba CFU znacznie różniła się od inokulum HuMiX i pobranych komórek (jednokierunkowa ANOVA, p = 0,0002), co wskazuje na wzrost komórek bakteryjnych wewnątrz początkowego urządzenia.

Wykres słupkowy; analiza CFU; eksperymentalne porównanie grup; istotność statystyczna; wynik mikrobiologiczny.
Rysunek 7: Limosilactobacillus reuteri Liczba CFU w inokulum (rozcieńczonym 1:100 000) i po 24 godzinach w HuMiX. Dwie różne konfiguracje: komórki Caco-2 w kokulturze z L. reuteri i urządzeniem. Jednoczynnikowa ANOVA pokazuje znaczącą różnicę (p = 0,0002 [***]) między inokulum a pobranymi komórkami, co oznacza, że bakterie rosną wewnątrz HuMiX. Paski błędów wskazują błąd standardowy. Skróty: CB. HX = bakterie Caco-2 HuMiX; nHX = neuroHuMiX. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Aby ocenić, czy hodowla EN w urządzeniu zmieni fenotyp komórek, zaobserwowano ogólną morfologię EN za pomocą mikroskopu z odwróconym kontrastem fazowym. Na tym etapie oceniono zarówno konfluencję, jak i morfologię EN. Ustanowienie zlewającej się sieci neuronowej wykazało, że komórki dobrze przyczepiły się do pokrywy komputera powlekanego urządzenia. Co ważne, podkreśla to pogląd, że rosły one w kokulturze z Caco-2 i L. reuteri. Krawędź między zlewającą się siecią neuronalną a spiralą wyznaczoną uszczelką była wyraźnie widoczna (Rysunek 8).

Obraz mikroskopowy, morfologia hodowli komórkowych, skala 200 μm, analiza badań biologicznych.
Rysunek 8: Neurony jelitowe po 14 dniach hodowli w urządzeniu. Po lewej stronie obrazu neurony urosły do zlewającej się warstwy na spirali. Krawędź między warstwą neuronalną a przestrzenią bez komórek jest krawędzią spirali; powiększony 10x, podziałka = 200 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Chip mikroprzepływowy, przezroczyste tworzywo sztuczne, stosowany w kontroli płynów, analizie laboratoryjnej, urządzeniu badawczym.
Rysunek 2: Pokrywy używane w urządzeniu. Zdjęcia pokazują górną (lewą) i dolną (prawą) pokrywę komputera. Każda strona pokrywy komputera ma 6,4 cm. Skrót: PC = poliwęglan. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Konfiguracja chipów mikroprzepływowych, konstrukcja kanału spiralnego do eksperymentu separacji płynów, analiza laboratoryjna.
Rysunek 3: Uszczelka komory nabłonkowej na dolnej pokrywie PC. Widok z góry uszczelki komory nabłonkowej umieszczonej na dolnej pokrywie PC (po lewej) oraz widok z dołu (po prawej) pokazujący wyrównanie uszczelki komory nabłonkowej z wlotami i wylotami dolnej pokrywy PC. Każda strona uszczelek, a także pokrywa PC, ma wymiary 6,4 cm. Skrót: PC = poliwęglan. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Montaż, układ i budowa urządzenia mikroprzepływowego, konstrukcja kanału spiralnego, konfiguracja eksperymentalna.
Rysunek 4: Montaż urządzenia. (A) Różne części do montażu HuMiX: (1) dolna pokrywa komputera; (2) uszczelka z membraną mikroporowatą pokrytą kolagenem, którą umieszcza się na (1); (3) uszczelka typu sandwich z membraną nanoporowatą pokrytą mucyną pomiędzy nimi i umieszczona na wierzchu (2); (4) górna pokrywa PC umieszczona na górze (3). Każda strona uszczelek i pokryw PC ma wymiary 6,4 cm. (B) Wszystkie części z (A) umieszczone razem. (C,D) Zmontowane urządzenie - widok z góry (po lewej) i z boku (po prawej). B jest umieszczany w systemie zaciskowym w celu zamknięcia systemu. (C) Każda strona górnego zacisku mierzy 8 cm. Skrót: PC = poliwęglan. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Schemat konfiguracji dożylnego transferu płynów; przewody, złącza, zawór do medycznego systemu infuzyjnego.
Rysunek 5: Części potrzebne do linii przewodów i zmontowanej linii przewodów dla jednej komory. (A) Różne części do budowy linii przewodów: a. linia przewodów pompy; b. kran trójdrogowy; c. igła 40 mm; d. igła 80 mm; e. igła 120 mm; f. długa rurka (20 cm); g. krótki przewód rurowy (8 cm); h. samiec Luer; i. samica Luer; J. Adapter. (B) Zmontowany przewód rurowy do komory bakteryjnej lub nabłonkowej. W przypadku komory neuronalnej igła o średnicy 120 mm musiałaby zostać zmieniona na igłę o średnicy 80 mm. (C) Zawór odcinający trójdrogowy obracany w celu przekierowania przepływu medium z urządzenia do "otwartego złącza" i zamknięcia komory. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

