Artykuł metodologiczny

Wykrywanie horyzontalnego transferu genów, w którym pośredniczą naturalne plazmidy koniugacyjne w E. coli

10.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64523

⸱

24 marca 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Biological Sciences, University of California Irvine, 2Department of Microbiology & Environmental Toxicology, University of California Santa Cruz

W tym artykule

Podsumowanie

Koniugacja pośredniczy w poziomym transferze genów poprzez mobilizację plazmidowego DNA przez dwie różne komórki, ułatwiając rozprzestrzenianie korzystnych genów. W pracy opisano szeroko stosowaną metodę skutecznego wykrywania sprzęgającego transferu plazmidu, opartą na zastosowaniu markerów różnicowych u plazmidu koniugacyjnego, dawcy i biorcy w celu wykrycia transkoniugacji.

Streszczenie

Koniugacja stanowi jeden z głównych mechanizmów ułatwiających horyzontalny transfer genów u bakterii Gram-ujemnych. W pracy opisano metody badania mobilizacji naturalnie występujących plazmidów koniugacyjnych na przykładzie dwóch naturalnie występujących plazmidów. Protokoły te opierają się na zróżnicowanej obecności wybieralnych markerów w plazmidzie dawcy, biorcy i koniugatora. W szczególności opisane metody obejmują: 1) identyfikację naturalnych plazmidów koniugacyjnych, 2) kwantyfikację szybkości koniugacji w kulturze stałej oraz 3) diagnostyczne wykrywanie genów oporności na antybiotyki i typów repliconów plazmidowych u biorców transkoniugantów za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). Opisane tutaj protokoły zostały opracowane w kontekście badania ekologii ewolucyjnej horyzontalnego transferu genów w celu przeprowadzenia badań przesiewowych pod kątem obecności plazmidów koniugacyjnych przenoszących geny oporności na antybiotyki u bakterii występujących w środowisku. Efektywny transfer plazmidów koniugacyjnych zaobserwowany w tych eksperymentach w kulturze podkreśla biologiczne znaczenie koniugacji jako mechanizmu promującego horyzontalny transfer genów w ogóle, a rozprzestrzenianie się oporności na antybiotyki w szczególności.

Wprowadzenie

W 1946 roku Lederberg i Tatum1 opisali proces seksualny u Escherichia coli K-12, który obecnie znany jest jako koniugacja. Koniugacja bakteryjna to proces, w którym komórka bakteryjna (donor) przenosi materiał genetyczny w sposób jednokierunkowy do innej komórki (recypienta) poprzez bezpośredni kontakt międzykomórkowy. Koniugacja jest szeroko rozpowszechniona wśród bakterii2,3, choć frakcja komórek donora wykazujących aparat koniugacyjny jest zazwyczaj bardzo mała4.

Plazmidy są autonomicznie replikującymi się pozachromosomalnymi elementami DNA. Oprócz genów zaangażowanych w replikację i utrzymanie plazmidu, plazmidy często przenoszą zestaw genów odpowiedzialnych za adaptację do wyzwań środowiskowych, takich jak metale ciężkie lub ekspozycja na antybiotyki5. Plazmidy koniugacyjne to klasa plazmidów posiadających zestaw wyspecjalizowanych genów, które umożliwiają ich transfer do komórek biorców i wspierają ich utrzymanie po transferze6. Plazmidy koniugacyjne u bakterii z typu Pseudomonadota (synonim Proteobacteria) różnią się wielkością od 21.8 kb do 1.35 Mb, przy czym mediana wynosi około 100 kb5,7. Zazwyczaj charakteryzują się one również niską liczbą kopii, co prawdopodobnie ma na celu zminimalizowanie obciążenia metabolicznego gospodarza8,9.

Typowy aparat koniugacyjny składa się z czterech komponentów: miejsca rozpoczęcia transferu (oriT), relaksazy, białka sprzęgającego typu IV oraz systemu sekrecji typu IV (struktury przypominającej rurkę, nazywanej pilusem, która umożliwia kontakt dawców z biorcami)6. Tylko niewielka frakcja komórek niosących plazmidy koniugacyjne wykazuje ekspresję maszynerii koniugacyjnej4, jednak jeśli plazmidy zapewniają korzyść adaptacyjną, transkonjuganty mogą gwałtownie zwiększyć swoją liczebność w populacji. Od 35% do ponad 80% izolatów E. coli pobranych z różnych siedlisk posiada plazmidy koniugacyjne z genami nadającymi oporność na co najmniej jeden antybiotyk10,11; w związku z tym horyzontalny transfer genów pośredniczony przez plazmidy koniugacyjne jest głównym mechanizmem napędzającym globalne rozprzestrzenianie się genów oporności na antybiotyki12.

Eksperymenty z kojeniem prowadzone w hodowlach laboratoryjnych wykazały, że na częstotliwość konjugacji wpływa wiele czynników, w tym charakter komórek biorców, faza wzrostu, gęstość komórek, stosunek dawcy do biorcy, to czy konjugacja odbywa się w podłożu płynnym czy stałym, węgiel, tlen, sole żółciowe, stężenia metali, obecność komórek ssaków, temperatura, pH oraz czas kojenia13,14,15.

Niniejsza praca opisuje protokoły służące do wykrywania obecności plazmidów koniugacyjnych w danym szczepie gospodarza, do ilościowego określania szybkości koniugacji w kulturze stałej oraz do weryfikacji ich transferu do komórek biorcy. Protokoły te mogą być wykorzystane jako pierwszy etap identyfikacji naturalnych plazmidów koniugacyjnych odpowiednich do badań. Opierają się one na minimalnej liczbie uproszczonych kroków, ponieważ zostały zaprojektowane do masowego przesiewania obecności plazmidów koniugacyjnych w bakteriach pochodzących z wielu źródeł (środowiskowych, komensalnych i patogennych) w dużej skali (od kilkudziesięciu do kilkuset dawców).

Dodatkowo przedstawiono testy mające na celu ustalenie, czy mobilizacja danego plazmidu koniugacyjnego jest niezależna od antybiotyku użytego do detekcji (tj. czy istotny jest gen oporności na antybiotyk poddanego selekcji), a także porównano szybkości koniugacji dwóch plazmidów koniugacyjnych znalezionych w różnych izolatach środowiskowych.

W oparciu o skład genetyczny odpowiednich plazmidów koniugacyjnych (replikon plazmidowy i zestaw genów oporności na antybiotyki), każdy krok protokołu można zmodyfikować, aby zbadać wpływ różnych czynników, które mogą wpływać na szybkość koniugacji.

Ogólny schemat doświadczenia:
Podstawowe elementy niezbędne do przygotowania eksperymentu z kojeniem to komórki donora, szczep biorcy oraz podłoża stałe umożliwiające selekcję donorów (antybiotyk A), biorców (antybiotyk B) oraz transkonjugantów (antybiotyk A i B). Transkonjuganty to komórki biorcy, które stabilnie utrzymują plazmid koniugacyjny donora.

Komórki donora są oporne na antybiotyk (antybiotyk A) i wrażliwe na marker lub markery stosowane do selekcji komórek biorcy (antybiotyk B). Lokalizacja genomowa genu oporności na antybiotyk (t.j..(niezależnie od tego, czy znajduje się on w chromosomie, czy w plazmidzie komórki donora) nie musi być znana a prioriponieważ mobilizacja markerów oporności na antybiotyki do biorcy (po bezpośrednim kontakcie dawca-biorca) oznacza, że markery dostarczone przez dawcę znajdowały się w plazmidzie.

Szczep biorcy (zdolny do przyjmowania plazmidów koniugacyjnych) musi posiadać stabilny marker selekcyjny, który nie występuje u donora; markerem tym jest zazwyczaj oporność na antybiotyk lub biocyd zlokalizowana w chromosomie. Wybór biorcy do eksperymentów z kojeniem jest krytyczny, ponieważ niektóre szczepy E. coli różnią się zdolnością do przyjmowania plazmidów koniugacyjnych16.

