Minimalnie inwazyjne techniki i proste urządzenie laboratoryjne poprawiają odtwarzalność modelu uszkodzenia rdzenia kręgowego, zmniejszając uszkodzenia operacyjne u zwierząt doświadczalnych i umożliwiając utrzymanie anatomicznej morfologii. Metoda ta jest opłacalna, ponieważ wiarygodne wyniki i powtarzalna procedura ułatwiają badanie mechanizmów naprawy choroby.
Artykuł metodologiczny
Ustalenie modelu urazu rdzenia kręgowego stłuczenia u myszy w oparciu o technikę minimalnie inwazyjną
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Użycie minimalnie inwazyjnych metod do modelowania uszkodzenia rdzenia kręgowego (SCI) może zminimalizować różnice behawioralne i histologiczne między zwierzętami doświadczalnymi, poprawiając tym samym odtwarzalność eksperymentów.
Te metody wymagają spełnienia dwóch wymagań: przejrzystości chirurgicznej ścieżki anatomicznej oraz prostoty i wygody urządzenia laboratoryjnego. Kluczowe dla operatora jest to, że wyraźna ścieżka anatomiczna zapewnia minimalnie inwazyjną ekspozycję, co pozwala uniknąć dodatkowych uszkodzeń zwierzęcia doświadczalnego podczas zabiegów chirurgicznych i pozwala zwierzęciu utrzymać spójną i stabilną morfologię anatomiczną podczas eksperymentu.
W tym badaniu badane jest użycie nowatorskiej zintegrowanej platformy zwanej współosiową platformą SCI do uszkodzenia rdzenia kręgowego u małych zwierząt, aby odsłonić rdzeń kręgowy na poziomie T9 w minimalnie inwazyjny sposób oraz ustabilizować i unieruchomić kręg myszy za pomocą stabilizatora kręgów, a na koniec, współosiowy impaktor grawitacyjny jest używany do konfiskaty rdzenia kręgowego myszy, aby zbliżyć się do różnych stopni uszkodzenia rdzenia kręgowego T9. Na koniec wyniki histologiczne są dostarczane jako odniesienie dla czytelników.
Wprowadzenie
Urazowe uszkodzenie rdzenia kręgowego (SCI) łatwo predysponuje jednostkę do poważnych konsekwencji1; niemniej jednak obecnie nie ma skutecznego leczenia1,2. Modele kontuzji zwierząt są jedną z głównych metod badania SCI3,4.
Od 2004 do 2014 roku4, szczury były używane jako organizmy modelowe w 289 z 407 badań (71%), a myszy w 69 (16,9%). Rzeczywiście, odsetek eksperymentów na myszach stopniowo wzrastał na przestrzeni lat ze względu na ich przewagę nad innymi modelami, zwłaszcza ogromny potencjał badań nad regulacją genów3,4,5. W związku z tym potrzebne są bardziej kompatybilne narzędzia do przeprowadzenia większej liczby badań z wykorzystaniem myszy jako modelu ze względu na dużą wagę przywiązywaną do spójności modelu6. Powszechne urządzenia opisane w poprzednich badaniach są zasadniczo oparte na zasadzie wpływu rdzenia kręgowego Allena, na przykład podstawowy impaktor spadku masy ciała7,8, New York University (NYU)/ Multicenter Animal Spinal Cord Injury Studies (MASCIS) impactor1,9 oraz Infinite Horizon (IH) impactor10,11. Impaktor powodujący spadek masy ciała i impaktor NYU/MASCIS mają tę samą zasadę celowania w docelowy rdzeń kręgowy i upuszczania stałego ciężaru z różnych wysokości, aby spowodować różny stopień urazu. Impaktor IH powoduje uraz rdzenia kręgowego pod wpływem różnych sił.
Dla wygody korzystania z modelu mysiego w badaniach SCI i dla stworzenia podstaw dla skutecznych metod leczenia, opracowano zintegrowaną platformę urazów rdzenia kręgowego u myszy, zwaną platformą koncentryczną urazów rdzenia kręgowego (SCICP). Platforma składa się z czterech głównych elementów: (1) stołu operacyjnego dla zwierząt zaprojektowanego z myślą o odpowiedniej pozycji dla obsługiwanych myszy, który jest bardzo kompaktowy i zapewnia wygodę bez ograniczeń pozycji; (2) mikrozwijacz po obu stronach do podtrzymywania mięśni przykręgosłupowych podczas operacji; (3) stabilizator kręgów do podtrzymywania kręgu przed zabiegiem SCI (dostępne są dwa stabilizatory kręgów do operacji na większych zwierzętach, takich jak szczury); (4) tuleja, końcówka udaru, obciążniki i kołek do ciągnięcia. Trzy części należy zmontować na zdejmowanym ramieniu X-Y-Z. W celu precyzyjnego celowania, końcówka udaru jest umieszczana na powierzchni rdzenia kręgowego, a ramię X-Y-Z jest delikatnie opuszczane na oczekiwaną wysokość za pomocą znaku między końcówką impaktora a tuleją. Końcówka udaru wykonana jest ze stopu aluminium o wadze 0,12 g, aby uniknąć uszkodzenia rdzenia kręgowego związanego z kompresją dużego ciężaru przed zabiegiem. Trzpień do ciągnięcia służy do przytrzymywania obciążników na górze rękawa w celu przygotowania zrzutu ciężaru (Rysunek 1).
W poprzednich badaniach podział siły uderzenia był definiowany zgodnie z danymi dotyczącymi siły uderzenia urządzenia IH, które wynoszą odpowiednio 30 Kdyn, 50 Kdyn i 70 Kdyn6,10. W trakcie procesu badawczego udowodniono, że seryjne stopnie modeli SCI zostały ustalone na podstawie SCICP, które mogą być wykorzystane w różnych badaniach. Dlatego przed oficjalnym rozpoczęciem eksperymentu przetestowano siły uderzenia generowane przez różne ciężary o różnych masach za pomocą urządzenia do testowania ciśnienia szczytowego. W rezultacie, trzy standaryzowane reprezentatywne modele myszy SCI zostały wybrane jako trzy różne stopnie urazu, w tym odpowiednio grupy ocenione łagodnie, umiarkowanie i ciężko6,10, a ciężarki zostały uwolnione na tej samej wysokości, z wagą 1,3 g dla łagodnego, 2,0 g dla umiarkowanego i 2,7 g dla poważnych obrażeń.
