Genowe obwody cyfrowe oparte na systemach CRISPR-Cas i białkach anty-CRISPR

Podsumowanie

Systemy CRISPR-Cas i białka anty-CRISPR zostały zintegrowane ze schematem bramek Boole'a u Saccharomyces cerevisiae. Nowe małe obwody logiczne wykazały się dobrą wydajnością i pogłębiły wiedzę zarówno na temat czynników transkrypcyjnych opartych na dCas9/dCas12a, jak i właściwości białek anty-CRISPR.

Streszczenie

Syntetyczne bramki Boole'a i obwody cyfrowe mają szeroki zakres zastosowań, od diagnostyki medycznej po ochronę środowiska. Odkrycie systemów CRISPR-Cas i ich naturalnych inhibitorów – białek anty-CRISPR (Acrs) – dostarcza nowego narzędzia do projektowania i wdrażania cyfrowych obwodów genowych in vivo. W tym miejscu opisujemy protokół, który jest zgodny z ideą cyklu inżynierii biologicznej "Zaprojektuj-Zbuduj-Przetestuj-Naucz się" i wykorzystuje dCas9/dCas12a wraz z odpowiadającymi im Acr do ustanowienia małych sieci transkrypcyjnych, z których niektóre zachowują się jak bramki Boole'a, w Saccharomyces cerevisiae. Wyniki te wskazują na właściwości dCas9/dCas12a jako czynników transkrypcyjnych. W szczególności, aby osiągnąć maksymalną aktywację ekspresji genów, dSpCas9 musi wchodzić w interakcje ze zmodyfikowanym rusztowaniem RNA, które zbiera wiele kopii domeny aktywacji VP64 (AD). Natomiast dCas12a powinien być stopiony, na końcu C, z silnym VP64-p65-Rta (VPR) AD. Co więcej, aktywność obu białek Cas nie jest zwiększona przez zwiększenie ilości sgRNA/crRNA w komórce. W tym artykule wyjaśniono również, jak tworzyć bramki logiczne w oparciu o interakcję CRISPR-dCas-Acr. Skondensowana domena wiążąca hormony AcrIIA4 ludzkiego receptora estrogenowego jest rdzeniem bramki NOT reagującej na β-estradiol, podczas gdy AcrVA syntetyzowane przez indukowalny promotor GAL1 pozwala naśladować zarówno bramki YES, jak i NOT z galaktozą jako wejściem. W tych ostatnich obwodach AcrVA5 wraz z dLbCas12a wykazywał najlepsze zachowanie logiczne.

Wprowadzenie

W 2011 roku badacze zaproponowali metodę obliczeniową i opracowali odpowiednie oprogramowanie do automatycznego projektowania cyfrowych obwodów syntetycznych genów¹. Użytkownik musiał określić liczbę wejść (trzy lub cztery) i wypełnić tabelę prawdy obwodu; Dostarczyło to wszystkich informacji niezbędnych do wyprowadzenia struktury obwodu przy użyciu technik elektronicznych. Tabela prawdy została przetłumaczona na dwie formuły logiczne za pomocą metody mapy Karnaugha². Każda formuła logiczna składa się ze zdań, które opisują operacje logiczne (sumowanie lub mnożenie) między (częścią) wejść obwodu i ich negacjami (literałami). Klauzule z kolei są albo sumowane (OR), albo mnożone (AND) w celu obliczenia wyjścia obwodu. Każdy obwód może być zrealizowany według dowolnej z dwóch odpowiadających mu formuł: jednej zapisanej w formie POS (iloczyn sum), a drugiej w reprezentacji SOP (suma produktów). Pierwsza z nich polega na mnożeniu klauzul (tj. bramek logicznych), które zawierają logiczną sumę literałów. Z kolei ta ostatnia jest sumą klauzul, w których literały są mnożone.

Obwody elektryczne mogą być realizowane na płytce stykowej, poprzez fizyczne połączenie ze sobą różnych bramek. Prąd elektryczny pozwala na wymianę sygnałów między bramkami, co prowadzi do obliczenia mocy wyjściowej.

W biologii sytuacja jest bardziej złożona. Bramka Boole'a może być zrealizowana jako jednostka transkrypcyjna (TU; tj. sekwencja "promotor-kodujący region-terminator" wewnątrz komórek eukariotycznych), w której regulowana jest transkrypcja lub translacja (lub jedno i drugie). W ten sposób co najmniej dwa rodzaje cząsteczek ustanawiają biologiczne okablowanie: białka czynnika transkrypcyjnego i niekodujące, antysensowne RNAs¹.

Cyfrowy obwód genu jest zorganizowany w dwie lub trzy warstwy bramek, a mianowicie: 1) warstwę wejściową, która składa się z bramek YES (bufor) i NOT i przekształca wejściowe substancje chemiczne w cząsteczki okablowania; 2) warstwa wewnętrzna, która składa się z tylu jednostek TU, ile jest klauzul w odpowiedniej formule logicznej. Jeśli obwód jest zaprojektowany zgodnie ze wzorem SOP, każda klauzula w warstwie wewnętrznej będzie wytwarzać wyjście obwodu (np. fluorescencję) w tak zwanej rozproszonej architekturze wyjściowej. Jeśli używana jest formuła iloczynu sumy (POS), wymagana jest 3) warstwa końcowa, która będzie zawierać pojedynczą bramkę multiplikatywną zbierającą cząsteczki przewodów z warstwy wewnętrznej.

