Artykuł metodologiczny

Metodologie ekotoksykologiczne do oceny biomarkerów w różnych skalach u anuranów neotropikalnych

DOI:

10.3791/64520

⸱

28 kwietnia 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Instituto de Química de San Luis (INQUISAL), Consejo Nacional de Investigaciones Científicas Y Técnicas (CONICET), Facultad de Ciencias de la Salud (FCS), Universidad Nacional de San Luis (UNSL), 2Departamento de Ciencias Ambientales y Producción, Universidad Nacional de Los Comechingones (UNLC), 3Laboratório de Patologia Experimental - LAPEx, Instituto de Biociências - INBIO Universidade Federal de Mato Grosso do Sul, 4Cátedra de Citología, Facultad de Ciencias Naturales y Museo, Universidad Nacional de La Plata, 5Área de Biología, Departamento de Biología, Facultad de Química, Bioquímica y Farmacia, Universidad Nacional de San Luis (UNSL), 6Instituto de Recursos Biológicos, Centro de Investigaciones de Recursos Naturales (CIRN), Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA), 7Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET)

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym artykule przedstawiono znormalizowane metody ekotoksykologiczne do oceny biomarkerów u neotropikalnych gatunków bezogonowych. W szczególności w artykule tym szczegółowo opisano kilka metodologii w różnych skalach oceny ekotoksykologicznej, takich jak poziom genetyczny, komórkowo-histologiczny, biochemiczny, morfologiczny i indywidualny.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nowe pytania w ekotoksykologii podkreślają znaczenie zastosowania baterii biomarkerów, ponieważ skutkuje to prognozami ekotoksykologicznymi, które poprawiają nie tylko interpretację wpływu stresorów środowiskowych na organizmy, ale także określenie ich możliwego wpływu. Powszechnie wiadomo, że wykorzystanie biomarkerów ekotoksykologicznych na różnych poziomach organizacji pozwala na przewidywanie reakcji biologicznych organizmów na stresory środowiskowe, co jest przydatne w ocenie ryzyka środowiskowego.

Niemniej jednak, konieczne jest rozważenie optymalizacji podstawowych procedur, wygenerowanie danych historycznych w grupach kontrolnych oraz zastosowanie specyficznych testów biologicznych do oceny odpowiedzi w narządach i tkankach, aby wyjaśnić naturę i zmienność obserwowanych efektów. W związku z tym niniejsza praca ma na celu opisanie kilku metodologii ekotoksykologicznych stosowanych we wszystkich stadiach neotropikalnych anuranów na różnych poziomach ekologicznych oraz walidacja ich jako użytecznych biomarkerów do stosowania zarówno w dzikich zwierzętach, jak i w warunkach laboratoryjnych. W niniejszej pracy biomarkery te zastosowano na poziomie indywidualnym/organizmu (wskaźnik kondycji ciała), na poziomie histologicznym/fizjologicznym (analiza histopatologiczna, histometryczna i pigmentowa), biochemicznym (enzymy stresu oksydacyjnego) i genetycznym (bezpośrednie i oksydacyjne uszkodzenie DNA za pomocą testu komety).

Chociaż te metodologie mają małe różnice lub modyfikacje w zależności od gatunku, techniki te dostarczają skutecznych biomarkerów do oceny wpływu ksenobiotyków na anurany, które posiadają pewne cechy, które czynią je użytecznymi gatunkami wskaźnikowymi ekosystemów wodnych i lądowych. Podsumowując, bateria biomarkerów zastosowanych w niniejszym badaniu okazała się odpowiednia do oszacowania reakcji toksycznych u anuranów neotropikalnych i może być dalej zalecana jako bioindykatory do identyfikacji wpływu zanieczyszczeń na ekosystemy wodne regionu. Wreszcie, zaleca się osiągnięcie standaryzacji tych ważnych biomarkerów dla anuranów w określonych regionach, a także ewentualne uwzględnienie ich w ocenach ryzyka i podejmowaniu decyzji.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wprowadzanie stresorów środowiskowych do naturalnych zbiorników wodnych może wpływać na zdrowie ekosystemu wodnego1. Narażenie na te stresory środowiskowe może wpływać na przetrwanie lub kondycję organizmów wodnych poprzez różne mechanizmy toksyczności, w tym bezpośrednie narażenie (zarówno krótko-, jak i długoterminowe)2. W związku z tym standaryzowane laboratoryjne testy biologiczne do oceny toksykologicznych punktów końcowych związanych ze sprawnością i przeżyciem mogą być niewiarygodnym oszacowaniem wielu pośrednich skutków stresu w terenie. Co więcej, zmiany w normalnych poziomach fizjologicznych i wpływ na osobniki, na przykład w zakresie chwytania zdobyczy, mogą być lepszymi długoterminowymi wskaźnikami wpływu na przetrwanie i sprawność reprodukcyjną organizmów, a ostatecznie na zdrowie ekosystemu1,3. Przewidywanie zmian w składzie i funkcjonowaniu ekosystemu, a także zdrowiu organizmów, w oparciu o znany zestaw parametrów środowiskowych i stężeń zanieczyszczeń, jest ważne dla poprawy zarządzania zanieczyszczeniami1.

Biomarkery są definiowane jako zmiany biochemiczne, fizjologiczne lub histologiczne spowodowane ekspozycją na lub działaniem ksenobiotycznych substancji chemicznych4,5. Biomarkery okazały się bardzo przydatne jako sygnały wczesnego ostrzegania4,5. Ważnym pytaniem, na które pomagają odpowiedzieć biomarkery, jest to, czy pewne stresory są obecne w środowisku w wystarczająco wysokich stężeniach, aby powodować niekorzystne skutki. Informacje te przyczyniają się do oceny, czy warto zbadać charakter i zakres szkody oraz czynników sprawczych, czy też w takim przypadku nie należy inwestować więcej zasobów6,7,8. Ponadto, ponieważ koncepcja oceny pojedynczego biomarkera jako bioindykatora może nie być adekwatna5,7,8,9,10, istnieje rosnąca tendencja do przeprowadzania kompleksowej oceny wielu biomarkerów w celu wykrycia wczesnych sygnałów ostrzegawczych, a tym samym zapobieżenia nieodwracalnym skutkom dla ekosystemów.

