Test pulldown w połączeniu z koekspresją w komórkach bakteryjnych jako efektywne czasowo narzędzie do testowania trudnych interakcji białko-białko

Konwencjonalne rozwijanie jest powszechnie używane do badania interakcji białko-białko¹. Jednak oczyszczone białka często nie oddziałują skutecznie in vitro^2,3, a niektóre z nich są nierozpuszczalne bez ich partnera wiążącego^4,5. Takie białka mogą wymagać złożenia kotranslacyjnego lub obecności molekularnych białek opiekuńczych^5,6,7,8,9. Innym ograniczeniem konwencjonalnego pulldownu jest testowanie możliwej aktywności heteromultimeryzacji między domenami, które mogą istnieć jako stabilne homo-oligomery złożone kotranslacyjnie^8,10, ponieważ wiele z nich nie może się rozdzielić i ponownie skojarzyć in vitro w czasie inkubacji. Stwierdzono, że wyrażenie współbieżne jest przydatne w przezwyciężaniu takich problemów^3,11. Koekspresja przy użyciu kompatybilnych wektorów u bakterii została z powodzeniem wykorzystana do oczyszczania dużych wielopodjednostkowych kompleksów makromolekularnych, w tym kompleksu represyjnego polycomb PRC2¹², moduł głowicy mediatora polimerazy II RNA¹³, płytka bazowa bakteriofaga T4¹⁴, moduł deubikwitylazy kompleksu SAGA^15,16, oraz ferritin¹⁷. Źródła replikacji często używane do kowyrażeń to ColE1, p15A¹⁸, CloDF13¹⁹ i RSF²⁰. W dostępnym na rynku systemie ekspresji Duet te pochodzenie jest łączone z różnymi genami oporności na antybiotyki i wygodnymi wieloma miejscami klonowania w celu wytworzenia wektorów policistronicznych, umożliwiających ekspresję do ośmiu białek. Te źródła mają różną liczbę kopii i mogą być używane w różnych kombinacjach w celu osiągnięcia zrównoważonych poziomów ekspresji docelowych białek²¹. Do testowania oddziaływań białko-białko stosuje się różne znaczniki powinowactwa; najczęstsze to 6xhistydyna, S-transferaza glutationu (GST) i białko wiążące maltozę (MBP), z których każde ma specyficzne powinowactwo do odpowiedniej żywicy. GST i MBP zwiększają również rozpuszczalność i stabilność oznakowanych białek²².

Opracowano również szereg metod obejmujących koekspresję białek w komórkach eukariotycznych, z których najważniejszą jest test dwuhybrydowy drożdży (Y2H)²³. Test Y2H jest tani, łatwy i umożliwia testowanie wielu interakcji; Jednak jego przepływ pracy trwa dłużej niż 1 tydzień. Istnieje również kilka rzadziej stosowanych testów opartych na komórkach ssaków, na przykład fluorescencyjny test dwuhybrydowy (F2H)²⁴ i test interakcji białko-białko w macierzy komórkowej (CAPPIA)²⁵. Test F2H jest stosunkowo szybki, pozwala na obserwację interakcji białek w ich naturalnym środowisku komórkowym, ale wymaga użycia drogiego sprzętu do obrazowania. Wszystkie te metody mają przewagę nad ekspresją prokariotyczną, zapewniając natywne środowisko translacji i fałdowania eukariotycznego; Wykrywają jednak interakcje pośrednio, albo poprzez aktywację transkrypcyjną, albo przez fluorescencyjny transfer energii, co często prowadzi do powstania artefaktów. Ponadto komórki eukariotyczne mogą zawierać innych partnerów interakcji białek będących przedmiotem zainteresowania, co może zakłócać testowanie interakcji binarnych między białkami wyższych eukariontów.

Niniejsze badanie opisuje metodę bakteryjnej koekspresji różnie znakowanych białek, stosowaną za pomocą konwencjonalnych technik pulldown. Metoda pozwala na badanie oddziaływań między białkami docelowymi, które wymagają koekspresji. Jest bardziej efektywny czasowo w porównaniu z tradycyjnym pulldownem, umożliwiając testowanie wsadowe wielu celów, co czyni go korzystnym w większości przypadków. Koekspresja przy użyciu kompatybilnych wektorów jest wygodniejsza niż policytroniczna koekspresja, ponieważ nie wymaga pracochłonnego etapu klonowania.

Schematyczne przedstawienie przepływu pracy metody jest pokazane w Rysunek 1.

