Szybkość sedymentacji erytrocytów: charakterystyka oparta na fizyce w kontekście medycznym

Summary

Szybkość sedymentacji erytrocytów (ESR) to parametr fizyczny, często używany w rutynowych kontrolach stanu zdrowia i diagnozach medycznych. Niedawno opracowano model teoretyczny, który pozwala na wyodrębnienie parametrów mających znaczenie fizyczne z całej krzywej sedymentacji, w oparciu o nowoczesną wiedzę koloidalną. W tym miejscu przedstawiamy protokół do automatycznego zbierania ESR w czasie i wyodrębniania parametrów tego najnowszego modelu z tego automatycznego zbierania danych. Te wyrafinowane parametry prawdopodobnie poprawią również jakość zeznań medycznych.

Abstract

Szybkość sedymentacji erytrocytów (lub czerwonych krwinek) (ESR) to fizyczny parametr krwi, który jest często używany w rutynowych badaniach lekarskich i diagnozach medycznych. Na przykład w przypadku zapalenia obserwuje się wyższe OB ze względu na związany z tym wzrost fibrynogenu i innych białek osocza. Uważano, że wzrost ten był spowodowany tworzeniem się większych agregatów czerwonych krwinek (RBC) spowodowanych wzrostem fibrynogenu. Rzeczywiście, fibrynogen jest agregacją erytrocytów sprzyjającą czynnikom i w reżimie Stokesa zakłada się, że szybciej obserwuje się ją w osadach większych agregatów krwi. Jednak wszystkie modele pomiarów ESR oparte na tej hipotezie wymagają dalszych szczegółowych założeń fizycznych, niewymaganych w żadnym innym systemie. Poza tym nowoczesne badania w dziedzinie zawiesin koloidalnych ustaliły, że cząstki przyciągające tworzą agregaty perkolacyjne (tj. agregaty o szerokości pojemnika). Sedymentacja tych koloidów następuje następnie po tak zwanym "zapadaniu się żelu koloidalnego". Ostatnio wykazano, że erytrocyty faktycznie zachowują się tak samo. Hipoteza ta pozwala również na efektywne i analityczne modelowanie krzywej sedymentacji erytrocytów, z której można wyodrębnić solidne i fizycznie znaczące deskryptory. Niniejszy manuskrypt opisuje, jak przeprowadzić taką analizę i omawia korzyści płynące z tego podejścia.

Introduction

Szybkość sedymentacji erytrocytów (ESR) jest medycznym narzędziem klinicznym in vitro, formalnie wprowadzonym do medycyny opartej na dowodach w XX wieku^1,2,3,4. Jest on obecnie stosowany na całym świecie jako niespecyficzny test zapalny lub do monitorowania ewolucji niektórych określonych stanów^5,6,7,8. Wynika to głównie ze wzrostu stężenia fibrynogenu, ale także innych składników osocza, takich jak IgM^1,9,10,11. Zgodnie z aktualnym standardowym protokołem Westergren, wartości ESR są podawane jako pomiar bezkomórkowej warstwy plazmy w danym punkcie czasowym (30 min lub 1 h) po pozostawieniu pionowej rurki o typowym rozmiarze 20 cm pionowo w spoczynku¹². Jednak ta metoda pomiaru została skrytykowana, ponieważ opisano jakościowo różne etapy procesu sedymentacji, w tym opóźnienie przed osiągnięciem maksymalnej prędkości osiadania¹³. Opóźnienie to trwa dłużej niż 1 godzinę w około połowie zdrowych próbek¹⁴. Prędkość w tej fazie podlega innemu skalowaniu niż podczas drugiej, szybszej fazy sedymentacji¹⁵. Ograniczenie odczytu do średniej prędkości osiadania w ciągu pierwszej godziny powoduje porównanie różnej mieszanki różnych właściwości krwi u różnych osób.