Bardzo ważne jest, aby zauważyć, że wszystkie efekty toksyczne zaczynają się od interakcji stresora z biomolekułami. W tym sensie efekty mogą przenikać kaskadowo przez biochemiczne, subkomórkowe, komórkowe, tkankowe, narządowe, indywidualne, populacyjne, społeczne, ekosystemowe, krajobrazowe i biosferyczne poziomy organizacji. Komórki są głównym miejscem interakcji między stresorami środowiskowymi a systemami biologicznymi. Tak więc zrozumienie efektów molekularnych i genetycznych pozwala naukowcom powiązać niskie i wysokie poziomy organizacji ekologicznej i pomaga im przewidzieć wpływ zanieczyszczeń środowiska, na przykład na zdrowie ludzkie, które nie zostały jeszcze przetestowane5. Co więcej, ze względu na wysoką specyficzność komórek, są one przydatne nie tylko do oceny zanieczyszczeń środowiska, ale także do oceny zdrowia ludzkiego5,11. Dlatego zrozumienie skutków stresorów na poziomie biochemicznym może dostarczyć wglądu w przyczyny obserwowanych efektów i pozwolić na powiązanie ich z tymi na następnym wyższym poziomie5. Ponadto, dzięki zrozumieniu mechanizmów biochemicznych czynników stresogennych, skutki nowych czynników stresogennych, które nie zostały jeszcze ocenione toksykologicznie, można przewidzieć w odniesieniu do innych dobrze znanych zanieczyszczeń na podstawie ich podobieństw w funkcji. W obecności różnych stresorów środowiskowych biomarkery genetyczne i biochemiczne mogą dostarczyć cennych informacji na temat zaobserwowanych konkretnych efektów. Oprócz tego, oceny histochemiczne związane ze zmianami biochemicznymi mogą dostarczyć informacji na temat toksykodynamiki5. Krótko mówiąc, konieczna jest kompleksowa analiza biomarkerów komórkowych, biochemicznych i histologicznych10,12, a ten rodzaj analizy z kolei powinien być uwzględniony w programach biomonitoringu dla lokalnych gatunków5,13,14.

Badanie biomarkerów w warunkach laboratoryjnych może jednak stwarzać pewne trudności, w tym trudności w wykrywaniu skutków subletalnych i przewlekłych skutków po ekspozycji na zanieczyszczenia oraz w walidacji i standaryzacji stosowanych metod, a także złożone reakcje zależne od czasu lub dawki, niejasne lub nieokreślone powiązania z przystosowaniem oraz brak zintegrowanych modeli mechanistycznych1,4. Aby rozwiązać te problemy, rozwiązaniem nie jest zwiększenie liczby mierzonych biomarkerów, ale staranne zaprojektowanie badań i testowalnych hipotez, które przyczynią się do wyjaśnienia mechanistycznych podstaw wpływu chemicznego na całe organizmy4.

Nowe pytania w ekotoksykologii podkreślają znaczenie zastosowania baterii biomarkerów do generowania prognoz ekotoksykologicznych, które poprawiają interpretację wpływu stresorów środowiskowych na organizmy, a także podejmowanie decyzji o ich możliwym wpływie. Co więcej, połączenie obu koncepcji – biomarkerów i bioindykatorów – w ocenach ryzyka środowiskowego i biomonitoringu polega na tym, że pozwoli to naukowcom określić, czy organizmy w określonym środowisku są fizjologicznie normalne, czy też zestresowane. Podejście przyjęte w tym badaniu przypomina podejście do analizy biochemicznej przeprowadzanej u ludzi. W tym sensie można przeanalizować baterię biomarkerów, aby sprawdzić, czy organizm jest zdrowy zarówno w terenie, jak i w laboratorium6. Wreszcie, biomarkery przyczynią się do oceny ryzyka ekologicznego na dwa sposoby: (1) ocena narażenia rzadkich i/lub długowiecznych gatunków oraz (2) testowanie hipotez dotyczących mechanizmów oddziaływania chemicznego na różnych poziomach organizacji biologicznej4.

W ostatnim dziesięcioleciu, biomarkery były używane u anuranów do biomonitorowania ekspozycji na zanieczyszczenia cytotoksyczne i genotoksyczne. Wśród nich najczęściej stosowanymi technikami są test mikrojądrowy (MN) i test komet lub indukcja pęknięć jednoniciowego DNA za pomocą testu jednokomórkowej elektroforezy żelowej (SCGE). Ponadto techniki te zostały z powodzeniem wykorzystane do oszacowania uszkodzeń DNA wywołanych przez różne stresory środowiskowe u kilku neotropikalnych anuranów14,15,16,17,18,19. Inne biomarkery mogą być wykorzystywane do badania zmian stanu oksydacyjnego w organizmach narażonych na zanieczyszczenia środowiska16,17,18,19. Stres oksydacyjny jest reakcją na ekspozycję na różne ksenobiotyki, co prowadzi do kilku szkodliwych skutków, w tym na zdolność przeciwutleniającą narażonych osób5,6,7,19,20.

W badaniach ekotoksykologicznych stosuje się gatunki bioindykatorów, ponieważ są to organizmy, które identyfikują długoterminowe interakcje i niekorzystne skutki stresorów środowiskowych na wyższych poziomach organizacyjnych (np. na poziomie organizmu, populacji, społeczności i ekosystemu)10,20,21. Integrując te dwie koncepcje – biomarkery i bioindykatory – gatunki mogą być poddawane badaniom przesiewowym w celu szerokiego zdefiniowania biochemicznych, fizjologicznych lub ekologicznych struktur lub procesów, które są skorelowane lub powiązane z mierzonymi efektami biologicznymi na jednym lub więcej poziomach organizacji biologicznej. Wreszcie, wielkie wyzwanie związane z wykorzystaniem obu koncepcji w celu poprawy szacunków toksyczności stresora wiąże się z analizą biomarkerów i bioindykatorów, które mają dużą użyteczność w ocenie zagrożeń ekologicznych20. W tym sensie istnieje zgoda co do znaczenia stosowania biomarkerów i bioindykatorów jako wczesnych znaków ostrzegawczych, ponieważ dostarczają one istotnych informacji na temat reakcji badanego organizmu na stresory środowiskowe12,20,21.

są jedną z najbardziej zagrożonych i szybko zanikających grup organizmów na świecie. Jedną z głównych przyczyn tego spadku są zanieczyszczenia, które dostają się do ich środowiska, takie jak pestycydy, metale i pojawiające się zanieczyszczenia22,23,24,25. Anurany mają kilka cech, które czynią je użytecznymi jako gatunki bioindykacyjne, takie jak przepuszczalna skóra, bliski związek z wodą i wrażliwość na zanieczyszczenie środowiska2,23,24. Te cechy sprawiają, że są skutecznymi bioindykatorami zdrowia środowiskowego7,8,22,23,24,26.

Niemniej jednak, konieczne jest nie tylko rozważenie optymalizacji podstawowych procedur i generowania danych historycznych w grupach kontrolnych, ale także zastosowanie specyficznych testów biologicznych do oceny odpowiedzi w narządach i tkankach, aby wyjaśnić naturę i zmienność efektów obserwowanych w bioindykatorach. W tym sensie niniejsza praca ma na celu opisanie kilku metodologii ekotoksykologicznych, które można zastosować we wszystkich stadiach neotropikalnych anuranów na różnych poziomach ekologicznych i walidację ich jako użytecznych biomarkerów do zastosowania zarówno w dzikich zwierzętach, jak i w warunkach laboratoryjnych. W niniejszej pracy przedstawiono zestaw biomarkerów, które można zintegrować i które zostały sprawdzone w biomonitoringu laboratoryjnym i przyrodniczym u anuranów narażonych na stresory środowiskowe.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Następujące techniki obejmują poprzednią ofiarę zwierzęcia, która została przeprowadzona zgodnie z międzynarodowymi standardami etycznymi46,47,48, oraz późniejsza sekcja i ablacja narządów. Zwierzęta zostały schwytane na podstawie zezwolenia Ministerstwa Środowiska, Rolnictwa i Produkcji prowincji San Luis (rezolucja 49-PMA2019). Metody składania ofiar i eutanazji zwierząt zostały należycie zatwierdzone przez protokoły Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (CICUA, protokół Q-322/19) z Narodowego Uniwersytetu San Luis. Procedury na organizmach anuran zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi opisanymi w Garber et al.46, CONICET47 i INTA48. Ponadto wszystkie przedstawione tutaj protokoły dotyczą neotropikalnych gatunków anuranów w ich larwalnych i dorosłych stadiach życia; Zostały one już szeroko zaakceptowane przez lokalnych badaczy i są przeprowadzane zgodnie ze ścisłym protokołem i za zgodą "Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (CICUA)" każdego zaangażowanego uniwersytetu. Wykaz zastosowanych materiałów i rozwiązań znajduje się w Tabeli Materiałów oraz Tabeli 1.