Ogólnie rzecz biorąc, w biologii syntetycznej można zaprojektować wiele różnych schematów dla tego samego obwodu. Różnią się one liczbą i rodzajem zarówno jednostek TU, jak i cząsteczek przewodów. Aby wybrać najłatwiejsze rozwiązanie do wdrożenia w komórkach drożdży, każdy projekt obwodu jest powiązany z wynikiem złożoności S, zdefiniowanym jako

gdzie A oznacza liczbę aktywatorów, R reprezentuje liczbę represorów, a a a jest ilością antysensownych cząsteczek RNA. Jeśli w obwodzie nie ma aktywatorów lub represorów, ich wkład w S wynosi zero. W związku z tym trudniej jest zrealizować schemat obwodu w laboratorium (wysokie S), gdy wymaga to dużej liczby ortogonalnych czynników transkrypcyjnych. Oznacza to, że nowe aktywatory i represory powinny być projektowane de novo w celu zrealizowania kompletnego okablowania wewnątrz obwodów cyfrowych. Zasadniczo, nowe białka wiążące DNA mogą być składane przy użyciu białek palca cynkowego³ i efektorów TAL⁴ jako szablonów. Jednak ta opcja wydaje się zbyt żmudna i czasochłonna; dlatego należy polegać głównie na małych RNA i regulacji translacji, aby sfinalizować złożone obwody genowe.

Pierwotnie, ta metoda została opracowana do wytwarzania obwodów cyfrowych u bakterii. Rzeczywiście, w komórkach eukariotycznych, zamiast antysensownych RNA, bardziej odpowiednie jest mówienie o mikroRNA (miRNA) lub małych interferujących RNA (siRNA)⁵. Jednak szlak RNAi nie jest obecny w drożdżach S. cerevisiae. Dlatego należy zdecydować się na sieci w pełni transkrypcyjne. Załóżmy, że obwód potrzebuje pięciu aktywatorów i pięciu represorów; jego wynik złożoności wynosiłby S = 32. Złożoność obwodu można zmniejszyć, zastępując 10 czynników transkrypcyjnych pojedynczym dCas9⁶ (Cas9 z niedoborem nukleazy) połączonym z domeną aktywacji (AD). Jak pokazano w⁷, dCas9-AD działa jako represor u drożdży podczas wiązania promotora między pudełkiem TATA a TSS (miejsce rozpoczęcia transkrypcji) oraz jako aktywator podczas wiązania przed pudełkiem TATA. W ten sposób można zastąpić 10 czynników transkrypcyjnych pojedynczym białkiem fuzyjnym dCas9-AD i 10 sgRNA (pojedynczymi przewodnikowymi RNA), co daje całkowity wynik złożoności S = 11. Synteza dziesięciu sgRNA jest szybka i łatwa, podczas gdy, jak wcześniej wspomniano, złożenie 10 białek wymagałoby znacznie dłuższej i bardziej skomplikowanej pracy.

Alternatywnie, można użyć dwóch ortogonalnych białek dCas (np. dCas9 i dCas12a): jednego do fuzji z AD, a drugiego gołego lub w połączeniu z domeną represji. Wynik złożoności wzrósłby tylko o jedną jednostkę (S = 12). W związku z tym systemy CRISPR-dCas są kluczem do budowy bardzo skomplikowanych obwodów cyfrowych genów u S. cerevisiae.

Ten artykuł dogłębnie opisuje skuteczność zarówno represorów, jak i aktywatorów opartych na dCas9 i dCas12a w drożdżach. Wyniki pokazują, że nie wymagają one dużej ilości sgRNA w celu optymalizacji swojej aktywności, dlatego preferencyjnie unika się plazmidów episomalnych. Co więcej, aktywatory oparte na dCas9 są znacznie bardziej skuteczne, gdy używa się rusztowania RNA (scRNA), które rekrutuje kopie VP64 AD. W przeciwieństwie do tego, dCas12a działa dobrze, gdy jest bezpośrednio połączony z silnym VPR AD. Ponadto syntetyczny aktywowany promotor wymaga zmiennej liczby miejsc docelowych, w zależności od konfiguracji aktywatora (np. Trzy w przypadku stosowania dCas12a-VPR, sześć w przypadku dCas9-VP64 i tylko jedno z dCas9 i scRNA). Jako represor, dCas12a wydaje się bardziej zdecydowany podczas wiązania regionu kodującego, a nie promotora.

Jako wada, CRISPR-dCas9/dCas12a nie wchodzą bezpośrednio w interakcje z chemikaliami. W związku z tym mogą być bezużyteczne w warstwie wejściowej. Z tego powodu zbadano alternatywne projekty bramek Boole'a zawierające białka anty-CRISPR (Acr). Acr działają na białka (d)Cas i hamują ich działanie⁸. W związku z tym są one środkiem do modulowania aktywności systemów CRISPR-(d)Cas. W niniejszej pracy dokładnie przeanalizowano interakcje między typem II Acrs i (d)Cas9, a także typem V Acrs i (d)Cas12a u S. cerevisiae. Ponieważ Acr są znacznie mniejsze niż białka Cas, bramka NOT reagująca na estrogen β-estradiol została zbudowana przez fuzję domeny wiążącej hormony ludzkiego receptora estrogenowego^9-HBD(hER)-do AcrIIA4. Poza tym zrealizowano kilka bramek TAK i NOT, które wyrażały dCas12a (-AD) konstytutywnie i AcrVA po indukcji galaktozą. Obecnie bramy te służą jedynie jako dowód słuszności koncepcji. Stanowią one jednak również pierwszy krok w kierunku głębokiego przemyślenia algorytmu w celu przeprowadzenia automatycznego obliczeniowego projektowania obwodów cyfrowych syntetycznych genów w komórkach drożdży.

Protokół

1. Projekt i budowa kasety ekspresji sgRNA/crRNA

UWAGA: Istnieją dwa rodzaje kaset ekspresyjnych sgRNA/crRNA: jednoterminowa SNR52^10-składa się z zależnego od polimerazy RNA III promotora SNR52, sekwencji sgRNA/crRNA i terminatora SUP4; inna - w skrócie RGR¹¹ - składa się z ADH1 zależnej od polimerazy RNA II. promotor, struktura RGR (rybozym-przewodnik RNA-rybozym), która zawiera dwa rybozymy (rybozym młota-HH i rybozym wirusa delta zapalenia wątroby-HDV) oraz sekwencję sgRNA/crRNA pomiędzy nimi oraz terminator ADH1. Homologi Cas9 prowadzące sgRNA składają się z sekwencji dystansowej i charakterystycznego bezpośredniego powtórzenia¹², podczas gdy crRNA dla białek Cas12a składa się z bezpośredniego powtórzenia, po którym następuje sekwencja dystansowa^13,14 (patrz Tabela Uzupełniająca 1 dla wszystkich sekwencji DNA użytych w tym badaniu).

