Artykuł metodologiczny

Ocena toksyczności związanej z chimerycznym receptorem antygenowym limfocytów T przy użyciu mysiego modelu ksenoprzeszczepu pobranego od pacjenta z ostrą białaczką limfoblastyczną

2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64535

⸱

10 lutego 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1T Cell Engineering Laboratory, Mayo Clinic, Rochester, 2Division of Hematology, Mayo Clinic, Rochester, 3Mayo Clinic Graduate School of Biomedical Sciences, Mayo Clinic, Rochester, 4Department of Molecular Medicine, Mayo Clinic, Rochester, 5Regenerative Sciences PhD Program, Mayo Clinic, Rochester, 6Department of Immunology, Mayo Clinic, Rochester

W tym artykule

Informacja o sprostowaniu

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Podsumowanie

Tutaj opisujemy protokół, w którym model ksenoprzeszczepu uzyskany od pacjenta z ostrą białaczką limfoblastyczną jest używany jako strategia oceny i monitorowania toksyczności związanej z receptorem chimerycznego antygenu T ukierunkowanym na CD19.

Streszczenie

Terapia komórkami CART (Chimeric antigen receptor T (CART) stała się potężnym narzędziem do leczenia wielu typów nowotworów złośliwych CD19+, co doprowadziło do niedawnego zatwierdzenia przez FDA kilku terapii komórkowych CART (CART19) ukierunkowanych na CD19. Jednak terapia komórkowa CART wiąże się z unikalnym zestawem toksyczności, które niosą ze sobą własną zachorowalność i śmiertelność. Obejmuje to zespół uwalniania cytokin (CRS) i zapalenie nerwów (NI). Wykorzystanie przedklinicznych modeli mysich miało kluczowe znaczenie w badaniach i rozwoju technologii CART do oceny zarówno skuteczności, jak i toksyczności CART. Dostępne modele przedkliniczne do testowania tej adoptywnej immunoterapii komórkowej obejmują modele syngeniczne, ksenoprzeszczepowe, transgeniczne i humanizowane mysie. Nie ma jednego modelu, który płynnie odzwierciedlałby ludzki układ odpornościowy, a każdy model ma mocne i słabe strony. Niniejszy artykuł ma na celu opisanie modelu ksenoprzeszczepu pochodzącego od pacjenta przy użyciu blastów białaczkowych od pacjentów z ostrą białaczką limfoblastyczną jako strategii oceny toksyczności związanej z CART19, CRS i NI. Wykazano, że model ten podsumowuje toksyczność związaną z CART19, a także skuteczność terapeutyczną, którą zaobserwowano w klinice.

Wprowadzenie

Terapia komórkami T z chimerycznym receptorem antygenowym (CART) zrewolucjonizowała dziedzinę immunoterapii nowotworów. Okazał się skuteczny w leczeniu nawrotowej/opornej na leczenie ostrej białaczki limfoblastycznej (ALL), chłoniaka z dużych komórek B, chłoniaka z komórek płaszcza, chłoniaka grudkowego i szpiczaka mnogiego1,2,3,4,5,6,7, co doprowadziło do niedawnych zatwierdzeń FDA. Pomimo początkowych sukcesów w badaniach klinicznych, leczenie terapią komórkową CART powoduje toksyczność, która często jest poważna, a czasami śmiertelna. Najczęstsze objawy toksyczności po terapii komórkami CART obejmują rozwój CRS i NI, określany również jako zespół neurotoksyczności związanej z komórkami efektorowymi układu odpornościowego (ICANS)8,9. CRS jest spowodowany nadmierną aktywacją i masywną ekspansją komórek CART in vivo, co prowadzi do późniejszego wydzielania wielu cytokin zapalnych, w tym interferonu-γ, czynnika martwicy nowotworu-α, czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów-makrofagów (GM-CSF) i interleukiny-6 (IL-6). Powoduje to niedociśnienie, wysoką gorączkę, zespół przesiąkania włośniczek, niewydolność oddechową, niewydolność wielonarządową, a w niektórych przypadkach śmierć10,11. CRS rozwija się w 50-100% przypadków po terapii komórkowej CART1911,12,13. ICANS to kolejne wyjątkowe zdarzenie niepożądane związane z terapią komórkową CART, które charakteryzuje się uogólnionym obrzękiem mózgu, splątaniem, otępieniem, afazją, osłabieniem motorycznym, a czasami drgawkami9,14. Każdy stopień ICANS występuje u maksymalnie 70% pacjentów, a stopnie 3-4 są zgłaszane u 20-30% pacjentów5,10,15,16. Ogólnie rzecz biorąc, CRS i ICANS są powszechne i mogą być śmiertelne.

Zarządzanie ICANS po terapii komórkowej CART jest wyzwaniem. Większość pacjentów z ICANS doświadcza również CRS17, który często może być leczony antagonistą receptora IL-6 tocilizumabem lub sterydami18. Poprzedni raport ujawnił, że wczesna interwencja tocilizumabu zmniejszała częstość występowania ciężkiego CRS, ale nie wpływała na częstość występowania ani nasilenie ICANS19. Obecnie nie ma skutecznego leczenia ani środka profilaktycznego dla ICANS, dlatego kluczowe jest zbadanie strategii prewencyjnych20.