1. Poziom indywidualny: Kondycja ciała oraz wskaźniki wątrobowe i gonadalne

  1. Indeks kondycji ciała: Skalowany indeks masy
    UWAGA: Indeks ten może być stosowany zarówno w przypadku osobników dorosłych, jak i osobników młodocianych i larw. Ta metodologia opiera się na Peig and Green27, z niewielkimi modyfikacjami dla anuranów według Brodeur et al.28,30oraz MacCracken i Stebbings29.
    1. Zapisać masę ciała każdej próbki za pomocą precyzyjnej wagi analitycznej.
    2. Umieść każdą próbkę na milimetrowym arkuszu i zrób zdjęcie w odległości ~15 cm.
      UWAGA: Ważne jest, aby zawsze robić zdjęcia z tej samej odległości.
    3. Analiza zdjęć:
      UWAGA: Zdjęcia można analizować za pomocą programu ImageJ, który jest dostępny bezpłatnie online (https://imagej.nih.gov/ij/index.html), lub za pomocą dowolnego innego programu do analizy obrazu, który umożliwia wykonywanie pomiarów ze skali dołączonej do zdjęcia.
      1. Zmierz długość pyska i otworu wentylacyjnego (SVL) każdej próbki za pomocą narzędzia do mierzenia z programu ImageJ i najpierw odwołaj się do znanej miary w arkuszu milimetrowym.
        UWAGA: W kijankach pomiar długości ciała musi być dokonany do rurki kloaki, z pominięciem płetwy ogonowej.
    4. Skalowany indeks masy (S)
      1. Na podstawie danych uzyskanych z masy ciała i SVL każdego anurana skonstruuj nieliniową linię regresji funkcji potęgowej masy ciała (oś y) w stosunku do SVL (oś x).
      2. Oblicz średnią długość na podstawie danych SVL wszystkich osób mierzonych z badanej populacji.
      3. Na koniec oblicz skalowany indeks masy (S) zgodnie z Peig and Green27 oraz Brodeur et al.28 za pomocą równania (1):
        S = Mi(L0/Li)b (1)
        gdzie Mi i L i są odpowiednio masą ciała i SVL od indywidualnego i; b jest wykładnikiem skalowania oszacowanym przez nieliniową regresję funkcji potęgowej28; L0 oznacza średnią długość dla badanej populacji; a S jest przewidywaną masą ciała dla osoby i, gdy jej SVL jest znormalizowany do wartości L0.
        UWAGA: Ważne jest, aby pamiętać, że b jest stałą specyficzną dla gatunku, która może być również specyficzna dla płci u gatunków dymorficznych płciowo.
  2. Indeks hepatosomatyczny: Skalowany indeks wątrobowy
    UWAGA: Jeśli chodzi o wskaźnik kondycji ciała, wskaźnik ten może być stosowany u osób na wszystkich etapach rozwoju. Metodologia opiera się na Brodeur et al.28.
    1. Zapisać SVL każdej próbki zgodnie z krokami 1.1.2 i 1.1.3.
    2. Poddaj jednostki eutanazji zgodnie ze standardami etycznymi dla anuran46,47,48.
    3. Usunąć całą wątrobę i zapisać jej masę na precyzyjnej skali analitycznej z dokładnością do miligrama.
    4. Na podstawie danych uzyskanych z masy wątroby i SVL każdego anurana skonstruuj nieliniową linię regresji funkcji siłowej masy wątroby (oś y) w stosunku do SVL (oś x).
    5. Oblicz średnią długość na podstawie danych SVL wszystkich osób mierzonych z badanej populacji.
    6. Oblicz skalowany wskaźnik wątroby (SLI) według Brodeur et al.28 za pomocą równania (2):
      SLI = Lmi (L0/Li)b (2)
      gdzie Lmi i Li i L i są odpowiednio masą wątroby i SVL od pojedynczego i; b jest wykładnikiem skalowania oszacowanym przez nieliniową regresję funkcji potęgowej28; L0 oznacza średnią długość dla badanej populacji; a SLI jest przewidywaną masą wątroby dla osoby i, gdy jej SVL jest standaryzowany do L0.
  3. Indeks gonad: Skalowany indeks gonad
    UWAGA: Ta metodologia jest oparta na Brodeur et al.30 i jest przydatna tylko dla dorosłych osobników. Ważne jest, aby pamiętać, że wskaźniki męskie i żeńskie muszą być analizowane oddzielnie, ponieważ różnią się w różnych skalach.
    1. Zapisać SVL każdej próbki zgodnie z krokami 1.1.2 i 1.1.3.
    2. Poddaj jednostki eutanazji zgodnie ze standardami etycznymi dla anuran46,47,48.
    3. Usuń prawą i lewą gonadę i zapisz masę na precyzyjnej wadze analitycznej z dokładnością do miligrama.
    4. Na podstawie danych uzyskanych z masy gonad i SVL każdego anurana skonstruuj nieliniową linię regresji funkcji potęgowej masy gonad (oś y) w stosunku do SVL (oś x), podobnie jak w kroku 1.1.4.1 i kroku 1.2.3.
    5. Oblicz średnią długość na podstawie danych SVL wszystkich osób mierzonych z badanej populacji.
    6. Oszacuj skalowany wskaźnik gonad (SGI) zgodnie z Brodeur et al.30 dla każdego zwierzęcia, używając równania (3):
      SGI = Gmi(L0/Li)b (3)
      gdzie Gmi i Li są masą gonad, a SVL odpowiednio z pojedynczego i, b jest wykładnikiem skalowania oszacowanym przez nieliniową regresję funkcji potęgowych przez Brodeura i wsp.30, L0 to średnia długość dla badanej populacji, a SGI to przewidywana masa gonady dla osobnika i, gdy jego SVL jest znormalizowany do L0.

2. Poziom morfologiczno-histologiczny

UWAGA: Do tej analizy konieczne jest użycie przekrojów histologicznych. Pierwszym krokiem jest pobranie tkanki.

