Wykrywanie horyzontalnego transferu genów, w którym pośredniczą naturalne plazmidy koniugacyjne w E. coli

Podsumowanie

Koniugacja pośredniczy w poziomym transferze genów poprzez mobilizację plazmidowego DNA przez dwie różne komórki, ułatwiając rozprzestrzenianie korzystnych genów. W pracy opisano szeroko stosowaną metodę skutecznego wykrywania sprzęgającego transferu plazmidu, opartą na zastosowaniu markerów różnicowych u plazmidu koniugacyjnego, dawcy i biorcy w celu wykrycia transkoniugacji.

Streszczenie

Koniugacja stanowi jeden z głównych mechanizmów ułatwiających horyzontalny transfer genów u bakterii Gram-ujemnych. W pracy opisano metody badania mobilizacji naturalnie występujących plazmidów koniugacyjnych na przykładzie dwóch naturalnie występujących plazmidów. Protokoły te opierają się na zróżnicowanej obecności wybieralnych markerów w plazmidzie dawcy, biorcy i koniugatora. W szczególności opisane metody obejmują: 1) identyfikację naturalnych plazmidów koniugacyjnych, 2) kwantyfikację szybkości koniugacji w kulturze stałej oraz 3) diagnostyczne wykrywanie genów oporności na antybiotyki i typów repliconów plazmidowych u biorców transkoniugantów za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). Opisane tutaj protokoły zostały opracowane w kontekście badania ekologii ewolucyjnej horyzontalnego transferu genów w celu przeprowadzenia badań przesiewowych pod kątem obecności plazmidów koniugacyjnych przenoszących geny oporności na antybiotyki u bakterii występujących w środowisku. Efektywny transfer plazmidów koniugacyjnych zaobserwowany w tych eksperymentach w kulturze podkreśla biologiczne znaczenie koniugacji jako mechanizmu promującego horyzontalny transfer genów w ogóle, a rozprzestrzenianie się oporności na antybiotyki w szczególności.

Wprowadzenie

W 1946 roku Lederberg i Tatum¹ opisali proces seksualny u Escherichia coli K-12, który jest obecnie znany jako koniugacja. Koniugacja bakteryjna to proces, w którym komórka bakteryjna (dawca) przenosi jednokierunkowy materiał genetyczny do innej komórki (biorcy) poprzez bezpośredni kontakt między komórkami. Koniugacja jest szeroko rozpowszechniona w bakteriach^2,3, chociaż frakcja komórek dawcy wyrażających maszynerię koniugacji jest zazwyczaj bardzo mała⁴.

Plazmidy to autonomicznie replikujące się pozachromosomalne elementy DNA. Oprócz genów zaangażowanych w replikację i utrzymanie plazmidu, plazmidy często zawierają ładunek genów zaangażowanych w adaptację do wyzwań środowiskowych, takich jak metale ciężkie lub narażenie na antybiotyki⁵. Plazmidy koniugatywne to klasa plazmidów z zestawem wyspecjalizowanych genów, które umożliwiają ich transfer do komórek biorcy i wspierają ich trwałość po transferze⁶. Plazmidy koniugacyjne różnią się wielkością od 21,8 kb do 1,35 Mb u bakterii z gromady Pseudomonadota (synonim Proteobacteria), z medianą około 100 kb^5,7. Na ogół mają również niską liczbę kopii, prawdopodobnie w celu utrzymania obciążenia metabolicznego gospodarza na niskim poziomie^8,9.

Typowy aparat koniugacyjny składa się z czterech elementów: początku transferu (oriT), relaksazy, białka sprzęgającego typu IV oraz systemu wydzielania typu IV (rurkowata struktura zwana pilusem, która pozwala dawcom kontaktować się z biorcami)⁶. Tylko bardzo mała część komórek przenoszących plazmidy koniugacyjne wyraża maszynerię koniugacji⁴, ale jeśli plazmidy zapewniają przewagę w dopasowaniu, transkoniuganty mogą szybko rozprzestrzeniać się w populacji. Od 35% do ponad 80% izolatów E. coli pobranych z różnych siedlisk ma koniugacyjne plazmidy z genami nadającymi oporność na co najmniej jeden antybiotyk^10,11; Dlatego horyzontalny transfer genów, w którym pośredniczą plazmidy koniugacyjne, jest głównym mechanizmem napędzającym globalne rozprzestrzenianie się genów oporności na antybiotyki¹².

Eksperymenty kryciowe przeprowadzone w hodowli laboratoryjnej wykazały, że na częstotliwość koniugacji wpływa wiele czynników, w tym charakter komórek biorcy, faza wzrostu, gęstość komórek, stosunek dawcy do biorcy, czy koniugacja odbywa się w środowisku płynnym czy stałym, węgiel, tlen, sole żółciowe, stężenia metali, obecność komórek ssaków, temperatura, pH i czas krycia^{13, 14,15}.

Ta praca opisuje protokoły do wykrywania obecności plazmidów koniugacyjnych w danym szczepie gospodarza, do ilościowego określania szybkości koniugacji w kulturze stałej i do dwukrotnego sprawdzania ich transferu do komórek biorcy. Protokoły te mogą być wykorzystane jako pierwszy krok do identyfikacji naturalnych plazmidów koniugacyjnych odpowiednich do badań. Wykorzystują minimalną liczbę uproszczonych kroków, ponieważ są przeznaczone do badania przesiewowego obecności plazmidów koniugacyjnych w bakteriach uzyskanych z wielu źródeł (środowiskowych, komensalnych i chorobotwórczych) na dużą skalę (od dziesiątek do setek dawców).

Dodatkowo, pokazane są testy wykrywające, czy mobilizacja danego plazmidu koniugacyjnego jest niezależna od antybiotyku użytego do wykrywania (tj. znaczenie genu oporności na antybiotyki podczas selekcji) oraz porównujące szybkość koniugacji dwóch plazmidów koniugacyjnych znalezionych w różnych izolatach środowiskowych.

Na podstawie składu genetycznego odpowiednich plazmidów koniugacyjnych (replika plazmidu i skład genu oporności na antybiotyki), każdy krok protokołu może być zmodyfikowany w celu zbadania wpływu różnych czynników, które mogą wpływać na szybkość koniugacji.

Ogólny projekt eksperymentalny:
Podstawowymi składnikami potrzebnymi do przeprowadzenia eksperymentu kojarzenia są komórki dawcy, szczep biorcy i stałe pożywki do wyboru dawców (antybiotyk A), biorców (antybiotyk B) i transkoniugantów (antybiotyk A i B). Transkoniuganty to komórki biorcze, które stabilnie utrzymują koniugacyjny plazmid dawcy.

Komórki dawcy są odporne na antybiotyk (antybiotyk A) i są podatne na marker lub markery używane do selekcji komórek biorczych (antybiotyk B). Lokalizacja genomowa genu oporności na antybiotyki (tj. czy jest on zlokalizowany w chromosomie, czy w plazmidzie komórki dawcy) nie musi być znana a priori, ponieważ mobilizacja markerów oporności na antybiotyki do biorcy (po bezpośrednim kontakcie dawca-biorca) oznacza, że markery dostarczone przez dawcę znajdowały się w plazmidzie.