Komórki mieloidalne i związane z nimi cytokiny/chemokiny są uważane za główne czynniki rozwoju CRS i ICANS21. Podczas gdy CRS jest bezpośrednio związany z ekstremalnym wzrostem cytokin i ekspansją limfocytów T, patofizjologia ICANS jest w dużej mierze nieznana22,23. Dlatego konieczne jest stworzenie modelu mysiego, który podsumowuje te toksyczne objawy po terapii komórkami CART, aby zbadać mechanizmy i opracować strategie zapobiegawcze.

Obecnie istnieje wiele przedklinicznych modeli zwierzęcych wykorzystywanych do badania, optymalizacji i walidacji skuteczności komórek CART, a także do monitorowania związanych z nimi toksyczności. Należą do nich myszy syngeniczne, ksenoprzeszczepowe, immunokompetentne transgeniczne, humanizowane transgeniczne i ksenoprzeszczepy pochodzące od pacjentów, a także modele naczelnych. Jednak każdy z tych modeli ma wady, a niektóre z nich nie odzwierciedlają prawdziwej skuteczności lub obaw dotyczących bezpieczeństwa komórek CART24,25. Dlatego konieczne jest staranne wybranie najlepszego modelu dla zamierzonych celów badania.

Ten artykuł ma na celu opisanie metodologii, która jest używana do oceny toksyczności związanej z komórkami CART, CRS i NI, przy użyciu modelu ALL od pacjenta (PDX) in vivo (Rysunek 1). W szczególności w opisanych tutaj metodach komórki CART19 wygenerowane w laboratorium autorów są wykorzystywane zgodnie z wcześniej opisanymi protokołami. Krótko mówiąc, ludzkie limfocyty T są izolowane ze zdrowych komórek jednojądrzastych krwi obwodowej dawcy (PBMC) za pomocą techniki gradientu gęstości, stymulowane kulkami CD3 / CD28 w dniu 0 i transdukowane lentiwirusowo w dniu 1 za pomocą CAR składających się z ukierunkowanego na CD19 fragmentu zmiennego pojedynczego łańcucha połączonego z domenami sygnałowymi 4-1BB i CD3ζ. Te komórki CART są następnie rozszerzane, usuwane z koralików w 6 dniu i kriokonserwowane w 8 dniu26,27,28,29,30. Jak opisano wcześniej, myszy są poddawane leczeniu limfodepletingowemu, a następnie podaje się im blasty białaczkowe pochodzące od pacjenta (ALL)28. Po pierwsze, wszczepienie guza jest weryfikowane poprzez pobranie krwi podżuchwowej. Po ustaleniu odpowiedniego obciążenia nowotworem myszom podaje się komórki CART19. Następnie myszy są codziennie ważone, aby ocenić samopoczucie. Obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego (MRI) u małych zwierząt wykonuje się w celu oceny NI, wraz z krwawieniem z ogona w celu oceny ekspansji limfocytów T i produkcji cytokin/chemokin. Techniki opisane poniżej są zdecydowanie zalecane do stosowania jako model do badania toksyczności związanej z komórkami CART w modelu PDX.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Ten protokół jest zgodny z wytycznymi Instytucjonalnej Komisji Rewizyjnej (IRB) Kliniki Mayo, Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC A00001767) oraz Instytucjonalnego Komitetu Bezpieczeństwa Biologicznego (IBC, Bios00000006.04).

UWAGA: Wszystkie materiały używane do pracy z myszami muszą być sterylne.

1. Wstrzyknięcie busulfanu myszom NSG

  1. Zdobądź samce, 8-12 tygodniowe, z obniżoną odpornością, NOD-SCID IL2rγnull (NSG) myszy i zważ je przed wstrzyknięciem.
    UWAGA: W celu uzyskania istotności statystycznej zaleca się użycie co najmniej pięciu myszy na grupę i powtórzenie tego eksperymentu co najmniej raz na samicach.
  2. Przygotować busulfan do wstrzyknięcia dootrzewnowego (i.p.). Używając strzykawki insulinowej o pojemności 1 ml, powoli i ostrożnie napełnij strzykawkę dokładnie 30 mg/kg busulfanu, a następnie wstrzyknij i.p myszom i umieść je z powrotem w klatce.

2. Wstrzyknięcie WSZYSTKICH blastów pochodzących od pacjenta (CD19+) myszom NSG

UWAGA: Ten protokół jest zgodny z wytycznymi Instytucjonalnego Komitetu ds. Bezpieczeństwa Biologicznego Kliniki Mayo (IBC, Bios00000006.04).