  1. Utrwalanie i odwodnienie
    1. Użyj roztworu utrwalającego, aby zachować struktury. W przypadku tkanek anuranowych zaleca się stosowanie metakarny lub roztworu Bouina, zalecanego zamiast pozostałych roztworów utrwalających (Tabela 1).
      UWAGA: Wszystkie substancje muszą być wymieszane w momencie użytkowania.
    2. Umieścić kijanki lub fragment tkanki w ilości 50-100 mg w stożkowej probówce z 1-2 ml roztworu utrwalającego w temperaturze 4 °C przez 3 godziny. Myć chusteczkę w tej samej objętości 70% alkoholu etylowego przez 30 minut.
    3. Umieść chusteczkę w świeżym roztworze 70% alkoholu etylowego.
      UWAGA: W tym momencie możliwe jest przerwanie zabiegu na kilka dni przed kontynuowaniem odwodnienia.
    4. Odwodnić tkankę w serii roztworów alkoholowych: alkohol etylowy 80% (10 min), alkohol 90% (10 min), alkohol etylowy 100% (10 min) i alkohol etylowy 100% (10 min).
    5. Wykonać diafanizację (oczyszczanie) 2 x 10 min w ksylenie.
    6. Rozpuść parafinę w zlewce. Moczyć chusteczkę przez 10 minut. Usuń tkankę i umieść w formie histologicznej z roztopioną parafiną. Poczekaj, aż stężeje w temperaturze pokojowej.
    7. Umieść 3 skrawki μm wykonane na obracającym się mikrotomie na szkiełku podstawowym.
  2. Analiza histometryczna
    1. Wybarwić skrawki tkanek w hematoksylinie-eozynie31.
    2. Użyj 10-20 mikrofotografii do pomiaru obiektywem 100x w mikroskopie świetlnym. Przeanalizuj 5-10 komórek wątroby na każdym zdjęciu mikrofotografii.
      UWAGA: W tym przypadku wątroba została użyta jako model do opisania techniki. Możliwe jest użycie innych tkanek; Upewnij się, że obiektyw mikroskopu świetlnego, który ma być użyty, jest odpowiedni do rodzaju tkanki. Konieczne jest, aby móc zobaczyć i zidentyfikować komórki, które mają być mierzone.
  3. histopatologia
    1. Po zabarwieniu skrawków tkanki w hematoksylinie-eozynie32, zbadaj 5-10 przekrojów histologicznych pod obiektywami 10x, 20x, 40x i 100x.
    2. Poszukaj zmian w tkance i oszacuj wskaźnik stopnia zmian w tkance (DTC) zgodnie z opisem Bernet et al.32 za pomocą równania (4):
      DTC = Σalt.(a × w) (4)
      gdzie Σalt jest sumą zmian; a reprezentuje etap uszkodzenia (0, brak; 1, niski; 2, umiarkowany; 3, wysoki); a w oznacza stopień odwracalności uszkodzeń (1 oznacza odwracalne; 2 – częściowo odwracalne; 3 – nieodwracalne).
      UWAGA: W tym przypadku wątroba została użyta jako model do opisania techniki. Możliwe jest użycie innych tkanek; Upewnij się, że obiektyw mikroskopu świetlnego, który ma być użyty, jest odpowiedni do rodzaju tkanki.
  4. System pigmentowy
    1. Po zabarwieniu szkiełek hematoksyliną-eozyną zbadaj 10-20 mikrofotografii za pomocą obiektywu 20x.
    2. Określ ilościowo obszar zajmowany przez melaninę, mierząc różnice w intensywności barwienia za pomocą oprogramowania Image Pro-Plus zgodnie z Santos et al.33.
    3. Otwórz oprogramowanie Image Pro Plus 6.0®.
    4. Wybierz Menu i pasek narzędzi: Biologiczny.
    5. Wybierz opcję Kalibracja przestrzenna powiększenia używanego do wykonywania mikrofotografii.
    6. Otwórz obraz histologiczny.
    7. Wybierz pozycję Liczba narzędzi | Mierzenie obiektów.
    8. Kliknij przycisk Wybierz kolory.
    9. Wybierz narzędzie zakraplacza i zaznacz na obrazie kolorystykę, która ma zostać zmierzona.
    10. Zamknij okno i kliknij Liczba.
    11. Wybierz punkt menu Widok | Statystyki, aby zobaczyć wyniki.