1. Zaprojektuj sekwencję dystansową dla aktywacji transkrypcji za pośrednictwem Cas9/Cas12a.
   1. Wykorzystaj bakteryjną sekwencję operatora lex (o nazwie lexOp) jako miejsce docelowe^15,16 i wstaw ją do promotora CYC1, który steruje ekspresją białka zielonej fluorescencji wzmocnionego drożdżami (yEGFP)¹⁷. W związku z tym sekwencja dystansowa jest zdefiniowana i komplementarna do wstawionego lexOp.
2. Sprawdź ortogonalność sekwencji odstępów za pomocą narzędzia CRISPRDIRECT¹⁸.
   1. Wklej sekwencję lexOp otoczoną sekwencją PAM w polu tekstowym, zdefiniuj sekwencję PAM jako NRG dla dCas9 i TTTV dla dCas12a, a następnie określ gatunek z listy rozwijanej jako S288C Genom drożdży pączkujących (Saccharomyces cerevisiae). Kliknij Projekt. Upewnij się, że nie ma pasującej witryny docelowej w wyszukiwaniu 20mer+PAM ani w 12mer+PAM.
3. Skonstruuj kasetę ekspresji sgRNA/crRNA.
   1. Użyj touchdown PCR, aby amplifikować sekwencje DNA standardowych części biologicznych, takich jak promotory, sekwencje kodujące i terminatory.
      1. Przygotować mieszaninę reakcyjną zawierającą: 20-40 ng matrycy DNA, 1 μL 10 μM startera do przodu (tj. ot25, budowa plazmidu ekspresji sgRNA/crRNA), 1 μL 10 μM odwrotnego startera (tj. ot26, budowa plazmidu ekspresji sgRNA/crRNA), 5 μL 2,5 mM mieszanki dNTP, 0,5 μL polimerazy DNA, 10 μL 5x buforu reakcyjnego polimerazy DNA i podwójnie destylowana woda (ddH₂O) do całkowitej objętości 50 μL.
         UWAGA: Zapoznaj się z Tabelą Uzupełniającą 2, aby zapoznać się z listą starterów użytych w tym badaniu.
      2. Uruchom program PCR przyziemienia na termocyklerze:
         Etap 1: 98 °C przez 30 s.
         Etap 2 z 10 cyklami: 98 °C przez 10 s, 68 °C przez 20 s i 72 °C przez 15 s.
         Etap 3 z 25 cyklami: 98 °C przez 10 s, 59 °C przez 20 s i 72 °C przez 15 s.
         Etap 4: 72 °C przez 2 min.
         Na koniec przytrzymać w temperaturze 4 °C do momentu rozpoczęcia dalszych eksperymentów.
         UWAGA: 68 °C w etapie 2 i 59 °C w etapie 3 zależą od temperatur topnienia zarówno starterów do przodu, jak i do tyłu, różniących się od różnych par starterów. Czas w temperaturze 72 °C na etapach 2 i 3 zależy od długości produktu PCR i prędkości polimerazy DNA.
   2. Wyizolować produkty PCR za pomocą elektroforezy żelowej (100 V, 30 min). Eluować sekwencje DNA z żelu agarozowego za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu DNA (patrz tabela materiałów).
      UWAGA: Żel agarozowy 0,8% jest wymagany dla fragmentów dłuższych niż 500 nt, 1,5% żel agarozowy dla fragmentów od 100 nt do 500 nt i 2% żel agarozowy dla fragmentów krótszych niż 100 nt.
   3. Wstaw ekspresję TU sgRNA/crRNA do wektora wahadłowego pRSII404/424 ¹⁹, który zawiera gen oporności na ampicylinę i wybierany przez drożdże gen markera auksotroficznego-TRP1.
      1. Trawić wektor czółenka w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę za pomocą dwóch enzymów restrykcyjnych SacI i Acc65I. Przygotować mieszaninę reakcyjną, dodając 5 μg wektora wahadłowego, zalecane ilości enzymów, bufor trawienny (zgodnie z instrukcjami enzymu) i ddH₂O do całkowitej objętości 30 μl.
      2. Sprawdzić trawienie wektora wahadłowego za pomocą elektroforezy żelowej (patrz podkrok 1.3.2). Następnie dezaktywować oba enzymy w temperaturze 65 °C przez 20 minut.
      3. Użyj metody montażu Gibsona²⁰, aby wprowadzić oczyszczone produkty PCR do rozciętego wektora wahadłowego, wpuszczając równomolową mieszaninę DNA w temperaturze 50 °C na 1 godzinę.
      4. Przekształć kompetentne komórki Escherichia coli DH5α za pomocą powyższej mieszaniny reakcyjnej Gibsona za pomocą metody transformacji szoku cieplnego²¹. Przenieść przekształcone komórki E. coli na płytki agarowe Luria-Bertani (LB) zawierające ampicylinę (0,1 g/l). Umieścić płytki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i pozostawić komórki do wzrostu przez noc.
      5. Pobrać cztery kolonie z płytki agarowej LB i hodować je oddzielnie przez noc w temperaturze 37 °C w roztworze LB zawierającym ampicylinę (0,1 g/l). Następnie użyj procedury mini-przygotowania, aby wyekstrahować plazmidy z komórek E. coli²².
      6. Użyj starterów ot18 i ot19 (patrz Tabela Uzupełniająca 2 dla sekwencji oligo), aby zsekwencjonować i potwierdzić wstawioną jednostkę transkrypcyjną za pomocą metody Sangera²³.
         UWAGA: W późniejszych eksperymentach skonstruowane i potwierdzone plazmidy zostaną wprowadzone do genomu drożdży za pomocą protokołu PEG/LiAc²⁴.