  1. Zbierz pierwotne blasty białaczkowe z krwi obwodowej pacjentów z nawrotową i oporną na leczenie ALL.
  2. Przygotować komórki docelowe do wstrzyknięcia dożylnego (dożylnego).
    1. Policz komórki docelowe CD19+ za pomocą hemocytometru i zapisz końcową objętość i stężenie komórek.
      UWAGA: Aby określić żywotność komórek, zdecydowanie zaleca się użycie błękitu trypanowego podczas liczenia komórek.
    2. Granulować komórki przez odwirowanie w temperaturze 300 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    3. Zawiesić osad komórkowy w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS) do końcowego stężenia 50 × 106 komórek/ml w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i umieścić na lodzie.
    4. Ostrożnie przetrząsać palcem probówkę mikrowirówkową o pojemności 1,5 ml zawierającą komórki docelowe, aż komórki zostaną całkowicie zhomogenizowane.
    5. Używając strzykawki insulinowej o pojemności 1 ml, powoli i ostrożnie napełnij strzykawkę dokładnie 100 μl przygotowanych komórek docelowych i przesuń strzykawkę, aby usunąć pęcherzyki.
      UWAGA: Objętość 100 μL pozwoli na podanie 5 × 106 komórek do każdej myszy.
    6. Umieść myszy w ciepłym świetle na 5-10 minut. Gdy żyła ogonowa stanie się obrzęknięta i bardziej widoczna gołym okiem, umieść myszy w odpowiedniej komorze ograniczającej.
    7. Przetrzyj ogon myszy wacikiem nasączonym alkoholem. Wstrzyknij komórki docelowe bezpośrednio do żyły ogonowej (iv) i umieść mysz z powrotem w klatce. Po zaszczepieniu komórek docelowych należy monitorować myszy codziennie lub zgodnie z zaleceniami lokalnej komisji etycznej ds. zwierząt.

3. Ocena wszczepienia guza

  1. Począwszy od 6 tygodni po wstrzyknięciu komórki docelowej, oceń wszczepienie guza za pomocą cytometrii przepływowej w celu zmierzenia ekspresji komórek CD19 + we krwi obwodowej.
  2. Test krwi obwodowej w celu oceny ekspansji CD19 +
    1. Pobrać krew od myszy 6-8 tygodni po wstrzyknięciu komórek CART19.
      UWAGA: Do pobrania krwi można zastosować kilka metod. W przypadku tego protokołu preferowaną metodą jest pobieranie krwi podżuchwowej.
    2. Znieczulić mysz izofluranem w komorze indukcyjnej z 5% izofluranem. Po uzyskaniu znieczulenia należy utrzymać poziom 1-3% izofluranu wdychanego przez stożek nosowy.
      UWAGA: Zdecydowanie zaleca się stosowanie maści okulistycznej, aby zapobiec wysuszeniu oczu.
    3. Wyjmij mysz z komory i przytrzymaj mysz ręką niedominującą, chwytając luźną skórę nad szyją. Nakłuć żyłę lancetem nieco za żuchwą.
      UWAGA: Do wejścia do żyły potrzebna jest tylko końcówka igły (1-2 mm).
    4. Ponieważ krew kapie, zbierz co najmniej 50 μl do probówki pokrytej heparyną i dobrze wymieszaj, kilkakrotnie odwracając probówkę w górę iw dół. Przenieść 30 μl krwi do probówki z polistyrenu o okrągłym dnie o pojemności 5 ml.
      UWAGA: Aby uzyskać pozostałą krew, odwirować probówkę w temperaturze 17 000 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Przenieść surowicę (warstwę supernatantu) do czystej i znakowanej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze -80 °C (do użycia w teście cytokin).
    5. Dodać 2 ml buforu do lizy (10x bufor lizacyjny na bazie chlorku amonu rozcieńczony do 1x przy użyciu wody wolnej od nukleaz) do 5 ml probówki okrągłodennej zawierającej krew. Bardzo dobrze wymieszaj, wirując rurkę. Inkubować probówkę w temperaturze pokojowej przez 20 minut, aby zapewnić prawidłową lizę czerwonych krwinek.
    6. Dodać 2 ml buforu przepływowego (PBS, 0,2 g/l chlorku potasu, 0,2 g/l jednozasadowego fosforanu potasu, 8 g/l chlorku sodu i 1,15 g/l dwuzasadowego fosforanu sodu zawierającego 2% płodowej surowicy bydlęcej i 1% azydku sodu).
    7. Odwirować probówkę o stężeniu 300 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Zdekantować supernatant i dodać 2 ml buforu przepływowego. Powtórz ten krok prania 2 razy.
    8. Ostrożnie zdekantować zawartość probówki. Zwróć uwagę na niewielką ilość płynu z osadem pozostałym w probówce. Dodać 100 μl buforu przepływowego i bardzo dobrze zawiesić.
    9. Przenieść cały pozostały płyn z probówki przepływowej o pojemności 5 ml do płytki 96-dołkowej. Upewnij się, że każda próbka jest odpowiednio oznakowana. Dodać 100 μl buforu przepływowego do odpowiednich studzienek i odwirować 96-dołkową płytkę o masie 650 × g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C.
  3. Oceń ekspansję komórek docelowych CD19 + za pomocą cytometrii przepływowej (Rysunek 2).
    1. Przygotować mieszankę wzorcową zawierającą 0,3 μl żywej/martwej barwie, 0,13 μg (2,5 μl) przeciwciała anty-ludzkiego CD19, 0,06 μg (2,5 μl) przeciwciała anty-ludzkiego CD45, 5 μg (2,5 μl) anty-mysiego CD45 i 42,2 μl buforu przepływowego, co daje łącznie 50 μl na próbkę. Inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
    2. Przemyć 150 μl buforu przepływowego, a następnie odwirować w stężeniu 650 × g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C. Zdekantować supernatant i ponownie zawiesić osad w 195 μl buforu przepływowego i 5 μl kulek do liczenia.
    3. Zdobądź na cytometrze przepływowym, aby określić poziom ekspresji komórek CD19 +. Do celów bramkowania i analizy najpierw bramkuje się badaną populację (CD19+) na podstawie charakterystyki rozproszenia do przodu i bocznego, a następnie pojedynczą populację bramkowania, a następnie żywe komórki. Po bramkowaniu żywych komórek oceń ludzką populację CD45 w porównaniu z mysią populacją CD45, a z populacji ludzkiej bramkować populację docelową CD19 +.
  4. Określić ilościowo, aby określić ilość obecną w 70 μl, a następnie wyrazić w komórkach/μl za pomocą równania (1):
    Bezwzględna liczba komórek CD19+ = ([Komórki CD19+/koraliki zliczające] × liczba kulek zliczających w granicach 5 μl)/70
    UWAGA: Powtarzaj test krwi obwodowej co 5 dni, aby ocenić ekspansję komórek CD19 +. Pobieraj nie więcej niż 200 μl krwi łącznie co 2 tygodnie, zgodnie z wytycznymi lokalnej komisji etyki zwierząt. Gdy myszy osiągną obciążenie chorobą ≥10 komórek/μl, losowo przydziel je do komórek CART19 lub grup kontrolnych (sekcja 4).