3. Poziom biochemiczny: Reaktywne formy tlenu (ROS) i enzymy cholinergiczne

  1. Homogenizacja próbki
    UWAGA: Po zakończeniu eksperymentu należy zachować próbki (tkanki lub kijanki) w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), jeśli nie mają one być przetwarzane w tym czasie przez zamrażanie w temperaturze -20 °C (przez 2 miesiące) lub -80 °C (przez 6 miesięcy). Alternatywnie można je homogenizować w tym czasie zgodnie z zaleceniami zaproponowanymi poniżej.
    1. Kijanki
      1. Zważyć 1 g kijanki lub kałuży kijanek na precyzyjnej wadze analitycznej.
      2. Umieścić 1 g kijanek w stożkowej probówce o pojemności 15 ml zawierającej 1 ml PBS i zanurzyć ją w łaźni lodowej (4 °C).
      3. Homogenizować za pomocą homogenizatora z końcówką teflonową dostosowanego do stożkowej rurki i pracować w niskich temperaturach (4 °C).
        UWAGA: Unikaj używania dużej liczby obrotów, ponieważ może to zniszczyć białka i podnieść temperaturę.
      4. Przenieść tę samą objętość ciekłego homogenatu z każdej próbki do dwóch znakowanych probówek mikrowirówek o pojemności 2 ml i pracować w niskich temperaturach (4 °C).
      5. Odwirować próbki z ciekłym homogenatem przez 10 minut w temperaturze 4 °C i 9,520 × g.
      6. Na koniec ekstrahować supernatant, umieścić go w probówkach do mikrowirówek, oznaczyć w porcjach od 0,5 ml do 1 ml i przechowywać w zamrażarce w temperaturze -80 °C (przez 6 miesięcy) lub -20 °C (przez 2 miesiące) do czasu przeprowadzenia testu enzymatycznego.
    2. dorośli
      1. Usunąć tkankę będącą przedmiotem zainteresowania (np. wątrobę, mięśnie, nerki) i zważyć 1 g na precyzyjnej wadze analitycznej.
      2. Umieścić tkankę w stożkowej probówce o pojemności 50 ml zawierającej 1 ml PBS i zanurzyć ją w łaźni lodowej (4 °C).
      3. Homogenizować za pomocą homogenizatora z końcówką teflonową dostosowanego do stożkowej rurki i pracować w niskiej temperaturze (4 °C).
        UWAGA: Unikaj używania wysokich obrotów, ponieważ może to zniszczyć białka i podnieść temperaturę.
      4. Przenieść tę samą objętość ciekłego homogenatu z każdej próbki do dwóch oznakowanych probówek do mikrowirówek o pojemności 2 ml i pracować w niskiej temperaturze (4 °C).
      5. Odwirować probówki z płynnym homogenatem przez 10 minut w temperaturze 4 °C i 9,520 × g.
      6. Na koniec ekstrahować supernatant, umieścić go w probówkach do mikrowirówek, oznaczyć w porcjach od 0,5 ml do 1 ml i przechowywać w zamrażarce w temperaturze -80 °C (przez 6 miesięcy) lub -20 °C (przez 2 miesiące) do czasu oznaczenia enzymatycznego.
  2. Oznaczanie białka
    UWAGA: Wartość białka uzyskuje się w celu oszacowania aktywności enzymatycznej w stosunku do całkowitej ilości białka, unikając przy tym niedoszacowania lub przeszacowania wartości aktywności enzymatycznej. Ta metodologia jest oparta na Bradford34 z niewielkimi modyfikacjami dla anuranów:
    1. Przygotować odczynnik Bradforda (patrz Tabela 1).
    2. Dodać 100 ml H3PO4 o stężeniu 85% (p/v) do Coomassie G-250 + etanol i doprowadzić do objętości 1 l wodą destylowaną.
    3. Przygotować krzywą kalibracyjną z albuminą surowicy bydlęcej (BSA) jako znanym wzorcem białka (tabela 1).
    4. Przygotować wzorce albuminy w rosnących stężeniach dla kuwety spektrofotometru o pojemności 3 ml. Przykład krzywej standardowej znajduje się w tabeli 2.
    5. Zmierzyć absorbancję za pomocą spektrofotometru przy długości fali 590 nm (jest to długość fali, przy której powstaje kompleks odczynnika i białka).
      UWAGA: Przeprowadzenie reakcji Bradforda z próbką do odczytu w spektrofotometrze przy użyciu szklanej kuwety o maksymalnej objętości 3 ml i ścieżce optycznej 1 cm pomaga w oznaczaniu białka.
    6. Umieść następujące reagenty w kuwecie w następującej kolejności: 2 000 μl odczynnika Bradforda + X μl próbki (X = 20 μl homogenatu próbki narządu będącego przedmiotem zainteresowania od dorosłego anurana lub 40 μl próbki homogenatu z kijanki).
    7. Na koniec zmierz absorbancję w spektrofotometrze przy 590 nm.
      UWAGA: Nie jest konieczna praca w temperaturze 4 °C.
  3. Katalaza
    UWAGA: Ta metodologia jest oparta na Aebi35 z niewielkimi modyfikacjami dla anuranów.
    1. Inkubować 1 900 μl PBS + 40 μl nadtlenku wodoru (H20 2) + 20 μl próbki (czystej w kijankach i rozcieńczonej w stosunku 1:25 dla tkanek dorosłych) w kuwecie kwarcowej o pojemności 3 ml i długości drogi 1 cm.
      UWAGA: Postępować zgodnie z podaną powyżej kolejnością dodawania odczynników i próbki podczas inkubacji. Reagenty można inkubować w temperaturze pokojowej (25 °C), ponieważ anurany są fizjologicznie ektotermiczne.
    2. Odczytać kinetykę katalazy przy 240 nm przez 2 minuty w spektrofotometrze UV.
    3. Oblicz aktywność enzymu za pomocą następującego równania (5)35:
      k (mmol∙min-1∙mg-1 Prt) = (absorbancja Δ/1,000)/stężenie białka (5)
      UWAGA: W badaniach z oczyszczonymi preparatami enzymatycznymi aktywność właściwą k'0 otrzymuje się przez podzielenie k przez molowy współczynnik ekstynkcji (e = 43,6); k' = (k/e).
  4. S-transferaza glutationowa (GST)
    UWAGA: Ta metodologia opiera się na Habig et al.36 z niewielkimi modyfikacjami dla anuranów.
    1. Inkubować 300 μl GST + 10 μL 1-choro-2, 4-dinitrobenzeno (CDNB) (0,1 M) + 10 μl próbki (czystej w kijankach i rozcieńczonej 1/25 dla tkanek dorosłych) w kuwecie.
      UWAGA: Podczas inkubacji należy przestrzegać kolejności dodawania odczynników i próbki podanej powyżej. Odczynniki mogą być inkubowane w temperaturze pokojowej (25 °C), ponieważ anurany są fizjologicznie ektotermiczne.
    2. Przygotuj podatek od towarów i usług (tabela 1).
    3. Odczytaj kinetykę GST przy 340 nm przez 2 minuty w spektrofotometrze.
    4. Obliczyć aktywność enzymu za pomocą następującego równania (6):
      Wskaźnik aktywności GST (mmol/na minutę/mg białka) = ([Δ absorbancja/1 000]/9,6 × 104)/stężenie białka (6)
      Gdzie 9,6 mM−1 cm−1 = molowy współczynnik ekstynkcji.
  5. Peroksydacja lipidów (TBARS)
    UWAGA: Ta metodologia jest oparta na Buege i Aust37 z niewielkimi modyfikacjami dla anuranów.
    1. Skonstruuj krzywą kalibracyjną z MDA jako wzorcem i 0,7% TBA (Tabela 3).
    2. Przygotować wzorcowy roztwór MDA (10 mM) (Tabela 1). Przeprowadzić hydrolizę THP do MDA, umieszczając roztwór w łaźni wodnej o temperaturze 50 °C na 1 godzinę.
    3. Przygotować 0,7% (w/v) roztwór TBA (Tabela 1) za pomocą magnetycznego mieszadła z płytą grzejną.
    4. Następnie odwirować homogenaty próbki przez 30 minut w temperaturze 9,520 × g i temperaturze 4 °C.
    5. Wyekstrahować 500 μl supernatantu, dodać 100 μl 6 M NaOH i umieścić w łaźni termalnej w temperaturze 60 °C na 30 minut.
    6. Po kąpieli termalnej dodać 250 μl 35% HClO4, a następnie umieścić w łaźni lodowej (4 °C) na 30 min.
    7. Po tym czasie odwirować przy 9 520 × g przez 12 minut i wyekstrahować 300 μl supernatantu.
    8. Dodać 300 μl 0,7% TBA do supernatantu (próbki) i umieścić w łaźni termalnej (97,5 °C) na 30 minut.
    9. Odczytać absorbancję kompleksu utworzonego przez próbkę i TBA przy długości fali 532 nm i określić stężenie MDA w próbkach, podstawiając wartości absorbancji w równaniu krzywej (Rysunek 1).
  6. Acetylocholinoesterazy (AChE)
    UWAGA: Ta metodologia jest oparta na metodologii zaproponowanej przez Ellmana i in.38 z niewielkimi modyfikacjami dla anuranów.
    1. W momencie pomiaru należy ustawić odczynniki DTNB i jodku acetylotiocholiny (ATCh).
    2. Przygotować reakcję DTNB (tabela 1).
    3. Przygotować reakcję AChE (tabela 1).
    4. W szklanej kuwecie o drodze optycznej 1 cm przygotować reakcję AChE, umieszczając te odczynniki w następującej kolejności: 150 μl buforu PBS (pH = 8) + 150 μL DTNB + 50 μL ATCh + 10 μL próbki (czystej u kijanek i rozcieńczonej 1/10 u dorosłych anuranów).
    5. Odczytaj kinetykę AChE przy 412 nm przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.
    6. Obliczyć wartość aktywności AChE za pomocą następującego równania (7):
      Wskaźnik aktywności AChE (białko mmol∙min-1∙mg-1) = ([Δ absorbancja/1,000]/1,36)/stężenie białka (7)