2. Projekt i budowa rusztowania kasety z ekspresją RNA

UWAGA: RNA prowadnicy rusztowania (scRNA) składa się z sekwencji sgRNA i struktur spinki do włosów MS2²⁵. W tej pracy stosuje się dwa rodzaje struktur spinki do włosów MS2: spinkę do włosów typu dzikiego MS2 i białko płaszcza f6 MS2 (MCP) aptamer-f6.

1. Zsyntetyzuj matrycę scRNA, która jest w stanie pomieścić różne sekwencje dystansowe (tj. pSNR52-dystans_DR(SpCas9)-2×MS2(wt+f6)-SUP4t).
   UWAGA: W tym badaniu matryca scRNA została zsyntetyzowana przez firmę zajmującą się syntezą genów (patrz tabela materiałów).
2. Zaprojektuj odpowiednie startery (patrz Tabela Uzupełniająca 2), aby przeprowadzić PCR na niezbędnych sekwencjach dystansowych.
3. Postępuj zgodnie z procedurami opisanymi w kroku 1.3, aby skonstruować kasetę ekspresji scRNA.

3. Inżynieria dSpCas9 i budowa plazmidu ekspresyjnego

1. Uzyskaj pTPGI_dSpCas9_VP64 plazmidowy (patrz Tabela materiałów).
2. Skonstruuj wektor akceptora pRSII406-pGPD-ATG-XbaI-XhoI-CYC1t, w oparciu o wektor wahadłowy pRSII406, za pomocą PCR z przyłożeniem i metody montażu Gibsona (patrz krok 1.3). Plazmid zapewnia silny konstytutywny promotor - pGPD i terminator - CYC1t.
3. Trawić plazmid pTPGI_dCas9_VP64 i nowo utworzony wektor akceptorowy (5 μg przez 1 godzinę lub 10 μg przez noc – patrz krok 1.3.3.1 jako odniesienie) za pomocą XbaI i XhoI w temperaturze 37 °C. Oddzielić i oczyścić fragment insertu i wektor akceptorowy, jak w kroku 1.3.2.
4. Oczyszczony fragment insercji i wektor akceptorowy należy związać ligazą DNA T4 w temperaturze 16 °C przez 8 godzin. Przygotować roztwór ligacji, dodając 50-100 ng oczyszczonego wektora akceptorowego, oczyszczone fragmenty docelowe w ilości równomolowej z wektorem akceptorowym, 1,5 μl buforu T4, 0,5 μl ligazy T4 i ddH₂O do całkowitej objętości 15 μL.
5. Wykonaj kroki 1.3.3.3 i 1.3.3.4. Następnie potwierdzić, że nowo wytworzony plazmid jest prawidłowy, poprzez trawienie za pomocą XbaI i Xhol (37 °C, 1 h) oraz elektroforezę żelową (patrz krok 1.3.2).

4. Inżynieria dCas12a i budowa plazmidu

1. Skonstruuj plazmidy eksprymujące dCas12a-AD.
   1. Zsyntetyzuj dwa białka dCas12a zoptymalizowane pod kątem kodonów drożdży (denAsCas12a i dLbCas12a) otoczone miejscami enzymów restrykcyjnych BamHI i Xhol.
      UWAGA: W tym badaniu dwa białka dCas12a zoptymalizowane pod kątem kodonów drożdżowych zostały zsyntetyzowane przez firmę zajmującą się syntezą genów (patrz tabela materiałów).
   2. Skonstruuj wektor akceptora pRSII406-promotor-ATG-NLS-GS-HIStag-GS-BamHI-sp-XhoI-AD-NLS-TAA-mTGUO1 za pomocą touchdown PCR i metody montażu Gibsona (patrz krok 1.3), gdzie "promotorem" jest pGPD lub pGAL1, "sp" reprezentuje krótką sekwencję losową, a "AD" to VPR lub VP64.
   3. Wstawić każde białko dCas12a do dwóch nowo skonstruowanych wektorów akceptorowych poprzez trawienie z BamHI i XhoI oraz ligację z ligazą DNA T4 (patrz kroki 3.3 i 3.4).
2. Skonstruuj plazmidy wyrażające goły dCas12a.
   1. Skonstruuj wektor akceptorowy dla indukowanych galaktozą kaset ekspresyjnych dCas12a jako pRSII406-Acc651-pGAL1-ATG-NLS-GS-HIStag-GS-BamHI-sp-XhoI-GS-NLS-TAA-CYC1t przy użyciu touchdown PCR i metody montażu Gibsona (patrz krok 1.3).
   2. Trawić plazmidy zawierające białka dCas12a i powyższy wektor akceptorowy za pomocą BamHI i Xhol, a następnie podwiązywać je ligazą DNA T4, aby uzyskać plazmid pRSII406-pGAL1-Acc651-ATG-NLS-GS-HIStag-GS-BamHI-dCas12a-XhoI-GS-NLS-TAA-CYC1t (patrz kroki 3.3 i 3.4).
   3. Przetrawić plazmid uzyskany w kroku 4.2.2 za pomocą Acc65I i BamHI, a następnie zastąp pGAL1 pGPD za pomocą touchdown PCR i metody montażu Gibsona, aby skonstruować pRSII406-pGPD-ATG-NLS-GS-HIStag-GS-BamHI-dCas12a-XhoI-GS-NLS-TAA-CYC1t.

5. Inżynieria białek anty-CRISPR i budowa plazmidów

UWAGA: Do napędzania ekspresji Acrs zastosowano trzy rodzaje promotorów: indukowalny promotor-pGAL1, cztery promotory konstytutywne drożdży-pGPD, pACT1, pTEF1 i pTEF2, oraz syntetyczny konstytutywny promotor-genCYC1t_pCYC1noTATA²⁶.