dzień0cyfra arabska46810
Kompozycja mediów100% E6100% E675% E650% E625% E6100% N2
+ LDN+ LDN25% N250% N275% N2+ LDN
+ SB+ SB+ LDN+ LDN+ LDN+ SB
+ CHIR+ SB+ SB+ SB+ CHIR
+ CHIR+ CHIR+ CHIR+ RA
+ RA+ RA
molekuła[koncentracja]
Sieć LDN100 nM
Sb10 μM
CHIR (Dzwonek3 μM
Kwas retinowy (RA)1 μM

Tabela 1: Kompozycja mediów.

mediaSkładniki (stężenia wymienione w tabeli materiałów)Objętość (ml)
Nośnik N2 (50 ml)Zobacz materiał DMEM-F12Rozdział 48
Suplement N20,5
L-glutamina0,5
Penicylina/Streptomycyna0,5
NEAA (Agencja Zdrowia)0,5
N2B27/ENS Media (50 ml)NeuropodstawowyRozdział 48
Suplement N20,5
L-glutamina0,5
Penicylina/Streptomycyna0,5
Zobacz materiał B27-A0,5

Tabela 2: Przepisy medialne.

Rozdział
Temperatura sterylizacji (°C)Rozdział 116
Czas sterylizacji (min)20
Czas schnięcia (min)10
Impulsów3
Temperatura końcowa (°C)99

Tabela 3: Uruchomienie autoklawu HuMiX.

Rozdział szt.
Obroty na minutę (rpm)Średnie natężenie przepływu (μl/min)
0,513
cyfra arabska79
5180

Tabela 4: Natężenia przepływu pompy perystaltycznej.

Dyskusja

Obecnie wiadomo, że ludzki mikrobiom jelitowy wpływa na zdrowie i choroby gospodarza. Pomimo wiedzy sugerującej znaczenie naszego mikrobiomu, zwłaszcza w zaburzeniach neurologicznych, takich jak choroba Alzheimeraczy Parkinsona 3,13, pozostaje w dużej mierze nieznane, w jaki sposób mikrobiom jelitowy oddziałuje na jelitowy układ nerwowy, a następnie na mózg.

Reprezentatywny model do badania interakcji między mikrobiomem jelitowym a układem nerwowym był do tej pory niedostępny. Badania dotyczące osi jelitowo-mózgowej tradycyjnie przeprowadza się przy użyciu modeli mysich13. Myszy i ludzie dzielą 85% swoich sekwencji genomowych14, ale istnieją znaczące różnice, które należy wziąć pod uwagę przy porównywaniu myszy z ludźmi. Jeśli chodzi o jelita, należy zauważyć, że w porównaniu z ludźmi myszy są wyłącznie roślinożercami. W rezultacie ich przewód pokarmowy różni się długością i cechami, takimi jak "opróżnianie żołądka"14. Mózgi myszy wykazują również istotne różnice, przy czym ogólna struktura między myszami i ludźmi jest różna15. Co ważne, ludzie mają dłuższe czasy cyklu komórkowego neuronalnych komórek progenitorowych15. W związku z tym ważne jest opracowanie reprezentatywnych modeli, które obejmują komórki pochodzenia ludzkiego, w tym komórki jelitowe i neuronalne5. W tym kontekście opracowanie bardziej powtarzalnych badań za pomocą modeli in vitro zmniejsza potrzebę korzystania z modeli zwierzęcych i poprawia odtwarzalność.