4. Podawanie komórek CART19 in vivo

  1. Przygotowanie komórek CART19 (~Dzień 80):
    UWAGA: Generowanie komórek CART19 zostało wcześniej opublikowane27,30,31. Procedura ta musi być przeprowadzana w komorze bezpieczeństwa biologicznego poziomu 2+ przy użyciu techniki aseptycznej i środków ochrony osobistej.
    1. Rozmrozić komórki CART19 w pojemniku do kąpieli wodnej (37 °C). Następnie umyj komórki w ciepłym podłożu z limfocytów T (TCM), aby usunąć dimetylosulfotlenek.
      UWAGA: TCM składa się z 10% ludzkiej surowicy AB (v / v), 1% penicyliny-streptomycyny-glutaminy (v / v) i pożywki dla komórek krwiotwórczych bez surowicy 27,30.
    2. Odwirować komórki CART19 w temperaturze 300 × g przez 8 minut w temperaturze 4 °C i ponownie zawiesić w ciepłym TCM do końcowego stężenia 2 × 106 komórek/ml. Pozostawić komórki koszyka w inkubatorze (37 °C, 5 % CO2 ) na noc, ale nie dłużej niż 16 godzin.
  2. Podawanie komórek CART19 przez wstrzyknięcie dożylne (dzień ~80)
    1. Policz komórki CART19 i wiruj z prędkością 300 × g przez 8 minut w temperaturze 4 °C.
    2. Ponownie zawiesić komórki CART19 w 10 ml PBS i wirować w temperaturze 300 × g przez 8 minut w temperaturze 4 °C.
    3. Zawiesić komórki CART19 do końcowego stężenia 40 × 106 komórek/ml za pomocą PBS, przenieść komórki do sterylnej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i umieścić je na lodzie.
    4. Wykonaj iniekcję żyły ogonowej komórki CART19 (jak opisano powyżej), wstrzykując 100 μl zawieszonych komórek i.v.
      UWAGA: Objętość 100 μL pozwoli na podanie 4 × 106 komórek do każdej myszy. Włączenie grupy nieleczonych myszy jako kontroli negatywnej.

5. Ocena toksyczności komórek CART19

  1. Po podaniu komórek CART19 monitoruj myszy 2 razy dziennie, aby ocenić wszelkie zmiany w ich samopoczuciu, takie jak osłabienie motoryczne, zgarbione ciało i utrata masy ciała.
    UWAGA: Wszystkie te zmiany fizyczne korelują z objawami CRS w tym modelu28.
  2. Gdy u myszy zacznie rozwijać się osłabienie motoryczne i redukcja masy ciała (redukcja o 10-20% w stosunku do wartości wyjściowej), należy pobrać krew obwodową, aby przeanalizować obciążenie guzem i przeprowadzić izolację surowicy pod kątem cytokin zgodnie z metodologią opisaną w sekcji 3 (Rysunek 3).
  3. Przechowywać probówki do mikrowirówek surowicy w temperaturze -80 °C i użyć surowicy do analizy chemokin i cytokin za pomocą testu Multiplex (Rysunek 4).
    UWAGA: Jeśli myszy wykazują oznaki paraliżu kończyn tylnych, wydają się być w stanie agonalnym lub ospałym, a utrata masy ciała wynosi > 20% ich masy ciała do punktu, który ogranicza ich zdolność do dotarcia do pożywienia i/lub wody, zostaną poddane eutanazji.

6. Obrazowanie MRI

UWAGA: Przedkliniczny (dla małych zwierząt) skaner MRI z pionowym magnesem otworowym został użyty do rezonansu magnetycznego in vivo i akwizycji obrazu32,33.