Po ustaleniu tych parametrów każda kolonia, która urośnie na podłożu zawierającym oba antybiotyki (A i B) po kontakcie pary dawca-biorca, jest domniemanym transkonjugantem (Rysunek 1). Przyjmuje się tutaj, że dawcy mogą rosnąć na podłożu z antybiotykiem A, ale nie mogą rosnąć na podłożu z antybiotykiem B, natomiast biorcy są w stanie rosnąć na podłożu z antybiotykiem B, ale nie mogą rosnąć na podłożu z antybiotykiem A. Transkonjugację można potwierdzić za pomocą dwóch testów diagnostycznych. Pierwszy test polega na wykryciu (poprzez amplifikację genów za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy [PCR] lub innymi metodami) genów znajdujących się w plazmidzie koniugacyjnym w koloniach transkonjugantów. Drugi test wykorzystuje różnicowe markery koloru kolonii oparte na metabolizmie laktozy. Różnicowy kolor kolonii ujawnia się przy użyciu agaru MacConkey; laktoza w agarze może służyć jako źródło fermentacji dla mikroorganizmów fermentujących laktozę (lac+). Mikroorganizmy te wytwarzają kwasy organiczne, w szczególności kwas mlekowy, który obniża pH. Czerwony neutralny jest wskaźnikiem pH zawartym w podłożu, który zmienia barwę z białej na jaskrawoczerwoną/różową, gdy pH spadnie poniżej 6.817. W związku z tym szczepy E. coli laktozowo-dodatnie tworzą na agarze MacConkey większe różowe kolonie, podczas gdy szczepy laktozowo-ujemne tworzą na agarze MacConkey bladożółte i mniejsze kolonie.

Schemat transferu plazmidu koniugacyjnego; wymiana plazmidów, oporność na antybiotyki, analiza PCR.
Rysunek 1: Projekt eksperymentalny wykorzystany do wykrywania obecności plazmidów koniugacyjnych w szczepach dawców. W tym przykładzie dawca posiada plazmid koniugacyjny z genem oporności na antybiotyki, który nadaje oporność na antybiotyk A, lecz jest on wrażliwy na antybiotyk B. Z kolei biorca posiada chromosomowy determinant oporności, który zapewnia ochronę przed antybiotykiem B, lecz jest wrażliwy na antybiotyk A. Transkonjuganty są oporne na oba antybiotyki (A i B), ponieważ posiadają plazmid koniugacyjny dawcy nadający oporność na antybiotyk A oraz chromosom biorcy zapewniający ochronę przed antybiotykiem B. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Współczynnik koniugacji dla pary dawca-biorca (w określonych warunkach eksperymentalnych) można obliczyć, dzieląc liczbę transkonjugantów przez liczbę dawców lub przez liczbę biorców; pierwszy współczynnik wskazuje ułamek komórek dawców wykazujących funkcjonalną ekspresję aparatury koniugacyjnej przez dawcę.16,18, podczas gdy druga wartość wskazuje na zdolność biorcy do przyjmowania plazmidów koniugacyjnych19,20W niniejszym badaniu, o ile nie zaznaczono inaczej, częstość koniugacji reprezentuje ułamek komórek biorcy, które stają się transkonjugantami (tj.., stawka na odbiorcę).

W niniejszej pracy opisano dwa niezależne eksperymenty kojarzenia z udziałem jednego biorcy E. coli i dwóch dawców E. coli. Ponadto, w celu potwierdzenia, że pojedynczy plazmid wielolekooporny może być selekcjonowany za pomocą dowolnego z genów oporności na antybiotyki obecnych w plazmidzie koniugacyjnym, zastosowano różne antybiotyki do selekcji transkonjugantów dla jednego z dawców.

Szczepy dawcy i biorcy wykorzystane w niniejszej pracy zostały w pełni zsekwencjonowane, aby zrozumieć wszystkie komponenty tego układu eksperymentalnego; jednak protokoły te zostały opracowane w celu wykrywania obecności plazmidów koniugacyjnych u gospodarzy o nieznanej sekwencji i mogą być stosowane również w takim kontekście eksperymentalnym, przy czym w tym przypadku odpowiednie geny są najpierw sekwencjonowane.

Szczepy dawcy i biorcy użyte w protokole to:

Dawca 1. E. coli SW4955 została wyizolowana z jeziora w Baton Rouge (LA, USA). Posiada ona koniugacyjny plazmid o wielkości 134 797 bp (p134797) z replikonami IncFIC(FII) i IncFIB (AP001918). Plazmid koniugacyjny ten zawiera geny nadające oporność na cefalosporyny trzeciej generacji (blaCTX-M-55), aminoglikozydy (aac(3)-IIa i aadA1), fenikole (catA2), tetracykliny (tet(A)), trimetoprim (dfrA14) oraz sulfonamidy (sul3). Pełna mapa p134797 przedstawiona jest na Ryc. 2A. E. coli SW4955 jest laktozowo-dodatnia i tworzy różowe kolonie na agarze MacConkey.

Dawca 2. E. coli SW7037 została pobrana z jeziora Erie (hrabstwo Ottawa, OH, USA). Posiada ona koniugacyjny plazmid o długości 101 718 bp (p101718) z replikonem IncI1-I(Alpha). Ten plazmid koniugacyjny zawiera gen nadający oporność na beta-laktamy (blaCMY-2). Pełną mapę p101718 przedstawiono na Rysunku 2B. E. coli SW7037 jest również laktozowo-dodatnia, tworząc różowe kolonie na agarze MacConkeya.

Mapy plazmidów E. coli z adnotacjami genów oporności, 134797 bp i 101718 bp, na schemacie porównawczym.
Rycina 2: Mapa genetyczna plazmidów koniugacyjnych użytych w tej badaniu. (A) Plazmid p134797, plazmid koniugacyjny znaleziony w szczepie E. coli SW4955. (B) Plazmid p101718, plazmid koniugacyjny znaleziony w szczepie E. coli SW7037. Geny oporności na antybiotyki są zaznaczone na niebiesko, a geny należące do aparatu koniugacyjnego są zaznaczone na czerwono. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Biorca. Jako biorca wykorzystuje się szczep E. coli LMB100. Jest to szczep pozbawiony plazmidów, oporny na rifampicynę (100 mg/L) oraz streptomycynę (100 mg/L). Posiadanie oporności na dwa antybiotyki zmniejsza prawdopodobieństwo wystąpienia mutacji oporności u donora, co mogłoby zakłócić interpretację wyników. Dodatkowo E. coli LMB100 jest laktozo-ujemny i można go odróżnić od dwóch szczepów donora, ponieważ na agarze MacConkey tworzy on małe, bladożółte kolonie (w przeciwieństwie do większych, różowych kolonii).

W przypadku, gdy dawca jest laktozo-ujemny, zaleca się użycie biorcy laktozo-dodatniego (np. E. coli J53). Szczepy LMB100 i J53 są dostępne dla innych laboratoriów. Prosimy o przesłanie zapytania do dr. Gerardo Cortés-Cortés wraz z adresem i numerem FedEx.

Pożywką stałą niezbędną do selekcji i zliczania dawców, biorców oraz transkonjugantów jest agar MacConkey w szalkach Petriego o średnicy 100 mm. Wymagane jest dodanie następujących antybiotyków: (i) Pożywka A: karbenicylina (100 mg/L) w celu zliczenia dawców oraz upewnienia się, że biorcy nie rosną w obecności tego antybiotyku. (ii) Pożywka B: ryfampicyna (100 mg/L) + streptomycyna (100 mg/L) w celu zliczenia biorców oraz upewnienia się, że dawcy nie rosną w obecności tych dwóch antybiotyków. (iii) Pożywka AB: karbenicylina (100 mg/L) + ryfampicyna (100 mg/L) + streptomycyna (100 mg/L) w celu uzyskania i zliczenia transkonjugantów. (iv) Pożywka C: bez antybiotyków do wysiewania wszystkich badanych izolatów.