4. Poziom genetyczny i komórkowy: Test mikrojądrowy i kometa

  1. Test mikrojądrowy (MN)
    UWAGA: Metodologia jest zgodna z tą zaproponowaną przez Fenech39 z niewielkimi modyfikacjami dla anuranów neotropikalnych.
    1. Próbki należy znieczulić przez zanurzenie w lodowatej wodzie (4 °C) i pobrać próbki krwi przez przecięcie za wieczkiem w przypadku kijanek lub przez nakłucie serca u dorosłych.
    2. Rozsmaruj dwie krople krwi obwodowej z próbek na wstępnie oczyszczonych szkiełkach.
    3. Następnie wysuszyć szkiełka na powietrzu, utrwalić 100% (v/v) zimnym metanolem (4 °C) przez 20 minut, a następnie zabarwić 5% roztworem Giemsy przez 12 minut.
    4. Niech jeden badacz zakoduje i zakoduje slajdy na ślepo przy powiększeniu 1,000x.
    5. Określ częstość występowania MN, analizując 1,000 dojrzałych erytrocytów z każdej próbki i wyraź jako całkowitą liczbę MN na 1,000 komórek.
    6. W celu prawidłowej identyfikacji MN należy stosować następujące kryteria:
      1. Szukaj MN, które mają średnicę mniejszą niż 1/3 średnicy głównego jądra.
      2. Upewnij się, że zabarwienie MN nie jest kramiące się, ale ma intensywność barwienia, która jest taka sama lub jaśniejsza niż w przypadku głównego jądra.
      3. Poszukaj granicy MN, która jest odróżnialna od granicy głównego jądra bez żadnego połączenia z rdzeniem lub nakładania się na główne jądro.
      4. Upewnij się, że liczba MN w komórkach nie przekracza więcej niż cztery MN związane z jądrem.
  2. Test komety lub jednokomórkowa elektroforeza żelowa (SCGE)
    1. Próbki należy znieczulać przez zanurzenie w lodowatej wodzie, a próbki krwi należy uzyskać, dzieląc je za wieczkiem u kijanek lub przez nakłucie serca u dorosłych.
    2. Rozcieńczyć krew w 1 ml PBS, odwirować (381 × g, 9 min) i ponownie zawiesić w końcowej objętości 50 ml PBS.
    3. Wymieszać 30 μl próbki krwi z 70 μl agarozy o niskiej temperaturze topnienia (LMPA) przy stężeniu 0,5% agarozy, aby utworzyć warstwę 2. Następnie umieścić 50 μl warstwy 2 na szkiełku uprzednio pokrytym warstwą 1 zawierającą 100 μl 0,5% agarozy o normalnej temperaturze topnienia.
    4. Przykryj szkiełko szkiełkiem nakrywkowym i umieść na zimno (4 °C) na 10 minut, aby zestalić warstwę 2.
    5. Po zestaleniu usuń szkiełko nakrywkowe i uformuj trzecią warstwę, nakładając 100 μl 0,5% LMPA.
    6. Gdy trzecia warstwa zastygnie, zdjąć szkiełko nakrywkowe i zanurzyć każde szkiełko w słoiku o pojemności 100 ml z kopliny zawierającym roztwór do lizy (Tabela 1), który został przygotowany tego samego dnia i przechowywany w temperaturze 4 °C. Umieść słoiki Coplin w zimnej kąpieli na 1 godzinę w ciemności (4 °C), aby nastąpiła liza.
      UWAGA: Eksperyment można wstrzymać i wznowić później. Podano, że okres lizy trwa od 1 godziny do 1 miesiąca.
    7. Pod koniec lizy wyjąć szkiełka i zanurzyć w roztworze buforowym do elektroforezy (tabela 1) w zbiorniku do elektroforezy. Wykonaj ten krok w ciemności przez 15 minut w temperaturze 4 °C, aby umożliwić rozwinięcie DNA. Po rozwinięciu jądrowego DNA przeprowadzić elektroforezę na tym samym buforze w temperaturze 4 °C przez 10 minut przy napięciu 25 V i natężeniu 250 mA.
    8. Pod koniec elektroforezy zneutralizować próbki zawarte w szkiełkach 3 x 5 minut, dodając 2 ml roztworu Tris-HCl (Tabela 1).
    9. W ostatnim etapie techniki oznaczania komety należy odwodnić próbki, umieszczając je w 100 ml słoikach Coplin zawierających alkohol (95%) w temperaturze 4 °C.
    10. Na koniec wybarwić próbki, umieszczając 10 μl 4′,6-diamino-2-fenyloindolu (DAPI) na środku szkiełka i umieścić szkiełko nakrywkowe, które rozprowadza barwnik po próbkach. Zbadaj preparaty pod mikroskopem fluorescencyjnym z filtrem WB.
      UWAGA: Cały proces musi być przeprowadzany w ciemności, aby uniknąć fotodegradacji DNA.
    11. Określ ilościowo uszkodzenia DNA, oceniając długość migracji DNA z nukleoidu. W takim przypadku określ to wizualnie na 100 losowo wybranych komórkach bez nakładania się. Podziel uszkodzenia DNA na cztery klasy: 0-I (brak uszkodzeń), II (minimalne uszkodzenia), III (średnie uszkodzenia) i IV (maksymalne uszkodzenia). Wyrazić dane jako średnią liczbę uszkodzonych komórek (suma klas II-IV) i średni wynik komety dla każdej grupy badanej. Na podstawie tych danych należy obliczyć wskaźnik uszkodzeń genetycznych (GDI) dla każdego badanego organizmu, stosując następujące równanie (8):
      GDI = (1[I] + 2[II] + 3[III] + 4[IV])/N[I-IV]) (8)
      gdzie I-IV reprezentują typ uszkodzenia nukleoidu, a NI-NIV reprezentują całkowitą liczbę nukleoidów ocenionych zgodnie z Pitarque et al.40.

5. Skorelowane biomarkery

UWAGA: W ostatnim czasie, biomarkery mogą być zintegrowane na wszystkich poziomach za pomocą indeksu odpowiedzi biomarkerów (IBR) zaproponowanego przez Beliaeffa i Burgeot49 i dostosowanego do neotropikalnych anuranów. IBR zapewnia wartość liczbową, która integruje wszystkie odpowiedzi biomarkerów; wyższe wartości IBR wskazują na wyższe poziomy naprężeń49. W zakresie estymacji IBR dla danej stacji lub traktowania danego badania, kolejne kroki przetwarzania danych w celu ustalenia ostatecznego wyniku są następujące:

  1. Obliczyć średnią oszacowania (X), gdy dostępne są indywidualne wyniki; w przeciwnym razie należy użyć wartości z próbki zbiorczej na każdej stacji pobierania próbek.
  2. Dla każdego biomarkera należy obliczyć ogólną średnią (m) i odchylenie standardowe (s) X dla wszystkich stacji i/lub badań, w zależności od porównań, które należy przeprowadzić.
  3. Standaryzacja X, aby uzyskać Y. Oblicz wartość o nazwie Y: Y = (X- m)/s.
  4. Oblicz wartość Z w następujący sposób: Z = Y lub Z = −Y, w przypadku efektu biologicznego odpowiadającego, odpowiednio, hamowaniu lub aktywacji w odpowiedzi na stresor.
  5. Na koniec oblicz wynik (S), gdzie S = Z + |Min|, gdzie S ≥ 0 i |Minimalny| oznacza minimalną wyznaczoną wartość bezwzględną.
  6. Narysuj diagram pająka lub gwiazdy po obliczeniu wartości S dla każdego biomarkera (Si) i wykonaniu podsumowania, aby uzyskać IBR.
    UWAGA: zapoznaj się z oryginalnym paper49, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat obliczeń.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie przedstawione tutaj techniki biomarkerów są proste, szybkie, wygodne, czułe, tanie i dokładne. W przypadku każdego biomarkera ważne jest, aby zwrócić uwagę na następujące kwestie.

