Test pulldown w połączeniu z koekspresją w komórkach bakteryjnych jako efektywne czasowo narzędzie do testowania trudnych interakcji białko-białko

Summary

Tutaj opisujemy metodę bakteryjnej koekspresji różnie znakowanych białek za pomocą zestawu kompatybilnych wektorów, a następnie konwencjonalne techniki pulldown do badania kompleksów białkowych, które nie mogą się składać in vitro.

Abstract

Pulldown to łatwy i szeroko stosowany test interakcji białko-białko. Ma jednak ograniczenia w badaniu kompleksów białkowych, które nie łączą się skutecznie in vitro. Takie kompleksy mogą wymagać składania kotranslacyjnego i obecności molekularnych białek opiekuńczych; Albo tworzą stabilne oligomery, które nie mogą się rozdzielić i ponownie asocjować in vitro, albo są niestabilne bez partnera wiążącego. Aby przezwyciężyć te problemy, możliwe jest zastosowanie metody opartej na bakteryjnej koekspresji różnie znakowanych białek przy użyciu zestawu kompatybilnych wektorów, a następnie konwencjonalnych technik pulldown. Przepływ pracy jest bardziej efektywny czasowo w porównaniu z tradycyjnym pulldownem, ponieważ brakuje w nim czasochłonnych etapów oddzielnego oczyszczania oddziałujących białek i ich późniejszej inkubacji. Kolejną zaletą jest większa odtwarzalność ze względu na znacznie mniejszą liczbę etapów i krótszy okres czasu, w którym białka istniejące w środowisku in vitro są narażone na proteolizę i utlenianie. Metoda ta została z powodzeniem zastosowana do badania szeregu interakcji białko-białko, gdy inne techniki in vitro okazały się nieodpowiednie. Metoda może być stosowana do badania okresowego oddziaływań białko-białko. Reprezentatywne wyniki przedstawiono w badaniach interakcji między domeną BTB a wewnętrznie nieuporządkowanymi białkami oraz heterodimerów domen związanych z palcem cynkowym.

Introduction

Konwencjonalne rozwijanie jest powszechnie używane do badania interakcji białko-białko¹. Jednak oczyszczone białka często nie oddziałują skutecznie in vitro^2,3, a niektóre z nich są nierozpuszczalne bez ich partnera wiążącego^4,5. Takie białka mogą wymagać złożenia kotranslacyjnego lub obecności molekularnych białek opiekuńczych^5,6,7,8,9. Innym ograniczeniem konwencjonalnego pulldownu jest testowanie możliwej aktywności heteromultimeryzacji między domenami, które mogą istnieć jako stabilne homo-oligomery złożone kotranslacyjnie^8,10, ponieważ wiele z nich nie może się rozdzielić i ponownie skojarzyć in vitro w czasie inkubacji. Stwierdzono, że wyrażenie współbieżne jest przydatne w przezwyciężaniu takich problemów^3,11. Koekspresja przy użyciu kompatybilnych wektorów u bakterii została z powodzeniem wykorzystana do oczyszczania dużych wielopodjednostkowych kompleksów makromolekularnych, w tym kompleksu represyjnego polycomb PRC2¹², moduł głowicy mediatora polimerazy II RNA¹³, płytka bazowa bakteriofaga T4¹⁴, moduł deubikwitylazy kompleksu SAGA^15,16, oraz ferritin¹⁷. Źródła replikacji często używane do kowyrażeń to ColE1, p15A¹⁸, CloDF13¹⁹ i RSF²⁰. W dostępnym na rynku systemie ekspresji Duet te pochodzenie jest łączone z różnymi genami oporności na antybiotyki i wygodnymi wieloma miejscami klonowania w celu wytworzenia wektorów policistronicznych, umożliwiających ekspresję do ośmiu białek. Te źródła mają różną liczbę kopii i mogą być używane w różnych kombinacjach w celu osiągnięcia zrównoważonych poziomów ekspresji docelowych białek²¹. Do testowania oddziaływań białko-białko stosuje się różne znaczniki powinowactwa; najczęstsze to 6xhistydyna, S-transferaza glutationu (GST) i białko wiążące maltozę (MBP), z których każde ma specyficzne powinowactwo do odpowiedniej żywicy. GST i MBP zwiększają również rozpuszczalność i stabilność oznakowanych białek²².