Porównano szybkości koniugacji plazmidów koniugacyjnych z E. coli SW4955 i E. coli SW7037 do E. coli LMB100. Ponadto, w przypadku plazmidu koniugacyjnego p134797 (szczep SW4955), w kolejnych eksperymentach zastąpiono antybiotyk karbenicylinę (100 mg/L) gentamycyną (2 mg/L), chloramfenikolem (25 mg/L), tetracykliną (10 mg/L), trimetoprimem (20 mg/L) lub sulfametoksazolem (100 mg/L), aby ustalić, czy marker oporności na antybiotyki użyty do selekcji ma jakikolwiek wpływ na wyniki.

Protokół

1. Metoda 1: Koniugacja

  1. Dzień 1: Wyślij serię dawców i biorcy. Smugować oddzielnie od zapasów glicerolu na podłożu C (agar MacConkey bez antybiotyków) i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Ten krok jest niezbędny, aby upewnić się, że eksperyment jest przeprowadzany z czystymi izolatami i potwierdzić fenotyp laktozy na podstawie koloru kolonii.
  2. Dzień 2: Oznacz probówkę hodowlaną o pojemności 14,0 ml dla każdego dawcy i biorcy. Wybierz pojedynczą kolonię każdego dawcy i biorcy i hoduj je przez noc (18 godzin) w oddzielnych probówkach hodowlanych o pojemności 14,0 ml zawierających 2 ml bulionu Mueller Hinton w temperaturze 37 °C i wstrząsających z prędkością 200 obr.
    UWAGA: W stosowanych szczepach fazę stacjonarną osiąga się po całonocnej hodowli trwającej 18 godzin.
  3. Dzień 3: Zmierzyć gęstość optyczną przy 600 nm (OD600) nocnej hodowli każdego dawcy i biorcy (bez wirowania) przy użyciu rozcieńczenia 1:10 900 μl roztworu soli i 100 μl nocnej hodowli.
  4. Dostosuj gęstość optyczną każdego dawcy i biorcy do 2,0 (OD600 = 2,0) za pomocą sterylizowanego roztworu soli fizjologicznej (0,85% NaCl w wodzie).
    UWAGA: Nocna hodowla E. coli o OD600 = 2,0 ma 1,6 x 109 CFU/ml.
  5. Oznacz probówkę do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml "probówką pasującą", wskazując szczepy dawcy i biorcy. Przenieś 500 μl dostosowanej (OD600 = 2,0) zawiesiny każdego dawcy i biorcy i umieść je w probówce łączącej (ta probówka łącząca miałaby 0,8 x 109 CFU/ml każdego dawcy i biorcy). Delikatnie wymieszaj rurkę współpracującą przez odwrócenie.
  6. Odwirować probówkę współpracującą przez 10 minut przy 500 x g w temperaturze pokojowej.
  7. Nie naruszając osadu, odpipetować 800 μl probówki do koniugacji. W probówce do koniugacji powinno pozostać 200 μl.
    UWAGA: Wyrzuć supernatant do 10% pojemnika z wybielaczem w celu dezaktywacji bakterii w zawiesinie.
  8. Inkubować probówkę łączącą przez 18 godzin (przez noc) w temperaturze 37 °C w inkubatorze. Gody następują w czasie inkubacji.
    UWAGA: Ten krok należy wykonać bez potrząsania, aby nie złamać pilusów koniugacyjnych.
  9. Jako kontrolę ujemną należy prześledzić całonocny posiew dawców na pożywce B i biorców na pożywce A. Inkubować płytki przez noc w temperaturze 37 °C
  10. Dzień 4: Dodać 800 μl roztworu soli fizjologicznej do probówki współpracującej i odwirować w celu ponownego zawieszenia (w ten sposób mieszanina godowa odtwarza się do 1 ml).
    UWAGA: Wirowanie rozbija współpracujące bakterie i homogenizuje kulturę w celu ilościowego określenia CFU/ml.
  11. Przygotować rozcieńczenia 1:10 (od 1 x 100 do 1 x 10-7) mieszanki łączącej. Płytka 100 μl rozcieńczeń od 10-5 do 10-7 na pożywce A i pożywce B oraz wszystkie rozcieńczenia na pożywce AB.
    UWAGA: Rozcieńczenie 100 odnosi się do zgrabnej rurki.
  12. Poczekaj, aż płytki wyschną przed umieszczeniem ich w inkubatorze do góry nogami. Inkubować płytki przez 18 godzin (przez noc) w temperaturze 37 °C.
  13. Dzień 5: Zbadaj kontrole ujemne, aby upewnić się, że smugi czystych nocnych kultur dawców nie wyrosły na pożywce B, a czysta nocna kultura biorców nie wyrosła na pożywce A.
  14. Zapisać liczbę kolonii i rozcieńczeń, które można policzyć:
    1. Policz kolonie w pożywce A; to są dawcy. Kolonie powinny być różowe (Rysunek 3A,B).
    2. Policz kolonie w pożywce B; są to biorcy i transkoniuganty. Kolonie powinny być bladożółte (Rysunek 3C).
    3. Policz kolonie w pożywce AB; to są transkoniuganty. Kolonie powinny być bladożółte.
      UWAGA: Wybierz policzalną płytę. Przeliczalna płytka ma od 30 do 300 kolonii (więcej niż 300 kolonii byłoby trudne do policzenia, a mniej niż 30 kolonii uważa się za zbyt małą wielkość próby, aby przedstawić dokładne odwzorowanie oryginalnej próbki).
  15. Oblicz częstotliwość koniugacji na dawcę lub biorcę
    Częstość koniugacji na dawcę = (jtk/ml transkoniugantu [pożywka AB])/ (jtk/ml dawców [pożywka A]) x 100
    Częstość koniugacji na biorcę = (CFU/ml transkoniugantu [pożywka AB])/ (CFU/ml biorców i transkoniugantów [pożywka B]) x 100
    UWAGA: Częstość koniugacji dla tego protokołu została obliczona jako liczba transkoniugantów podzielona przez liczbę biorcy pomnożoną przez 100. Zgodnie z literaturą wynikową ilość koniugacji można nazwać jako częstość koniugacji, częstotliwość transferu genów, częstotliwość koniugacji, wydajność rekombinacji, wydajność transferu plazmidu, częstość koniugacji na podstawie całkowitej liczby bakterii, odsetek transkoniugantów, frakcja transkoniugantów w populacji biorców, częstość transkoniugacji, częstość koniugacji, logarytm szybkości koniugacji, stała szybkości transferu, szybkość koniugacji na parę kryjącą, współczynnik koniugacji lub efektywność koniugacji20. Protokół ten odnosi się do terminu efektywność koniugacji.
  16. Przechowywać transkoniuwanty w zapasach glicerolu w temperaturze -80 °C. Postępować zgodnie z podetapami przygotowania wywaru glicerynowego.
    1. Wybierz pojedynczą kolonię transkoniugantów i hoduj je przez noc (18 godzin) w probówkach hodowlanych o pojemności 5,0 ml zawierających 2 ml bulionu Mueller Hinton uzupełnionego karbenicyliną (100 mg/l), w temperaturze 37 °C i wstrząsając przy 200 obr./min.
    2. Oznaczyć fiolki kriogeniczne, wskazując nazwę transkoniugantu, w następujący sposób: Tc + imię dawcy + antybiotyk selekcji w pożywce A (ponieważ są to transkoniuganty, wiadomo, że ich tłem jest szczep biorca, który jest już oporny na streptomycynę i ryfampicynę, ale dodatkowo zawiera plazmid przenoszący gen oporności na beta-laktamy); na przykład TcU1Carb. Dodaj liczby ciągłe w przypadku, gdy konieczne jest przechowywanie więcej niż jednego transkoniuganta od tego samego dawcy (np. TcU1Carb1, TcU1Carb2 itp.).
    3. Przenieś 1 ml kultury na noc do 1 ml 50% glicerolu (v/v; końcowe stężenie glicerolu powinno wynosić 25%) i delikatnie wymieszaj przez odwrócenie. Umieścić fiolki kriogeniczne na suchym lodzie na 15 minut i przechowywać kriowiale w temperaturze -80 °C do przyszłych eksperymentów.
  17. W celu ekstrakcji DNA należy rozprowadzić trasnkoniuganty z zapasów glicerolu na agarze Mueller Hinton z dodatkiem karbenicyliny (100 mg/l) i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C; następnie postępować zgodnie z zaleceniami z kroku 2.1.