Jako kolejny sposób gwarantujący operatywność i dokładność, zgłaszane jest nowatorskie i minimalnie inwazyjne podejście operacyjne. Dzięki badaniom anatomii normalnych myszy odkryto nową metodę lokalizacji przestrzeni międzykolcowej T12-T13. Metoda lokalizacji kręgów na etapach operacji jest łatwa do opanowania i dokładna, co zapewnia precyzyjne lokalizowanie w przypadku operacji minimalnie inwazyjnych.
Mam nadzieję, że ta technika leczenia kontuzji może pomóc w badaniach i zrozumieniu urazów rdzenia kręgowego, w tym w zrozumieniu patofizjologii, ocenie postępowania i tak dalej.
Protokół
UWAGA: Wszystkie eksperymenty zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Etyki i Dobrostanu Zwierząt Laboratoryjnych Uniwersytetu Shandong Cheeloo College of Medicine (numer zatwierdzenia: 21L60) i zostały przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem dla Opieki i Użytkowania Zwierząt Laboratoryjnych opublikowanym przez National Institutes of Health (Publikacje NIH nr 85-23, poprawione w 1996 roku).
1. Mechanizm uszkodzenia rdzenia kręgowego, platforma koncentryczna i testy mechaniczne
- Zmontuj platformę z chirurgicznym stołem operacyjnym, stabilizatorem kręgów i końcówką udarową (Rysunek 1).
UWAGA: Utrzymuj w czystości szczeliny ciężaru i wydechu, które zapobiegają zetknięciu się ciężaru z prądami powietrza, ponieważ wszelkie zabrudzenia na kropli ciężaru lub tulei mogą wpłynąć na precyzję platformy. - Włóż końcówkę, która pozwala na dokładne zlokalizowanie rdzenia kręgowego, do rękawa.
- Wybierz odpowiednie masy spadków masy ciała do eksperymentu, które wynoszą 1,3 g, 2,0 g i 2,7 g odpowiednio dla grupy łagodnej, umiarkowanej i ciężkiej.
- Podłącz kołek do ciągnięcia w otwory w kropli ciężaru.
- Zamontuj kroplę ciężaru do górnej części tulei za pomocą kołka pociągającego umieszczonego w rowku na ramieniu X-Y-Z, tak aby po zakończeniu lokalizacji ciężarek został zwolniony, aby uderzyć w końcówkę impaktora, w konsekwencji zatykając rdzeń kręgowy, a zmiany w rdzeniu kręgowym były obserwowane pod mikroskopem.
- Dostosuj zdejmowane precyzyjne ramię X-Y-Z 0,1 mm dla wygody operatora, aby zapewnić odpowiednią przestrzeń roboczą (Rysunek 1D, E).
UWAGA: Aby potwierdzić spójność wyników badania, przed rozpoczęciem eksperymentu zmierz siłę generowaną podczas wrzucania ciężaru do wnętrza rękawa za pomocą urządzenia do wykrywania ciśnienia szczytowego. Powtórzenie potwierdzenia nie jest konieczne w przypadku przyszłych badań. - Włącz urządzenie, umieść metalowy receptor nacisku pod końcówką, wyzeruj adapter, zwolnij zawleczkę i zapisz rzeczywistą siłę uderzenia.
2. Lokalizacja i laminektomia 9 kręgu piersiowego (T9)
UWAGA: Samice myszy C57BL/6J w wieku 9-10 tygodni zostały zakupione od Jinan Pengyue Experimental Animal Company (Jinan, Chiny).
- Autoklawuj zestaw narzędzi chirurgicznych do eksperymentu i wysterylizuj stół operacyjny 75% alkoholem przed operacją.
- Wstrzyknąć buprenorfinę w celu znieczulenia (0,05-2,0 mg/kg, SQ) 30 minut przed znieczuleniem do operacji urazów. Następnie znieczulij mysz izofluranem (indukcja: ~3%-5%, konserwacja: ~1,5%-2%). Sprawdź, czy zwierzę jest w pełni znieczulone przez odruchy szczypania ogona lub palca u nogi. Po uruchomieniu znieczulenia połóż mysz w pozycji leżącej w wyznaczonej części stołu operacyjnego i pokryj rogówkę maścią okulistyczną (nałóż maść okulistyczną na rogówki, aby chronić oczy przed wysuszeniem podczas operacji).
- Ogol włosy od ogona do rostralu za pomocą golarki elektrycznej na odcinku piersiowo-lędźwiowym kręgosłupa. Sterylizuj skórę kilka razy okrężnymi ruchami jodoforem przez 30 sekund, a następnie 75% alkoholem. Nałożyć sterylną serwetę chirurgiczną i wykonać podłużne nacięcie o długości około 1,5 cm na skórze od około T6 do T13 za pomocą skalpela i ostrza.
UWAGA: Badanie palpacyjne wzdłuż brzegu żebrowego do linii środkowej, gdzie znajduje się przestrzeń międzykolcowa T12-T13. Wykonaj 1,5 cm nacięcie rostralu, a nacięcie jest w przybliżeniu równo z kręgami T6-T13.
- Ogol włosy od ogona do rostralu za pomocą golarki elektrycznej na odcinku piersiowo-lędźwiowym kręgosłupa. Sterylizuj skórę kilka razy okrężnymi ruchami jodoforem przez 30 sekund, a następnie 75% alkoholem. Nałożyć sterylną serwetę chirurgiczną i wykonać podłużne nacięcie o długości około 1,5 cm na skórze od około T6 do T13 za pomocą skalpela i ostrza.
- Zbadaj 13. żebro po jednej stronie od części kostnej pod mikroskopem operacyjnym. Zbadaj wyrostek kolczysty w linii środkowej, lekko dotykając obszaru kąta żebrowo-rdzeniowego, a następnie w kierunku rostralu, aby zlokalizować przestrzeń międzykolcową T12-T13. Zbadaj przestrzeń międzykolcową T9-T10 od przestrzeni T12-T13 do strony rostralnej. (Rysunek 2A, 3A)
- Wypreparuj mięsień przykręgosłupowy wzdłuż wyrostka kolczystego T9 do przednich i tylnych stawów międzywyrostkowych po obu stronach za pomocą mikronożyczek (Rysunek 3B). Wycofaj mięśnie przykręgosłupowe za pomocą mikroretraktorów i oczyść tkankę miękką na blaszce oraz w przestrzeni międzykolcowej T8-T9 i T9-T10 za pomocą mikronożyczek.