Opracowano również szereg metod obejmujących koekspresję białek w komórkach eukariotycznych, z których najważniejszą jest test dwuhybrydowy drożdży (Y2H)²³. Test Y2H jest tani, łatwy i umożliwia testowanie wielu interakcji; Jednak jego przepływ pracy trwa dłużej niż 1 tydzień. Istnieje również kilka rzadziej stosowanych testów opartych na komórkach ssaków, na przykład fluorescencyjny test dwuhybrydowy (F2H)²⁴ i test interakcji białko-białko w macierzy komórkowej (CAPPIA)²⁵. Test F2H jest stosunkowo szybki, pozwala na obserwację interakcji białek w ich naturalnym środowisku komórkowym, ale wymaga użycia drogiego sprzętu do obrazowania. Wszystkie te metody mają przewagę nad ekspresją prokariotyczną, zapewniając natywne środowisko translacji i fałdowania eukariotycznego; Wykrywają jednak interakcje pośrednio, albo poprzez aktywację transkrypcyjną, albo przez fluorescencyjny transfer energii, co często prowadzi do powstania artefaktów. Ponadto komórki eukariotyczne mogą zawierać innych partnerów interakcji białek będących przedmiotem zainteresowania, co może zakłócać testowanie interakcji binarnych między białkami wyższych eukariontów.

Niniejsze badanie opisuje metodę bakteryjnej koekspresji różnie znakowanych białek, stosowaną za pomocą konwencjonalnych technik pulldown. Metoda pozwala na badanie oddziaływań między białkami docelowymi, które wymagają koekspresji. Jest bardziej efektywny czasowo w porównaniu z tradycyjnym pulldownem, umożliwiając testowanie wsadowe wielu celów, co czyni go korzystnym w większości przypadków. Koekspresja przy użyciu kompatybilnych wektorów jest wygodniejsza niż policytroniczna koekspresja, ponieważ nie wymaga pracochłonnego etapu klonowania.

Protocol

Schematyczne przedstawienie przepływu pracy metody jest pokazane w Rysunek 1.

1. Współtransformacja E. coli

1. Przygotuj wektory ekspresyjne dla białek docelowych przy użyciu standardowych metod klonowania.
   UWAGA: Zazwyczaj dobrym punktem wyjścia jest użycie konwencjonalnych wektorów pGEX/pMAL zawierających gen oporności na ampicylinę i pochodzenie ColE1 do ekspresji białek znakowanych GST/MBP oraz kompatybilnego wektora o pochodzeniu p15A lub RSF i oporności na kanamycynę do ekspresji białek znakowanych 6xHis, w niektórych przypadkach w połączeniu z tioredoksyną lub znacznikiem SUMO w celu zwiększenia rozpuszczalności. Zazwyczaj przed eksperymentem należy przetestować kilka kombinacji tagów. Opisana metoda sama w sobie jest wygodna do badania okresowego warunków ekspresji białek docelowych. Ważne jest, aby zauważyć, że większość szczepów Rosetta zawiera już plazmid o pochodzeniu p15A do ekspresji tRNA dla rzadkiego kodonu, więc jeśli użycie takich szczepów jest możliwą opcją, należy unikać plazmidów p15A. Szczegółowe informacje można znaleźć w tabeli materiałów.
   1. Hodować bakterie odpowiedniego szczepu w pożywce Luria-Bertani (LB) w temperaturze 37 °C do gęstości optycznej (OD) 0,1-0,2. W tym badaniu jako przykłady użyto szczepu BL21(DE3).
      UWAGA: Zaleca się użycie świeżo przygotowanych kompetentnych komórek, aby osiągnąć wydajną kotransformację z dwoma wektorami. Jeśli więcej niż dwa wektory muszą być przekształcane współ, lepiej jest przekształcać je sekwencyjnie, aby osiągnąć dobrą wydajność transformacji. Dobrą alternatywą jest elektroporacja.
   2. Odwirować 1,0 ml zawiesiny bakteryjnej przez 1 minutę w temperaturze 9 000 x g w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant.
   3. Dodać 0,5 ml lodowatego buforu transformacyjnego buforowego (TB) (10 mM MOPS [pH 6,7], 250 mM KCl, 55 mM MnCl₂ i 15 mM CaCl₂) i inkubować przez 10 minut na lodzie.
   4. Wirować przez 30 s przy 8 000 x g w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant.
   5. Dodaj 100 μl buforu TB, dodaj 100 ng każdego wektora i inkubuj przez 30 minut na lodzie. Oddzielnie przekształcaj pojedyncze wektory, aby badać zachowanie białek bez koekspresji. Ponadto współprzekształcanie wektorów wyrażeń w parach z pustymi wektorami współwyrażeń dla kontrolek powiązań niespecyficznych.
      UWAGA: W przykładach podanych w tym badaniu wektory pGEX/pMAL z odpowiadającymi im cDNA połączonymi z cDNA GST/MBP zastosowano w połączeniu z kompatybilnymi wektorami pochodzącymi z pACYC, zawierającymi kodujące cDNA domeny białka partnera połączone z cDNA tioredoksyny.
   6. Podgrzewać w temperaturze 42 °C przez 150 s, a następnie schładzać przez 1 minutę na lodzie.
   7. Dodać 1 ml płynnej pożywki LB bez antybiotyków i inkubować w temperaturze 37 °C przez 90 minut. Płytka na płytkach LB-agar zawierających 0,5% glukozy i odpowiednie antybiotyki (typowe stężenia to: 50 mg/l ampicyliny; 20 mg/l kanamycyny; 50 mg/l streptomycyny; 35 mg/l chloramfenikol). Inkubować płytki przez noc w temperaturze 37 °C.