1. Uzyskaj plazmidy zawierające sekwencje Acrs typu II (AcrIIA2, AcrIIA4²⁷ i AcrIIA5²⁸) i typu V-A Acrs (AcrVA1, AcrVA4 i AcrVA5²⁹) z firmy zajmującej się syntezą genów.
2. Skonstruuj plazmidy w oparciu o wektor wahadłowy pRSII403 do ekspresji Acrs.
   1. Konstruowanie kaset wyrażeń AcrIIA.
      UWAGA: Użyj touchdown PCR, aby amplifikować cztery różne promotory (tj. pGPD, pACT1, pTEF2 i genCYC1t_pCYC1noTATA), trzy rodzaje AcrIIA i dwa terminatory (ADH1t i CYC1t). Zbuduj serię jednostek TU wyrażających AcrIIA, pod różnymi promotorami, za pomocą metody montażu Gibsona (patrz krok 1.3).
   2. Konstruowanie kaset z wyrażeniami AcrVA.
      1. Zsyntetyzuj sekwencję akceptora: ATG-FLAGtag-GS-BamHI-sp-XhoI-NLS-GS-NLS-TAA-Tsynth6, gdzie "sp" to losowa sekwencja, która zostanie później zastąpiona przez AcrVA.
         UWAGA: W tym badaniu sekwencje akceptorowe zostały zsyntetyzowane przez firmę zajmującą się syntezą genów (tabela materiałów).
      2. Zbierz wektory akceptora pRSII403-promotor-ATG-FLAGtag-GS-BamHI-sp-XhoI-NLS-GS-NLS-TAA-Tsynth6, gdzie "promotorem" jest: pGAL1, pTEF1 i genCYC1t_pCYC1noTATA. Użyj metody montażu Gibsona (patrz krok 1.3).
      3. Wstaw każdy z trzech AcrVA do wektora akceptora opisanego w kroku 5.2.2.2 (za pomocą PCR z przyłożeniem i metody montażu Gibsona [patrz krok 1.3]), aby zbudować zestaw plazmidów wytwarzających AcrVA.
3. Dalej inżynier AcrIIA4, rozszerzając jego sekwencję o sekwencje łącznika GS i HBD(hER). Pozwala to na zbudowanie obwodu reagującego na β-estradiol.
   1. Użyj PCR z przyłożeniem, aby uzyskać oddzielnie części GS-HBD i AcrIIA4 (patrz krok 1.3.1).
   2. Umieść AcrIIA4, GS-HBD i wektor wahadłowy w mieszaninie Gibsona i skonstruuj kompletny plazmid za pomocą metody Gibsona (patrz krok 1.3.3).

6. Wykrywanie crRNA: RT-qPCR i konstrukcja starterów

UWAGA: wykrywanie crRNA zostało osiągnięte za pomocą RT-qPCR, który jest zorganizowany w trzech krokach.