- Wykonaj laminektomię T9, zaciśnij wyrostek kolczysty T9 za pomocą kleszczy mikrochirurgicznych, lekko go podnieś, włóż mikronożyczki równolegle wzdłuż prawej grzbietowo-bocznej strony blaszki, unikając uszkodzenia rdzenia kręgowego, i odetnij blaszkę mikronożyczkami. Powtórz po lewej stronie, a rdzeń kręgowy może zostać odsłonięty (Rysunek 2B, 3C).
- Przed zamocowaniem kręgu poluzuj ramię uniwersalne i powoli zaciskaj stawy międzywyrostkowe od 9 do 10 po obu stronach kręgu za pomocą mikrokleszczyków do komarów stabilizatora kręgów. Dokręć na mikro kleszczach do komarów, a kręg zostanie w ten sposób ustabilizowany. Dopasuj rdzeń kręgowy do płaszczyzny poziomej, napnij ramię uniwersalne, a kręg zostanie zamocowany (Rysunek 3D).
3. Kontuzja T9
- Gdy rdzeń kręgowy na poziomie T9 zostanie odsłonięty, a kręg zamocowany, wyceluj w rdzeń kręgowy za końcówkę wewnątrz rękawa pod mikroskopijnym narzędziem operacyjnym (Rysunek 3E).
- Sprawdź, czy powierzchnia końcówki jest równoległa do rdzenia kręgowego z tylnej i bocznej części rdzenia kręgowego, ponieważ pod mikroskopem łatwo jest zaobserwować związek między rdzeniem kręgowym a końcówką, a stół operacyjny można łatwo obrócić.
- Sprawdź, czy powierzchnia końcówki jest równoległa do obustronnych granic oszczędzonej blaszki, zanim końcówka zetknie się z rdzeniem kręgowym po laminektomii, ponieważ jest to naturalna płaszczyzna odniesienia równoległa do rdzenia kręgowego.
- Po zlokalizowaniu przestrzeni międzykolcowej T12-T13 należy opuścić tuleję do momentu, aż koniec impaktora będzie zgodny ze znakiem na okienku obserwacyjnym i zostanie osiągnięta określona wysokość 22 mm. Wyciągnij szpilkę, aby zwolnić ciężar (1.3 g, 2.0 g lub 2.7 g w zależności od grupy, przy czym każda grupa zawiera 3 myszy, a każda grupa ma jedną mysz na każdy punkt czasowy).
UWAGA: Rdzeń kręgowy powinien być równoległy do podłoża i prostopadły do końcówki; Przesuń stół operacyjny, aby zapewnić mikroskopijne pole widzenia, ponieważ stół jest bardzo kompaktowy. - Po zakończeniu stłuczenia należy zdjąć impaktor i obserwować stopień SCI pod mikroskopem operacyjnym. W grupie łagodnej można zaobserwować jasnoczerwoną zmianę koloru, podczas gdy w grupie umiarkowanej miejsce urazu wykazuje ciemnoczerwony kolor w ciągu 3-4 s i ewentualnie można zaobserwować wypukłość. W grupie ciężkiej ciemnoczerwone objawy mogą pojawić się natychmiast i manifestuje się oczywista wyniosłość opony twardej, ale opona twarda jest nadal w spójnym kształcie (Ryc. 3F).
- Zszyj powierzchowną powięź i skórę szwami (szew polipropylenowy niewchłanialny, rozmiar: 6-0).
- Po wykonaniu szwu wysterylizuj obszar operacyjny, umieść mysz na podkładce o kontrolowanej temperaturze do czasu przywrócenia pełnej świadomości, a następnie umieść mysz w klatkach dla myszy.
4. Opieka nad zwierzętami
- Umieść zwierzę na poduszce grzewczej w celu odzyskania sił i obserwuj ruch obu tylnych kończyn.
UWAGA: Zwierzęta, które przeszły operację, nie powinny być zwracane do towarzystwa innych zwierząt, dopóki nie wyzdrowieją. - Połóż dietę wysokowodną na podłodze klatki, aby zwierzęta mogły łatwo dotrzeć do jedzenia. Alternatywnie użyj klatki z dolnym stołem do karmienia.
- Opróżniaj pęcherze myszy dwa razy dziennie po operacji, ponieważ grupom z umiarkowanymi i ciężkimi urazami trudno jest odzyskać funkcję pęcherza. Wstrzyknąć buprenorfinę w celu znieczulenia (0,05-2,0 mg/kg, SQ) 8-12 h/dobę przez 3 dni.
5. Perfuzja przezsercowa, barwienie i barwienie immunologiczne
- W 1, 28 i 56 dniu po urazie poświęć odpowiednio jedną mysz z każdej grupy przez perfuzję.
- Perfuzję myszy z 60 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i 20 ml 4% paraformaldehydu po nadmiernym znieczuleniu (4% -6% izofluranu).
- Zbierz kręgosłup mikronożyczkami, rozciągając się rostralnie i doogonowo odpowiednio 1 cm od centrum zmiany.
- Wyciąć nadmiar mięśni, zachować nienaruszone segmenty kręgosłupa z częściowymi żebrami do przytrzymania narzędzi w kroku 5.1.4 i zanurzyć je w 4% paraformaldehydzie przez 24 godziny.
- Zacisnąć żebra kleszczami hemostatycznymi w celu utrwalenia i zdefiniować centrum zmiany pod mikroskopem zgodnie z wyciętą blaszką i zmianą koloru w centrum uszkodzenia rdzenia kręgowego.
- Wytnij wszystkie blaszki i wyrostki stawowe mikronożyczkami od ogona.
- Odetnij korzenie nerwowe mikronożyczkami i wyjmij rdzeń kręgowy.
- Zbierz 0,5 cm rdzenia kręgowego rozciągającego się odpowiednio doogonowo i rostralnie z centrum zmiany za pomocą mikronożyczek.