2. Wyrażenie

1. Przepłukać komórki z płytki 2 ml płynnej pożywki LB do 50 ml pożywki LB z odpowiednimi antybiotykami (typowe stężenia to: 50 mg/l ampicyliny; 20 mg/l kanamycyny; 50 mg/l streptomycyny; 35 mg/l chloramfenikolu). Dodaj jony metali lub inne znane kofaktory (w przykładach podanych w tym badaniu do pożywki dodano 0,2 mM ZnCl₂). Przechowywać podwielokrotność z 20% glicerolem w temperaturze -70 °C do ponownego powtórzenia doświadczenia.
   UWAGA: Zaleca się wypłukanie kilku kolonii bezpośrednio z płytki, aby wykluczyć możliwość złej ekspresji w pojedynczym izolowanym klonie z powodu sporadycznych zdarzeń rekombinacji między dwoma plazmidami.
2. Hodować komórki ze stałą rotacją 220 obr./min w temperaturze 37 °C do OD 0,5-0,7, schłodzić do temperatury pokojowej (RT) i dodać izopropyl β-D-1-tiogalaktopiranozyd (IPTG) do 1 mM. Przechowywać 20 μl podwielokrotności zawiesiny komórek jako kontrolę próbki nieindukowanej.
3. Inkubować komórki ze stałą rotacją 220 obr./min w temperaturze 18 °C przez noc.
   UWAGA: Optymalny czas i temperatura inkubacji mogą się różnić; 18 °C przez noc działa najlepiej w przypadku większości białek i zaleca się ich domyślne wypróbowanie. Skróć czas inkubacji do 2-3 godzin, jeśli zaobserwuje się silne niespecyficzne wiązanie.
4. Podzielić zawiesinę bakteryjną na dwie części (lub więcej, jeśli użyto więcej niż dwóch różnych znaczników) i przechowywać 20 μl podwielokrotności zawiesiny komórkowej w celu potwierdzenia ekspresji białka. Wirować przy 4 000 x g przez 15 min.
   UWAGA: Punkt pauzy: granulki bakteryjne można przechowywać w temperaturze -70 °C przez co najmniej 6 miesięcy.

3. Test pulldown

UWAGA: Szczegółowe procedury są opisane dla białek oznaczonych tagiem 6xHis lub MBP/GST. Wszystkie zabiegi wykonywane są w temperaturze 4°C.