neuroHuMiX to zaawansowana wersja poprzedniego modelu HuMiX9. HuMiX to model typu gut-on-a-chip, który umożliwia proksymalne i reprezentatywne kohodowle komórek nabłonkowych i bakteryjnych. Komunikacja komórka-komórka jest możliwa poprzez proksymalną kokulturę i dyfuzję wydzielanych czynników i metabolitów przez błony półprzepuszczalne. Jednak, aby rozszerzyć użyteczność początkowego urządzenia do badania środowiska jelitowego człowieka, konieczne jest wprowadzenie dodatkowego typu komórek. Aby rozwiązać ten problem, neuroHuMiX, opracowany wraz z wprowadzeniem EN pochodzących z iPSC, umożliwia proksymalną kokulturę bakterii, komórek nabłonka jelitowego i EN. Uzyskany w ten sposób model in vitro pozwala odpowiedzieć na pytania dotyczące mikrobiomu jelitowego człowieka w odniesieniu do układu nerwowego człowieka. Wspólna hodowla różnych typów komórek, zwłaszcza kokultur komórek ssaków i bakterii, wiąże się z kilkoma wyzwaniami, w tym utratą żywotności, słabą adhezją i ogólną utratą konfluencji16. W tym przypadku wykazaliśmy, że w ramach tego urządzenia jesteśmy w stanie wspólnie hodować trzy różne typy komórek w tym samym systemie, utrzymując jednocześnie wysoką żywotność komórek.

Krytycznym krokiem w protokole jest zapewnienie zbiegu komórek nerwowych - 80%-90% zbiegu i żywotności komórek - przed zaszczepieniem urządzenia. Ponieważ nie jest możliwa ocena wzrostu komórek podczas biegu, niezwykle ważne jest, aby upewnić się, że komórki zlewają się i dobrze rosną przed wprowadzeniem ich do modelu. Chociaż może to być czynnik ograniczający, ogólna żywotność i zbieżność obserwowana w urządzeniu jest na ogół wysoka.

Urządzenie jest połączone przewodami rurowymi z pompą perystaltyczną. Każda komora komórkowa ma swoją specyficzną linię przewodów. Rurka składa się z rurki pompy, która umożliwia użycie pompy perystaltycznej do perfuzji medium, a także rurki łączącej rurkę pompy z urządzeniem oraz rurki łączącej urządzenie z butelkami odpływowymi/odpadowymi. Porty do pobierania próbek znajdują się przed i za urządzeniem, aby umożliwić inokulację i pobieranie próbek pożywki odpływowej. Każda komora może być podłączona do innego podłoża, co pozwala na uzyskanie najlepszych warunków hodowli dla każdego typu komórek. Każda komora może być otwierana lub zamykana w zależności od konkretnych potrzeb w zakresie dostarczania medium. W urządzeniu komora neuronalna pozostaje zamknięta przez większość eksperymentu, podczas gdy komory bakteryjne i nabłonkowe są otwarte przez cały czas, co oznacza, że otrzymują świeżą pożywkę przez cały okres eksperymentu. Aby mieć pewność, że medium przepływa bez zakłóceń, ważne jest, aby nie pozostało powietrze w przewodach, złączach ani w urządzeniu. Dlatego ważne jest, aby najpierw pozwolić urządzeniom pracować przez kilka minut na etapie zalewania. To często rozwiązuje problem. Jeśli nie, jedną z pozostałych linii, które opadają, można zamknąć na krótki czas, zamykając trójdrogowy kran odpływu. Powoduje to przekierowanie medium do linii z pęcherzykiem powietrza, rozwiązując w ten sposób problem poprzez wypychanie pęcherzyka na zewnątrz przez rurkę.