2. Metoda 2: Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) w celu wzmocnienia genów oporności na antybiotyki i replikonów plazmidowych w transkoniugancjach E. coli

UWAGA: Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) została opracowana przez dr Kary'ego Mullisa w 1983 roku. PCR zależy od określonych starterów (krótki fragment DNA komplementarny do danej sekwencji DNA, który działa jako punkt, w którym może przebiegać replikacja, zwykle o długości 20-40 nukleotydów i najlepiej o zawartości guaniny-cytozyny 40%-60%), które są wyżarzane do przeciwległych nici zdenaturowanej, dwuniciowej matrycy DNA i przedłużane przez termostabilną polimerazę DNA, generując w ten sposób dodatkowy szablon dla następnego cyklu reakcji, prowadzący do wykładniczego wzmocnienia oryginalnego szablonu21. W tym protokole replikony i geny oporności obecne w plazmidach koniugacyjnych zostały amplifikowane w celu potwierdzenia transferu w komórkach biorcy transkoniugantu.

  1. Ekstrakcja DNA
    1. Aby wykryć transfer genów oporności przenoszonych przez plazmidy koniugacyjne, użyj transsprzężonego DNA jako matrycy. Użyj prostej ekstrakcji przygotowawczej, aby zlizować ściany komórkowe bakterii.
      UWAGA: Prosta ekstrakcja przygotowawcza do wrzenia to proste podejście do lizy ścian komórkowych bakterii. Ta ekstrakcja zawiera plazmidowe DNA zmieszane z genomowym DNA, ale ponieważ startery są projektowane zgodnie z określonymi sekwencjami DNA, ta matryca jest również przydatna do PCR. Plazmidy mogą być również specyficznie oczyszczane, chociaż plony mają tendencję do spadku wraz ze wzrostem rozmiaru plazmidu22. Jest to wygodny punkt postoju. DNA może być przechowywane przez kilka miesięcy w temperaturze -20 °C.
  2. Metoda PCR
    1. Biorąc pod uwagę, że eksperyment ma kontrolę negatywną i pozytywną, korzystne jest utworzenie puli dla wszystkich reakcji w probówce o pojemności 1,5 ml. Oznacz probówkę o pojemności 1,5 ml jako "pulę" i wymagane probówki PCR nazwą genu i próbki (np. OXA-U1).
    2. Odczynniki do PCR należy pipetować w następującej kolejności do probówki o pojemności 1,5 ml: sterylna woda, 2x Master Mix, startery i polimeraza (z wyjątkiem matrycy DNA) (patrz Tabela 1). Delikatnie wymieszać, pipetując w górę i w dół co najmniej 10 razy. Trzymaj na lodzie przez cały czas.
      UWAGA: Nosić rękawice, aby uniknąć zanieczyszczenia mieszaniny reakcyjnej lub odczynników. Staraj się unikać otwierania i mieszania odczynników oraz obchodzenia się z próbkami w tym samym obszarze, aby zapobiec zanieczyszczeniu odczynnikami. Umieść odczynniki w pojemniku na lód, aby stłumić aktywność nukleazy i niespecyficzne gruntowanie. Pozwól im całkowicie się rozmrozić przed rozpoczęciem reakcji. Utrzymuj odczynniki na lodzie przez cały czas trwania eksperymentu. Polimeraza Taq jest dodawana na końcu, ponieważ jest wrażliwa na zmiany pH; Musi być buforowany, aby uniknąć degradacji lub nieprawidłowego fałdowania. Sekwencja starterów jest wymieniona w Tabeli 2 - Geny oporności na antybiotyki - i Tabeli 3 - Tabela 3 - Odpowiedzi < klasa sup = "xref" > 23 < sup class = "xref" > 24 < klasa sup = "xref" > 25,< sup class="xref">26,< sup class="xref">27,< sup class="xref">28.
    3. Dodaj matrycę DNA do odpowiedniej probówki. Unikaj wprowadzania pęcherzyków i zabezpiecz nakrętki na probówkach PCR.
    4. Umieść probówki PCR w termocyklerze.
    5. Uruchom program. Zapoznaj się z ustawieniami programu wymienionymi dla każdego genu w Tabeli 2 (Geny oporności) i Tabeli 3 (replikony).
      UWAGA: Ustawić programy PCR tak, aby utrzymywały próbki w temperaturze 4 °C po przebiegu.
      1. Warunki PCR dla replikonów: jeden cykl denaturacji w temperaturze 94 °C przez 5 minut, następnie 30 cykli denaturacji w temperaturze 94 °C przez 1 min, wyżarzanie w temperaturze 60 °C przez 30 s, wydłużenie w temperaturze 72 °C przez 1 minutę i końcowe przedłużenie jednego cyklu w temperaturze 72 °C przez 5 min.
        UWAGA: Są to warunki ustandaryzowane przez Carattoli et al.29.
    6. Po zakończeniu programu przechowuj probówki PCR w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Jest to wygodny punkt postoju. Produkty PCR mogą być przechowywane przez kilka miesięcy w temperaturze -20 °C
    7. Przygotuj 1% żel agarozowy, ważąc 0,6 g agarozy w kolbie o pojemności 250 ml i dodając 60 ml 1x buforu Tris-acetate-EDTA (TAE) (dostosuj odczynniki, jeśli potrzebny jest inny rozmiar żelu). Rozpuść agarozę ostrożnie i powoli w kuchence mikrofalowej, aby zapobiec rozlaniu się agarozy po kolbie, i pozwól jej ostygnąć do około 55 °C (10-15 min).
      1. Przygotuj wszystkie odczynniki, używając ultraczystej wody dejonizowanej i odczynników klasy analitycznej:
      2. TAE 50x Bufor (zasada Tris, kwas octowy i EDTA) (1 l): Wymieszaj 121,1 g zasady Tris + 372,24 g EDTA i dodaj 500 ml wody destylowanej. Rozpuścić za pomocą mieszadła magnetycznego. Dodać 57,1 ml kwasu octowego i dodać wodę destylowaną do całkowitej objętości 1,000 ml.
      3. Autoklaw w temperaturze 15 psi, 121 °C przez 15 minut i przechowywanie w temperaturze pokojowej do momentu uzyskania gotowości przez okres do 6 miesięcy.
      4. TAE 1x Bufor (1 l): Połącz 20 ml buforu TAE 50x z 980 ml wody destylowanej i wymieszaj.
    8. Pod wyciągiem dodaj 6 μl SYBR Green do stopionej agarozy, wymieszaj i wylej do tacki (i grzebienia), uprzednio uszczelnionej taśmą klejącą, aby uniknąć rozlania. Pozostaw żel na 15-25 minut, aż pojawi się zmętnienie.
      UWAGA: Dostępne są również inne alternatywne barwniki30,31,32,33.
    9. Usuń taśmę klejącą i umieść żel w komorze elektroforezy, dodając wystarczającą ilość 1x bufor TAE, aby pokryć żel.
    10. Wymieszaj 5 μl 6x barwnika ładującego żel DNA z 25 μl każdej reakcji. Delikatnie wymieszać, pipetując w górę i w dół co najmniej 10 razy.
      UWAGA: Nie cały produkt PCR musi być załadowany do żelu, aby uwidocznić oczekiwany produkt (dostosować ilość barwnika zgodnie z potrzebami). Pozostałą próbkę PCR można przechowywać i przechowywać w temperaturze -20 °C przez kilka miesięcy.
    11. Załaduj mieszankę do studzienek (unikaj wprowadzania bąbelków) i odłóż pokrywę komory do dołu.
      UWAGA: Załaduj pierwszą próbkę do drugiej studzienki (pierwszą zarezerwuj na drabinie), zaczynając od kontroli ujemnej.
    12. Załaduj 4 μl drabinki DNA o wielkości 1 kb do pierwszej studzienki.
    13. Uruchom elektroforezę przy napięciu 120 V, 400 mA i 60 minutach.
    14. Wizualizuj żel w świetle UV (z oświetlaczem UV) i zarejestruj obraz.
      UWAGA: Jeśli obecny jest produkt PCR, prążki DNA wybarwione można wykryć za pomocą standardowego transiluminatora UV, transiluminatora światła widzialnego lub skanera laserowego.
Odczynnik Roztwór podstawowyObjętość dodana do 50 μL reakcji (1x)finał Przykład: wolumin Przykład: wolumin Przykład: objętość dodana do każdej probówki Pojemność końcowa 50 μLObjętość dodana do kontroli pozytywnejObjętość dodana do kontroli negatywnej
koncentracjaDodano do 1xDodano do 3x (pula)
Sterylna woda - 21,5 μl (kw. do 50 μl) -21,5 μL 64,5 μl49 μl/probówkę 49 μL/probówkę49 μl/probówkę
Mistrz Mix 2x 25 μL1x25 μL75 μL
Podkład do przodu 25 μM 1 μL0,5 μM1 μL 3 μL
Podkład odwrotny 25 μM 1 μL0,5 μM1 μL3 μL
Matrycowy DNA Zmienna (100–200 ng/μl) Zmienna (1 μL) zmienna0,5 μL 1,5 μL
Polimerazy5 jednostek/μL 0,5 μL2.5 Jednostki- - 1 μl (transkoniugant) 1 μL (dawca)1 μL (odbiornik)
UWAGA: q.s. to łaciński skrót od quantum satis oznaczający potrzebną ilość.