- Umieścić rdzeń kręgowy w 30% sacharozie w temperaturze 4 °C na 48 godzin.
- Po zamrożeniu tkanki pociąć na odcinki o grubości 6 μm w zależności od rodzaju badania histologicznego.
- Wykonaj barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E).
- Podgrzej skrawki do temperatury pokojowej i namocz sekcje o grubości 6 μm w 4% formaldehydzie przez około 15 minut, a następnie namocz w 1x PBS przez 1 minutę cztery razy w celu usunięcia pozostałości OCT.
- Zabarwić skrawki hematoksyliną przez 90 s i spłukać wodą podwójnie destylowaną.
- Następnie myj sekcje pod bieżącą wodą przez 3 minuty.
- Plamić eozyną przez 4 minuty i moczyć w 95% alkoholu przez 30 s dwukrotnie, aby spłukać nadmiar eozyny.
- Na koniec odwodnić alkoholem gradientowym (95% alkoholu i 50% alkoholu raz, kolejno) przez 30 s i moczyć w ksylenie dla uzyskania przezroczystości przez 2 minuty. Następnie uszczelnij próbki żelem żywicznym (przekrój płaszczyzny koronalnej: Rysunek 4; przekrój płaszczyzny strzałkowej: Rysunek 5).
- Wykonaj barwienie immunofluorescencyjne.
- Rozgrzej sekcje do temperatury pokojowej i namocz sekcje o grubości 6 μm w 4% formaldehydzie przez około 2 minuty.
- Myj sekcje w TBST przez 5 minut trzy razy.
- Inkubować skrawki roztworem blokującym (10% kozia normalna surowica w PBS) i blokować przez 1 godzinę, aby zablokować nieswoiste wiązanie immunoglobuliny.
- Inkubować odcinki rdzenia kręgowego przez noc w temperaturze 4 °C zarówno z mysim białkiem fibrylarnym anty-gleju (GFAP, marker reaktywnych astrocytów), przeciwciałem poliklonalnym (1:600), jak i króliczym przeciwciałem anty-NF200 (1:2000), markerem neurofilamentu w 0,4 ml roztworu blokującego.
- Przepłukać skrawki PBS i dodać 0,4 ml roztworu blokującego z kozimi przeciwciałami anty-króliczymi Alexa 594-sprzężonymi IgG (1:1,000) i kozimi przeciwciałami anty-mysimi Alexa 488-sprzężonymi IgG (1:1,000) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
- Rób zdjęcia mikroskopem fluorescencyjnym z powiększeniem 10x za pomocą automatycznego skanowania panoramicznego odpowiednio na długościach fal 594 nm i 488 nm (Rysunek 6).
- Włącz mikroskop fluorescencyjny, umieść szkiełko na stoliku mikroskopu, przełącz się na kanał fluorescencyjny, użyj pozycjonowania, aby ustawić trzy do czterech punktów na tkance i skup się, aby zakończyć fotografowanie. Po zakończeniu fotografowania zapisz obrazy z różnych kanałów w żądanym formacie, a następnie zapisz scalony obraz.
Wyniki
Aby przetestować precyzję urządzenia, za pomocą urządzenia do pomiaru szczytowego nacisku zmierzono siłę wywołaną przez trzy różne masy ciężarków upuszczonych z tej samej wysokości. Przeprowadzono dwadzieścia cztery testy z różnymi grupami ciężarków, co dało wyniki (średnia ± SD) 0,323 N ± 0,02 N dla ciężarków 1,3 g, 0,543 N ± 0,15 N dla ciężarków 2,0 g oraz 0,723 N ± 0,26 N dla ciężarków 2,7 g (Rysunek 7). W poprzednich badaniach jako jednostki pomiaru intensywności stłuczeń stosowano dyny (dyn) lub kilodyny (Kdyn). W celu lepszego porównania z wcześniejszymi badaniami przedstawiono przeliczniki między niutonami (N) a dyną/kilodyną (1 N = 1 kg × 1 m/s2 = 1 × 103 g × 1 × 100 cm/s2 = 1 × 105 dyn; 0,323 N = 32,3 Kdyn; 0,543 N = 54,3 Kdyn; 0,723 N = 72,3 Kdyn).
Tabela 1 oraz Rysunek 4 przedstawiają dane dotyczące zmian w grupach z łagodnym, umiarkowanym i ciężkim uszkodzeniem w przekrojach czołowych. Na podstawie Rysunku 4 w 28. dniu po urazie ciągłość wyraźnych granic między istotą szarą a białą sukcesywnie malała w grupach z łagodnym, umiarkowanym i ciężkim uszkodzeniem, przy jednoczesnym powiększaniu się obszaru tkanki bliznowatej oraz wzroście jej proporcji w przekroju poprzecznym centrum zmiany. We wszystkich grupach doświadczalnych wystąpiły wyraźne różnice morfologiczne w porównaniu z grupą kontrolną. Potwierdziło to zasadność podziału stopni uszkodzenia w grupach doświadczalnych.
Tabela 2 oraz Rysunek 5 przedstawiają obrazy uszkodzenia rdzenia kręgowego w 1. i 56. dobie po urazie na przekrojach strzałkowych. Można zauważyć, że obszar uszkodzenia stopniowo i znacząco zwiększał się od grup z łagodnym do ciężkiego urazu w 1. dobie po urazie. Jednocześnie ciągłość istoty białej po obu stronach rdzenia kręgowego była lepsza w grupie z łagodnym urazem, z widocznymi małymi okrągłymi wakuolami, które są charakterystyczne dla obrzęku śródmiąższowego. W grupie z umiarkowanym urazem istota biała wykazywała słabą ciągłość, a struktura brzusznej istoty białej była nieuporządkowana. W grupie z ciężkim urazem brzuszna istota biała wykazywała silniejsze przerwanie ciągłości, a w centrum urazu pojawił się obszerny obszar jamisty. Dodatkowo w tkance otaczającej widoczne było wyraźne wypełnienie erytrocytami, a erytrocyty w pobliżu kanału środkowego gromadziły się w pasma. W 56. dobie po urazie w centrum uszkodzenia we wszystkich trzech grupach zaobserwowano tworzenie się blizny, której obszar zwiększał się zgodnie ze stopniem ciężkości urazu.