Poziom indywidualny
Skalowany indeks masy
Wykonywanie zdjęć w skali milimetrowej ma ogromne znaczenie, ponieważ wartość ta zostanie wykorzystana do kalibracji oprogramowania, a to skutkuje lepszym obiektywizmem w odniesieniu do pomiaru suwmiarki podczas wykonywania ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biomarkery na poziomie indywidualnym są bardzo proste do określenia i bardzo tanie, ponieważ badanie tych biomarkerów wymaga tylko kilku elementów wyposażenia, które są zwykle dostępne w każdym laboratorium badawczym. Ponadto biomarkery te dostarczają ogólnych informacji na temat zdrowia i sprawności zwierząt. Liczba zwierząt wykorzystywanych w każdym protokole ma kluczowe znaczenie dla uzyskania wiarygodnych wyników. Ze względu na zmienność danych, do każdego zabiegu konieczne jest co najmniej pięć zwierząt (N = 5). W s...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują Instituto de Química de San Luis "Dr. Roberto Olsina"- Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Tecnológicas (INQUISAL-CONICET), Universidad Nacional de San Luis (Project PROICO 2-1914), Laboratório de Patologia Experimental (LAPEx) - Instituto de Biociências (INBIO) - Universidade Federal de Mato Grosso do Sul (UFMS), Cátedra de Citología - Universidad Nacional de La Plata (UNLP) oraz Agencia Nacional de Promoción Científica (FONCYT; PICT-2018-02570 i PICT-2018-01067) o wsparcie finansowe. Chcielibyśmy również podziękować native speakerce Lidii Unger oraz GAECI-UNSL (centrum pomocy w pisaniu naukowym) z Narodowego Uniwersytetu San Luis za korektę manuskryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Waga
Zasilanie do elektroforezy  Enduro  E0203-250V 
Eosin firmy Merck
  Olimpia  BX50Wyposażony w odpowiednią kombinację filtrów
Hematoksylina firmy HarrisMerck
Aparat fotograficzny o wysokiej rozdzielczości   >16 megapikseli
Homogenizator
Pozioma komora elektroforezy  Mikrowirówka Sigma
Denver Instrument Microscope
LeicaDM4000 BWyposażony w system przechwytywania obrazu Leica DFC 280
MicrotomeLeica2265
ParaplastSigmaP3558
Komputer  Kompatybilny z Mac OS X, Lynux lub Windows
Wirówka
UV– Spektrofotometr VisRayleigh723Gz lampą UV
analitycznaMikroskop fluorescencyjny osobistyz chłodzeniem