1. Wykonaj ekstrakcję i oczyszczanie RNA z komórek drożdży za pomocą zestawu RNA.
   1. Hoduj komórki drożdży przez noc w 2 ml syntetycznego zdefiniowanego kompletnego podłoża (SDC, objętość 1 l: 20 g glukozy, 2 g mieszanki AA, 6,7 g YNB, 396 mg leucyny, 79,2 mg tryptofanu, 79,2 mg histydyny i 79,2 mg uracylu) przy użyciu płytki 24-dołkowej (240 obr./min, 30 °C).
   2. Rano rozcieńczyć kulturę komórkową (1:100) w 2 ml świeżego SDC i kontynuować hodowlę komórek drożdży w temperaturze 30 °C, 240 obr./min, przez kolejne 4 godziny.
   3. Zebrać całe 2 ml roztworu komórkowego i odwirować przy 20,238 x g przez 2 minuty. Ostrożnie usunąć supernatant, ponieważ osad komórkowy jest mały.
   4. Wyodrębnij RNA z komórek drożdży za pomocą zestawu RNA.
   5. Sprawdź jakość RNA.
      1. Przygotuj 1% żel agarozowy. Wymieszaj 5 μl każdej próbki RNA z 1 μl barwnika ładującego DNA. Następnie załaduj mieszaninę na żel i uruchom ją.
      2. Upewnij się, że na żelu znajdują się dwa przezroczyste prążki o stężeniu ~4,000 nt i ~2,000 nt, odpowiadające rybosomalnemu RNA (25S/18S). Dalsze rozmyte pasmo można zobaczyć przy ~80 nt dla tRNA.
   6. Próbki RNA należy natychmiast wykorzystać do syntezy cDNA lub przechowywać je w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości.
2. Odwrotna transkrypcja: Użyj metody pętli macierzystej³⁰, aby utworzyć pierwszą nić cDNA odpowiadającą crRNA (40 nt). W przypadku odwrotnej transkrypcji sgRNA (prawie 100 nt) procedura jest taka sama, jak w przypadku syntezy cDNA referencyjnego genu ACT1.
   UWAGA: Metoda odwrotnej transkrypcji crRNA różni się od metody stosowanej w przypadku sgRNA i mRNA ACT1. Ponieważ crRNA jest bardzo krótkie, potraktowano je jako mikroRNA i zastosowano metodę odwrotnej transkrypcji mikroRNA (podejście stem-loop) w celu uzyskania odpowiedniego cDNA. Do kwantyfikacji crRNA użyto dwóch zestawów do syntezy cDNA (zestaw pętli macierzystej dla crRNA i zwykły zestaw do odwrotnej transkrypcji dla genu ACT1). Ta sama ilość RNA została użyta w dwóch zestawach (patrz Tabela materiałów), aby wyniki eksperymentu były porównywalne. Starter używany z zestawem stem-loop został zaprojektowany zgodnie z sekwencją stem-loop i ostatnimi sześcioma nukleotydami na końcu 3' crRNA (dla sekwencji stem-loop i startera, patrz Tabela uzupełniająca 2).
   1. Metoda pętli macierzystej do odwrotnej transkrypcji crRNA
      1. Wyjmij matrycę RNA, starter i z zamrażarki i pozwól im stopić się na lodzie.
      2. Usuwanie genomowego DNA: Najpierw przygotuj 10 μl mieszaniny reakcyjnej zgodnie z instrukcją zestawu. Umieścić mieszaninę w termocyklerze w temperaturze 42 °C na 2 minuty. Na koniec przenieś go na lód.
      3. Synteza pierwszej nici cDNA: Przygotować 20 μl mieszaniny reakcyjnej, dodając 10 μl mieszaniny z kroku 6.2.1.2, 1 μl startera pętli macierzystej (stężenie 2 μM), 2 μl buforu reakcyjnego 10x RT, 2 μl mieszaniny enzymów odwrotnej transkrypcji (zawierającej odwrotną transkryptazę) i 5 μl_H2Owolnego od RNaz.
      4. Umieść mieszaninę reakcyjną w termocyklerze i uruchom następujący program: 25 °C przez 5 minut, 50 °C przez 15 minut i 85 °C przez 5 minut. Produkt do reakcji qPCR należy natychmiast użyć lub przechowywać w temperaturze -80 °C.
   2. odwrotna transkrypcja mRNA sgRNA i ACT1
      1. Pierwsza reakcja: Przygotuj mieszaninę o pojemności 13 μl składającą się z mieszaniny starterów, mieszaniny dNTP, matrycy RNA (50 pg-5 μg) i wody wolnej od RNaz (z wyjątkiem matrycy RNA, wszystko dostarczone przez zestaw), zgodnie z instrukcją zestawu. Użyj 1 μg matrycy RNA. Umieścić mieszaninę w termocyklerze w temperaturze 70 °C na 10 minut.
      2. Druga reakcja (synteza cDNA): Przygotować mieszaninę reakcyjną, dodając odczynniki (zgodnie z opisem w instrukcji zestawu) do 13 μl pierwszego roztworu reakcyjnego do końcowej objętości 20 μl. Umieścić mieszaninę w termocyklerze na 15 minut w temperaturze 50 °C, a następnie na dodatkowe 5 minut w temperaturze 85 °C. Produkt należy natychmiast zużyć do reakcji qPCR lub przechowywać w temperaturze -80 °C.
3. Zestaw SYBR do qPCR: Wykrywanie wartości Ct
   UWAGA: Odwrotny starter stosowany w qPCR crRNA jest utrwalony, ponieważ odpowiada odwrotnemu dopełnieniu sekwencji pętli macierzystej (patrz Tabela Uzupełniająca 2). Natomiast starter do przodu jest zmienny i zależy od sekwencji crRNA. Startery do przodu i do tyłu dla sgRNA i mRNA ACT1 qPCR są zaprojektowane w https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/. Dwa startery wybiera się, gdy różnica między ich temperaturami topnienia nie jest większa niż 2 °C (patrz tabela uzupełniająca 2). Każdą próbkę mierzy się w trzech powtórzeniach.
   1. Przygotować mieszaninę reakcyjną qPCR zgodnie z instrukcją producenta zestawu SYBR.
   2. Ustaw następujący program qPCR w maszynie do PCR w czasie rzeczywistym.
      Preinkubacja: 10 min w temperaturze 95 °C.
      Etap PCR: 15 s w 95 °C, a następnie 34 s w 55 °C. Ustaw cykl etapu PCR na 45 razy. Etap topnienia: 10 s w 95 °C, następnie 60 s w 65 °C i wreszcie 1 s w 97 °C.
   3. Oblicz względne wartości ekspresji mRNA za pomocą formuły Pfaffl³¹.

7. Immunofluorescencja do wykrywania białek Cas

UWAGA: Białka Cas (CasP) są połączone w His_tag.

1. Przygotowanie komórek drożdży
   1. Pobrać kilka komórek drożdży za pomocą sterylnej pętli i wyhodować je w 5 ml pożywki bogatej w YPD przez noc przy 240 obr./min w temperaturze 30 °C. Rano dodać 500 μl roztworu komórkowego do 20 ml świeżego YPD i hodować je z prędkością 240 obr./min w temperaturze 30 °C, aż OD₆₀₀ osiągnie 0,6.
   2. Weź 5 ml kultury i wymieszaj ją z 500 μl 37% formaldehydu. Pozostaw mieszaninę w temperaturze pokojowej (RT) przez 10 minut. Zebrać komórki przez odwirowanie w stężeniu 1 500 x g przez 5 minut.
   3. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki za pomocą 1 ml buforu utrwalającego (0,1 M KH₂PO₄, 0,5 M MgCl₂, 3,7% formaldehydu, pH = 6,5). Utrzymuj roztwór komórkowy w temperaturze pokojowej przez 20 minut.
   4. Odwirować roztwór komórkowy o stężeniu 1 500 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1 ml buforu płuczącego (0,1 M_{KH 2}PO₄, 1,2 M sorbitolu, pH = 6,5) uzupełnionego 4 μl beta-merkaptoetanolu i 4 μl roztworu lizatu (5 mg/ml). Umieścić roztwór komórkowy w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 20 minut.
   5. Odwirować roztwór komórkowy o stężeniu 1,500 x g przez 5 minut i odrzucić supernatant. Przepłukać osad komórkowy dwukrotnie 1 ml PBS przez odwirowanie (1 500 x g przez 5 min).
   6. Ponownie zawiesić komórki w 100 μl PBS plus 0,05% Tween 20 i dodać 4 μl roztworu BSA (10 mg/ml). Utrzymuj roztwór komórkowy w temperaturze pokojowej przez 20 minut.
2. Inkubacja z przeciwciałem pierwszorzędowym
   1. Dodać przeciwciało pierwszorzędowe ze znacznikiem Anti-His do mieszaniny w kroku 7.1.6 w rozcieńczeniu 1:400. Roztwór należy przechowywać w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.
   2. Odwirować mieszaninę w kroku 7.2.1 przy 1,500 x g przez 5 minut i usunąć sklarowany nad osadem. Dodać 1 ml PBST i wirować (1 500 x g) przez 5 minut, aby przepłukać osad komórkowy. Powtórz tę operację dwukrotnie. Na koniec odrzucić supernatant i zawiesić komórki w 100 μl 1x PBST.
3. Wykrywanie komórek mikroskopowych
   1. Zamontować komórki na szkiełku podstawowym; pobrać 2 μl roztworu komórkowego z kroku 7.2.2 i umieścić go na szkiełku podstawowym. Przykryj go szkiełkiem nakrywkowym.
   2. Obserwuj komórki pod mikroskopem fluorescencyjnym. Włącz fluorescencyjne źródło światła, mikroskop i komputer. Zapisz numer źródła światła fluorescencyjnego i otwórz oprogramowanie mikroskopu na komputerze.
   3. Umieść szkiełko na stoliku mikroskopu. Wybierz soczewkę obiektywu 40x i obserwuj komórki w zielonym świetle (550 nm). Przesuwaj pokrętło zgrubnej ostrości, aż pojawi się kontur komórek drożdży. Przesuń pokrętło precyzyjnego ustawiania ostrości, aby ustawić ostrość komórek.
   4. Wykryj komórki za pomocą oprogramowania mikroskopu. Zamknij pole widzenia mikroskopu i przełącz się na ekran komputera. Kliknij Na żywo, poczekaj 3-5 sekund i kliknij Przechwyć, aby zrobić zdjęcie. Zapisz zdjęcie.
   5. Wyłącz komputer, mikroskop i fluorescencyjne źródło światła.