W każdym eksperymencie z hodowlą komórkową kluczowym elementem jest pożywka, w której każdy typ komórki ma swoje odpowiednie podłoże. W konfiguracji kohodowli pożywka musi być kompatybilna nie tylko z typem komórek rosnących w niej, ale także z innymi typami komórek w kokulturze. Nie inaczej jest w przypadku urządzenia, co stanowi dodatkowe wyzwanie, ponieważ mamy trzy różne przedziały z trzema różnymi typami komórek wewnątrz - komórkami bakteryjnymi, nabłonkowymi i neuronalnymi. Wykazaliśmy jednak, że poprzez modyfikację pożywki bakteryjnej - z dodatkiem 5% MRS do RPMI 1640 z 10% FBS - wszystkie typy komórek, w szczególności komórki bakteryjne i nabłonkowe, mogą być z powodzeniem hodowane w systemie. Jednak w urządzeniu różne typy komórek są hodowane w pobliżu siebie, a zatem nie są ze sobą w bezpośrednim kontakcie. Mimo że nie jest to w pełni reprezentatywne dla bezpośredniego kontaktu między komórkami w ludzkim jelicie, a zatem stanowi ograniczenie, proksymalny i reprezentatywny warunek kohodowli jest mocną stroną dla dalszych analiz. Wymiana czynników rozpuszczalnych między różnymi komorami i typami komórek; W związku z tym komórki nadal wchodzą ze sobą w interakcje. Dodatkowo, fakt, że typy komórek mogą być zbierane i analizowane oddzielnie, pozwala nam badać wpływ zdrowego i/lub chorego mikrobiomu na różne typy komórek (w tym komórki neuronalne), a tym samym określać/odzyskiwać odczyty specyficzne dla typu komórki. Innym ograniczeniem jest to, że morfologia komórek nie może być śledzona podczas przebiegu eksperymentalnego, ponieważ urządzenie można otworzyć i sprawdzić komórki dopiero pod koniec każdego eksperymentu.

Zgodnie z naszą wiedzą, neuroHuMiX jest pierwszym modelem typu gut-on-a-chip zawierającym EN. Jest to krok w kierunku wyjaśnienia komunikacji między mikrobiotą jelitową a jelitowym układem nerwowym. Jest to model pozwalający na badanie wzajemnych oddziaływań między gatunkami bakterii, warstwą nabłonkową i EN. Jego konstrukcja pozwala nam badać wymianę rozpuszczalnych czynników wydzielanych przez różne typy komórek i ich wzajemny wpływ. Idąc dalej, ważne byłoby, aby wewnątrz urządzenia znajdowały się nie tylko EN pochodzące z iPSC, ale także komórki nabłonkowe pochodzące z iPSC, aby przekształcić urządzenie w spersonalizowany model. Co ważne, ten spersonalizowany model może być wykorzystany do testowania pre-, pro- i synbiotyków10,11 oraz potencjalnie do opracowania spersonalizowanych badań przesiewowych i podejść terapeutycznych17. Spersonalizowany projekt neuroHuMiX może ostatecznie rzucić światło na "ciemną materię" ludzkiego mikrobiomu jelitowego i jej interakcje z układem nerwowym na osi mikrobiomu jelitowego i układu nerwowego, torując drogę do oceny terapeutycznej i interwencji.

Możemy wywnioskować, że możliwość posiadania jelita na chipie, w tym jelitowego układu neuronalnego, ma kluczowe znaczenie dla postępów w badaniu i zrozumienia interakcji wzdłuż osi mikrobiomu jelitowego i układu nerwowego. NeuroHuMiX pozwala nam badać wpływ gatunków bakterii na komórki gospodarza i daje nam dobrą podstawę do dalszego ulepszania modelu w jeszcze bardziej reprezentatywny fizjologicznie sposób.