Szczep biorcy (znany z przyjmowania plazmidów koniugacyjnych) musi mieć stabilny, selektywny marker, którego nie ma u dawcy; ten selektywny marker jest ogólnie odporny na antybiotyk lub biocyd znajdujący się w chromosomie. Wybór biorcy do wykorzystania w eksperymentach godowych ma kluczowe znaczenie, ponieważ niektóre szczepy E. coli różnią się zdolnością do przyjmowania plazmidów koniugacyjnych¹⁶.

Po ustaleniu tych składników, każda kolonia, która rośnie na pożywce z obydwoma antybiotykami (A i B) po kontakcie pary dawca-biorca jest domniemanym transkoniugantem (Rysunek 1). Zakłada się, że dawcy mogą rosnąć w pożywce z antybiotykiem A, ale nie mogą rosnąć w pożywce z antybiotykiem B, oraz że biorcy są w stanie rosnąć w pożywce z antybiotykiem B, ale nie są w stanie rosnąć z antybiotykiem A. Transkoniugację można potwierdzić za pomocą dwóch testów diagnostycznych. Pierwszy test polega na wykrywaniu (za pomocą amplifikacji genów za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy [PCR] lub innymi metodami) genów znajdujących się w plazmidzie koniugacyjnym w koloniach transkoniugantowych. Drugi test polega na zastosowaniu zróżnicowanych markerów barwnych kolonii opartych na metabolizmie laktozy. Zróżnicowany kolor kolonii ujawnia się za pomocą agaru MacConkey; Laktoza zawarta w agarze może być wykorzystana jako źródło fermentacji przez mikroorganizmy fermentujące laktozę (^LAC+). Mikroorganizmy te wytwarzają kwasy organiczne, zwłaszcza kwas mlekowy, które obniżają pH. Neutralna czerwień to wskaźnik pH zawarty w pożywce, który zmienia kolor z białawego na jaskrawoczerwony/różowy, gdy pH spada poniżej 6,8¹⁷. Tak więc szczepy E. coli laktozo-dodatnie wytwarzają większe różowe kolonie na agarze MacConkey, podczas gdy szczepy ujemne laktozy wytwarzają bladożółte i mniejsze kolonie na agarze MacConkey.

Rysunek 1: Eksperymentalny projekt używany do wykrywania obecności koniugujących plazmidów w szczepach dawców. W tym przykładzie dawca jest nosicielem plazmidu koniugacyjnego z genem oporności na antybiotyki, który nadaje oporność na antybiotyk A, ale jest podatny na antybiotyk B. I odwrotnie, biorca ma determinant oporności chromosomalnej, który zapewnia ochronę przed antybiotykiem B, ale jest podatny na antybiotyk A. Transkoniuganty są oporne na oba antybiotyki (A i B), ponieważ mają koniugacyjny plazmid dawcy, który nadaje odporność na antybiotyk A i chromosom biorcy, który zapewnia ochronę przed antybiotykiem B. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Szybkość koniugacji dla pary dawca-biorca (w danych warunkach eksperymentalnych) może być obliczona dzieląc liczbę transkoniugantów przez liczbę dawców lub przez liczbę biorców; pierwsza szybkość wskazuje frakcję komórek dawcy wykazującą funkcjonalną ekspresję maszynerii koniugacji przez dawcę^16,18, podczas gdy drugi wskaźnik wskazuje na zdolność biorcy do przyjmowania plazmidów koniugacyjnych^19,20. W tym badaniu, o ile nie zaznaczono inaczej, współczynnik koniugacji reprezentuje frakcję komórek biorcy, które stają się transkoniugowane (tj. Szybkość na biorcę).

Tutaj opisano dwa niezależne eksperymenty kryjowe, z udziałem jednego biorcy E. coli i dwóch dawców E. coli. Ponadto zastosowano różne antybiotyki do selekcji transkoniugantów dla jednego z dawców, aby potwierdzić, że pojedynczy plazmid wielolekooporny może być wybrany z dowolnym genem oporności na antybiotyki znajdującym się w plazmidzie sprzężonym.

Szczepy dawcy i biorcy użyte w tej pracy zostały w pełni zsekwencjonowane, aby zrozumieć wszystkie składniki tego eksperymentalnego systemu; jednak te protokoły zostały zaprojektowane do badania obecności plazmidów sprzężonych u gospodarzy o nieznanej sekwencji i mogą być również używane w tym kontekście eksperymentalnym; jednak w tym przypadku, odpowiednie geny są sekwencjonowane jako pierwsze.

Szczepy dawcy i biorcy użyte w protokole są następujące:

Darczyńca 1. Bakteria E. coli SW4955 został zebrany w jeziorze w Baton Rouge (LA, USA). Ma plazmid koniugacyjny 134,797 pz (p134797) z replikonami IncFIC (FII) i IncFIB (AP001918). Ten koniugacyjny plazmid ma geny, które nadają oporność na cefalosporyny trzeciej generacji (bla_CTX-M-55), aminoglikozydy (aac(3)-IIa i aadA1), fenikole (catA2), tetracykliny (tet(A)), trimetoprim (dfrA14) i sulfonamidy (sul3). Pełna mapa p134797 znajduje się na rysunku 2A. Bakteria E. coli SW4955 jest laktozo-dodatni, wytwarza różowe kolonie na agarze MacConkey.

Darczyńca 2. Bakteria E. coli SW7037 został zebrany w jeziorze Erie (hrabstwo Ottawa, OH, USA). Przenosi plazmid koniugacyjny 101,718 pz (p101718) z replikonem IncI1-I(Alpha). Ten sprzęgany plazmid ma gen, który nadaje oporność na beta-laktamy (bla_CMY-2). Pełna mapa p101718 znajduje się na rysunku 2B. Bakteria E. coli SW7037 jest również laktozo-dodatni, wytwarzając różowe kolonie na agarze MacConkey.

Rysunek 2: Mapa genetyczna plazmidów koniugacyjnych użytych w tym badaniu. (A) Plazmid p134797, plazmid koniugacyjny znaleziony w szczepie E. coli SW4955. (B) Plazmid p101718, koniugacyjny plazmid znajdujący się w szczepie E. coli SW7037. Geny oporności na antybiotyki są wyróżnione kolorem niebieskim, a geny należące do aparatu koniugacyjnego są wyróżnione kolorem czerwonym. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Odbiorca. Bakteria E. coli LMB100 jest używany jako odbiorca. Jest to szczep bezplazmidowy, który jest odporny na ryfampicynę (100 mg/L) i streptomycynę (100 mg/L). Oporność na dwa antybiotyki zmniejsza możliwość powstania mutacji oporności u dawcy, które zakłócałyby interpretację wyników. Ponadto E. coli LMB100 jest laktozo-ujemny i można go odróżnić od dwóch szczepów dawców, ponieważ wytwarza bladożółte i małe kolonie (w przeciwieństwie do większych, różowych kolonii) na agarze MacConkey.