1. Współtransformacja E. coli

1. Przygotuj wektory ekspresyjne dla białek docelowych przy użyciu standardowych metod klonowania.
   UWAGA: Zazwyczaj dobrym punktem wyjścia jest użycie konwencjonalnych wektorów pGEX/pMAL zawierających gen oporności na ampicylinę i pochodzenie ColE1 do ekspresji białek znakowanych GST/MBP oraz kompatybilnego wektora o pochodzeniu p15A lub RSF i oporności na kanamycynę do ekspresji białek znakowanych 6xHis, w niektórych przypadkach w połączeniu z tioredoksyną lub znacznikiem SUMO w celu zwiększenia rozpuszczalności. Zazwyczaj przed eksperymentem należy przetestować kilka kombinacji tagów. Opisana metoda sama w sobie jest wygodna do badania okresowego warunków ekspresji białek docelowych. Ważne jest, aby zauważyć, że większość szczepów Rosetta zawiera już plazmid o pochodzeniu p15A do ekspresji tRNA dla rzadkiego kodonu, więc jeśli użycie takich szczepów jest możliwą opcją, należy unikać plazmidów p15A. Szczegółowe informacje można znaleźć w tabeli materiałów.
   1. Hodować bakterie odpowiedniego szczepu w pożywce Luria-Bertani (LB) w temperaturze 37 °C do gęstości optycznej (OD) 0,1-0,2. W tym badaniu jako przykłady użyto szczepu BL21(DE3).
      UWAGA: Zaleca się użycie świeżo przygotowanych kompetentnych komórek, aby osiągnąć wydajną kotransformację z dwoma wektorami. Jeśli więcej niż dwa wektory muszą być przekształcane współ, lepiej jest przekształcać je sekwencyjnie, aby osiągnąć dobrą wydajność transformacji. Dobrą alternatywą jest elektroporacja.
   2. Odwirować 1,0 ml zawiesiny bakteryjnej przez 1 minutę w temperaturze 9 000 x g w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant.
   3. Dodać 0,5 ml lodowatego buforu transformacyjnego buforowego (TB) (10 mM MOPS [pH 6,7], 250 mM KCl, 55 mM MnCl₂ i 15 mM CaCl₂) i inkubować przez 10 minut na lodzie.
   4. Wirować przez 30 s przy 8 000 x g w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant.
   5. Dodaj 100 μl buforu TB, dodaj 100 ng każdego wektora i inkubuj przez 30 minut na lodzie. Oddzielnie przekształcaj pojedyncze wektory, aby badać zachowanie białek bez koekspresji. Ponadto współprzekształcanie wektorów wyrażeń w parach z pustymi wektorami współwyrażeń dla kontrolek powiązań niespecyficznych.
      UWAGA: W przykładach podanych w tym badaniu wektory pGEX/pMAL z odpowiadającymi im cDNA połączonymi z cDNA GST/MBP zastosowano w połączeniu z kompatybilnymi wektorami pochodzącymi z pACYC, zawierającymi kodujące cDNA domeny białka partnera połączone z cDNA tioredoksyny.
   6. Podgrzewać w temperaturze 42 °C przez 150 s, a następnie schładzać przez 1 minutę na lodzie.
   7. Dodać 1 ml płynnej pożywki LB bez antybiotyków i inkubować w temperaturze 37 °C przez 90 minut. Płytka na płytkach LB-agar zawierających 0,5% glukozy i odpowiednie antybiotyki (typowe stężenia to: 50 mg/l ampicyliny; 20 mg/l kanamycyny; 50 mg/l streptomycyny; 35 mg/l chloramfenikol). Inkubować płytki przez noc w temperaturze 37 °C.