Oświadczenia

P.W. oświadcza, że jest wymieniony jako wynalazca na patentach PCT/EP2013/056607, PCT/EP2016/062024, PCT/US2017/061602 i PCT/EP2019/081424. P.W., C.S. i L.G. oświadczają, że są wymienieni jako wynalazcy na LU503075 patentowej.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować Dr. Jaredowi Sterneckertowi za dostarczenie nam komórek z linii K7. Pragniemy również podziękować wieloletnim współpracownikom, dr Fredericowi Zenhausernowi i Matthew W. Barretowi z University of Arizona, za ich pomoc w aspektach inżynieryjnych. Chcielibyśmy również podziękować dr Valentinie Galatie za pomoc w zaprojektowaniu schematycznego przedstawienia neuroHuMiX. Projekt ten otrzymał dofinansowanie Europejskiej Rady ds. Badań Naukowych (ERBN) w ramach programu Unii Europejskiej w zakresie badań naukowych i innowacji Horyzont 2020 (umowa o grant 863664). Rysunek 1 został częściowo utworzony za pomocą Biorender.com.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2-MerkaptoetanolSigma Aldrich10712
Kaniula napowietrzająca (długość: 1,10 średnica: 30 mm)VWR (B.Braun)BRAU4190050
Agar-agarMerck Millipore1.01614.1000
Aluminiowaä tebau Ochs102050
Kwas askorbinowySigma AldrichA4544
B-27 Suplement Minus Witamina A (50x)Gibco12587-010
Bakteryjna błona komórkowa, wielkość porów: 1 i mikro; mVWR (Whatman)515-2084
Ogniwa Caco-2DSMZACC169
Licznik komórek i Analizator CASYOMNI Life Sceince
CHIRAxon Mechem BVCT99021
Collagen I, Rat TailInvitrogenA1048301
Costar 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment PlatesCorning3471
Difco Lactobacilli MRS BrothBD Biosciences288130
Discofix 3-drogowy kranB. BraunBRAU40951111
DMEM/F12, bez glutaminyThermofisher Scientific21331020
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami Dulbecco, D-PBSSigma Aldrich14190-169
Essential 6 MediumThermofisher ScientificA1516401
Essential 8 MediumThermofisher ScientificA1517001
Female Łącznik Luer Lock do BarbQosina11733
FGF2R& D Systems233-FB
FibronectinSigma AldrichF1141
Surowica bydlęca dla płodu, FBSThermofisher Scientific10500-064
GDNFPeproTech450-10
Błona komórek ludzkich, wielkość porów: 50 nmSigma Aldrich (GE Healthcare)WHA111703
Uszczelka HuMiX KolagenAuer Precision216891-003
HuMiX Uszczelka Kanapka Dolnaprecyzja Auera216891-002
Uszczelka HuMiX Sandwich TopAuer Precision216891-001
iPSCMax Planck Institute for Molecular BiomedicineK7 line
L-Glutamina (200 mM)Gibco25030081
Laminin z Engelbreth-HolmswarmSigma AldrichL2020
LDN193189Sigma AldrichSML0559
Limosilactobacillus reuteriATCC23272
Żywy/martwy BacLight Zestaw żywotności bakteriiThermofisher ScientificL7012
Męski Luer z blokadą spinu do BarbQosina11735
Rurka Marprene (0,8 mm x 1,6 mm)Watson-Marlow902.0008.J16
Matrigel Matryca z kwalifikacją hESCCorning354277
Mucyna, z żołądka świniSuplement Sigma AldrichT3924
N2 (100x)Igła Gibco17502048
NEAAThermofisher Scientific11140050
(długość: 120 mm; średnica: 0,80 mm)B.Braun (kod koloru: zielony)466 5643
Igła (długość: 40 mm; średnica: 0,70 mm)Henke Sass Wolf (kod koloru:)4710007040
Igła (długość: 80 mm; średnica: 0,60 mm)B.Braun (kod koloru: niebieski)466 5635
Neurobasal MediumGibco21103049
PE/Cy7 anty-ludzkie przeciwciało CD49dBiolegend304314
Penicylina-StreptomycynaSigma AldrichP0781
Pompa perystaltycznaWatson-Marlow205CA
Bromowodorek poli-L-ornitynySigma AldrichP3655
Pokrywki z poliwęglanu (HuMiX)University of ArizonaHuMiX 1.0 / 2.0
Kwas retinowySigma AldrichR2625
RLT Bufor (RNeasy Minikit)Qiagen74104
RPMI 1640 MediumThermofisher Scientific72400-021
SB431542, inhibitor ALKAbcamab120163
Butelki z surowicąGlasgerä tebau Ochs102091
StrzykawkaBD Biosciences309110
Roztwór trypsyny-EDTASigma AldrichT3924
Y-27632 DichlorowodorekR& Systemy D1254
gwinciarka do zaciskania