Gdy dawca jest laktozo-ujemny, zalecamy użycie laktozy-dodatniego biorcy (np. E. coli J53). Szczepy LMB100 i J53 są dostępne do użytku w innych laboratoriach. Prosimy o wysłanie zapytania do dr Gerardo Cortés-Cortésa wraz z adresem i numerem FedEx.

Stałym podłożem potrzebnym do wyboru i policzenia dawców, biorców i transkoniugantów jest agar MacConkeya na szalkach Petriego o średnicy 100 mm. Konieczne jest dodanie następujących antybiotyków: (i) Pożywka A: karbenicylina (100 mg/l) w celu zliczenia dawców i zapewnienia, że biorcy nie mogą rosnąć z tym antybiotykiem. (ii) Pożywka B: ryfampicyna (100 mg/l) + streptomycyna (100 mg/l) w celu zliczenia biorców i zapewnienia, że dawcy nie mogą rosnąć w tych dwóch antybiotykach. (iii) Pożywka AB: karbenicylina (100 mg/l) + ryfampicyna (100 mg/l) + streptomycyna (100 mg/l) w celu otrzymania i zliczenia transkoniugantów. (iv) Pożywka C: brak antybiotyków do smugowania wszystkich badanych izolatów.

Porównywane są wskaźniki koniugacji plazmidów koniugacyjnych od E. coli SW4955 i E. coli SW7037 do E. coli LMB100. Ponadto w przypadku plazmidu koniugacyjnego p134797 (szczep SW4955) antybiotyk karbenicylina (100 mg/l) jest zastępowany gentamycyną (2 mg/l), chloramfenikolem (25 mg/l), tetracykliną (10 mg/l), trimetoprimem (20 mg/l) lub sulfametoksazolem (100 mg/l) w kolejnych eksperymentach w celu ustalenia, czy marker oporności na antybiotyki zastosowany do selekcji ma jakikolwiek wpływ na wyniki.

Protokół

1. Metoda 1: Koniugacja

1. Dzień 1: Wyślij serię dawców i biorcy. Smugować oddzielnie od zapasów glicerolu na podłożu C (agar MacConkey bez antybiotyków) i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
   UWAGA: Ten krok jest niezbędny, aby upewnić się, że eksperyment jest przeprowadzany z czystymi izolatami i potwierdzić fenotyp laktozy na podstawie koloru kolonii.
2. Dzień 2: Oznacz probówkę hodowlaną o pojemności 14,0 ml dla każdego dawcy i biorcy. Wybierz pojedynczą kolonię każdego dawcy i biorcy i hoduj je przez noc (18 godzin) w oddzielnych probówkach hodowlanych o pojemności 14,0 ml zawierających 2 ml bulionu Mueller Hinton w temperaturze 37 °C i wstrząsających z prędkością 200 obr.
   UWAGA: W stosowanych szczepach fazę stacjonarną osiąga się po całonocnej hodowli trwającej 18 godzin.
3. Dzień 3: Zmierzyć gęstość optyczną przy 600 nm (OD600) nocnej hodowli każdego dawcy i biorcy (bez wirowania) przy użyciu rozcieńczenia 1:10 900 μl roztworu soli i 100 μl nocnej hodowli.
4. Dostosuj gęstość optyczną każdego dawcy i biorcy do 2,0 (OD₆₀₀ = 2,0) za pomocą sterylizowanego roztworu soli fizjologicznej (0,85% NaCl w wodzie).
   UWAGA: Nocna hodowla E. coli o OD₆₀₀ = 2,0 ma 1,6 x 10⁹ CFU/ml.
5. Oznacz probówkę do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml "probówką pasującą", wskazując szczepy dawcy i biorcy. Przenieś 500 μl dostosowanej (OD₆₀₀ = 2,0) zawiesiny każdego dawcy i biorcy i umieść je w probówce łączącej (ta probówka łącząca miałaby 0,8 x 10⁹ CFU/ml każdego dawcy i biorcy). Delikatnie wymieszaj rurkę współpracującą przez odwrócenie.
6. Odwirować probówkę współpracującą przez 10 minut przy 500 x g w temperaturze pokojowej.
7. Nie naruszając osadu, odpipetować 800 μl probówki do koniugacji. W probówce do koniugacji powinno pozostać 200 μl.
   UWAGA: Wyrzuć supernatant do 10% pojemnika z wybielaczem w celu dezaktywacji bakterii w zawiesinie.
8. Inkubować probówkę łączącą przez 18 godzin (przez noc) w temperaturze 37 °C w inkubatorze. Gody następują w czasie inkubacji.
   UWAGA: Ten krok należy wykonać bez potrząsania, aby nie złamać pilusów koniugacyjnych.
9. Jako kontrolę ujemną należy prześledzić całonocny posiew dawców na pożywce B i biorców na pożywce A. Inkubować płytki przez noc w temperaturze 37 °C
10. Dzień 4: Dodać 800 μl roztworu soli fizjologicznej do probówki współpracującej i odwirować w celu ponownego zawieszenia (w ten sposób mieszanina godowa odtwarza się do 1 ml).
    UWAGA: Wirowanie rozbija współpracujące bakterie i homogenizuje kulturę w celu ilościowego określenia CFU/ml.
11. Przygotować rozcieńczenia 1:10 (od 1 x 10⁰ do 1 x ^10-7) mieszanki łączącej. Płytka 100 μl rozcieńczeń od ^10-5 do ^10-7 na pożywce A i pożywce B oraz wszystkie rozcieńczenia na pożywce AB.
    UWAGA: Rozcieńczenie 10⁰ odnosi się do zgrabnej rurki.
12. Poczekaj, aż płytki wyschną przed umieszczeniem ich w inkubatorze do góry nogami. Inkubować płytki przez 18 godzin (przez noc) w temperaturze 37 °C.
13. Dzień 5: Zbadaj kontrole ujemne, aby upewnić się, że smugi czystych nocnych kultur dawców nie wyrosły na pożywce B, a czysta nocna kultura biorców nie wyrosła na pożywce A.
14. Zapisać liczbę kolonii i rozcieńczeń, które można policzyć:
    1. Policz kolonie w pożywce A; to są dawcy. Kolonie powinny być różowe (Rysunek 3A,B).
    2. Policz kolonie w pożywce B; są to biorcy i transkoniuganty. Kolonie powinny być bladożółte (Rysunek 3C).
    3. Policz kolonie w pożywce AB; to są transkoniuganty. Kolonie powinny być bladożółte.
       UWAGA: Wybierz policzalną płytę. Przeliczalna płytka ma od 30 do 300 kolonii (więcej niż 300 kolonii byłoby trudne do policzenia, a mniej niż 30 kolonii uważa się za zbyt małą wielkość próby, aby przedstawić dokładne odwzorowanie oryginalnej próbki).
15. Oblicz częstotliwość koniugacji na dawcę lub biorcę
    Częstość koniugacji na dawcę = (jtk/ml transkoniugantu [pożywka AB])/ (jtk/ml dawców [pożywka A]) x 100
    Częstość koniugacji na biorcę = (CFU/ml transkoniugantu [pożywka AB])/ (CFU/ml biorców i transkoniugantów [pożywka B]) x 100
    UWAGA: Częstość koniugacji dla tego protokołu została obliczona jako liczba transkoniugantów podzielona przez liczbę biorcy pomnożoną przez 100. Zgodnie z literaturą wynikową ilość koniugacji można nazwać jako częstość koniugacji, częstotliwość transferu genów, częstotliwość koniugacji, wydajność rekombinacji, wydajność transferu plazmidu, częstość koniugacji na podstawie całkowitej liczby bakterii, odsetek transkoniugantów, frakcja transkoniugantów w populacji biorców, częstość transkoniugacji, częstość koniugacji, logarytm szybkości koniugacji, stała szybkości transferu, szybkość koniugacji na parę kryjącą, współczynnik koniugacji lub efektywność koniugacji20. Protokół ten odnosi się do terminu efektywność koniugacji.
16. Przechowywać transkoniuwanty w zapasach glicerolu w temperaturze -80 °C. Postępować zgodnie z podetapami przygotowania wywaru glicerynowego.
    1. Wybierz pojedynczą kolonię transkoniugantów i hoduj je przez noc (18 godzin) w probówkach hodowlanych o pojemności 5,0 ml zawierających 2 ml bulionu Mueller Hinton uzupełnionego karbenicyliną (100 mg/l), w temperaturze 37 °C i wstrząsając przy 200 obr./min.
    2. Oznaczyć fiolki kriogeniczne, wskazując nazwę transkoniugantu, w następujący sposób: Tc + imię dawcy + antybiotyk selekcji w pożywce A (ponieważ są to transkoniuganty, wiadomo, że ich tłem jest szczep biorca, który jest już oporny na streptomycynę i ryfampicynę, ale dodatkowo zawiera plazmid przenoszący gen oporności na beta-laktamy); na przykład TcU1Carb. Dodaj liczby ciągłe w przypadku, gdy konieczne jest przechowywanie więcej niż jednego transkoniuganta od tego samego dawcy (np. TcU1Carb1, TcU1Carb2 itp.).
    3. Przenieś 1 ml kultury na noc do 1 ml 50% glicerolu (v/v; końcowe stężenie glicerolu powinno wynosić 25%) i delikatnie wymieszaj przez odwrócenie. Umieścić fiolki kriogeniczne na suchym lodzie na 15 minut i przechowywać kriowiale w temperaturze -80 °C do przyszłych eksperymentów.
17. W celu ekstrakcji DNA należy rozprowadzić trasnkoniuganty z zapasów glicerolu na agarze Mueller Hinton z dodatkiem karbenicyliny (100 mg/l) i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C; następnie postępować zgodnie z zaleceniami z kroku 2.1.