8. Akwizycja danych: FACS

UWAGA: Zielona fluorescencja jest wykrywana za pomocą cytometrii przepływowej (tj. pomiarów sortowania komórek aktywowanych fluorescencją [FACS]). Komórki drożdży są hodowane, na ogół, w temperaturze 30 °C i 240 obr./min w celu przeprowadzenia eksperymentów FACS. Jednak komórki mogą wymagać pewnych środków ostrożności w zależności od ich zawartości genetycznej. Komórki zawierające gen dCas12a-VPR (kontrolowany przez konstytutywny promotor GPD) muszą być hodowane przez 24 godziny w roztworze SDC. Następnie komórki rozcieńcza się w stosunku 1:100 w świeżym SDC i hoduje przez kolejne 12 godzin przed pomiarem intensywności fluorescencji. Rozcieńczenia wymagają również komórki zmodyfikowane genem AcrIIA4-HBD(hER). Ponadto OD₆₀₀ musi być kontrolowany. Najpierw komórki mogą rosnąć w SDC przez noc (ponad 14 godzin). Rano mierzy się OD₆₀₀. Następnie hodowlę rozcieńcza się w SDC, dostarczając zróżnicowane stężenie β-estradiolu, aż do OD₆₀₀ = 0,1. Przed eksperymentami FACS komórki są hodowane przez kolejne 7 godzin, tak aby OD₆₀₀ osiągnął 0,8-1,0. Komórki wykazujące ekspresję dCas9-VP64 lub dCas12a-VP64 są hodowane w SDC przez 20-24 godziny bez rozcieńczania i dalszego wzrostu przed pomiarami na maszynie FACS.

1. Włącz maszynę FACS 20 minut przed pomiarami, aby rozgrzać laser.
2. Przygotować próbki (rozcieńczenie): zmieszać 20 μl kultury komórkowej z 300 μl ddH₂O.
3. Uruchom oprogramowanie FACS na komputerze podłączonym do komputera FACS i utwórz nowy eksperyment. Ustaw parametry pomiaru (np. FSC(SSC)-A/H/W i histogram).
4. Filtr należy dobrać zgodnie z długościami fal wzbudzenia i emisji próbek. Na przykład białkiem docelowym jest tutaj yEGFP, którego długości fal wzbudzenia i emisji wynoszą odpowiednio 488 nm i 507 nm. Wybierz więc filtr FITC lub GFP (długość fali wzbudzenia: 488 nm; długość fali emisji: 527/32 nm). Ustaw numer komórki akwizycji na 10 000.
5. Dostosuj napięcie filtra FITC, mierząc intensywność koralików fluorescencyjnych. Upewnij się, że względna różnica w intensywności koralików między dwoma kolejnymi eksperymentami nie przekracza 5%.
6. Myj maszynę za pomocą ddH₂O przez kilka sekund, aby usunąć ewentualny nadmiar kulek.
7. Zmierzyć intensywność fluorescencji próbki. Kliknij Podgląd i poczekaj 3-5 sekund, aby próbka wstrzyknęła stabilność. Na koniec kliknij Nabierz.
8. Zmierz koraliki ponownie pod koniec eksperymentu. Napięcie to to, które zostało użyte podczas początkowego pomiaru kulek (patrz krok 8.4, 438-441 V). Sprawdź, czy względna różnica między wymiarami dwóch koralików przekracza 5%.
9. Eksportuj dane FACS jako pliki FCS.
10. Analizowanie plików FCS za pomocą oprogramowania R Studio.

9. Analiza danych

UWAGA: Użyj pakietu Flowcore R Bioconductor³² w R studio. Pliki FCS zostały przeanalizowane za pomocą skryptu napisanego w języku R.

1. Otwórz program R Studio i załaduj analizę Bdverse skryptu. R, aby przeanalizować pliki FCS.
2. Ustaw nazwę eksperymentu (ename), katalog (ścieżkę), w którym znajdują się pliki FCS
   Przechowywane (dir_d) i gdzie zostaną utworzone pliki wynikowe (dir_r).
3. Ustaw kanał fluorescencji. Na przykład select_ch = "GPA-A", jeśli zmierzono zieloną fluorescencję.
4. Ustaw liczbę próbek, które zostały zmierzone (s_num).
5. Ustaw wymiary każdego wykresu kropkowego (sxlim, sylim). Ustawia maksymalną długość osi x i y dla wykresów słupkowych i pudełkowych (xlimit, ylimit). xlimit musi być większa lub równa s_num.
6. Wybierz metodę bramkowania, usuwając znak # z odpowiednich linii.
   UWAGA: morphGate to automatyczna metoda bramkowania przeprowadzana przez skrypt (tj. obszar wykresów punktowych, w którym komórki są gęstsze, jest rozpoznawany i wybierany przez program). polygonGate i rectangleGate wymagają przyjrzenia się wykresom kropkowym i zdefiniowania wierzchołków wielokąta lub boku prostokąta, który obejmuje strefę, w której leży większość komórek.
7. Wybierz obiekt flowSet gated, odpowiadający wybranej metodzie bramkowania. Wybierz rozdzielczość wykresu punktowego (res; powinna być co najmniej równa 256).
8. Odkomentuj flt_low <-filter_low(sp), aby usunąć pomiary, w których fluorescencja jest ujemna. Odkomentuj filtr(flt_lw flt_sp <, aby usunąć wartości odstające wynikające z innych eksperymentów.
9. Naciśnij Źródło i uruchom skrypt. Wszystkie pliki zawierające wyniki analizy są tworzone w dir_r.