Ponadto, ostatnio wykazano, że zwykłe teoretyczne rozważania stojące za tym protokołem były błędne^16,17,18. Przy fizjologicznym hematokrycie (powyżej około 25%) czerwone krwinki (RBC) nie osadzają się jako oddzielne agregaty, ale raczej jako ciągła, tak zwana perkolująca sieć RBCs^17,18, przestrzegając innego zestawu równań fizycznych niż zwykle wspominany sedymentation Stokesa^16,17. Wykazano, że uwzględnienie opisu fizycznego opartego na pomiarach sedymentacji (cała krzywa w czasie) było bardziej wiarygodne w niektórych nowych kontekstach medycznych^19,20. Co więcej, pomiary te mogą być wykorzystane do rzucenia światła na fizyczne mechanizmy zmieniające ESR w patologiach, w których kształty komórek są zmieniane^19,20. Dodatkowo, powolny ESR może mieć użyteczną interpretację medyczną, jak wskazano w pomiarach kohorty pacjentów z zespołem neuroakantocytozy^19,20. W tym artykule omówiono, jak praktycznie wdrożyć pomiar parametrów mających znaczenie fizyczne, w oparciu o całą kinetykę ESR. Dokładniej, przedstawiona tutaj metoda wyodrębnia maksymalną prędkość sedymentacji U_m, której wartość można skorygować, aby uwzględnić wpływ hematokrytu dawcy^16,17. Ten parametr jest dokładniejszy, a tym samym bardziej wiarygodny niż tradycyjny pomiar^16,17,19,20.

Ponadto, w niektórych podstawowych badaniach, zamiast monitorować stan zapalny danego pacjenta, interesujące jest wykluczenie wpływu hematokrytu na ESR^21,22,23, lub zbadanie roli RBC w zmodyfikowanym ESR^19,20,24,25 między różnymi darczyńcami. Przydatne może być porównanie próbek, które nie są bezpośrednio pełnymi próbkami krwi pobranymi od pacjentów. W związku z tym, ponowne zawieszenie erytrocytów z kontrolowanym hematokrytem w osoczu autologicznym lub w podstawniku osocza może być stosowane jako pierwszy etap pomiaru OB. Na przykład roztwory Dekstranu 70 kDa o stężeniu 55 mg/ml w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) wytwarzają zakres sedymentacji w zakresie kontrolnym dla zdrowych komórek¹⁹. Niniejszy artykuł pokazuje również, w jaki sposób takie kroki powinny być prowadzone, a przedstawiona analiza jest istotna również w tych przypadkach.

Protocol

Pobieranie próbek krwi i eksperymenty zostały zatwierdzone przez "Ärztekammer des Saarlandes", ethics votum 51/18, i przeprowadzone po uzyskaniu świadomej zgody zgodnie z Deklaracją Helsińską. Standardowe pomiary należy wykonywać we krwi z antykoagulacją kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) (standardowe stężenie EDTA 1,6 mg/ml krwi, norma europejska NF EN ISO 6710), w probówkach Westergrena. Objętość wymagana do napełnienia rurki Westergren zależy od producenta (ponieważ dolne części czasami zawierają szerszy zbiornik); Objętość powinna wynosić około 1 ml pełnej krwi i 800 μl dla probówek wskazanych w Tabeli Materiałów. Opisana poniżej metoda jest jednak ważna bez względu na konkretny kształt zawiesiny i pojemnika, o ile hematokryt w badanych próbkach jest wyższy niż 25%¹⁶. Objętości, pojemniki, pożywka zawieszająca i dodatki powinny być zatem dobrane zgodnie ze szczegółowymi celami prowadzonych badań.

1. Eksperymenty i pomiary

UWAGA: Zapisuj szybkość sedymentacji próbki co minutę.