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hook, S. E., Gallagher, E. P., Batley, G. E. The role of biomarkers in the assessment of aquatic ecosystem health. Integrated Environmental Assessment and Management. 10 (3), 327-341 (2014).
  2. Connon, R. E., et al. Linking mechanistic and behavioral responses to sublethal esfenvalerate exposure in the endangered delta smelt; Hypomesus transpacificus (Fam. Osmeridae). BMC Genomics. 10, 608(2009).
  3. Scholz, N. L., et al. A perspective on modern pesticides, pelagic fish declines, and unknown ecological resilience in highly managed ecosystems. Bioscience. 62 (4), 428-434 (2012).
  4. Forbes, V. E., Palmqvist, A., Bach, L. The use and misuse of biomarkers in ecotoxicology. Environmental Toxicology and Chemistry: An International Journal. 25 (1), 272-280 (2006).
  5. Newman, M. C. Fundamentals of Ecotoxicology: The Science of Pollution., Fifth edition. , CRC Press. Boca Raton, FL. (2019).
  6. Walker, C. Ecotoxicology: Effects of Pollutants on the Natural Environment. , CRC Press. Boca Raton, FL. (2014).
  7. Venturino, A., et al. Biomarkers of effect in toads and frogs. Biomarkers. 8 (3-4), 167-186 (2003).
  8. Lajmanovich, R. C., et al. Técnicas para el relevamiento de anfibios en ambientes contaminados. Manual de Técnicas y Protocolos para el Relevamiento y Estudio de Anfibios de Argentina., 1a Edition. , Universidad Nacional de Jujuy. San Salvador de Jujuy, Argentina. (2021).
  9. Vander Oost, R., Beyer, J., Vermeulen, N. P. Fish bioaccumulation and biomarkers in environmental risk assessment: A review. Environmental Toxicology and Pharmacology. 13 (2), 57-149 (2003).
  10. Pérez-Iglesias, J. M., González, P., Calderón, M. R., Natale, G. S., Almeida, C. A. Comprehensive evaluation of the toxicity of the flame retardant (decabromodiphenyl ether) in a bioindicator fish (Gambusia affinis). Environmental Science and Pollution Research. 29 (33), 50845-50855 (2022).
  11. Bickham, J. W., Sandhu, S., Hebert, P. D., Chikhi, L., Athwal, R. Effects of chemical contaminants on genetic diversity in natural populations: Implications for biomonitoring and ecotoxicology. Mutation Research/Reviews in Mutation Research. 463 (1), 33-51 (2000).
  12. Adams, S. M., Ham, K. D. Application of biochemical and physiological indicators for assessing recovery of fish populations in a disturbed stream. Environmental Management. 47 (6), 1047-1063 (2011).
  13. Rautenberg, G. E., Amé, M. V., Monferrán, M. V., Bonansea, R. I., Hued, A. C. A multi-level approach using Gambusia affinis as a bioindicator of environmental pollution in the middle-lower basin of Suquía River. Ecological Indicators. 48, 706-720 (2015).
  14. Larramendy, M. L. Ecotoxicology and Genotoxicology: Non-Traditional Terrestrial Models. , Royal Society of Chemistry. London, UK. (2017).
  15. Guilherme, S., Gaivão, I., Santos, M. A., Pacheco, M. DNA damage in fish (Anguilla anguilla) exposed to a glyphosate-based herbicide-elucidation of organ-specificity and the role of oxidative stress. Mutation Research. 743 (1-2), 1-9 (2012).
  16. Lajmanovich, R. C., et al. Harmful effects of the dermal intake of commercial formulations containing chlorpyrifos, 2, 4-D, and glyphosate on the common toad Rhinella arenarum (Anura: Bufonidae). Water, Air, & Soil Pollution. 226 (12), 427(2015).
  17. Pérez-Iglesias, J. M., de Arcaute, C. R., Natale, G. S., Soloneski, S., Larramendy, M. L. Evaluation of imazethapyr-induced DNA oxidative damage by alkaline Endo III-and Fpg-modified single-cell gel electrophoresis assay in Hypsiboas pulchellus tadpoles (Anura, Hylidae). Ecotoxicology and Environmental Safety. 142, 503-508 (2017).
  18. Carvalho, W. F., et al. DNA damage exerted by mixtures of commercial formulations of glyphosate and imazethapyr herbicides in Rhinella arenarum (Anura, Bufonidae) tadpoles. Ecotoxicology. 28 (3), 367-377 (2019).
  19. Jacobsen-Pereira, C. H., et al. Markers of genotoxicity and oxidative stress in farmers exposed to pesticides. Ecotoxicology and Environmental Safety. 148, 177-183 (2018).
  20. Bartell, S. M. Biomarkers, bioindicators, and ecological risk assessment-A brief review and evaluation. Environmental Bioindicators. 1 (1), 60-73 (2006).
  21. Hamza-Chaffai, A. Usefulness of bioindicators and biomarkers in pollution biomonitoring. International Journal of Biotechnology for Wellness Industries. 3 (1), 19-26 (2014).
  22. Kacoliris, F. P., et al. Current threats faced by amphibian populations in the southern cone of South America. Journal for Nature Conservation. 69, 126254(2022).
  23. Sparling, D. W., Linder, G., Bishop, C. A., Krest, S. K. Ecotoxicology of Amphibians and Reptiles. , SETAC Books. Boca Raton, FL. (2010).
  24. Kiesecker, J. M., Blaustein, A. R., Belden, L. K. Complex causes of amphibian population declines. Nature. 410 (6829), 681-684 (2001).
  25. Brühl, C. A., Schmidt, T., Pieper, S., Alscher, A. Terrestrial pesticide exposure of amphibians: An underestimated cause of global decline. Scientific Reports. 3, 1135(2013).
  26. Wagner, N., Lötters, S., Veith, M., Viertel, B. Effects of an environmentally relevant temporal application scheme of low herbicide concentrations on larvae of two anuran species. Chemosphere. 135, 175-181 (2015).
  27. Peig, J., Green, A. J. New perspectives for estimating body condition from mass/length data: the scaled mass index as an alternative method. Oikos. 118 (12), 1883-1891 (2009).
  28. Brodeur, J. C., et al. Frog body condition: Basic assumptions, comparison of methods and characterization of natural variability with field data from Leptodactylus latrans. Ecological Indicators. 112, 106098(2020).
  29. MacCracken, J. G., Stebbings, J. L. Test of a body condition index with amphibians. Journal of Herpetology. 46 (3), 346-350 (2012).
  30. Brodeur, J. C., et al. Frog somatic indices: Importance of considering allometric scaling, relation with body condition and seasonal variation in the frog Leptodactylus latrans. Ecological Indicators. 116, 106496(2020).
  31. Carson, A. F., Hladik, L. C. Histotechnology: A Self-Instructional Text. , American Society for Clinical Pathology Press. Hong Kong. (2009).
  32. Bernet, D., Schmidt, H., Meier, W., Burkhardt-Holm, P., Wahli, T. Histopathology in fish: Proposal for a protocol to assess aquatic pollution. Journal of Fish Diseases. 22 (1), 25-34 (1999).
  33. Santos, L. R. D. S., Franco-Belussi, L., Zieri, R., Borges, R. E., de Oliveira, C. Effects of thermal stress on hepatic melanomacrophages of Eupemphix nattereri (Anura). Anatomical Record. 297 (5), 864-875 (2014).
  34. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  35. Aebi, H. Catalase in vitro. Methods in Enzymology. 105, 121-126 (1984).
  36. Habig, W. H., Pabst, M. J., Jakoby, W. B. Glutathione S-transferases: The first enzymatic step in mercapturic acid formation. Journal of Biological Chemistry. 249 (22), 7130-7139 (1974).
  37. Buege, J. A., Aust, S. D. Microsomal lipid peroxidation. Methods in Enzymology. 52, 302-310 (1978).
  38. Ellman, G. L., Courtney, K. D., Andres, V., Featherstone, R. M. A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity. Biochemical Pharmacology. 7 (2), 88-95 (1961).
  39. Fenech, M. Cytokinesis-block micronucleus cytome assay. Nature Protocols. 2 (5), 1084-1104 (2007).
  40. Pitarque, M., et al. Evaluation of DNA damage by the Comet assay in shoe workers exposed to toluene and other organic solvents. Mutation Research. 441 (1), 115-127 (1999).
  41. Nersesyan, A., Kundi, M., Atefie, K., Schulte-Hermann, R., Knasmuller, S. Effect of staining procedures on the results of micronucleus assays with exfoliated oral mucosa cells. Cancer Epidemiology Biomarkers & Prevention. 15 (10), 1835-1840 (2006).
  42. Pérez-Iglesias, J. M., Brodeur, J. C., Larramendy, M. An imazethapyr-based herbicide formulation induces genotoxic, biochemical, and individual organizational effects. Leptodactylus latinasus tadpoles (Anura: Leptodactylidae). Environmental Science and Pollution Research. 27 (2), 2131-2143 (2020).
  43. Pérez-Iglesias, J. M., et al. Multiple level effects of imazethapyr on Leptodactylus latinasus (Anura) adult frogs. Archives of Environmental Contamination and Toxicology. 81 (3), 492-506 (2021).
  44. Pérez-Iglesias, J. M., et al. The genotoxic effects of the imidacloprid-based insecticide formulation Glacoxan Imida on Montevideo tree frog Hypsiboas pulchellus tadpoles (Anura, Hylidae). Ecotoxicology and Environmental Safety. 104, 120-126 (2014).
  45. Jha, A. N. Ecotoxicological applications and significance of the comet assay. Mutagenesis. 23 (3), 207-221 (2008).
  46. Garber, J. C., Barbee, R. W., Bielitzki, J. T. Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , National Academies Press. Washington, DC. (2011).
  47. Council, N.S.a.T.R. (Ed.). Reference Ethical Framework for Biomedical Research: Ethical Principles for Research with Laboratory, Farm, and Wild Animals. CONICET. , (2005).
  48. INTA. Guía para cuidado y uso de animales para experimentación. INTA. , Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA), Secretaría de Agricultura. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias, Ganadería, Pesca y Alimentación, República Argentina. (2008).
  49. Beliaeff, B., Burgeot, T. Integrated biomarker response: A useful tool for ecological risk assessment. Environmental Toxicology and Chemistry. 21 (6), 1316-1322 (2002).
  50. Pérez-Iglesias, J. M., Natale, G. S., Brodeur, J. C., Larramendy, M. L. Realistic scenarios of pesticide exposure alters multiple biomarkers in BOANA PULCHELLA (ANURA) adult frogs. Ecotoxicology. , (2023).
  51. Bassó, A., Devin, S., Peltzer, P. M., Attademo, A. M., Lajmanovich, R. C. The integrated biomarker response in three anuran species larvae at sublethal concentrations of cypermethrin, chlorpyrifos, glyphosate, and glufosinate-ammonium. Journal of Environmental Science, Part B. 57 (9), 687-696 (2022).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Ecotoxicological BiomarkersComet AssayOxidative Stress EnzymesBody Condition IndexHistopathology AnalysisPigmentary AnalysisCatalase ActivityDNA Damage AssessmentEnvironmental Risk Assessment

Powiązane artykuły