Tabela 1: Odczynniki PCR i pula dla trzech reakcji (przykład). 

powiedział:
Startery (sekwencja wymieniona w orientacji 5' - 3')program PCROczekiwany rozmiar
(bp)Ref.
blaCTX-M grupa 194 oC 7 min(864)23
CTX-M: GGTTAAAAAATCACTGCGYC94 oC 50 s (35 cykli)
CTX-M: TTGGTGACGATTTTAGCCGC POWIEDZIAŁ:50 oC 40 s
68 oC 1 min
68 oC 5 min
blaCMY-295 oC 3 min(1855)24
CMY-2-F: GATTCCTTGGACTCTTCAG95 oC 30 s (30 cykli)
CMY-2-R: TAAAACCAGGTTCCCAGATAGC53 oC 30 s
72 oC 30 s
72 oC 3 min
aac(3')-II94 oC 5 min(237)25
AAC(3')-II-F: ACTGTGATGGGATACGCGTC94 oC 30 s (32 cykle)
AAC(3')-II-R: CTCCGTCAGCGTTTCAGCTA60 oC 45 s
72 oC 2 min
72 oC 8 min
aadA powiedział:94 oC 5 min(283)26
aadA1: GCAGCGCAATGACATTCTTG94 oC 1 min (35 cykli)
aadA2: ATCCTTCGGCGCGATTTTG60 oC 1 min
72 oC 1 min
72 oC 8 min
SUL-394 oC 5 min(799)27
sul-3-F: GAGCAAGATTTTTGGAATCG94 oC 1 min (30 cykli)
sul-3-R: CATCTGCAGCTAACCTAGGGCTTTGGA51 oC 1 min
72 oC 1 min
72 oC 5 min
tet(A)95 oC 5 min(957)28
TETA-1: GTAATTCTGAGCACTGTCGC powiedział:95 oC 30 s (23 cykle)
TETA-2: CTGCCTGGACAACATTGCTT62 oC 30 s
72 oC 45 s
72 oC 7 min
dfrA95 oC 5 min(302) To działa
dfrA-F: CATACCCTGGTCCGCGAAAG95 oC 1 min (30 cykli)
55 oC 1 min
dfrA-R: CGATGTCGATCGTCGATAAGTG72 oC 1 min
72 oC 7 min
kat.A295 oC 5 min
katA2-F: GACCCGGTCTTTACTGTCTTTC95 oC 1 min (25 cykli)(225) Dzieło to
katA2-R: TCCGGTGATATTCAGATTAAAT60 oC 1 min
72 oC 1 min
72 oC 7 min

Tabela 2: Startery i programy PCR używane do amplifikacji genów oporności diagnostycznej. 

Replicon (Replicon)Podkład (sekwencja wymieniona w orientacji 5' - 3')celProgram PCROczekiwany rozmiar (bp)
IncFIBF: TCTGTTTATTCTTTTACTGTCCACrepA94 oC 5 min683
R: CTCCCGTCCTTCAGGGCATT94 oC 1 min (30 cykli)
60 oC 30 s
IncFICF: GTGAACTGGCAGATGAGGAAGGrepA272 oC 1 min262
R: TTCTCCTCGTCGCCAAACTAGAT72 oC 5 min
IncI1F: CGAAAGCCGGACGGCAGAARNAI139
R: TCGTCGTTCCGCCAAGTTCGT

Tabela 3: Startery i program PCR używane do klasyfikacji plazmidów p134797 i p101718 według typowania repliconu opartego na PCR29. 

Wyniki

Biorąc pod uwagę, że szczepy donora SW4955 i SW7037 zostały zsekwencjonowane, oczekuje się, że oba te szczepy będą wykazywać fenotypy oporności odpowiadające profilowi genów oporności zidentyfikowanemu w ich sekwencji genomowej. Plazmid p134797 (z SW4955) posiada geny nadające oporność na cefalosporyny trzeciej generacji (blaCTX-M-55), a także oporność na aminoglikozydy (aac(3)-IIa i aadA1), fenikole (catA2), tetracykliny (tet(A)), trimetoprim (dfrA14) i sulfonamidy (sul3); w chromosomie SW4955 nie znaleziono genów oporności na antybiotyki. Plazmid p101718 (z SW7037) niesie tylko jeden gen oporności na antybiotyki (blaCMY-2), który prawdopodobnie nadaje oporność na cefalosporyny trzeciej generacji (blaCTX-M-55). Ponownie, w chromosomie SW7037 nie znaleziono genów oporności na antybiotyki.

Po kojeniu oczekiwano wykrycia transferu dwóch plazmidów koniugacyjnych niosących wszystkie wspomniane powyżej geny oporności. Pozytywny wynik wykrywania koniugacji oznacza, że biorcy zidentyfikowani jako transkonjuganty powinny nabyć plazmidy koniugacyjne. Oczekiwano również obecności diagnostycznych genów oporności dla plazmidów koniugacyjnych w transkonjugantach (wykrytej za pomocą PCR).

Aby zilustrować opisane tutaj metody, przetestowano zdolność dwóch izolatów środowiskowych E. coli do przenoszenia plazmidowego DNA drogą koniugacji. Schematyczny przedstawienie układu eksperymentalnego pokazano na Rysunku 1. Dwa szczepy donora (E. coli SW4955 i SW7037) oraz jeden szczep biorcy (E. coli LMB100) poddano niezależnym procesom koniugacji. Mapa genetyczna plazmidów koniugacyjnych znalezionych w E. coli SW4955 (p134797) i SW7037 (p101718) przedstawiona jest na Rysunku 2.

Plazmidy koniugacyjne wyselekcjonowano za pomocą karbenicyliny, a kontrselekcję przeprowadzono przy użyciu ryfampicyny i streptomycyny, których determinanty oporności znajdują się w chromosomie biorcy. Agar MacConkeya został wykorzystany do odróżnienia dawców laktozo-dodatnich (które tworzą duże, różowe kolonie) od biorcy i transkonjugantów (które są laktozo-ujemne i tworzą mniejsze, bladożółte kolonie) (Rysunek 3).

Porównanie wzrostu bakterii na płytkach z agarem; zbliżenie kolonii od dawców SW4955, SW7037 oraz biorcy LMB100.
Rycina 3: Ilustracja różnicujących markerów koloru dla kolonii dawców i biorców na agarze MacConkey. Kolonie odpowiadające dawcom są różowe na agarze MacConkey, ponieważ są laktozo-dodatnie. Pozwala to odróżnić kolonie dawców od kolonii biorców, które są bladożółte i mniejsze (laktozo-ujemne). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykryto mobilizację plazmidu koniugacyjnego p134797, przy czym każdy z pięciu antybiotyków odpowiadał pięciu różnym klasom genów oporności obecnych w plazmidzie.