2. Metoda 2: Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) w celu wzmocnienia genów oporności na antybiotyki i replikonów plazmidowych w transkoniugancjach E. coli

UWAGA: Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) została opracowana przez dr Kary'ego Mullisa w 1983 roku. PCR zależy od określonych starterów (krótki fragment DNA komplementarny do danej sekwencji DNA, który działa jako punkt, w którym może przebiegać replikacja, zwykle o długości 20-40 nukleotydów i najlepiej o zawartości guaniny-cytozyny 40%-60%), które są wyżarzane do przeciwległych nici zdenaturowanej, dwuniciowej matrycy DNA i przedłużane przez termostabilną polimerazę DNA, generując w ten sposób dodatkowy szablon dla następnego cyklu reakcji, prowadzący do wykładniczego wzmocnienia oryginalnego szablonu²¹. W tym protokole replikony i geny oporności obecne w plazmidach koniugacyjnych zostały amplifikowane w celu potwierdzenia transferu w komórkach biorcy transkoniugantu.

1. Ekstrakcja DNA
   1. Aby wykryć transfer genów oporności przenoszonych przez plazmidy koniugacyjne, użyj transsprzężonego DNA jako matrycy. Użyj prostej ekstrakcji przygotowawczej, aby zlizować ściany komórkowe bakterii.
      UWAGA: Prosta ekstrakcja przygotowawcza do wrzenia to proste podejście do lizy ścian komórkowych bakterii. Ta ekstrakcja zawiera plazmidowe DNA zmieszane z genomowym DNA, ale ponieważ startery są projektowane zgodnie z określonymi sekwencjami DNA, ta matryca jest również przydatna do PCR. Plazmidy mogą być również specyficznie oczyszczane, chociaż plony mają tendencję do spadku wraz ze wzrostem rozmiaru plazmidu²². Jest to wygodny punkt postoju. DNA może być przechowywane przez kilka miesięcy w temperaturze -20 °C.
2. Metoda PCR
   1. Biorąc pod uwagę, że eksperyment ma kontrolę negatywną i pozytywną, korzystne jest utworzenie puli dla wszystkich reakcji w probówce o pojemności 1,5 ml. Oznacz probówkę o pojemności 1,5 ml jako "pulę" i wymagane probówki PCR nazwą genu i próbki (np. OXA-U1).
   2. Odczynniki do PCR należy pipetować w następującej kolejności do probówki o pojemności 1,5 ml: sterylna woda, 2x Master Mix, startery i polimeraza (z wyjątkiem matrycy DNA) (patrz Tabela 1). Delikatnie wymieszać, pipetując w górę i w dół co najmniej 10 razy. Trzymaj na lodzie przez cały czas.
      UWAGA: Nosić rękawice, aby uniknąć zanieczyszczenia mieszaniny reakcyjnej lub odczynników. Staraj się unikać otwierania i mieszania odczynników oraz obchodzenia się z próbkami w tym samym obszarze, aby zapobiec zanieczyszczeniu odczynnikami. Umieść odczynniki w pojemniku na lód, aby stłumić aktywność nukleazy i niespecyficzne gruntowanie. Pozwól im całkowicie się rozmrozić przed rozpoczęciem reakcji. Utrzymuj odczynniki na lodzie przez cały czas trwania eksperymentu. Polimeraza Taq jest dodawana na końcu, ponieważ jest wrażliwa na zmiany pH; Musi być buforowany, aby uniknąć degradacji lub nieprawidłowego fałdowania. Sekwencja starterów jest wymieniona w Tabeli 2 - Geny oporności na antybiotyki - i Tabeli 3 - Tabela 3 - Odpowiedzi < klasa sup = "xref" > 23 ^< sup class = "xref" > 24 ^< klasa sup = "xref" > 25^,< sup class="xref">26^,< sup class="xref">27^,< sup class="xref">28.
   3. Dodaj matrycę DNA do odpowiedniej probówki. Unikaj wprowadzania pęcherzyków i zabezpiecz nakrętki na probówkach PCR.
   4. Umieść probówki PCR w termocyklerze.
   5. Uruchom program. Zapoznaj się z ustawieniami programu wymienionymi dla każdego genu w Tabeli 2 (Geny oporności) i Tabeli 3 (replikony).
      UWAGA: Ustawić programy PCR tak, aby utrzymywały próbki w temperaturze 4 °C po przebiegu.
      1. Warunki PCR dla replikonów: jeden cykl denaturacji w temperaturze 94 °C przez 5 minut, następnie 30 cykli denaturacji w temperaturze 94 °C przez 1 min, wyżarzanie w temperaturze 60 °C przez 30 s, wydłużenie w temperaturze 72 °C przez 1 minutę i końcowe przedłużenie jednego cyklu w temperaturze 72 °C przez 5 min.
         UWAGA: Są to warunki ustandaryzowane przez Carattoli et al.²⁹.
   6. Po zakończeniu programu przechowuj probówki PCR w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Jest to wygodny punkt postoju. Produkty PCR mogą być przechowywane przez kilka miesięcy w temperaturze -20 °C
   7. Przygotuj 1% żel agarozowy, ważąc 0,6 g agarozy w kolbie o pojemności 250 ml i dodając 60 ml 1x buforu Tris-acetate-EDTA (TAE) (dostosuj odczynniki, jeśli potrzebny jest inny rozmiar żelu). Rozpuść agarozę ostrożnie i powoli w kuchence mikrofalowej, aby zapobiec rozlaniu się agarozy po kolbie, i pozwól jej ostygnąć do około 55 °C (10-15 min).