  1. Wymieszaj 120 μl gadolinu + 880 μl roztworu soli fizjologicznej i załaduj do strzykawki insulinowej o pojemności 1 ml. Wstrzyknąć 100 μl każdej myszy (i.p.).
    UWAGA: Gadolin należy wstrzyknąć 15-20 minut przed rozpoczęciem eksperymentu.
  2. Znieczulić mysz za pomocą izofluranu (2-3%) w komorze indukcyjnej przez 10-15 min.
    UWAGA: Zdecydowanie zaleca się stosowanie maści okulistycznej, aby zapobiec wysuszeniu oczu.
  3. Umieść grzbiet myszy na sondzie kołyskowej kompatybilnej z gryzoniami. Następnie przystąp do ustawiania myszy, zaczepiając jej zębami o pasek gryzowy.
  4. Wciągnij głowę myszy do cewki głośności 25 mm i wyreguluj stożek nosowy podłączony do systemu znieczulenia izofluranem. Dokręć pokrętło belki gryzowej, aby utrzymać pozycję przez cały czas skanowania.
    UWAGA: Jeśli przeprowadzasz badanie MRI ze wzmocnieniem kontrastowym, upewnij się, że gadolin (w tym przypadku) lub środek kontrastowy został wstrzyknięty co najmniej 10 minut przed umieszczeniem aparatu w magnesie otworowym. Przez cały czas obrazowania myszy będą znieczulone przez wdychanie 2-3% izofluranu w powietrzu przez stożek nosowy, a ich częstość oddechów będzie jednocześnie monitorowana.
  5. Do oceny oddechu należy użyć urządzenia do monitorowania oddychania/oddechu.
    UWAGA: Ważne jest również, aby ocenić temperaturę ciała, aby zapobiec możliwej hipotermii spowodowanej długotrwałym narażeniem na znieczulenie. Zaleca się stosowanie poduszek grzewczych do kontrolowania temperatury ciała.
    1. Przymocuj sondę monitora oddechu blisko membrany i zabezpiecz ją taśmą chirurgiczną. Utrzymuj częstość oddechów między 20-60 oddechami na minutę, aby stan myszy był stabilny.
      UWAGA: Ta szybkość zapewnia bardziej stabilne obrazy MRI i zapobiega artefaktom ruchu na uzyskanym obrazie. Jeśli częstość oddechów jest wyższa niż 20-60 oddechów na minutę, należy zwiększyć stężenie izofluranu. Jeśli częstość oddechów jest mniejsza niż 20 oddechów na minutę, znieczulenie jest zbyt głębokie; Dlatego należy zmniejszyć koncentrację.
  6. Włóż sondę zwierzęcą do małego otworu w systemie MRI dla małych zwierząt z otworem pionowym. Wyreguluj głowę zwierzęcia na środku cewki. Zabezpiecz urządzenie zamkiem, aby mogło stać pionowo, i podłącz instrument do komputera.
  7. Otwórz oprogramowanie (np. Paravision) i użyj go, aby skonfigurować pozycje skanowania i typy skanowania. Określ optymalne pozycje osiowe i strzałkowe, zachowując ich spójność dla wszystkich grup eksperymentalnych.
    UWAGA: Zaleca się wykorzystanie skanu próbnego jako odniesienia przed właściwymi pełnowymiarowymi skanami MRI.
  8. Kontynuuj zbieranie danych MRI (zgodnie z wcześniejszym opisem32,34,35,36). Uzyskaj zarówno obrazy MRI T1-zależne, jak i T2-zależne, korzystając z sugerowanej konfiguracji wymienionej poniżej.
    1. W przypadku obrazów MRI zależnych T1 należy użyć wielopunktowej sekwencji wielopunktowej wielorzędowej wieloechowej (MSME) T1 z czasem powtarzania (TR) 300 ms, czasem echa (TE) 9,5 ms, polem widzenia (FOV) 4 cm x 2 cm x 2 cm i matrycą 192 x 96 x 96.
    2. W przypadku obrazów MRI T2-zależnych należy użyć sekwencji Multislice Multiecho (MSME) o TR 300 ms, TE 9,5 ms, FOV 4 cm x 2 cm x 2 cm i matrycy 192 x 96 x 96
      3. .
  9. Po zakończeniu skanowania wyjmij sondę z otworu. Delikatnie wyjmij mysz, usuwając zęby z paska zgryzowego. Monitoruj zwierzę w oddzielnej klatce, dopóki nie będzie w pełni przytomne i nie odzyska odpowiednich funkcji motorycznych.
  10. Po ekstrakcji danych z oprogramowania użyj oprogramowania analitycznego do kwantyfikacji i renderowania objętości 3D (Rysunek 4) obszarów hiperintensywności.
    UWAGA: Jeśli to możliwe, zdecydowanie zaleca się posiadanie dwóch oddzielnych zaślepionych obserwatorów do analizy danych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Celem tego protokołu jest ocena toksyczności związanej z komórkami CART przy użyciu modelu myszy PDX z komórek nowotworowych pacjentów z ALL (Rysunek 1). Po pierwsze, myszy NSG otrzymały zastrzyki i.p. busulfanu (30 mg / kg) w celu immunosupresji i ułatwienia wszczepienia komórek CART28. Następnego dnia otrzymali ~5 × 106 PBMC (iv) pochodzących od pacjentów ALL. Myszy były monitorowane pod kątem wszczepienia przez ~ 13 tygodni za pomocą testu krwawienia z og...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W niniejszym raporcie opisano metodologię oceny toksyczności związanej z komórkami CART przy użyciu modelu ALL PDX. Mówiąc dokładniej, model ten ma na celu naśladowanie dwóch zagrażających życiu toksyn, CRS i NI, których pacjenci często doświadczają po infuzji komórek CART. Podsumowuje wiele cech charakterystycznych toksyczności CART obserwowanych w klinice: utratę masy ciała, dysfunkcję motoryczną, zapalenie nerwów, produkcję cytokin zapalnych i chemokiny oraz infiltrację różnych komórek efektorowych do ośrodkowego ukła...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