Integralność neurofilamentów rdzenia kręgowego w 56. dniu po urazie może zostać również określona na podstawie analizy wyników barwienia immunofluorescencyjnego (Rysunek 6). Rysunek pokazuje również, że nakładające się astrocyty tworzące bliznę były widoczne w centrum wszystkich trzech grup urazów, przy czym długość obszaru urazu wzrastała wraz z ciężkością uszkodzenia, podczas gdy średnica blizny ulegała zmniejszeniu. Sugeruje to obecność skurczu blizny, co może prowadzić do zmniejszenia średnicy rdzenia kręgowego.
Rycina 1: Prezentacja całości oraz poszczególnych części współosiowej platformy do urazów rdzenia kręgowego. (A) Ramię X-Y-Z oraz stół operacyjny mogą być rozdzielone, co zapewnia odpowiednią przestrzeń podczas procedury operacyjnej, w trakcie której odsłania się rdzeń kręgowy małego zwierzęcia. Stół operacyjny można swobodnie przesuwać podczas operacji, co zmniejsza potencjalne trudności operacyjne wynikające z ograniczeń pozycjonowania. Korpus stabilizatora kręgów posiada trójointowe ramię uniwersalne do wspomagania kierunkowania, co zwiększa jego elastyczność. (B) Włożyć końcówkę impaktora do tulei, a następnie zamontować tuleję w ramieniu X-Y-Z. Włożyć końcówkę zawleczki w otwory obciążnika, aby zapobiec jego upadkowi, i umieścić obciążnik w tulei. Po zmontowaniu części zlokalizować pod mikroskopem docelowy obszar urazu. Następnie obniżyć ramię X-Y-Z, aż koniec końcówki impaktora zrówna się z dolnym poziomem okna obserwacyjnego, co wskazuje na osiągnięcie jednolitej wysokości stłuczenia (wysokość między obciążnikiem a końcówką impaktora wynosi 22 mm w momencie rozpoczęcia opadania). Wyciągnąć zawleczkę, aby wykonać uderzenie. (C) Po odsłonięciu obszaru urazu użyć klipsów do zaciśnięcia i unieruchomienia kręgosłupa myszy oraz śruby dociskowej do stabilizacji stabilizatora kręgów. (D) Zalecane funkcje rowków na stole operacyjnym. Zwierzę doświadczalne powinno być umieszczone w środkowym rowku, głową skierowaną do przodu, z częścią klatki piersiowej na skosie. Ramię X-Y-Z jest oddzielone od stołu operacyjnego. (E) Prezentacja zmontowanego SCICP. Strzałki wskazują poszczególne części. Po skierowaniu końcówki w stronę docelowego obszaru stłuczenia, aby rozpocząć procedurę, wyciągnąć zawleczkę; obciążnik opadnie wtedy na końcówkę impaktora, powodując stłuczenie rdzenia kręgowego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 2: Schemat obrazowy metody lokalizacji kręgu żebrowego T13. (A) 13. żebro i T13 są stosunkowo stałymi strukturami anatomicznymi. Kąt żebrowo-kręgowy T13 można łatwo zidentyfikować pod mikroskopem, skąd operator może wprowadzać sondę w kierunku wyrostka kolczastego i odnaleźć przestrzeń międzykolczystą T12-T13. Następnie, przesuwając sondę kolejno w stronę rostralną, można odnaleźć kręg z docelowym urazem (na przykład T9). (B) Minimalnie inwazyjna laminektomia 9. kręgu piersiowego pozwala zachować odpowiednią ilość blaszki łukowej i stawów międzywyrostkowych pomiędzy sąsiednimi ciałami kręgów. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
Rysunek 3: Ekspozycja i kontuzja rdzenia kręgowego na poziomie T9 u myszy. (A) Sondowanie kąta żebrowo-kręgowego T13. (B) Po odsunięciu mięśni przykręgosłupowych za pomocą mikro-retraktorów w celu stworzenia odpowiedniej przestrzeni operacyjnej, odsłonięcie poziomu T9. (C) Wykonanie laminektomii T9 przy użyciu mikro-nożyczek. (D) Stabilizacja kręgu za pomocą klipsów stabilizatora kręgosłupa. (E) Nakierowanie końcówki impaktora na docelowy obszar kontuzji. (F) W obszarze urazu po kontuzji odnotowano obrzęk i przekrwienie. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 4: Reprezentatywne przekroje w 28. dniu po różnym stopniu SCI u myszy (przekroje czołowe). (A) Normalny rdzeń kręgowy piersiowy myszy. Pasek skali = 500 µm. (B) W grupie z łagodnym urazem można zauważyć niewielkie uszkodzenie w części grzbietowej rdzenia kręgowego, podczas gdy morfologia zachowanej istoty białej i szarej jest w znacznym stopniu zachowana. (C) W grupie z umiarkowanym urazem w rdzeniu kręgowym widoczna jest wyraźna tkanka bliznowata (oznaczona czerwoną gwiazdką). Cechy różnicujące istotę białą od szarej są niemal nierozpoznawalne. (D) W porównaniu z tym, rdzeń kręgowy w grupie z ciężkim urazem niemal całkowicie utracił pierwotną morfologię i został w znacznym stopniu zastąpiony przez tkankę bliznowatą. Zielona przerywana linia wskazuje obszar uszkodzenia, a czarna przerywana linia wskazuje granicę widocznej istoty szarej. Wraz ze wzrostem stopnia ciężkości urazu w rdzeniu kręgowym myszy pojawiła się większa zmiana i mniej zachowanych struktur, a granica istoty szarej stała się niemal nierozpoznawalna. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 5: Reprezentatywne przekroje w 1. i 56. dobie po urazie rdzenia kręgowego u myszy (przekroje strzałkowe). (A) Prawidłowy rdzeń kręgowy w odcinku piersiowym u myszy. (B) B1-B3 przedstawiają odpowiednio rdzeń kręgowy w 1. dobie po urazie w grupach z urazem lekkim, umiarkowanym i ciężkim. Widać, że wraz ze wzrostem stopnia uszkodzenia, w centrum zmiany objęto większy obszar przerwany lub upłynniony. Ciągłość istoty białej w brzusznej części rdzenia kręgowego różniła się w zależności od natężenia urazu. B1 wykazuje lepszą ciągłość istoty białej w brzusznej części rdzenia kręgowego z lekkim obrzękiem. B2 wykazuje gorszą ciągłość istoty białej w brzusznej części rdzenia kręgowego i silniejszy obrzęk. Tkanka w centrum urazu SCI w B3 utraciła niemal całkowicie ciągłość, a w obszarze poza centrum urazu występuje rozległy obrzęk. (C) C1-C3 przedstawiają odpowiednio rdzeń kręgowy w 56. dobie po urazie w grupach z urazem lekkim, umiarkowanym i ciężkim. W centrum urazu u różnych grup zaobserwowano różny stopień kurczenia się blizny oraz istotną różnicę w średnicy obszaru urazu. Pasek skali = 500 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 6: Reprezentatywne przekroje w 56. dniu po uszkodzeniu rdzenia kręgowego u myszy (przekroje strzałkowe). (A) Reprezentatywny przekrój z grupy łagodnej. NF200 oznacza neurofilamenty, natomiast GFAP oznacza astrocyty. W centrum zmiany obserwuje się nakładanie się astrocytów, podczas gdy neurofilamenty w brzusznej części rdzenia kręgowego zachowują dobrą ciągłość. (B) Reprezentatywny przekrój z grupy umiarkowanej. Oprócz nakładających się astrocytów można zaobserwować dwa centra bliznowacenia (oznaczone czerwonymi gwiazdkami), natomiast neurofilamenty w części brzusznej zachowują ciągłość. (C) Reprezentatywny przekrój z grupy ciężkiej, z dużym zakresem uszkodzenia i masową obecnością astrocytów tworzących bliznę. Nie obserwuje się wyraźnego centrum bliznowacenia, a neurofilamenty wykazują słabą ciągłość. Pasek skali = 500 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 7: Siła generowana z tej samej wysokości, ale przy użyciu różnych ciężarów. Przed eksperymentem siłę generowaną przez różne masy ciężarków upuszczonych z tej samej wysokości mierzono za pomocą urządzenia do detekcji ciśnienia szczytowego. Po wykonaniu 24 pomiarów w każdej grupie uzyskano bardziej wiarygodne dane dotyczące grawitacji jako punkt odniesienia dla siły uderzenia. Dane analizowano przy użyciu oprogramowania statystycznego SPSS 19.0. Dane przedstawiono jako średnia ± SD, n = 24 w każdej grupie. Porównania pomiędzy grupami oparto na jednoczynnikowej analizie wariancji (ANOVA) w celu zbadania różnic; wartość p < 0,05 uznano za istotną statystycznie. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
| 28 dpi | |||
| Grupa | GMR (%) | WMR (%) | DR (%) |
| Normalny | 35.44 | 64.57 | 0 |
| Łagodny | 11.59 | 64.88 | 23.53 |
| Umiarkowany | 0 | 41.14 | 58.86 |
| Ciężki | 0 | 0 | 100 |
Tabela 1: Odsetek istoty białej, istoty szarej oraz uszkodzeń w 28. dniu po urazie. Skróty: dpi = dni po urazie, DA = obszar uszkodzony; GMR = odsetek istoty szarej; WMR = odsetek istoty białej; DR = odsetek uszkodzeń.
| Grupa | 1 dpi DA (μm2) | 56dpi DA (μm2) |
| Normalny | 0 | 0 |
| Łagodny | 2391250 | 666091 |
| Umiarkowany | 4383381 | 1263191 |
| Ciężki | 5118833 | 1943962 |
Tabela 2: Porównanie zmian w przekrojach strzałkowych w 1. i 56. dniu po urazie.
Dyskusja
Dzięki ustandaryzowanej procedurze można uzyskać stabilne dane, zwłaszcza w eksperymentach in vivo na małych zwierzętach, co może zminimalizować odchylenia wyników spowodowane indywidualnymi różnicami między zwierzętami. Na podstawie powyższych warunków i wygodnych instrumentów aplikacyjnych można ustalić znormalizowane, minimalnie inwazyjne, dokładne i powtarzalne modele SCI.
Ze względu na swoją praktyczność i wygodę, wcześniej impaktor odchudzający był używany głównie3. Impaktor wprowadzony w tym badaniu działa na tej samej zasadzie co model12 Allena. Na szczęście, ze względu na dokładne zalety produkcyjne nowoczesnej technologii obróbki skrawaniem, zespół badawczy zaprojektował impaktor odchudzający o zaletach łatwości obsługi, dużej stabilności i rzadko niedokładności. Do pomiaru ciężaru różnych mas wykorzystano urządzenie do wykrywania ciśnienia szczytowego. Poprzednie badania 6,10 dotyczące impaktora Infinite Horizons wykazały, że zakres siły ±5 Kdyn odbiegający od zamierzonej siły jest akceptowany w grupach 30 Kdyn, 50 Kdyn i 70 Kdyn, co stanowi odniesienie dla niniejszego badania pod względem podziału grup i wyboru stopnia stłuczenia. W niniejszych badaniach z wyprzedzeniem zmierzono możliwą siłę różnych grup i uzyskano dokładniejsze dane.