      1. Przygotuj wszystkie odczynniki, używając ultraczystej wody dejonizowanej i odczynników klasy analitycznej:
      2. TAE 50x Bufor (zasada Tris, kwas octowy i EDTA) (1 l): Wymieszaj 121,1 g zasady Tris + 372,24 g EDTA i dodaj 500 ml wody destylowanej. Rozpuścić za pomocą mieszadła magnetycznego. Dodać 57,1 ml kwasu octowego i dodać wodę destylowaną do całkowitej objętości 1,000 ml.
      3. Autoklaw w temperaturze 15 psi, 121 °C przez 15 minut i przechowywanie w temperaturze pokojowej do momentu uzyskania gotowości przez okres do 6 miesięcy.
      4. TAE 1x Bufor (1 l): Połącz 20 ml buforu TAE 50x z 980 ml wody destylowanej i wymieszaj.
   8. Pod wyciągiem dodaj 6 μl SYBR Green do stopionej agarozy, wymieszaj i wylej do tacki (i grzebienia), uprzednio uszczelnionej taśmą klejącą, aby uniknąć rozlania. Pozostaw żel na 15-25 minut, aż pojawi się zmętnienie.
      UWAGA: Dostępne są również inne alternatywne barwniki^30,31,32,33.
   9. Usuń taśmę klejącą i umieść żel w komorze elektroforezy, dodając wystarczającą ilość 1x bufor TAE, aby pokryć żel.
   10. Wymieszaj 5 μl 6x barwnika ładującego żel DNA z 25 μl każdej reakcji. Delikatnie wymieszać, pipetując w górę i w dół co najmniej 10 razy.
       UWAGA: Nie cały produkt PCR musi być załadowany do żelu, aby uwidocznić oczekiwany produkt (dostosować ilość barwnika zgodnie z potrzebami). Pozostałą próbkę PCR można przechowywać i przechowywać w temperaturze -20 °C przez kilka miesięcy.
   11. Załaduj mieszankę do studzienek (unikaj wprowadzania bąbelków) i odłóż pokrywę komory do dołu.
       UWAGA: Załaduj pierwszą próbkę do drugiej studzienki (pierwszą zarezerwuj na drabinie), zaczynając od kontroli ujemnej.
   12. Załaduj 4 μl drabinki DNA o wielkości 1 kb do pierwszej studzienki.
   13. Uruchom elektroforezę przy napięciu 120 V, 400 mA i 60 minutach.
   14. Wizualizuj żel w świetle UV (z oświetlaczem UV) i zarejestruj obraz.
       UWAGA: Jeśli obecny jest produkt PCR, prążki DNA wybarwione można wykryć za pomocą standardowego transiluminatora UV, transiluminatora światła widzialnego lub skanera laserowego.

Odczynnik	Roztwór podstawowy	Objętość dodana do 50 μL reakcji (1x)	finał	Przykład: wolumin	Przykład: wolumin	Przykład: objętość dodana do każdej probówki Pojemność końcowa 50 μL	Objętość dodana do kontroli pozytywnej	Objętość dodana do kontroli negatywnej
			koncentracja	Dodano do 1x	Dodano do 3x (pula)
Sterylna woda	-	21,5 μl (kw. do 50 μl)	-	21,5 μL	64,5 μl	49 μl/probówkę	49 μL/probówkę	49 μl/probówkę
Mistrz Mix	2x	25 μL	1x	25 μL	75 μL
Podkład do przodu	25 μM	1 μL	0,5 μM	1 μL	3 μL
Podkład odwrotny	25 μM	1 μL	0,5 μM	1 μL	3 μL
Matrycowy DNA	Zmienna (100–200 ng/μl)	Zmienna (1 μL)	zmienna	0,5 μL	1,5 μL
Polimerazy	5 jednostek/μL	0,5 μL	2.5 Jednostki	-	-	1 μl (transkoniugant)	1 μL (dawca)	1 μL (odbiornik)
UWAGA: q.s. to łaciński skrót od quantum satis oznaczający potrzebną ilość.

Tabela 1: Odczynniki PCR i pula dla trzech reakcji (przykład). 

powiedział:

Startery (sekwencja wymieniona w orientacji 5' - 3')	program PCR	Oczekiwany rozmiar
		(bp)Ref.
blaCTX-M grupa 1	94 oC 7 min	(864)23
CTX-M: GGTTAAAAAATCACTGCGYC	94 oC 50 s (35 cykli)
CTX-M: TTGGTGACGATTTTAGCCGC POWIEDZIAŁ:	50 oC 40 s
	68 oC 1 min
	68 oC 5 min
blaCMY-2	95 oC 3 min	(1855)24
CMY-2-F: GATTCCTTGGACTCTTCAG	95 oC 30 s (30 cykli)
CMY-2-R: TAAAACCAGGTTCCCAGATAGC	53 oC 30 s
	72 oC 30 s
	72 oC 3 min
aac(3')-II	94 oC 5 min	(237)25
AAC(3')-II-F: ACTGTGATGGGATACGCGTC	94 oC 30 s (32 cykle)
AAC(3')-II-R: CTCCGTCAGCGTTTCAGCTA	60 oC 45 s
	72 oC 2 min
	72 oC 8 min
aadA powiedział:	94 oC 5 min	(283)26
aadA1: GCAGCGCAATGACATTCTTG	94 oC 1 min (35 cykli)
aadA2: ATCCTTCGGCGCGATTTTG	60 oC 1 min
	72 oC 1 min
	72 oC 8 min
SUL-3	94 oC 5 min	(799)27
sul-3-F: GAGCAAGATTTTTGGAATCG	94 oC 1 min (30 cykli)
sul-3-R: CATCTGCAGCTAACCTAGGGCTTTGGA	51 oC 1 min
	72 oC 1 min
	72 oC 5 min
tet(A)	95 oC 5 min	(957)28
TETA-1: GTAATTCTGAGCACTGTCGC powiedział:	95 oC 30 s (23 cykle)
TETA-2: CTGCCTGGACAACATTGCTT	62 oC 30 s
	72 oC 45 s
	72 oC 7 min
dfrA	95 oC 5 min	(302) To działa
dfrA-F: CATACCCTGGTCCGCGAAAG	95 oC 1 min (30 cykli)
	55 oC 1 min
dfrA-R: CGATGTCGATCGTCGATAAGTG	72 oC 1 min
	72 oC 7 min
kat.A2	95 oC 5 min
katA2-F: GACCCGGTCTTTACTGTCTTTC	95 oC 1 min (25 cykli)	(225) Dzieło to
katA2-R: TCCGGTGATATTCAGATTAAAT	60 oC 1 min
	72 oC 1 min
	72 oC 7 min

Tabela 2: Startery i programy PCR używane do amplifikacji genów oporności diagnostycznej. 