S.S.K. jest wynalazcą patentów w dziedzinie immunoterapii CAR, na które udziela licencji Novartis (na mocy umowy między Mayo Clinic, University of Pennsylvania i Novartis) oraz Mettaforge (poprzez Mayo Clinic). R.L.S. i S.S.K. są wynalazcami patentów w dziedzinie immunoterapii CAR, które są licencjonowane przez Humanigen. S.S.K. otrzymuje fundusze na badania od Kite, Gilead, Juno, Celgene, Novartis, Humanigen, MorphoSys, Tolero, Sunesis, Leahlabs i Lentigen.

Podziękowania

Ta praca była częściowo wspierana przez National Institutes of Health (R37CA266344, 1K99CA273304), Departament Obrony (CA201127), Mayo Clinic K2R pipeline (S.S.K.), Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (S.S.K.) oraz Fundację Predolin (R.L.S.). Ponadto chcielibyśmy podziękować personelowi Mayo Clinic NMR Core Facility. Rysunek 1 został utworzony w BioRender.com

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
  Tablet APC Anti-Human CD19Biolegend302211
Alcohol Prep Pad Wecol6818
Analyze 14.0 Analyze 14.0AnalyzeDirect Inc.Nie dotyczyhttps://analyzedirect.com/analyze14/
Sztuczne łzy (olej mineralny i wazelina)Akorn17478-062-35Miejscowy żel okulistyczny zapobiegający suchości oczu
Roztwór lizujący BD FACS BD349202Bufor lizujący czerwone krwinki
Strzykawki insulinowe BD Micro-Fin IVBD329461
Brillian Violet 421 Anti-Human CD45Biolegend304032
Bruker Avance II 7 Tesla Maszyna do rezonansu magnetycznegoBruker BiospinN/A
Busulfan (NSC-750)SelleckchemS1692
CountBright Absolutne koraliki do liczeniaInvitrogenC36950
CytoFLEX System B4-R2-V2 Cytometrprzepływowy Beckman CoulterC10343
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami DulbeccoGibco14190-144 
Moduł sterujący/bramkujący ERT SA InstrumentsModel 1030Monitorowanie małych zwierząt Układ oddechowy i bramkowy
Surowica bydlęcapłodu Millipore SigmaF8067
HemocytometrBright-LineZ359629-1EA
Ludzka surowica AB; Dawcy płci męskiej; typu AB; USCorning35-060-CI
Izofluran (płyn)Sigma-Aldrich792632
LIVE/DEAD Zestaw do mocowania barwników Aqua Dead Cell, do wzbudzenia 405 nmInvitrogenL34966
Microvette 500 Heparyna litowaSarstedt20.1345.100Probówka do pobierania krwi
MILLIPLEX Huma/Cytokina/Chemokine Panel kulek magnetycznychMillipore SigmaHCYTMAG-60K-PX38Test immunologiczny Multiplex do identyfikacji cytokin i chemokin
OmniscanGe Healthcare, Inc.0407-0690-10Środek przeciwutleniający na bazie gadolinu
Pd Anti-Mouse CD45Biolegend103106
Penicylina-Streptomycyna-Glutamina (100x), płynGibco10378-016
Probówka z polistyrenu z okrągłym dnemCorning352008
Azek sodu, 5% (w/v)Ricca Chemical7144.8-16
Stal nierdzewna chirurgiczna BladeBard-Parker371215
X-VIVO 15 Bezemisyjne Medium KrwiotwórczeLonza04-418Q