Przedstawiono przykład obliczania wydajności koniugacji (CE) dla szczepu SW4955. W badaniu z użyciem szczepu SW4955 na płytce z rozcieńczeniem 10-2 naliczono 172 CFU transkonjugantów; liczba biorców z odpowiadającego rozcieńczenia (10-2) wyniosła 10 300 000 CFU/mL (Tabela 4).

Wartość CE oblicza się w następujący sposób:

CE = (174 CFU/mL)/(10,300,000 CFU/mL)

CE= 1,67 x 10-5 transkonjugantów/biorcy

LMB100Transkonjuganty szczepu SW4955 wyselekcjonowane na karbelicylinieWydajność koniugacji
RozcieńczenieCFU (płytka zliczalna)Przybliżone CFU/mLCFU (płytka zliczalna)
100zrośnięte1.03E+09
10-1zrośnięte1.03E+08
10-2zrośnięte103000001721.67 x 10-5 transkonjugantów/rekrypienta
10-3zrośnięte1030000
10-4zrośnięte103000
10-5zrośnięte10300
10-6zrośnięte1030
10-7103103
Wartości wykorzystane do obliczenia CE są zaznaczone pogrubieniem.

Tabela 4: Przykład obliczania wydajności koniugacji (CE) dla szczepu SW4955.

Wyniki przedstawiono w Tabeli 5, wyrażone jako wydajność koniugacji na biorcę. Pięć wartości wydajności koniugacji uzyskanych z wykorzystaniem szczepu SW4955 jako donora mieściło się w tym samym rzędzie wielkości. Wyniki te wskazują, że mobilizację plazmidu koniugacyjnego można wykryć niezależnie od rodzaju selekcji zastosowanej do identyfikacji transkonjugantów.

Przy użyciu szczepu SW7037 jako donora uzyskana wydajność koniugacji była o trzy rzędy wielkości niższa; wyniki te pozwalają na porównanie wydajności koniugacji różnych donorów i typów plazmidów przy zastosowaniu tych samych biorców.

Wydajność koniugacji
SzczepKarbenycylina (100 mg/L)Gentamycyna (2 mg/L)Chlorampfenikol (25 mg/L)Tetracyklina (10 mg/L)Trimetoprim (20 mg/L)
SW49551,67 x 10-55,67 x 10-52,17 x 10-57,62 x 10-51,36 x 10-5
SW70372,14 x 10-6

Tabela 5: Wydajność koniugacji szczepów donora E. coli SW4955 i SW7037 w zależności od antybiotyku użytego do selekcji.

W transkonjugantach obecność replikonów oraz wszystkich genów oporności zakodowanych w dwóch testowanych plazmidach koniugacyjnych, a także ich odpowiednich replikonów, sprawdzono za pomocą PCR. Warunki zastosowane w tych diagnostycznych reakcjach PCR przedstawiono w Tabeli 3.

Żele diagnostyczne przedstawiono na Rysunku 4. Żele te potwierdzają obecność oczekiwanych replikonów u transkonjugantów (IncFIC i IncFIB w p1347975 oraz IncI1 w p101718). Potwierdzają one również obecność oczekiwanych genów oporności na antybiotyki, mianowicie grupy blaCTX-M-55 (beta-laktamy), aac(3)-II i aadA (aminoglikozydy), catA2 (fenikole), tet(A) (tetracyklina), dfrA14 (trimetoprim) i sul3 (sulfonamidy) dla p1347975 oraz blaCMY-2 dla p101718 (Rysunek 4).

Wyniki elektroforezy żelowej; wzory prążków DNA; drabinka 1 kb; analiza molekularna.
Rycina 4: Diagnostyczne żele elektroforetyczne. Elektroforeza żelowa produktów PCR genów oporności na antybiotyki i replikonów plazmidowych znalezionych w koniugacyjnych plazmidach p134797 i p101718 w komórkach donora (odpowiednio szczepy SW4955 i SW7037) oraz w odpowiadających im transkonjugantach LMB100. Do selekcji plazmidów użyto karbenicyliny. Skróty. -: kontrola negatywna (jako kontrolę negatywną wykorzystano DNA szczepu LMB100); D: donor; T: transkonjugant. Oczekiwane wielkości amplikonów: blaCTX-M-55: 864 pb; aac(3)-IIa: 237 bp; aadA1: 283 bp; catA2: 225 bp; tet(A): 957 bp; dfrA14: 302 bp; sul3: 799 bp; IncFIC(FII): 262 bp; IncFIB: 683 bp; blaCMY-2: 1,855 bp; IncI1-I: 139 bp. Żel zawiera 1% agarozy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Plazmidy koniugacyjne zapewniają dostęp do wspólnej puli genów w określonym środowisku środowiskowym poprzez rekombinację i horyzontalny transfer genów34. Tak więc plazmidy koniugatywne są jednostkami ewolucyjnymi zdolnymi do nabywania i nadawania funkcji, które pozwalają bakteriom przystosować się do wielu warunków (w tym między innymi oporności na antybiotyki, odporności na metale, nabywania metali, tworzenia biofilmu i genów chorobotwórczych) w skali czasowej godzin.

W pracy przedstawiono protokół identyfikacji plazmidów koniugacyjnych u bakterii. Aby protokół działał, użyte markery muszą różnicować szczepy dawcy i biorcy, jak pokazano w kontrolach w pożywkach A i B. Muszą również skutecznie selekcjonować komórki przenoszące plazmid. Reakcja godowa jest krytyczna. W tej reakcji dawcy i biorcy muszą nawiązać przedłużony kontakt (poprzez pilusy), aby doszło do koniugacji. Wszystko, co może zakłócić kontakt międzykomórkowy, takie jak niewystarczający czas inkubacji lub potrząsanie lub mieszanie kultury, zmniejsza w ten sposób efektywność koniugacji. Wybór biorcy jest również krytyczny, ponieważ niektóre szczepy biorcy są oporne na koniugację35,36. LMB100 jest proponowany jako biorca z wyboru, ponieważ jest w stanie przyjmować plazmidy o wielu typach niezgodności.

Szybkość koniugacji jest specyficzna dla każdej pary chromosomów plazmid-dawca, biorcy i warunków środowiskowych. Stwierdzono, że koniugacja specyficznych plazmidów jest wrażliwa na wiele zmiennych, w tym fazę wzrostu, gęstość komórek, stosunek dawcy do biorcy, to, czy koniugacja odbywa się w środowisku ciekłym czy stałym, węgiel, tlen, sole żółciowe, stężenia metali, obecność komórek ssaków, temperaturę, pH i czas krycia 13,14,15. Badanie tych interakcji zależy od początkowego wykrycia plazmidu sprzęgającego, który ma być dogłębnie zbadany. W związku z tym opisany tutaj protokół może być również modyfikowany w celu zbadania wpływu różnych zmiennych eksperymentalnych, chociaż odbywa się to kosztem ograniczenia liczby przebadanych dawców. Może również identyfikować mobilizowalne plazmidy u gospodarzy, którzy mają plazmidy pomocnicze (tj. plazmidy, które umożliwiają koniugację, zapewniając funkcje, których brakuje w mobilizowalnych plazmidach w trans6).

Znajomość sekwencji plazmidu koniugacyjnego jest zalecana (ale nie jest konieczna do wykrycia koniugacji, jak omówiono powyżej). Gdy dawcy są ujemni pod względem laktozy (produkują żółte kolonie na agarze MacConkey), biorca dodatni pod względem laktozy (wytwarzający różowe kolonie na agarze MacConkey) może być użyty do odróżnienia prawdziwych transkoniugantów od komórek dawcy, które są w stanie rosnąć na pożywce w celu wybrania transkoniugancji. Opisany tutaj protokół ma na celu wykrywanie plazmidów koniugacyjnych od środowiskowych, komensalnych i patogennych członków rodziny Enterobacteriaceae; Można go jednak stosować z dowolnymi gatunkami bakterii z odpowiednim dawcą, biorcą, antybiotykiem (antybiotykami) i markerami kolorowymi. Identyfikacja tych krytycznych składników w innych bakteriach wymaga systematycznych badań z wykorzystaniem wielu dawców, biorców i markerów (antybiotyków i barwników). Protokół ten nie został przetestowany na bakteriach Gram-dodatnich.