Replicon (Replicon)	Podkład (sekwencja wymieniona w orientacji 5' - 3')				cel	Program PCR	Oczekiwany rozmiar (bp)
IncFIB	F: TCTGTTTATTCTTTTACTGTCCAC				repA	94 oC 5 min	683
	R: CTCCCGTCCTTCAGGGCATT					94 oC 1 min (30 cykli)
						60 oC 30 s
IncFIC	F: GTGAACTGGCAGATGAGGAAGG				repA2	72 oC 1 min	262
	R: TTCTCCTCGTCGCCAAACTAGAT					72 oC 5 min
IncI1	F: CGAAAGCCGGACGGCAGAA				RNAI		139
	R: TCGTCGTTCCGCCAAGTTCGT

Tabela 3: Startery i program PCR używane do klasyfikacji plazmidów p134797 i p101718 według typowania repliconu opartego na PCR²⁹. 

Wyniki

Biorąc pod uwagę, że dawcy SW4955 i SW7037 zostali zsekwencjonowani, oczekuje się, że te dwa szczepy dawców będą miały fenotypy odporności odpowiadające profilowi genu oporności zidentyfikowanemu w ich sekwencji genomowej. Plazmid p134797 (od SW4955) ma geny, które nadają odporność na cefalosporyny trzeciej generacji (bla_CTX-M-55) oraz oporność na aminoglikozydy (aac(3)-IIa i aadA1), fenikole (catA2), tetracykliny (tet(A)), trimetoprim (dfrA14) i sulfonamidy (sul3); w chromosomie SW4955 nie stwierdzono genów oporności na antybiotyki. Plazmid p101718 (od SW7037) jest nosicielem tylko jednego genu oporności na antybiotyki (bla_CMY-2), który ma nadawać oporność na cefalosporyny trzeciej generacji (bla_CTX-M-55). Ponownie nie znaleziono genów oporności na antybiotyki w chromosomie SW7037.

Po kryciu oczekiwano wykrycia transferu dwóch koniugacyjnych plazmidów zawierających wszystkie wyżej wymienione geny odporności. Pozytywne wykrywanie koniugacji oznacza, że biorcy zidentyfikowani jako transkoniuganci powinni byli nabyć plazmidy koniugacyjne. Spodziewano się również obecności genów oporności diagnostycznej na plazmidy koniugacyjne w transkoniugancjach (wykrytych za pomocą PCR).

Aby zilustrować opisane tutaj metody, przetestowano zdolność dwóch izolatów środowiskowych E. coli do przenoszenia plazmidowego DNA przez koniugację. Schematyczne przedstawienie ustawienia eksperymentalnego jest pokazane w Rysunek 1. Dwóch dawców (E. coli SW4955 i SW7037) i jeden biorca (E. coli LMB100) kryto niezależnie. Mapa genów plazmidów koniugacyjnych znalezionych w E. coli SW4955 (p134797) i SW7037 (p101718) jest pokazana w Rysunek 2.

Plazmidy koniugacyjne zostały wybrane za pomocą karbenicyliny i przeciwselekcji za pomocą ryfampicyny i streptomycyny, których determinanty oporności znajdują się w chromosomie biorcy. Agar MacConkeya został użyty do odróżnienia dawców laktozo-dodatnich (którzy wytwarzają duże, różowe kolonie) od biorcy i transkoniugantów (które są ujemne pod względem laktozy i wytwarzają mniejsze, bladożółte kolonie) (Ryc. 3).

Rysunek 3: Ilustracja różnicowych znaczników kolorów dla kolonii dawców i biorców na agarze MacConkey. Kolonie odpowiadające dawcom są różowe na agarze MacConkey, ponieważ są laktozo-dodatnie. Odróżnia to kolonie dawcy od biorcy, które są bladożółte i mniejsze (laktoza ujemna). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wykryto mobilizację koniugacyjnego plazmidu p134797, przy czym każdy z pięciu antybiotyków odpowiadał pięciu różnym klasom genów oporności znajdujących się w plazmidzie.

Przedstawiono przykład obliczania efektywności koniugacji (CE) dla szczepu SW4955. Z testu ze szczepem SW4955 na płytce naliczono 172 CFU transkoniugantów z rozcieńczenia ^10-2; liczba biorców z odpowiedniego rozcieńczenia (^10-2) wynosiła 10 300 000 jtk/ml (Tabela 4).

CE oblicza się w następujący sposób:

CE = (174 jtk/ml)/(10,300,000 CFU/ml)

CE= 1,67 x ^10-5 transkoniugantów/odbiorcę

się się się się się się się

	LMB100		Transkoniuganty ze szczepu SW4955 wyselekcjonowane z karbelicyliną	Efektywność koniugacji
Rozcieńczeniu	CFU (płytka policzalna)	Około jtk/ml	CFU (płytka policzalna)
100	Zlewający	1.03E+09
10-1	Zlewający	1.03E+08
10-2	Zlewający	Numer katalogowy: 10300000	172 Rozdział 172	1,67 x 10-5 transkoniugantów/biorca
10-3	Zlewający	Numer katalogowy: 1030000
10-4	Zlewający	Numer katalogowy: 103000
10-5	Zlewający	Numer katalogowy: 10300
10-6	Zlewający	Numer katalogowy 1030
10-7	Rozdział 103	Rozdział 103
Wartości używane do obliczania CE są wyróżnione pogrubioną czcionką.

Tabela 4: Przykład jak obliczyć efektywność koniugacji (CE) dla szczepu SW4955.

Wyniki są pokazane w Tabeli 5, wyrażone jako wydajność koniugacji na odbiorcę. Pięć sprawności koniugacji uzyskanych przy użyciu szczepu SW4955 jako dawcy mieściło się w tym samym rzędzie wielkości. Wyniki te wskazują, że mobilizację plazmidu koniugacyjnego można wykryć niezależnie od selekcji użytej do identyfikacji transkoniugantu.

Używając szczepu SW7037 jako dawcy, uzyskana wydajność koniugacji była o trzy rzędy wielkości niższa; wyniki te pozwalają na porównanie efektywności koniugacji różnych dawców i typów plazmidów z tymi samymi biorcami.

szt. szt.

	Efektywność koniugacji
naprężać	Karbenicylina (100 mg/l)	Gentamycyna (2 mg/l)	Chloramfenikol (25 mg/l)	Tetracyklina (10 mg/l)	trimetoprim (20 mg/l)
Zobacz materiał SW4955	1,67 x 10-5	5,67 x 10-5	2,17 x 10-5	7,62 x 10-5	1,36 x 10-5
Zobacz materiał SW7037	2,14 x 10-6

Tabela 5: Skuteczność koniugacji szczepów dawców E. coli SW4955 i SW7037 w zależności od antybiotyku użytego do selekcji.