1. Zawiesić osady bakteryjne w 1 ml lodowatego buforu do lizy z inhibitorami proteazy i środkami redukującymi (patrz poniżej) dodanymi bezpośrednio przed eksperymentem. Unikaj ditiotreitolu (DTT) podczas stosowania żywic chelatujących metale, ponieważ usuwa on jony metali. Dostosuj skład buforu dla badanych białek. Typowe receptury do lizy, które są odpowiednie dla większości białek, to:
   1. 6xHis-pulldown: Wymieszaj 30 mM HEPES (pH 7,5), 400 mM NaCl, 10 mM Imidazol, 0,1% NP40, 10% [w/w] glicerolu, 5 mM beta-merkaptoetanolu, 1 mM fenylometylosfulfonylofluorku (PMSF) i rozcieńcz 1:1,000 koktajlu inhibitora proteazy (patrz Tabela materiałów).
   2. GST lub MBP-pulldown: Wymieszaj 20 mM Tris (pH 7,5 w 25 °C), 150 mM NaCl, 10 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 0,1 mM ZnCl₂, 0,1% NP40, 10% [w/w] glicerolu, 5 mM DTT, 1 mM PMSF i rozcieńczenie 1:1,000 koktajlu inhibitora proteazy (patrz tabela materiałów).
2. Rozbij komórki przez sonikację na lodzie. Przechowywać 20 μl podwielokrotności do elektroforezy.
   UWAGA: Zazwyczaj wymagane jest 20-25 impulsów po 5 s w odstępach 15 s z mocą wyjściową 20 W na próbkę. Odpowiednia moc sonikacji powinna być dostosowana do każdego instrumentu, aby uniknąć przegrzania i zapewnić całkowite rozerwanie komórek. Aby osiągnąć lepszą wydajność, zdecydowanie zaleca się stosowanie sond sonicyjnych z wieloma końcówkami o wysokiej przepustowości.
3. Wirować przy 20 000 x g przez 30 min. Zebrać 20 μl oczyszczonego lizatu do dalszej analizy SDS-PAGE.
4. Zrównoważyć żywicę (50 μl na każdą próbkę) z 1 ml lodowatego buforu do lizy przez 10 minut, odwirować przy 2 000 x g przez 30 s i odrzucić supernatant.
5. Dodać lizaty komórkowe (całkowite stężenie białka: 20-50 mg/ml) do żywicy, inkubować przez 10 minut przy stałych obrotach 15 obr./min, odwirować przy 2 000 x g przez 30 s i odrzucić supernatant. Zebrać 20 μl frakcji niezwiązanej do dalszej analizy SDS-PAGE.
6. Dodać 1 ml lodowatego buforu do przemywania i inkubować przez 1 min. Wirować przy 2 000 x g przez 30 s i odrzucić supernatant. Typowe przepisy na do płukania to:
   1. 6xHis-pulldown: Wymieszaj 30 mM HEPES (pH 7,5), 400 mM NaCl, 30 mM Imidazolu, 0,1% NP40, 10% [w/w] glicerolu i 5 mM beta-merkaptoetanolu.
   2. GST lub MBP-pulldown: Wymieszaj 20 mM Tris (pH 7,5 przy 25 °C), 500 mM NaCl, 10 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 0,1 mM ZnCl₂, 0,1% NP40, 10% [w/w] glicerolu i 5 mM DTT.
7. Wykonać dwa długie płukania: dodać 1 ml lodowatego buforu do płukania, inkubować przez 10-30 minut ze stałą prędkością 15 obr./min, odwirować przy 2 000 x g przez 30 s i wyrzucić supernatant.
8. Dodać 1 ml lodowatego buforu do przemywania wodą, inkubować przez 1 minutę, odwirowywać przy 2 000 x g przez 30 s i odrzucić supernatant.
9. Eluować związane białka za pomocą 50 μl buforu elucyjnego w wytrząsarce z prędkością 1 200 obr./min przez 10 minut. Typowe receptury elucyjnych to:
   1. 6xHis-pulldown: Wymieszaj 30 mM HEPES (pH 7,5), 400 mM NaCl, 300 mM Imidazolu i 5 mM beta-merkaptoetanolu.
   2. GST-pulldown: 20 mM Tris (pH 7,5 przy 25 °C), 150 mM NaCl, 50 mM Glutation (dostosowany do pH 7,5 z zasadowym Tris) i 5 mM DTT.
   3. MBP-pulldown: Wymieszaj 20 mM Tris (pH 7,5 przy 25 °C), 150 mM NaCl, 40 mM maltozy i 5 mM DTT.
10. Analizuj eluowane białka za pomocą SDS-PAGE.
    UWAGA: Procentowa zawartość akrylamidu powinna być dostosowana do wielkości białek. W przykładach podanych w tym badaniu użyto 12% żeli akrylowych, pracujących w buforze tris-glicyna-SDS (2 mM Tris, 250 mM glicyny, 0,1% SDS) przy stałym napięciu 180 V. Żele barwiono przez gotowanie w 0,2% Coomassie blue R250, 10% kwasu octowego i 30% izopropanolu, a odbarwiono przez gotowanie w 10% kwasie octowym. Ilość załadowanego białka nie powinna być równa, ponieważ różne ilości oddziałujących białek mogą być ściągane w dół w różnych eksperymentach.