Kilka wariantów przedstawionej tu metody zostało opisanych w literaturze, ostatnio recenzowanej20. Wynik jakościowy może być również odniesiony na różne sposoby (np. częstość koniugacji i częstotliwość transferu genów), a jednostki bezwymiarowe mogą być używane do raportowania wydajności koniugacji (mL/CFU x h)20.

Opisany tutaj protokół rozwiązuje kilka ograniczeń, które wcześniej nie były rozwiązywane przez istniejące metody 16,18,19,20. W pierwszej kolejności zidentyfikowano odpowiedniego odbiorcę. Po drugie, zastosowanie dwóch antybiotyków (ryfampicyny i streptomycyny) do selekcji prawdziwych transkoniugantów minimalizuje możliwość, że dawcy wyewoluują oporność na jeden z antybiotyków stosowanych do selekcji transkoniugantów poprzez spontaniczną mutagenezę. Fałszywe transkoniuganty mogą również wynikać z ochrony osób postronnych przez hydrolizę antybiotyku stosowanego do selekcji transkoniugantów przez enzymy (np. beta-laktamazy) wytwarzane w dużych ilościach przez dawcę. Po trzecie, uwzględniono kilka eksperymentalnych kontroli w celu zapewnienia, że produkt krycia jest prawdziwym transkoniugantem (tj. komórką biorcy, która stabilnie włączyła koniugacyjny plazmid dawcy). Tutaj przedstawiliśmy dwie niezależne metody badania autentyczności transkoniugantów, a mianowicie marker kolorymetryczny w agarze MacConkey oraz wykrywanie PCR replikonów i genów oporności na antybiotyki plazmidu koniugacyjnego u biorcy. Opisany tutaj protokół ma również na celu wyizolowanie i scharakteryzowanie koniugacyjnych plazmidów od środowiskowych, komensalnych i patogennych członków rodziny Enterobacteriaceae (Escherichia, Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter, Salmonella, Shigella i inne gatunki).

Aby zrozumieć mechanikę koniugacji, obserwacje eksperymentalne zostały zamodelowane za pomocą symulacji komputerowych. Te modele predykcyjne szacują częstotliwość transferu plazmidu dla danej gęstości wzrostu dawców, biorców i transkoniugantów. Model znany jako model punktu końcowego znalazł progi, powyżej których szybkość transferu plazmidu w płynnej hodowli i stwierdził, że na szybkość transferu nie ma wpływu gęstość komórek, stosunek dawcy do biorcy i czas krycia19. Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH) została wykorzystana jako alternatywna metoda transkoniugacyjnego wykrywania plazmidu. FISH umożliwia wizualizację plazmidu za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej poprzez hybrydyzację sondy DNA i docelowego DNA. W związku z tym FISH umożliwia wizualne wykrywanie przepływów plazmidów w różnych populacjach komórek37, chociaż nie ma takiego samego poziomu czułości jak metoda przedstawiona tutaj, jeśli transkoniuganty są wykrywane przez wizualne badania przesiewowe, a nie selekcję.

Istnieje ogromna potrzeba zrozumienia biologii plazmidów koniugacyjnych, które dyspersują geny oporności na antybiotyki w różnych składnikach ekosystemu (kliniki, rolnictwo, ścieki, dzika przyroda, zwierzęta domowe, gleby, rzeki i jeziora). Podsumowując, uproszczone warunki eksperymentalne przedstawione w opisanych tutaj protokołach ułatwiają badania przesiewowe dawców na dużą skalę, a tym samym stanowią kluczowe narzędzie do badania horyzontalnego transferu genów pochodzących z plazmidów koniugacyjnych z różnych źródeł. Można je wykorzystać do zbadania częstości występowania genów oporności na antybiotyki lub innych klinicznie istotnych genów w koniugacyjnych plazmidach pochodzących z wielu źródeł i bakterii. Można je również zaadaptować do badania koniugacji in vivo (np. w jelitach kręgowców) oraz do badania warunków, które modulują skuteczność koniugacji. Wszystkie te badania znacznie przyczynią się do zrozumienia, w jaki sposób mobilizacja wielolekoopornych plazmidów koniugacyjnych przyczynia się do rozprzestrzeniania się oporności wielolekowej.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

LM-B, IMG, AT i IS były wspierane przez GM055246 grantowe NIH przyznane LM-B. GC-C otrzymał stypendium podoktorskie UC MEXUS-CONACYT na dwa kolejne lata: AY 2017-18 i 2018-19. Bardzo dziękujemy studentom Sage Chavez i Pepper St. Clair z programu mentorskiego Academic Inspiration Network (GAIN) sponsorowanego przez Genentech-Foundation za ich wsparcie techniczne w eksperymentach.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Stojaki na probówki 1,5 mlThermo Fisher Scientific22-313630Można go wymienić na inną markę
2,0 ml Fiolki kriogeniczneCorning430659Można go wymienić na inną markę
Probówki stożkowe 14 mlFALCON149597Można go wymienić na inną markę
Stojaki na probówki 14 mlThermo Fisher Scientific8850Można go wymienić na inną markę
1 kb drabinka DNANew England BiolabsN0552G 
Kolby sterylne 250 ml PYREX5320Można go wymienić na marker permanentny innej marki
Kwas octowyFisher ScientificA38SI-212Można go wymienić na inną markę
Agaroza (klasa biologii molekularnej, wielofunkcyjna)Fisher ScientificBP160-500Można go wymienić na inną markę
KarbenicylinaGOLD BIOTECHNOLOGYC-103-50Można go wymienić na inną markę
Jednorazowe pętle inokulacyjne: 1 i mikro; LFisherbrand22-363-595Można go wymienić na inny barwnik
ładujący żel DNA innej marki 6x New England BiolabsB7024SMożna go wymienić na inną markę
EDTAFisher ScientificBP119-500Można go wymienić na inną markę
Elektroniczna waga cyfrowaDenver InstrumentAPX-2001Można go wymienić na inną
markę Rurki stożkowe Eppendorf: 1,5 mlEppendorf14-282-302Można go wymienić na inną markę
Sprzęt do elektroforezy w żelu agarozowymFisher ScientificFP300Można go wymienić na inną markę
Markery odporne na etanolSharpie37001; 37002; 37003Można go wymienić na inną markę
Systemy dokumentacji żeli (UVP GelSolo)AnalytakjenaSP-1108; 849-97-0936-01; 95-0612-01Można go wymienić na inną markę
RękawiceX-GEN44-100MDziała dowolna marka rękawic nitrylowych
Wiaderko do loduThermo Fisher Scientific432128Można go wymienić na inny agar
MacConkey innej marki BD DIFCO212123
Master Mix BioLabsM0496S Można go wymienić na inną markę
MetanolFisher ScientificA452-4Można go wymienić na inną markę
Probówki do mikrowirówek: 2,0 mlFisherbrand05-408-138Można go wymienić na inną markę
Agar Mueller HintonBD DIFCODF0479-17-3
Rosół Mueller HintonBD DIFCO275730
NucleoSpin Plasmid, Mini zestaw do plazmidowego DNATakara Bio USA, Inc., MACHEREY-NAGEL740588. 250
stojaków na probówki do PCRAXYGEN   R96PCRFSPMożna go wymienić na
probówki PCR innej marki (0,2 ml)AXYGEN PCR-02-CMożna go wymienić na inną markę
RifampicinFisher Scientific50-164-7517
Zestaw mikropipet dozujących od 1 do 10 mu; L (P10), 2– 20 μ L (P20), 20– 200 μ L (P200) oraz 200– 1000 μ L (P1000)RAININ17008648; 17008650; 17008652; 17008653Mikropipety powinny być skalibrowane; można wymienić na inną markę
Chlorek soduFisher ScientificS671-3Można go wymienić na inną markę
SpektrofotometrThermo Scientific335905PMożna go wymienić na inną markę
Sterylizowane końcówki do 10 μ L, 200 μ L oraz 1000 μ L Zaćmienie1011-260-000-9; 1018-260-000; 1019-260-000-9Można go wymienić na inną markę
StreptomycinFisher ScientificBP910-50
SYBR Bezpieczny żel DNA barwnik Thermo Fisher ScientificS33102
Taq DNA PolimerazaBioLabsM0273S
Termocykler C1000 Dotyk Bio-Rad1851196Można go wymienić na inną markę
Tris Fisher ScientificBP153-500Można go wymienić na inną markę