U transkoniugantów obecność replikonów i wszystkich genów oporności zakodowanych w dwóch testowanych plazmidach koniugacyjnych i odpowiadających im replikonach została sprawdzona za pomocą PCR. Warunki stosowane w tych diagnostycznych reakcjach PCR przedstawiono w Tabeli 3.

Żele diagnostyczne są pokazane w Rysunek 4. Żele te potwierdzają obecność oczekiwanych replikonów w transkoniugancjach (IncFIC i IncFIB w p1347975 oraz IncI1 w p101718). Potwierdzają również obecność oczekiwanych genów oporności na antybiotyki, a mianowicie grupy bla_CTX-M-55 (beta-laktam), aac(3)-II i aadA (aminoglikozyd), catA2 (fenikol), tet(A) (tetracyklina), dfrA14 (trimetoprim) i sul3 (sulfonamid) dla p1347975 oraz bla_CMY-2 dla p101718 (Figura 4).

Rysunek 4: Żele do elektroforezy diagnostycznej. Elektroforeza żelowa produktów PCR genów oporności na antybiotyki i replikonów plazmidowych znajdujących się w plazmidach koniugacyjnych p134797 i p101718 w komórkach dawcy (szczepy SW4955 i SW7037, odpowiednio) oraz w odpowiadających im transkoniugancjach LMB100. Do selekcji plazmidu użyto karbenicyliny. Skróty. -: kontrola ujemna (jako kontrolę ujemną wykorzystano DNA szczepu LMB100); D: dawca; T: transkoniugant. Oczekiwane rozmiary amplikonów: bla_CTX-M-55: 864 pb; aac(3)-IIa: 237 punktów bazowych; aadA1: 283 punktów bazowych; kat. A2: 225 punktów bazowych; tet(A): 957 punktów bazowych; dfrA14: 302 punkty bazowe; SUL3: 799 punktów bazowych; IncFIC(FII): 262 punkty bazowe; IncFIB: 683 pb; bla_CMY-2: 1 855 pz; IncI1-I: 139 pz. Żel zawiera 1% agarozy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Plazmidy koniugacyjne zapewniają dostęp do wspólnej puli genów w określonym środowisku środowiskowym poprzez rekombinację i horyzontalny transfer genów³⁴. Tak więc plazmidy koniugatywne są jednostkami ewolucyjnymi zdolnymi do nabywania i nadawania funkcji, które pozwalają bakteriom przystosować się do wielu warunków (w tym między innymi oporności na antybiotyki, odporności na metale, nabywania metali, tworzenia biofilmu i genów chorobotwórczych) w skali czasowej godzin.

W pracy przedstawiono protokół identyfikacji plazmidów koniugacyjnych u bakterii. Aby protokół działał, użyte markery muszą różnicować szczepy dawcy i biorcy, jak pokazano w kontrolach w pożywkach A i B. Muszą również skutecznie selekcjonować komórki przenoszące plazmid. Reakcja godowa jest krytyczna. W tej reakcji dawcy i biorcy muszą nawiązać przedłużony kontakt (poprzez pilusy), aby doszło do koniugacji. Wszystko, co może zakłócić kontakt międzykomórkowy, takie jak niewystarczający czas inkubacji lub potrząsanie lub mieszanie kultury, zmniejsza w ten sposób efektywność koniugacji. Wybór biorcy jest również krytyczny, ponieważ niektóre szczepy biorcy są oporne na koniugację^35,36. LMB100 jest proponowany jako biorca z wyboru, ponieważ jest w stanie przyjmować plazmidy o wielu typach niezgodności.

Szybkość koniugacji jest specyficzna dla każdej pary chromosomów plazmid-dawca, biorcy i warunków środowiskowych. Stwierdzono, że koniugacja specyficznych plazmidów jest wrażliwa na wiele zmiennych, w tym fazę wzrostu, gęstość komórek, stosunek dawcy do biorcy, to, czy koniugacja odbywa się w środowisku ciekłym czy stałym, węgiel, tlen, sole żółciowe, stężenia metali, obecność komórek ssaków, temperaturę, pH i czas krycia 13,14,15. Badanie tych interakcji zależy od początkowego wykrycia plazmidu sprzęgającego, który ma być dogłębnie zbadany. W związku z tym opisany tutaj protokół może być również modyfikowany w celu zbadania wpływu różnych zmiennych eksperymentalnych, chociaż odbywa się to kosztem ograniczenia liczby przebadanych dawców. Może również identyfikować mobilizowalne plazmidy u gospodarzy, którzy mają plazmidy pomocnicze (tj. plazmidy, które umożliwiają koniugację, zapewniając funkcje, których brakuje w mobilizowalnych plazmidach w trans⁶).

Znajomość sekwencji plazmidu koniugacyjnego jest zalecana (ale nie jest konieczna do wykrycia koniugacji, jak omówiono powyżej). Gdy dawcy są ujemni pod względem laktozy (produkują żółte kolonie na agarze MacConkey), biorca dodatni pod względem laktozy (wytwarzający różowe kolonie na agarze MacConkey) może być użyty do odróżnienia prawdziwych transkoniugantów od komórek dawcy, które są w stanie rosnąć na pożywce w celu wybrania transkoniugancji. Opisany tutaj protokół ma na celu wykrywanie plazmidów koniugacyjnych od środowiskowych, komensalnych i patogennych członków rodziny Enterobacteriaceae; Można go jednak stosować z dowolnymi gatunkami bakterii z odpowiednim dawcą, biorcą, antybiotykiem (antybiotykami) i markerami kolorowymi. Identyfikacja tych krytycznych składników w innych bakteriach wymaga systematycznych badań z wykorzystaniem wielu dawców, biorców i markerów (antybiotyków i barwników). Protokół ten nie został przetestowany na bakteriach Gram-dodatnich.

Kilka wariantów przedstawionej tu metody zostało opisanych w literaturze, ostatnio recenzowanej²⁰. Wynik jakościowy może być również odniesiony na różne sposoby (np. częstość koniugacji i częstotliwość transferu genów), a jednostki bezwymiarowe mogą być używane do raportowania wydajności koniugacji (mL/CFU x h)²⁰.