Bibliografia

  1. Turtle, C. J., et al. Immunotherapy of non-Hodgkin's lymphoma with a defined ratio of CD8+ and CD4+ CD19-specific chimeric antigen receptor-modified T cells. Science Translational Medicine. 8 (355), (2016).
  2. Kochenderfer, J. N., et al. Long-duration complete remissions of diffuse large B cell lymphoma after anti-CD19 chimeric antigen receptor T cell therapy. Molecular Therapy. 25 (10), 2245-2253 (2017).
  3. Kochenderfer, J. N., et al. Lymphoma remissions caused by anti-CD19 chimeric antigen receptor T cells are associated with high serum interleukin-15 levels. Journal of Clinical Oncology. 35 (16), 1803-1813 (2017).
  4. Maude, S. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia. New England Journal of Medicine. 371 (16), 1507-1517 (2014).
  5. Park, J. H., et al. Long-term follow-up of CD19 CAR therapy in acute lymphoblastic leukemia. New England Journal of Medicine. 378 (5), 449-459 (2018).
  6. Kochenderfer, J. N., et al. Chemotherapy-refractory diffuse large B-cell lymphoma and indolent B-cell malignancies can be effectively treated with autologous T cells expressing an anti-CD19 chimeric antigen receptor. Journal of Clinical Oncology. 33 (6), 540-549 (2015).
  7. Anagnostou, T., Riaz, I. B., Hashmi, S. K., Murad, M. H., Kenderian, S. S. Anti-CD19 chimeric antigen receptor T-cell therapy in acute lymphocytic leukaemia: A systematic review and meta-analysis. Lancet Haematology. 7 (11), 816-826 (2020).
  8. Siegler, E. L., Kenderian, S. S. Neurotoxicity and cytokine release syndrome after chimeric antigen receptor T cell therapy: Insights into mechanisms and novel therapies. Frontiers in immunology. 11, 1973(2020).
  9. Lee, D. W., et al. ASTCT consensus grading for cytokine release syndrome and neurologic toxicity associated with immune effector cells. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 25 (4), 625-638 (2019).
  10. Maude, S. L., et al. Tisagenlecleucel in children and young adults with B-cell lymphoblastic leukemia. The New England Journal of Medicine. 378 (5), 439-448 (2018).
  11. Teachey, D. T., et al. Identification of predictive biomarkers for cytokine release syndrome after chimeric antigen receptor T-cell therapy for acute lymphoblastic leukemia. Cancer Discovery. 6 (6), 664-679 (2016).
  12. Neelapu, S. S., et al. Axicabtagene ciloleucel CAR T-cell therapy in refractory large B-cell lymphoma. The New England Journal of Medicine. 377 (26), 2531-2544 (2017).
  13. Locke, F. L., et al. Long-term safety and activity of axicabtagene ciloleucel in refractory large B-cell lymphoma (ZUMA-1): A single-arm, multicentre, phase 1-2 trial. The Lancet. Oncology. 20 (1), 31-42 (2019).
  14. Hunter, B. D., Jacobson, C. A. CAR T-cell associated neurotoxicity: Mechanisms, clinicopathologic correlates, and future directions. Journal of the National Cancer Institute. 111 (7), 646-654 (2019).
  15. Neelapu, S. S., et al. Axicabtagene ciloleucel CAR T-cell therapy in refractory large B-cell lymphoma. New England Journal of Medicine. 377 (26), 2531-2544 (2017).
  16. Schuster, S. J., et al. Tisagenlecleucel in adult relapsed or refractory diffuse large B-cell lymphoma. New England Journal of Medicine. 380 (1), 45-56 (2019).
  17. Santomasso, B. D., et al. Clinical and biological correlates of neurotoxicity associated with CAR T-cell therapy in patients with B-cell acute lymphoblastic leukemia. Cancer Discovery. 8 (8), 958-971 (2018).
  18. Lee, D. W., et al. Current concepts in the diagnosis and management of cytokine release syndrome. Blood. 124 (2), 188-195 (2014).
  19. Chen, F., et al. Measuring IL-6 and sIL-6R in serum from patients treated with tocilizumab and/or siltuximab following CAR T cell therapy. Journal of Immunological Methods. 434, 1-8 (2016).
  20. Ruff, M. W., Siegler, E. L., Kenderian, S. S. A concise review of neurologic complications associated with chimeric antigen receptor T-cell immunotherapy. Neurologic Clinics. 38 (4), 953-963 (2020).
  21. Sterner, R. M., Kenderian, S. S. Myeloid cell and cytokine interactions with chimeric antigen receptor-T-cell therapy: Implication for future therapies. Current Opinion in Hematology. 27 (1), 41-48 (2020).
  22. Gofshteyn, J. S., et al. Neurotoxicity after CTL019 in a pediatric and young adult cohort. Annals of Neurology. 84 (4), 537-546 (2018).
  23. Shalabi, H., et al. Systematic evaluation of neurotoxicity in children and young adults undergoing CD22 chimeric antigen receptor T-cell therapy. Journal of Immunotherapy. 41 (7), 350-358 (2018).
  24. Siegler, E. L., Wang, P. Preclinical models in chimeric antigen receptor-engineered T-cell therapy. Human Gene Therapy. 29 (5), 534-546 (2018).
  25. Mhaidly, R., Verhoeyen, E. Humanized mice are precious tools for preclinical evaluation of CAR T and CAR NK cell therapies. Cancers. 12 (7), 1915(1915).
  26. Sakemura, R., et al. Development of a clinically relevant reporter for chimeric antigen receptor T-cell expansion, trafficking, and toxicity. Cancer Immunology Research. 9 (9), 1035-1046 (2021).
  27. Sterner, R. M., Cox, M. J., Sakemura, R., Kenderian, S. S. Using CRISPR/Cas9 to knock out GM-CSF in CAR-T cells. Journal of Visualized Experiments. (149), e59629(2019).
  28. Sterner, R. M., et al. GM-CSF inhibition reduces cytokine release syndrome and neuroinflammation but enhances CAR-T cell function in xenografts. Blood. 133 (7), 697-709 (2019).
  29. Cox, M. J., et al. Leukemic extracellular vesicles induce chimeric antigen receptor T cell dysfunction in chronic lymphocytic leukemia. Molecular Therapy. 29 (4), 1529-1540 (2021).
  30. Sakemura, R., et al. Dynamic imaging of chimeric antigen receptor T cells with [18F]tetrafluoroborate positron emission tomography/computed tomography. Journal of Visualized Experiments. (180), e62334(2022).
  31. Cox, M. J., Kenderian, S. S., et al. GM-CSF disruption in CART cells modulates T cell activation and enhances CART cell anti-tumor activity. Leukemia. 36 (6), 1635-1645 (2022).
  32. Pirko, I., Suidan, G. L., Rodriguez, M., Johnson, A. J. Acute hemorrhagic demyelination in a murine model of multiple sclerosis. Journal of Neuroinflammation. 5, 31(2008).
  33. Denic, A., et al. MRI in rodent models of brain disorders. Neurotherapeutics. 8 (1), 3-18 (2011).
  34. Johnson, H. L., et al. CD8 T cell-initiated blood-brain barrier disruption is independent of neutrophil support. Journal of Immunology. 189 (4), 1937-1945 (2012).
  35. Johnson, H. L., et al. Perforin competent CD8 T cells are sufficient to cause immune-mediated blood-brain barrier disruption. PLoS One. 9 (10), 111401(2014).
  36. Huggins, M. A., et al. Perforin expression by CD8 T cells is sufficient to cause fatal brain edema during experimental cerebral malaria. Infection and Immunity. 85 (5), 00985(2017).
  37. Pennell, C. A., et al. Human CD19-targeted mouse T cells induce B cell aplasia and toxicity in human CD19 transgenic mice. Molecular Therapy. 26 (6), 1423-1434 (2018).
  38. Khadka, R. H., Sakemura, R., Kenderian, S. S., Johnson, A. J. Management of cytokine release syndrome: an update on emerging antigen-specific T cell engaging immunotherapies. Immunotherapy. 11 (10), 851-857 (2019).
  39. Sanmamed, M. F., Chester, C., Melero, I., Kohrt, H. Defining the optimal murine models to investigate immune checkpoint blockers and their combination with other immunotherapies. Annals of Oncology. 27 (7), 1190-1198 (2016).
  40. Mardiana, S., et al. A multifunctional role for adjuvant anti-4-1BB therapy in augmenting antitumor response by chimeric antigen receptor T cells. Cancer Research. 77 (6), 1296-1309 (2017).
  41. Pegram, H. J., et al. Tumor-targeted T cells modified to secrete IL-12 eradicate systemic tumors without need for prior conditioning. Blood. 119 (18), 4133-4141 (2012).
  42. Kalscheuer, H., et al. A model for personalized in vivo analysis of human immune responsiveness. Science Translational Medicine. 4 (125), (2012).
  43. Xia, J., et al. Modeling human leukemia immunotherapy in humanized mice. EBioMedicine. 10, 101-108 (2016).
  44. Holzapfel, B. M., Wagner, F., Thibaudeau, L., Levesque, J. P., Hutmacher, D. W. Concise review: humanized models of tumor immunology in the 21st century: Convergence of cancer research and tissue engineering. Stem Cells. 33 (6), 1696-1704 (2015).
  45. Cogels, M. M., et al. Humanized mice as a valuable pre-clinical model for cancer immunotherapy research. Frontiers in Oncology. 11, 784947(2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Sprostowanie