Wyniki

sgRNA/crRNA ekspresja przez promotor polimerazy RNA typu III
Po pierwsze, praca ta dotyczyła inżynierii obwodu aktywacji transkrypcji (obwód 1) pokazanego na Rysunek 1A. Zawierał on trzy podstawowe komponenty: 1) gen kodujący yEGFP (reporter), który był poprzedzony serią różnych syntetycznych promotorów, które zapewniały miejsca docelowe dla dCas9/dCas12a-AD; 2) zoptymalizowana pod kątem kodonów drożdżowych wersja dCas9 lub dCas12a połączona z domeną aktywacji (odpowiedn...

Dyskusja

Protokół pokazał możliwy kompletny przepływ pracy dla obwodów cyfrowych syntetycznych genów, zgodnie z cyklem inżynierii biologicznej "Zaprojektuj-zbuduj-Testuj-Naucz się" (DBTL) i dotyczy zarówno eksperymentów w laboratorium suchym, jak i mokrym. W tym przypadku skupiliśmy się na systemie CRISPR-Cas, głównie dSpCas9, denAsCas12a, dLbCas12a i odpowiednich białkach anty-CRISPR, projektując i budując w S. cerevisiae małe sieci transkrypcyjne. Niektóre z nich naśladowały bramki Boole'a, które są podstawowymi elemen...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
0,1 ml probówki do PCR 8-paskowe	NEST	403112
0,2 ml probówki do PCR	Axygen	PCR-02-C
1,5 ml Mikroprobówki	Axygen	MCT-150-C
15 ml Probówki wirówkowe	BIOFIL	CFT011150
2 ml Mikroprobówki	Axygen	MCT-200-C
50 ml Probówki wirówkowe	BIOFIL	CFT011500
Agaroza-klasa biologii molekularnej	Invitrogen	75510-019
Sól sodowa ampicyliny	Solarbio	69-52-3
Applied biosystems veriti 96-dołkowy termocykler	Thermo Fisher Scientific	4375786
Zestaw do ekstrakcji żelu DNA AxyPrep	Axygen	AP-GX-250
BD FACSuite CS& Amp; Koraliki badawcze T	BD	650621	Koraliki fluorescencyjne
BD FACSPerse cytometr przepływowy
Wirówka	Eppendorf	5424
Wirówka Sorvall ST 16R	Thermo Fisher Scientific	75004380
E. coli kompetentne komórki (szczep DH5α)	Life Technologies	18263-012
ECL select Western Blotting odczynnik do wykrywania	Healthcare	RPN2235
Aparatura do elektroforezy	Pekin JUNYI Electrophoresis Co., Ltd	JY300C
Płaskie 8-paskowe nakrętki	NEST	406012
Firma zajmująca się syntezą genów	Azenta Life Sciences		https://web.azenta.com/zh-cn/azenta-life-sciences
Kozie przeciwciało wtórne anty-mysie IgG (H+L) adsorbowane krzyżowo Alexa Fluor 568	Invitrogen	A-11004
Zestaw do syntezy cDNA HiFiScript	CW2569M CWBIO		używany w kroku 6.2.2.1
Roztwór lizatu (Zymolyase)	zymoresearch	E1004-A
Mikroskop fluorescencyjny Nikon Eclipse 80i	Nikon	-	Mikroskop fluorescencyjny
Końcówki do pipet— 10 μ L	Axygen	T-300-R-S
Końcówki do pipet— 1000 μ L	Axygen	T-1000-B-R-S
Końcówki do pipet— 200 μ L	Axygen	T-200-Y-R-S
pRSII403	Addgene	35436
pRSII404	Addgene	35438
pRSII405	Addgene	35440
pRSII406 Addgene		35442
pRSII424	Addgene	35466
pTPGI_dSpCas9_VP64	Addgene	49013
Q5 Polimeraza DNA o wysokiej wierności	New England Biolabs	M0491
Enzym restrykcyjny-Acc65I	New England Biolabs	R0599
Enzym restrykcyjny-BamHI	New England Biolabs	R0136
Enzym restrykcyjny-SacI-HF	New England Biolabs	R3156
Enzym restrykcyjny-XhoI	New England Biolabs	R0146
Roche LightCycler 96	Instrument do PCR w czasie rzeczywistym	Roche
S. cerevisiae CEN. PK2-1C	-		Szczep macierzysty. Genotyp to: MATa; jego3D1; leu2-3_112; ura3-52; TRP1-289; MAL2-8c; Zestaw
pętli trzpienia	SparkJade	AG0502	Zestaw używany w kroku 6.2.1.3
T100 Termocykler	BIO-RAD	186-1096
Ligaza DNA T4	New England Biolabs	M0202
T5 Egzonukleaza	Nowa Anglia Biolabs	M0363
Ligaza DNA Taq	Nowa Anglia Biolabs	M0208
Polimeraza DNA Taq	New England Biolabs	M0495
TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)(2x) (SYBR Green I dye)	Takara	RR820Q
YeaStar RNA kit	Zymo Research	R1002
β-estradiol	Sigma-Aldrich	E8875