1. Przygotowanie próbki (jeśli jest wymagane): Jeśli wymagany jest kontrolny hematokryt lub ciecz zawieszająca, zacznij od umycia komórek i przygotowania próbek (na przykład pokazujemy, jak przygotować próbki o różnych poziomach fibrynogenu, mieszając surowicę autologiczną i osocze). Surowicę rzeczywiście można w przybliżeniu określić jako osocze wolne od fibrynogenu^26,27 i może być stosowana w celu zmniejszenia agregacji erytrocytów w innych warunkach fizjologicznych. W celu przygotowania kilku próbek należy zebrać krew do standardowych probówek EDTA o pojemności 9 ml, a surowicę do standardowych probówek surowicy (z kulkami krzemionki jako aktywatorami krzepnięcia) o pojemności 9 ml.
   1. Odwirować próbki krwi (tj. 9 ml wzorcowego EDTA i probówek surowicy w wybranym przykładzie) przy 3 000 x g przez co najmniej 7 minut, w celu optymalnego zagęszczenia upakowanych erytrocytów. Zastąpić supernatant PBS lub żądaną cieczą zawieszającą, jeśli dostępna jest wystarczająca ilość. Jeśli wymagane jest po prostu kontrolowanie hematokrytu w osoczu autologicznym, przejdź bezpośrednio do kroku 1.1.3. W przeciwnym razie delikatnie wymieszać po dodaniu supernatantu do mycia.
   2. Powtórz trzy razy. W każdym przypadku wykonaj ostatnie pranie żądanym płynem do zawieszania.
      1. W wybranym przykładzie należy przygotować mieszaniny autologicznego osocza i surowicy o określonych proporcjach (np. 25%/75%, 50%/50% lub 75%/25% frakcji objętościowej osocza-surowica). Na przykład, przygotowując 2,5 ml mieszaniny 25%/75% osocza i surowicy, dodaj 0,625 ml osocza do 1,875 ml surowicy.
   3. Wyodrębnij wymaganą objętość wypełnionych komórek i zawieś ją w żądanym płynie. Upakowane komórki należy przetworzyć jako ciecz o wysokiej lepkości (przy użyciu standardowego pipetowania wstępnego i/lub pipetowania wstecznego lub pipety wyporowej²⁸). W wybranym przykładzie, dla próbki o objętości 4 ml przy hematokrycie 45%, zawiesić 1,8 ml upakowanych komórek w obrębie 2,2 ml mieszaniny osocza i surowicy.
2. Jeśli hematokryt próbki nie jest kontrolowany, oznacz go za pomocą szybkiego mikrowirowania (odpowiednie są również inne standardowe metody).
   1. Pobrać wymaganą ilość próbki do oznaczenia hematokrytu: wypełnić naczynia włosowate mikrohematokrytu, zanurzając jego dolną końcówkę w cieczy. Zatrzymaj go, zakrywając górny otwór, gdy wymagana ilość próbki wzrośnie w probówce przez odsysanie kapilarne.
   2. Uszczelnij naczynia włosowate woskiem uszczelniającym. Umieść je w wirówce do mikrohematokrytu i uruchom ją z prędkością 15 000 x g (12 000 obr./min) przez 5 minut lub zgodnie z instrukcjami producenta.
   3. Odczytaj poziom hematokrytu na kapilarze i zapisz go w celach informacyjnych.
3. Skonfiguruj kamerę do rejestrowania sedymentacji próbek. Aby uniknąć przeciążenia pamięci lub rozładowania baterii, należy zasilić urządzenie z sieci i zapisać zdjęcia bezpośrednio na komputerze lub zewnętrznym dysku twardym.
   1. Ustaw stabilną kamerę przed uchwytem, w którym lampy ESR pozostaną w spoczynku. Użyj białego, podświetlanego tła (doskonale sprawdzają się białe kartki papieru w tle).
   2. Używając pustych tub Westergrena, najlepiej bez oznaczeń, ustaw ostrość i pole widzenia kamery, aby uzyskać najwyższą rozdzielczość, w której zostaną umieszczone próbki. Najlepiej upewnić się, że krawędzie zdjęć są wyrównane w kierunku pionowym i poziomym.
   3. Zrób zdjęcie przeskalowanej rury, aby wyodrębnić rozdzielczość pikseli. Zalecane jest korzystanie ze zdjęć RGB.
   4. Ustaw światło i czas naświetlania aparatu tak, aby miały białe tło, ale bez nasycenia. Przykład w Rysunek 1 został uzyskany przy użyciu aparatu Canon EOS M50, z czasem naświetlania 1/15 s, przysłoną F8,0, balansem bieli wolframu, w trybie pojedynczego zdjęcia z ręcznym ustawianiem ostrości i czułością ISO 1,000.
4. Przygotuj i umieść probówki ESR.
   1. Napełnij dolny pojemnik probówki Westergren objętością odpowiadającą instrukcjom producenta. Włóż rurkę Westergren do dolnego pojemnika zgodnie ze wskazaniami producenta.
   2. Jak tylko pierwsza rurka będzie gotowa, umieść ją w uchwycie i rozpocznij nagrywanie z kamery. Rejestrowanie jednego zdjęcia co minutę zwykle daje dobrą rozdzielczość krzywej kinetycznej ESR.
   3. Przygotuj i umieść kolejne próbki. Upewnij się, że nie stoisz przed żadną próbką podczas robienia zdjęcia.
   4. Pozwól pomiarom trwać co najmniej 2 godziny, aby porównać je ze standardowymi pomiarami po 30 minutach, 1 godzinie i 2 godzinach. Jednak lepiej jest również zobaczyć nasycenie i zatrzymanie sedymentacji. W przypadku zdrowych próbek lub w przypadku stanu zapalnego rejestrowanie próbek przez noc, między 12 godzinami a 24 godzinami, jest więcej niż wystarczające, ponieważ krzywizna najszybszych próbek jest widoczna w ciągu 3 h^13,19. Jeśli jednak warunek zmniejsza prędkość sedymentacji, tak jak ma to miejsce w przypadku spadku stężenia fibrynogenu (tj. w wybranym przykładzie frakcja o dużej objętości surowicy), mogą być wymagane zapisy 50 godzin lub więcej w celu uzyskania najdokładniejszych informacji^16,19.