Formal Correction: Erratum: Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-derived Xenograft Mouse Model
Posted by JoVE Editors on 3/14/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-derived Xenograft Mouse Model. The Authors section was updated from:

Claudia Manriquez Roman1,2,3,4,5
R. Leo Sakemura1,2
Fang Jin6
Roman H. Khadka6
Mohamad M. Adada1,2
Elizabeth L. Siegler1,2
Aaron J. Johnson6
Saad S. Kenderian1,2,6
1T Cell Engineering Laboratory, Mayo Clinic, Rochester,
2Division of Hematology, Mayo Clinic, Rochester,
3Mayo Clinic Graduate School of Biomedical Sciences, Mayo Clinic, Rochester,
4Department of Molecular Medicine, Mayo Clinic, Rochester,
5Regenerative Sciences PhD Program, Mayo Clinic, Rochester,
6Department of Immunology, Mayo Clinic, Rochester

to:

Claudia Manriquez Roman1,2,3,4,5
R. Leo Sakemura1,2
Brooke L. Kimball1,2
Fang Jin6
Roman H. Khadka6
Mohamad M. Adada1,2
Elizabeth L. Siegler1,2
Aaron J. Johnson6
Saad S. Kenderian1,2,6
1T Cell Engineering Laboratory, Mayo Clinic, Rochester,
2Division of Hematology, Mayo Clinic, Rochester,
3Mayo Clinic Graduate School of Biomedical Sciences, Mayo Clinic, Rochester,
4Department of Molecular Medicine, Mayo Clinic, Rochester,
5Regenerative Sciences PhD Program, Mayo Clinic, Rochester,
6Department of Immunology, Mayo Clinic, Rochester

Tagi

Terapia kom rkami CAR Tzesp uwalniania cytokinocena neurostanu zapalnegotest multipleksowycytometria przep ywowaobrazowanie MRIanaliza obci enia nowotworowego

Powiązane artykuły