Bardziej krytyczne niż urządzenie w eksperymentach na modelach zwierzęcych jest zrozumienie i wykorzystanie anatomii myszy. Dobre wykorzystanie anatomii może sprawić, że zabiegi będą minimalnie inwazyjne. Chirurgia małoinwazyjna bezpośrednio wpływa na stabilność stanu funkcjonalnego zwierzęcia doświadczalnego i spójność późniejszej rekonwalescencji myszy. Wcześniejsze badania wykazały, że minimalnie inwazyjne ustanowienie modeli SCI zwiększa stabilność struktury kręgów i pozwala uniknąć dodatkowych uszkodzeń spowodowanych niestabilnością kręgosłupa podczas rekonwalescencji u szczurów1. Założeniem chirurgii małoinwazyjnej jest rozsądne wykorzystanie naturalnych struktur anatomicznych. Dlatego szybkie i precyzyjne lokalizowanie segmentów rdzenia kręgowego powinno odbywać się zgodnie z budową anatomiczną myszy. Jak informowano, do odnalezienia kręgu13 zastosowano metodę obrazowania. Chociaż ma wysoką dokładność, w rzeczywistym procesie operacji eksperymentalnej metoda obrazowania do lokalizacji ma wady polegające na niewygodnej obsłudze, długim czasie pracy, złożonym pozyskiwaniu sprzętu i wysokich wymaganiach dotyczących dokładności sprzętu. McDonough i in. opisali lokalizowanie T7 przez dolne kąty łopatek14, podczas gdy myszy działają w pozycji leżącej, więc wspomniane dolne kąty mają być kątami tylnymi. Co więcej, użycie dolnych końcówek łopatki do znalezienia T7 jest metodą lokalizowania określonej pozycji w ludzkiej anatomii15, która nie jest odpowiednia dla myszy. Wreszcie, dane z mikrotomografii komputerowej potwierdziły również hipotezę, że tylne kąty łopatek nie są równo z T7, niezależnie od tego, czy mysz znajduje się w swojej naturalnej, czy określonej pozycji ciała. McDonough i wsp.14 wspomnieli również o zlokalizowaniu najwyższego punktu grzbietu, gdy mysz jest wygięta w łuk i zdefiniowaniu najwyższego punktu jako T12. Dla porównania, w niniejszych badaniach T9 jest zlokalizowany za pomocą przestrzeni międzykolcowej T12-T13, która nie jest związana z postawą myszy ani nie ma na nią wpływu. Poza tym dzięki tej metodzie docelowy kręg można łatwo zlokalizować i zoperować. Należy pod mikroskopem zbadać 13. żebro, delikatnie dotknąć obszaru kąta żebrowo-grzbietowego, narysować linię w kierunku wyrostka kolczystego, a następnie zbadać przestrzeń między wyrostkami kolczystymi T12-T13 w kierunku głowy. Zespół badawczy wykorzystał przestrzeń międzykolcową T12-T13 do zlokalizowania T9 12 myszy. Wreszcie, 12 samic myszy C57BL / 6J miało skan Micro-CT po lokalizacji T9 i laminektomii. Wynik badania Micro-CT wykazał, że usunięte blaszki u wszystkich 12 myszy miały kształt T9. Wyniki badania Micro-CT wykazały, że wszystkie T9 były dokładnie zlokalizowane, a dokładność była znacznie wyższa niż w przypadku metody lokalizacji łopatki. Ta metoda zapewnia nam szybki i dokładny sposób lokalizacji, co przyczynia się do spójności modelu urazu.
Minimalna inwazyjność niniejszego protokołu przejawia się głównie w trzech aspektach. Po pierwsze, po zlokalizowaniu, mięśnie przykręgosłupowe na poziomie T9 są cofane tylko przez mikro-retraktory, bez uszkadzania mięśni na poziomie T8 lub T10. Poza tym odsłonięcie blaszki przez mikro-zwijacze nie zakłóca pola widzenia. Po drugie, utrata krwi, która jest głównie spowodowana laminektomią, która może powodować odpływ krwi z kości gąbczastej, jest bardzo niska w procedurze operacyjnej, prawie nie większa niż objętość do zabarwienia trójkątnego kawałka bawełny o wymiarach 2 mm x 2 mm x 3 mm. Po trzecie, laminektomię przeprowadzono w największym stopniu ograniczonym do potrzebnej powierzchni, zachowując ciągłość bocznej części blaszki i znacznie osłabiając niestabilność kręgów. W porównaniu z poprzednimi protokołami16,17, obecny protokół redukuje wiele niepotrzebnych szkód.
Aby ocenić różne stopnie SCI, porównano wyniki między wszystkimi grupami w histopatologii z tym, co wykazały już poprzednie badania 9,11,18. Wyniki te są wystarczające do przeprowadzenia badania obserwacyjnego różnego stopnia urazu i zmian w różnych okresach. HE i immunofluorescencja wykazały, że wraz ze wzrostem nasilenia SCI w tkance rdzenia kręgowego pojawiło się więcej nieprawidłowych morfologii, a wzrost stopnia uszkodzenia doprowadził również do wzrostu stopnia zaburzeń strukturalnych rdzenia kręgowego. Z punktu widzenia obserwacji morfologii tkanek stopień i regularność zmian morfologii tkanek w każdej grupie eksperymentalnej w tym badaniu jest wysoce zgodna z wcześniejszymi badaniami.
Zgodnie z aktualnymi wynikami badań histologicznych wskazane są wyraźne zmiany różnych wskaźników po różnym stopniu urazowego SCI, co dodatkowo potwierdza wiarygodność modelu ustalonego w tym badaniu.
Chociaż technika ta jest dokładna i skuteczna, mogą istnieć potencjalne ograniczenia dla tych metod. Jeśli chodzi o laminektomię, operator powinien być biegły w operacjach pod mikroskopem, aby zapobiec przypadkowemu uszkodzeniu rdzenia kręgowego. Ponadto konfiguracja całej platformy opiera się na konstrukcjach mechanicznych, co stawia wyższe wymagania przed operatorem w porównaniu ze sprzętem zautomatyzowanym. Rzeczywiście, wszystkie wymienione problemy można poprawić poprzez wielokrotne szkolenie obsługi.
Można zauważyć, że minimalnie inwazyjne i ustandaryzowane modelowanie jest korzystne w ujednolicaniu wyników, ich stabilności i powtarzalności, dokładnej ocenie skuteczności różnych planów leczenia i optymalizacji planu badawczego dla urazowego SCI.