Bibliografia

  1. Lederberg, J., Tatum, E. Gene recombination in Escherichia coli. Nature. 158 (4016), 558(1946).
  2. de la Cruz, F., Frost, L. S., Meyer, R. J., Zechner, E. L. Conjugative DNA metabolism in Gram-negative bacteria. FEMS Microbiology Reviews. 34 (1), 18-40 (2010).
  3. Grohmann, E., Muth, G., Espinosa, M. Conjugative plasmid transfer in gram-positive bacteria. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 67 (2), 277-301 (2003).
  4. Koraimann, G., Wagner, M. A. Social behavior and decision making in bacterial conjugation. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 4, 54(2014).
  5. Dziewit, L., et al. Diversity and role of plasmids in adaptation of bacteria inhabiting the Lubin copper mine in Poland, an environment rich in heavy metals. Frontiers in Microbiology. 6, 152(2015).
  6. Smillie, C., Garcillán-Barcia, M. P., Francia, M. V., Rocha, E. P., de la Cruz, F. Mobility of plasmids. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 74 (3), 434-452 (2010).
  7. Balbuena-Alonso, M. G., et al. Genomic analysis of plasmid content in food isolates of E. coli strongly supports its role as a reservoir for the horizontal transfer of virulence and antibiotic resistance genes. Plasmid. 123-124, 102650(2022).
  8. San Millan, A., MacLean, R. C. Fitness costs of plasmids: A limit to plasmid transmission. Microbiol Spectrum. 5 (5), (2017).
  9. Coluzzi, C., Garcillán-Barcia, M. P., de la Cruz, F., Rocha, E. P. C. Evolution of plasmid mobility: Origin and fate of conjugative and nonconjugative plasmids. Molecular Biology and Evolution. 39 (6), 1-23 (2022).
  10. Bevan, E. R., et al. Molecular characterization of plasmids encoding blaCTX-M from faecal Escherichia coli in travellers returning to the UK from South Asia. The Journal of Hospital Infection. 114, 134-143 (2021).
  11. Minja, C. A., Shirima, G., Mshana, S. E. Conjugative plasmids disseminating CTX-M-15 among human, animals and the environment in Mwanza Tanzania: a need to intensify one health approach. Antibiotics. 10 (7), 836(2021).
  12. Carattoli, A. Plasmids and the spread of resistance. International Journal of Medical Microbiology. 303 (6-7), 298-304 (2013).
  13. Sengupta, M., Austin, S. Prevalence and significance of plasmid maintenance functions in the virulence plasmids of pathogenic bacteria. Infection and Immunity. 79 (7), 2502-2509 (2011).
  14. Alderliesten, J. B., et al. Effect of donor-recipient relatedness on the plasmid conjugation frequency: a meta-analysis. BMC Microbiology. 20 (1), 135(2020).
  15. Neil, K., Allard, N., Rodrigue, S. Molecular mechanisms influencing bacterial conjugation in the intestinal microbiota. Frontiers in Microbiology. 12, 673260(2021).
  16. Liu, G., Bogaj, K., Bortolaia, V., Olsen, J. E., Thomsen, L. E. Antibiotic-induced, increased conjugative transfer is common to diverse naturally occurring ESBL plasmids in Escherichia coli. Frontiers in Microbiology. 10, 2119(2019).
  17. Suchman, E. Polymerase chain reaction protocol. American Society for Microbiology. , 1-14 (2011).
  18. Watanabe, T. Infective heredity of multiple drug resistance in bacteria. Bacteriological Reviews. 27 (1), 87-115 (1963).
  19. Simonsen, L., Gordon, D. M., Stewart, F. M., Levin, B. R. Estimating the rate of plasmid transfer: an end-point method. Journal of General Microbiology. 136 (11), 2319-2325 (1990).
  20. Huisman, J. S., et al. Estimating plasmid conjugation rates: A new computational tool and a critical comparison of methods. Plasmid. 121, 102627(2022).
  21. Jung, B., Hoilat, G. J. MacConkey medium. StatPearls. , StatPearls Publishing. (2022).
  22. NucleoSpin Plasmid DNA purification. , Available from: https://www.mn-net.com/media/pdf/45/51/02/Instruction-NucleoSpin-Plasmid.pdf (2022).
  23. Jiang, X., et al. Detection of extended-spectrum beta-lactamases in clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50 (9), 2990-2995 (2006).
  24. Stapleton, P. D., Shannon, K. P., French, G. L. Carbapenem resistance in Escherichia coli associated with plasmid-determined CMY-4 beta-lactamase production and loss of an outer membrane protein. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 43 (5), 1206-1210 (1999).
  25. Ben Yahia, H., et al. Detection of CTX-M-15 harboring Escherichia coli isolated from wild birds in Tunisia. BMC Microbiology. 18 (1), 26(2018).
  26. Madsen, L., Aarestrup, F. M., Olsen, J. E. Characterisation of streptomycin resistance determinants in Danish isolates of Salmonella Typhimurium. Veterinary Microbiology. 75 (1), 73-82 (2000).
  27. Perreten, V., Boerlin, P. A new sulfonamide resistance gene (sul3) in Escherichia coli is widespread in the pig population of Switzerland. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 47 (3), 1169-1172 (2003).
  28. Guardabassi, L., Dijkshoorn, L., Collard, J. M., Olsen, J. E., Dalsgaard, A. Distribution and in-vitro transfer of tetracycline resistance determinants in clinical and aquatic Acinetobacter strains. Journal of Medical Microbiology. 49 (10), 929-936 (2000).
  29. Carattoli, A., et al. Identification of plasmids by PCR-based replicon typing. Journal of Microbiological Methods. 63 (3), 219-228 (2005).
  30. Green, M. R., Sambrook, J. Agarose gel electrophoresis. Cold Spring Harbor protocols. 2019 (1), (2019).
  31. Singer, V. L., Lawlor, T. E., Yue, S. Comparison of SYBR Green I nucleic acid gel stain mutagenicity and ethidium bromide mutagenicity in the Salmonella/mammalian microsome reverse mutation assay (Ames test). Mutation Research. 439 (1), 37-47 (1999).
  32. Tuma, R. S., et al. Characterization of SYBR Gold nucleic acid gel stain: a dye optimized for use with 300-nm ultraviolet transilluminators. Analytical Biochemistry. 268 (2), 278-288 (1999).
  33. Oatey, P. Imaging fluorescently stained DNA with CCD technology How to increase sensitivity and reduce integration times. Biotechniques. 42 (3), 376-377 (2007).
  34. Norman, A., Hansen, L. H., Sørensen, S. J. Conjugative plasmids: vessels of the communal gene pool. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 364 (1527), 2275-2289 (2009).
  35. Du, L., Liu, R. H., Ying, L., Zhao, G. R. An efficient intergeneric conjugation of DNA from Escherichia coli to mycelia of the lincomycin-producer Streptomyces lincolnensis. International Journal of Molecular Sciences. 13 (4), 4797-4806 (2012).
  36. Kirk, J. A., Fagan, R. P. Heat shock increases conjugation efficiency in Clostridium difficile. Anaerobe. 42, 1-5 (2016).
  37. Esteves, G. M., Pereira, J. A., Azevedo, N. F., Azevedo, A. S., Mendes, L. Friends with benefits: An inside look of periodontal microbes' interactions using fluorescence in situ hybridization-Scoping review. Microorganisms. 9 (7), 1504(2021).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Koniugacja E coligeny oporno ci na antybiotykimobilizacja plazmid wwydajno koniugacjimarkery selekcyjnereakcja a cuchowa polimerazyelektroforeza w elu agarozowymdetekcja replikonu plazmidowego
Wykrywanie horyzontalnego transferu genów, w którym pośredniczą naturalne plazmidy koniugacyjne w E. coli
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.