Opisany tutaj protokół rozwiązuje kilka ograniczeń, które wcześniej nie były rozwiązywane przez istniejące metody 16,18,19,20. W pierwszej kolejności zidentyfikowano odpowiedniego odbiorcę. Po drugie, zastosowanie dwóch antybiotyków (ryfampicyny i streptomycyny) do selekcji prawdziwych transkoniugantów minimalizuje możliwość, że dawcy wyewoluują oporność na jeden z antybiotyków stosowanych do selekcji transkoniugantów poprzez spontaniczną mutagenezę. Fałszywe transkoniuganty mogą również wynikać z ochrony osób postronnych przez hydrolizę antybiotyku stosowanego do selekcji transkoniugantów przez enzymy (np. beta-laktamazy) wytwarzane w dużych ilościach przez dawcę. Po trzecie, uwzględniono kilka eksperymentalnych kontroli w celu zapewnienia, że produkt krycia jest prawdziwym transkoniugantem (tj. komórką biorcy, która stabilnie włączyła koniugacyjny plazmid dawcy). Tutaj przedstawiliśmy dwie niezależne metody badania autentyczności transkoniugantów, a mianowicie marker kolorymetryczny w agarze MacConkey oraz wykrywanie PCR replikonów i genów oporności na antybiotyki plazmidu koniugacyjnego u biorcy. Opisany tutaj protokół ma również na celu wyizolowanie i scharakteryzowanie koniugacyjnych plazmidów od środowiskowych, komensalnych i patogennych członków rodziny Enterobacteriaceae (Escherichia, Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter, Salmonella, Shigella i inne gatunki).

Aby zrozumieć mechanikę koniugacji, obserwacje eksperymentalne zostały zamodelowane za pomocą symulacji komputerowych. Te modele predykcyjne szacują częstotliwość transferu plazmidu dla danej gęstości wzrostu dawców, biorców i transkoniugantów. Model znany jako model punktu końcowego znalazł progi, powyżej których szybkość transferu plazmidu w płynnej hodowli i stwierdził, że na szybkość transferu nie ma wpływu gęstość komórek, stosunek dawcy do biorcy i czas krycia¹⁹. Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH) została wykorzystana jako alternatywna metoda transkoniugacyjnego wykrywania plazmidu. FISH umożliwia wizualizację plazmidu za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej poprzez hybrydyzację sondy DNA i docelowego DNA. W związku z tym FISH umożliwia wizualne wykrywanie przepływów plazmidów w różnych populacjach komórek³⁷, chociaż nie ma takiego samego poziomu czułości jak metoda przedstawiona tutaj, jeśli transkoniuganty są wykrywane przez wizualne badania przesiewowe, a nie selekcję.

Istnieje ogromna potrzeba zrozumienia biologii plazmidów koniugacyjnych, które dyspersują geny oporności na antybiotyki w różnych składnikach ekosystemu (kliniki, rolnictwo, ścieki, dzika przyroda, zwierzęta domowe, gleby, rzeki i jeziora). Podsumowując, uproszczone warunki eksperymentalne przedstawione w opisanych tutaj protokołach ułatwiają badania przesiewowe dawców na dużą skalę, a tym samym stanowią kluczowe narzędzie do badania horyzontalnego transferu genów pochodzących z plazmidów koniugacyjnych z różnych źródeł. Można je wykorzystać do zbadania częstości występowania genów oporności na antybiotyki lub innych klinicznie istotnych genów w koniugacyjnych plazmidach pochodzących z wielu źródeł i bakterii. Można je również zaadaptować do badania koniugacji in vivo (np. w jelitach kręgowców) oraz do badania warunków, które modulują skuteczność koniugacji. Wszystkie te badania znacznie przyczynią się do zrozumienia, w jaki sposób mobilizacja wielolekoopornych plazmidów koniugacyjnych przyczynia się do rozprzestrzeniania się oporności wielolekowej.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Stojaki na probówki 1,5 ml	Thermo Fisher Scientific	22-313630	Można go wymienić na inną markę
2,0 ml Fiolki kriogeniczne	Corning	430659	Można go wymienić na inną markę
Probówki stożkowe 14 ml	FALCON	149597	Można go wymienić na inną markę
Stojaki na probówki 14 ml	Thermo Fisher Scientific	8850	Można go wymienić na inną markę
1 kb drabinka DNA	New England Biolabs	N0552G
Kolby sterylne 250 ml	PYREX	5320	Można go wymienić na marker permanentny innej marki
Kwas octowy	Fisher Scientific	A38SI-212	Można go wymienić na inną markę
Agaroza (klasa biologii molekularnej, wielofunkcyjna)	Fisher Scientific	BP160-500	Można go wymienić na inną markę
Karbenicylina	GOLD BIOTECHNOLOGY	C-103-50	Można go wymienić na inną markę
Jednorazowe pętle inokulacyjne: 1 i mikro; L	Fisherbrand	22-363-595	Można go wymienić na inny barwnik
ładujący żel DNA innej marki 6x	New England Biolabs	B7024S	Można go wymienić na inną markę
EDTA	Fisher Scientific	BP119-500	Można go wymienić na inną markę
Elektroniczna waga cyfrowa	Denver Instrument	APX-2001	Można go wymienić na inną
markę Rurki stożkowe Eppendorf: 1,5 ml	Eppendorf	14-282-302	Można go wymienić na inną markę
Sprzęt do elektroforezy w żelu agarozowym	Fisher Scientific	FP300	Można go wymienić na inną markę
Markery odporne na etanol	Sharpie	37001; 37002; 37003	Można go wymienić na inną markę
Systemy dokumentacji żeli (UVP GelSolo)	Analytakjena	SP-1108; 849-97-0936-01; 95-0612-01	Można go wymienić na inną markę
Rękawice	X-GEN	44-100M	Działa dowolna marka rękawic nitrylowych
Wiaderko do lodu	Thermo Fisher Scientific	432128	Można go wymienić na inny agar
MacConkey innej marki	BD DIFCO	212123
Master Mix	BioLabs	M0496S	Można go wymienić na inną markę
Metanol	Fisher Scientific	A452-4	Można go wymienić na inną markę
Probówki do mikrowirówek: 2,0 ml	Fisherbrand	05-408-138	Można go wymienić na inną markę
Agar Mueller Hinton	BD DIFCO	DF0479-17-3
Rosół Mueller Hinton	BD DIFCO	275730
NucleoSpin Plasmid, Mini zestaw do plazmidowego DNA	Takara Bio USA, Inc., MACHEREY-NAGEL	740588. 250
stojaków na probówki do PCR	AXYGEN	R96PCRFSP	Można go wymienić na
probówki PCR innej marki (0,2 ml)	AXYGEN	PCR-02-C	Można go wymienić na inną markę
Rifampicin	Fisher Scientific	50-164-7517
Zestaw mikropipet dozujących od 1 do 10 mu; L (P10), 2– 20 μ L (P20), 20– 200 μ L (P200) oraz 200– 1000 μ L (P1000)	RAININ	17008648; 17008650; 17008652; 17008653	Mikropipety powinny być skalibrowane; można wymienić na inną markę
Chlorek sodu	Fisher Scientific	S671-3	Można go wymienić na inną markę
Spektrofotometr	Thermo Scientific	335905P	Można go wymienić na inną markę
Sterylizowane końcówki do 10 μ L, 200 μ L oraz 1000 μ L	Zaćmienie	1011-260-000-9; 1018-260-000; 1019-260-000-9	Można go wymienić na inną markę
Streptomycin	Fisher Scientific	BP910-50
SYBR Bezpieczny żel DNA barwnik	Thermo Fisher Scientific	S33102
Taq DNA Polimeraza	BioLabs	M0273S
Termocykler C1000 Dotyk	Bio-Rad	1851196	Można go wymienić na inną markę
Tris	Fisher Scientific	BP153-500	Można go wymienić na inną markę