Oświadczenia
Profesor Shiqing Feng jest właścicielem platformy koncentrycznej po urazie rdzenia kręgowego.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez Państwowy Program Kluczowy Narodowej Nauki Przyrodniczej Chin (81930070).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 4% roztwór utrwalający | Solarbio | P1110 | 4% |
| Przeciwciało anty-neurofilamentowe ciężkie polipeptydowe | abcam | ab8135 | Stosunek rozcieńczenia (1: 2000) |
| Roztwór do barwienia eozyny (rozpuszczalny w wodzie) | biosharp | BL727B | |
| Etanol | Fuyu Odczynnik | 64-17-5 | |
| Mikroskop fluorescencyjny | KEYENCE | BZ-X800 | |
| Krajalnica do zamrażania | leica | CM3050 S | |
| GFAP (GA5) Mysz mAb | TECHNOLOGIA Sygnalizacji Komórkowej | #3670 | Stosunek rozcieńczenia (1: 600) |
| Kozioł anty-mysi IgG (H+L) Wysoce adsorbowane krzyżowo przeciwciało wtórne, Alexa Fluor Plus 488 | ThermoFisher SCIENTIFIC | A32723TR | Stosunek rozcieńczenia (1: 1000) |
| Kozia anty-królicza IgG (H + L) Wysoce zaadsorbowane krzyżowo przeciwciało drugorzędowe, Alexa Fluor Plus 594 | ThermoFisher SCIENTIFIC | A32740 | Stosunek rozcieńczenia (1: 1000) |
| Hematoksylina Roztwór do barwienia | biosharp | BL702A | |
| Myszy | Jinan Pengyue Experimental AnimalCompany | C57BL/6J | |
| Aparatura mikrochirurgiczna | Shandong ULT Biotechnology Co., Ltd | Wszystkie instrumenty chirurgiczne to wykonane na zamówienie | nożyczki okulistyczne, kleszczyki do mikrokomarów, kleszcze mikrochirurgiczne, mikronożyczki |
| Normalna surowica owcza do blokowania (roztwór roboczy) | Zhong Shan Jin Qiao | ZLI-9022 | roztwór roboczy |
| Związek OCT | SAKURA | 4583 | |
| PBS (roztwór buforowany fosforanem) | Solarbio | P1020 | pH 7.2-7.4 |
| RWD Laboratoryjna wziewna stacja anestezjologiczna | RWD Life Science Co., Ltd | R550 | |
| System obrazowania mikrotomografii komputerowej in vivo dla małych zwierząt | PerkinElmer | Quantum GX2 | |
| Platforma koncentryczna do uszkodzenia rdzenia kręgowego | Shandong ULT Biotechnology Co., Ltd | Wykonane na zamówienie (standard Fenga) | (https://shop43957633.m.youzan.com/wscgoods/detail/367x5ovgn69q18g?banner_id=f.81386274~goods.7~1 ~ b0yRFKOq & alg_id=0& slg=tagDobry Lista-domyślna%2COpBottom%2Cuuid %2CabTraceId& components_style_ układ=1& reft=1659409105184& sp m=g.930111970_f.81386274& alias =367x5ovgn69q18g& from_uuid=136 2cc46-ffe0-6886-2c65-01903dbacbb a& sf=qq_sm& is_share=1& shopAuto Enter=1& share_cmpt=native_ wechat& is_silence_auth=1) |
| Mikroskop chirurgiczny | Zumax Medycyna Co., Sp. z o.o. | zumax, OMS2355 | |
| TBST (Tris Buffered Saline+Tween) | Solarbio | T1082 | Stosunek rozcieńczenia (1: 19) |
| Odczynnik Xylene | Fuyu | 1330-20-7 |
Bibliografia
- Duan, H., et al. A novel, minimally invasive technique to establish the animal model of spinal cord injury. Annals of Translational Medicine. 9 (10), 881(2021).
- Piao, M. S., Lee, J. -K., Jang, J. -W., Kim, S. -H., Kim, H. -S. A mouse model of photochemically induced spinal cord injury. Journal of Korean Neurosurgical Society. 46 (5), 479-483 (2009).
- Sharif-Alhoseini, M., et al. Animal models of spinal cord injury: A systematic review. Spinal Cord. 55 (8), 714-721 (2017).
- Zhang, N., Fang, M., Chen, H., Gou, F., Ding, M. Evaluation of spinal cord injury animal models. Neural Regeneration Research. 9 (22), 2008-2012 (2014).
- Borges, P. A., et al. Standardization of a spinal cord lesion model and neurologic evaluation using mice. Clinics. 73, 293(2018).
- Ghasemlou, N., Kerr, B. J., David, S. Tissue displacement and impact force are important contributors to outcome after spinal cord contusion injury. Experimental Neurology. 196 (1), 9-17 (2005).
- Siddall, P., Xu, C. L., Cousins, M. Allodynia following traumatic spinal cord injury in the rat. Neuroreport. 6 (9), 1241-1244 (1995).
- Ford, J. C., et al. MRI characterization of diffusion coefficients in a rat spinal cord injury model. Magnetic Resonance in Medicine. 31 (5), 488-494 (1994).
- Basso, D. M., Beattie, M. S., Bresnahan, J. C. Graded histological and locomotor outcomes after spinal cord contusion using the NYU weight-drop device versus transection. Experimental Neurology. 139 (2), 244-256 (1996).
- Nishi, R. A., et al. Behavioral, histological, and ex vivo magnetic resonance imaging assessment of graded contusion spinal cord injury in mice. Journal of Neurotrauma. 24 (4), 674-689 (2007).
- Ma, M., Basso, D. M., Walters, P., Stokes, B. T., Jakeman, L. B. Behavioral and histological outcomes following graded spinal cord contusion injury in the C57Bl/6 mouse. Experimental Neurology. 169 (2), 239-254 (2001).
- Allen, A. R. Surgery of experimental lesion of spinal cord equivalent to crush injury of fracture dislocation of spinal column. The Journal of the American Medical Association. (11), 878-880 (1911).
- Kuhn, P. L., Wrathall, J. R. A mouse model of graded contusive spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 15 (2), 125-140 (1998).
- McDonough, A., Monterrubio, A., Ariza, J., Martinez-Cerdeno, V. Calibrated forceps model of spinal cord compression injury. Journal of Visualized Experiments. (98), e52318(2015).
- Ernst, M. J., Rast, F. M., Bauer, C. M., Marcar, V. L., Kool, J. Determination of thoracic and lumbar spinal processes by their percentage position between C7 and the PSIS level. BMC Research Notes. 6, 58(2013).
- Wu, X., et al. A tissue displacement-based contusive spinal cord injury model in mice. Journal of Visualized Experiments. (124), e54988(2017).
- Bhalala, O. G., Pan, L., North, H., McGuire, T., Kessler, J. A. Generation of mouse spinal cord injury. Bio-protocol. 3 (17), 886(2013).
- Shinozaki, M., et al. Novel concept of motor functional analysis for spinal cord injury in adult mice. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 157458(2010).
Przedruki i uprawnienia