Bibliografia

  1. Heintz-Buschart, A., Wilmes, P. Human gut microbiome: function matters. Trends in Microbiology. 26 (7), 563-574 (2018).
  2. Toor, D., et al. Dysbiosis disrupts gut immune homeostasis and promotes gastric diseases. International Journal of Molecular Sciences. 20 (10), 2432(2019).
  3. Braak, H., de Vos, R. A. I., Bohl, J., Del Tredici, K. Gastric α-synuclein immunoreactive inclusions in Meissner's and Auerbach's plexuses in cases staged for Parkinson's disease-related brain pathology. Neuroscience Letters. 396 (1), 67-72 (2006).
  4. Schmit, K. J., et al. Dietary fibre deprivation and bacterial curli exposure shift gut microbiome and exacerbate Parkinson's disease-like pathologies in an alpha-synuclein-overexpressing mouse. bioRxiv. , (2022).
  5. Fritz, J. V., Desai, M. S., Shah, P., Schneider, J. G., Wilmes, P. From meta-omics to causality: experimental models for human microbiome research. Microbiome. 1 (1), 14(2013).
  6. Fattahi, F., et al. Deriving human ENS lineages for cell therapy and drug discovery in Hirschsprung disease. Nature. 531 (7592), 105-109 (2016).
  7. Wu, Q., et al. Organ-on-a-chip: Recent breakthroughs and future prospects. BioMedical Engineering Online. 19 (1), 9(2020).
  8. May, S., Evans, S., Parry, L. Organoids, organs-on-chips and other systems, and microbiota. Emerging Topics in Life Sciences. 1 (4), 385-400 (2017).
  9. Shah, P., et al. A microfluidics-based in vitro model of the gastrointestinal human-microbe interface. Nature Communications. 7, 11535(2016).
  10. Greenhalgh, K., et al. Integrated in vitro and in silico modeling delineates the molecular effects of a synbiotic regimen on colorectal-cancer-derived cells. Cell Reports. 27 (5), 1621-1632 (2019).
  11. Mao, J. H., et al. Genetic and metabolic links between the murine microbiome and memory. Microbiome. 8 (1), 53(2020).
  12. Moysidou, C. M., Owens, R. M. Advances in modelling the human microbiome-gut-brain axis in vitro. Biochemical Society Transactions. 49 (1), 187-201 (2021).
  13. Kim, S., et al. Transneuronal propagation of pathologic α-synuclein from the gut to the brain models Parkinson's disease. Neuron. 103 (4), 627-641 (2019).
  14. Hugenholtz, F., de Vos, W. M. Mouse models for human intestinal microbiota research: a critical evaluation. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (1), 149-160 (2018).
  15. Marshall, J. J., Mason, J. O. Mouse vs man: Organoid models of brain development & disease. Brain Research. 1724, 146427(2019).
  16. Goers, L., Freemont, P., Polizzi, K. M. Co-culture systems and technologies: taking synthetic biology to the next level. Journal of the Royal Society Interface. 11 (96), 20140065(2014).
  17. Sedrani, C., Wilmes, P. Toward hypothesis-driven, personalized microbiome screening. Cell Reports Methods. 2 (1), 100139(2022).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

jelitowy uk ad nerwowymikrofluidyczna kokulturaludzkie interakcje z mikrobiotindukowane pluripotencjalne kom rki macierzystekom rki Caco 2hodowla kom rek neuronalnychmembrana p przepuszczalnapompa perystaltyczna

Powiązane artykuły