2. Analiza obrazu

UWAGA: Po nagraniu obrazów, wyodrębnij krzywą ESR. Przykład kodu Matlab jest dostarczany jako plik uzupełniający 1 (MatlabCodeImageAnalysisSampled.m).

1. Wybierz lub zidentyfikuj obszar zainteresowania (ROI), w którym widoczna jest tylko jedna rurka, przy czym dolna granica znajduje się pod najniższą pozycją interfejsu osocza wolnego od komórek erytrocytów, ale w próbce (patrz Rysunek 1A, B). W razie potrzeby obróć obraz tak, aby kierunek pionowy był wyrównany wzdłuż pierwszego składnika obrazu.
2. Przekonwertuj ROI obrazu RGB na obraz w skali szarości lub matrycę Gr. Zazwyczaj łączenie kanałów trójkolorowych (czerwony [R], zielony [G] i niebieski [B]) jako Gr = 2 * R - B - G jest bardzo wydajne z wyraźnym tłem (patrz Rysunek 1C i MatlabCodeImageAnalysisSampled.m linie 121-128).
3. Binaryzuj obraz. W przypadku zdrowej próbki, użycie progu Otsu ²⁹ zwykle daje spójny wynik (patrz Rysunek 1D i wiersz 133 MatlabCodeImageAnalysisSampled.m). W przypadku próbek o wysokim hematokrycie lub z pewną hemolizą, może być lepiej dostosować go ręcznie lub użyć innej metody automatycznej (jak to zrobiono w wierszach 129-131 MatlabCodeImageAnalysisSampled.m), w zależności od dokładnego kontrastu uzyskanego między różnymi fazami wewnątrz probówki.
4. Uzyskaj średnią wartości pikseli (lub elementów) Gr wzdłuż kierunku poziomego. Ten krok minimalizuje szum i skutecznie uśrednia możliwe nieprawidłowości interfejsu (patrz Rysunek 1E i MatlabCodeImageAnalysisSampled.m wiersz 137).
5. Przed obliczeniem wariacji wygładź krzywą za pomocą średniej ruchomej, zwłaszcza jeśli rury zawierają pewne poziome oznaczenia (patrz Rysunek 1F). Dla podanych przykładów do tego procesu użyto ruchomego okna o rozmiarze ~2,5 mm (50 pikseli) (patrz wiersz 138 MatlabCodeImageAnalysisSampled.m). Następnie zidentyfikuj pozycję interfejsu jako punkt o największej zmienności intensywności (patrz Rysunek 1G).
6. Powtórz te czynności dla każdego zdjęcia i każdej próbki. Dla każdej próbki zapisz pozycje interfejsu w czasie w odpowiednim formacie, aby dopasować model fizyczny do dowolnego odpowiednio dopasowanego oprogramowania.