Results

Opisana metoda była rutynowo stosowana z wieloma różnymi celami. Poniżej przedstawiono kilka reprezentatywnych wyników, których prawdopodobnie nie można uzyskać przy użyciu konwencjonalnych technik pulldown. Pierwszym z nich jest badanie specyficznej dimeryzacji ZAD (domena związana z palcem cynkowym)¹¹. ZAD-y tworzą stabilne i specyficzne dimery, przy czym heterodimery są możliwe tylko między blisko spokrewnionymi domenami w grupach paralogicznych. Dimery utworzone przez te domeny są stabilne i n...

Discussion

Opisana metoda pozwala na badanie oddziaływań białko-białko, które nie mogą być efektywnie złożone in vitro i wymagają koekspresji. Metoda ta jest jednym z niewielu odpowiednich podejść do badania białek heterodimeryzujących, które są również zdolne do homodimeryzacji, ponieważ po oddzielnym oczyszczeniu takie białka tworzą stabilne homodimery, które najczęściej nie mogą się dysocjować i ponownie asocjować podczas eksperymentu ^3,11.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
8-ELEMENTOWA	sonda Sonics	630-0586	Wysokowydajne 8-elementowe sondy sonikatywne
Agar	AppliChem	A0949
Żywica amylozowa	New England Biolabs	E8021	Żywica do oczyszczania białek znakowanych MBP
Antybiotyki	AppliChem	A4789 (kanamycyna); A0839 (ampicylina)
Beta-merkaptoetanol	AppliChem	A1108
BL21(DE3)	Novagen	69450-M
CaCl2	AppliChem	A4689
Wirówka	Eppendorf	5415R (Z605212)
Glutation	AppliChem	A9782
Glutation agaroza	Pierce	16100	Żywica do oczyszczania białek oznaczonych GST
Glycerol	AppliChem	A2926
HEPES	AppliChem	A3724
HisPur Ni-NTA Superflow Agarose	Thermo Scientific	25214	Żywica do oczyszczania białek znakowanych 6xHis
Imidazol	AppliChem	A1378
IPTG	AppliChem	A4773
KCl	AppliChem	A2939
LB	AppliChem	414753
Maltose	AppliChem	A3891
MOPS	AppliChem	A2947
NaCl	AppliChem	A2942
NP40	Roche	11754599001
pACYCDuet-1	Sigma-Aldrich	71147	Wektor do koekspresji białek o pochodzeniu replikacji p15A
pCDFDuet-1	Sigma-Aldrich	71340	Wektor do koekspresji białek o pochodzeniu replikacji CloDF13
PMSF	AppliChem	A0999
Koktajl inhibitorów proteazy VII	Calbiochem	539138	Inhibitor proteazy
Koktajl pRSFDuet-1	Sigma-Aldrich	71341	Wektor do koekspresji białek o pochodzeniu replikacji RSF
SDS	AppliChem	A2263
Tris	AppliChem	A2264
VC505 Sonikator	Sonics	CV334	Ultradźwiękowy procesor cieczy
ZnCl2	AppliChem	A6285