3. Dopasowanie modelu fizycznego

1. Korzystając z dowolnego, odpowiednio dopasowanego oprogramowania, znając hematokryt i początkową wysokość kolumny krwi h₀, znajdź wartości czasu opóźnienia t₀, bezwymiarowego czasu γ i końcowego ułamka objętości upakowanej Φ_m erytrocytów, która minimalizuje sumę kwadratów odchyleń resztkowych dla modelu fizycznego¹⁷. Kod Matlaba (ShapeAnalyzerIntegrated.m) jest dostarczany jako plik uzupełniający 2 jako przykład wykonania takiego dopasowania. Dalsze instrukcje znajdują się w pliku uzupełniającym 2. Jak opisano w innym miejscu^16,17, erytrocyty w fizjologicznym osadzie hematokrytu jako miękki żel cząsteczkowy, gdzie ważnymi parametrami fizycznymi są różnica gęstości między osoczem a erytrocytami dawcy Δρ, charakterystyczna średnica RBC r_RBC, lepkość osocza w temperaturze pokojowej η oraz hematokryt dawcy Φ. Korzystając z tych parametrów i zakładając, że naprężenie grawitacyjne jest głównym procesem napędzającym przepływ plazmy w górę przez porowatą sieć utworzoną przez erytrocyty po czasie opóźnienia t₀, otrzymujemy ewolucję czasową^16,17:
   
   z , , and to średni promień dysku erytrocytu. Przykład kodu Matlaba, który to wykonuje, jest dostarczony jako załącznik (ShapeAnalyzerIntegrated.m pasuje do funkcji zdefiniowanej w SedimFit.m [Plik uzupełniający 3]). Alternatywnie, G/γ może być również używany bezpośrednio jako parametr dopasowania z jednostkami 1/t.
2. Po wyodrębnieniu krzywej ilościowej z obrazu zapisz parametry fizyczne próbki. Tradycyjne wartości ESR po 30 minutach, 1 godzinach lub 2 godzinach można nadal wyodrębnić z krzywej w celach informacyjnych (patrz ShapeAnalyzerIntegrated.m wiersze 123-132).

Results

Przykład poprawnie uzyskanej sekwencji obrazów jest dostarczony jako Film uzupełniający 1 (MovieS1.avi). Szereg charakterystycznych pasowań modelu jest pokazany dla różnych warunków w Rysunek 2. Stężenie fibrynogenu określono na podstawie stężenia fibrynogenu w osoczu Fib₀, przy założeniu, że surowica w ogóle nie zawiera fibrynogenu. Stąd Fib = C Fib₀, gdzie C jest ułamkiem objętościowym osocza w mieszaninie osocza-surowicy. W ...

Discussion

Aby zautomatyzowany protokół działał wydajnie, ważne jest, aby mieć wyraźne tło i odpowiednie oświetlenie. Ciemne tło może uniemożliwić istnienie wydajnego progu binaryzacji. W przypadku próbek z pewną hemolizą, która zwykle występuje (wzrasta) w czasie, ważne jest, aby najpierw sprawdzić, czy wybrany próg binaryzacji jest istotny zarówno dla początkowych, jak i końcowych obrazów.

Jeśli chodzi o proces binaryzacji obrazu, wybór ROI i progu binaryzacji jest najbardziej wrażliwym krokiem. Przyda...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Probówka antykoagulantu (EDTA lub heparyny) (do próbki krwi)	SARSTEDT	267001 lub 265	Antykoagulowana próbka krwi w celu scharakteryzowania
Aparat EOS M50	Canon	Kit EF-M18-150 IS STM	Każdy aparat powinien działać, pod warunkiem, że dostępne jest zasilanie sektorowe, połączenie z komputerem w celu automatycznego fotografowania i dostosowany obiektyw
Wirówka	HERMLE	302.00 V03 - Z 36 HK	Wymagania: co najmniej 3000 x g ofr 7 min.
Mikrowirówka	MLW	TH21	lub dowolny inny sposób oznaczania hematokrytu
Kapilary mikrohematokrytokrytowe	Fisher 11884040		naukowe lub inne kapilary/pojemniki do oznaczania hematokrytu
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)	ThermoFisher	10010023	1x PBS, pH 7,4, 298 Osm
Pipety (np. pipeta wyporowa)	Gilson	FD10006	Pipeta wymagana do manipulowania krwią i/lub upakowanymi komórkami. Inne modele są oczywiście odpowiednie, ale należy uważać, aby traktować krew i spakowane komórki jako płyny o dużej lepkości.
Woskowa płytka uszczelniająca	Hirschmann	9120101	Wosk uszczelniający do kapilar mikrohematokrytu
Probówki Westergren	Praxindo	A9244560	Każda inna standardowa probówka Wetsergren również powinna działać
Białe tło z oświetleniem	/	/Białe	arkusze papieru za próbkami, przy zwykłym świetle w pomieszczeniu jest całkowicie wystarczające.