2. Wyrażenie

1. Przepłukać komórki z płytki 2 ml płynnej pożywki LB do 50 ml pożywki LB z odpowiednimi antybiotykami (typowe stężenia to: 50 mg/l ampicyliny; 20 mg/l kanamycyny; 50 mg/l streptomycyny; 35 mg/l chloramfenikolu). Dodaj jony metali lub inne znane kofaktory (w przykładach podanych w tym badaniu do pożywki dodano 0,2 mM ZnCl₂). Przechowywać podwielokrotność z 20% glicerolem w temperaturze -70 °C do ponownego powtórzenia doświadczenia.
   UWAGA: Zaleca się wypłukanie kilku kolonii bezpośrednio z płytki, aby wykluczyć możliwość złej ekspresji w pojedynczym izolowanym klonie z powodu sporadycznych zdarzeń rekombinacji między dwoma plazmidami.
2. Hodować komórki ze stałą rotacją 220 obr./min w temperaturze 37 °C do OD 0,5-0,7, schłodzić do temperatury pokojowej (RT) i dodać izopropyl β-D-1-tiogalaktopiranozyd (IPTG) do 1 mM. Przechowywać 20 μl podwielokrotności zawiesiny komórek jako kontrolę próbki nieindukowanej.
3. Inkubować komórki ze stałą rotacją 220 obr./min w temperaturze 18 °C przez noc.
   UWAGA: Optymalny czas i temperatura inkubacji mogą się różnić; 18 °C przez noc działa najlepiej w przypadku większości białek i zaleca się ich domyślne wypróbowanie. Skróć czas inkubacji do 2-3 godzin, jeśli zaobserwuje się silne niespecyficzne wiązanie.
4. Podzielić zawiesinę bakteryjną na dwie części (lub więcej, jeśli użyto więcej niż dwóch różnych znaczników) i przechowywać 20 μl podwielokrotności zawiesiny komórkowej w celu potwierdzenia ekspresji białka. Wirować przy 4 000 x g przez 15 min.
   UWAGA: Punkt pauzy: granulki bakteryjne można przechowywać w temperaturze -70 °C przez co najmniej 6 miesięcy.

3. Test pulldown

UWAGA: Szczegółowe procedury są opisane dla białek oznaczonych tagiem 6xHis lub MBP/GST. Wszystkie zabiegi wykonywane są w temperaturze 4°C.

1. Zawiesić osady bakteryjne w 1 ml lodowatego buforu do lizy z inhibitorami proteazy i środkami redukującymi (patrz poniżej) dodanymi bezpośrednio przed eksperymentem. Unikaj ditiotreitolu (DTT) podczas stosowania żywic chelatujących metale, ponieważ usuwa on jony metali. Dostosuj skład buforu dla badanych białek. Typowe receptury do lizy, które są odpowiednie dla większości białek, to:
   1. 6xHis-pulldown: Wymieszaj 30 mM HEPES (pH 7,5), 400 mM NaCl, 10 mM Imidazol, 0,1% NP40, 10% [w/w] glicerolu, 5 mM beta-merkaptoetanolu, 1 mM fenylometylosfulfonylofluorku (PMSF) i rozcieńcz 1:1,000 koktajlu inhibitora proteazy (patrz Tabela materiałów).
   2. GST lub MBP-pulldown: Wymieszaj 20 mM Tris (pH 7,5 w 25 °C), 150 mM NaCl, 10 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 0,1 mM ZnCl₂, 0,1% NP40, 10% [w/w] glicerolu, 5 mM DTT, 1 mM PMSF i rozcieńczenie 1:1,000 koktajlu inhibitora proteazy (patrz tabela materiałów).
2. Rozbij komórki przez sonikację na lodzie. Przechowywać 20 μl podwielokrotności do elektroforezy.
   UWAGA: Zazwyczaj wymagane jest 20-25 impulsów po 5 s w odstępach 15 s z mocą wyjściową 20 W na próbkę. Odpowiednia moc sonikacji powinna być dostosowana do każdego instrumentu, aby uniknąć przegrzania i zapewnić całkowite rozerwanie komórek. Aby osiągnąć lepszą wydajność, zdecydowanie zaleca się stosowanie sond sonicyjnych z wieloma końcówkami o wysokiej przepustowości.
3. Wirować przy 20 000 x g przez 30 min. Zebrać 20 μl oczyszczonego lizatu do dalszej analizy SDS-PAGE.
4. Zrównoważyć żywicę (50 μl na każdą próbkę) z 1 ml lodowatego buforu do lizy przez 10 minut, odwirować przy 2 000 x g przez 30 s i odrzucić supernatant.
5. Dodać lizaty komórkowe (całkowite stężenie białka: 20-50 mg/ml) do żywicy, inkubować przez 10 minut przy stałych obrotach 15 obr./min, odwirować przy 2 000 x g przez 30 s i odrzucić supernatant. Zebrać 20 μl frakcji niezwiązanej do dalszej analizy SDS-PAGE.
6. Dodać 1 ml lodowatego buforu do przemywania i inkubować przez 1 min. Wirować przy 2 000 x g przez 30 s i odrzucić supernatant. Typowe przepisy na do płukania to:
   1. 6xHis-pulldown: Wymieszaj 30 mM HEPES (pH 7,5), 400 mM NaCl, 30 mM Imidazolu, 0,1% NP40, 10% [w/w] glicerolu i 5 mM beta-merkaptoetanolu.
   2. GST lub MBP-pulldown: Wymieszaj 20 mM Tris (pH 7,5 przy 25 °C), 500 mM NaCl, 10 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 0,1 mM ZnCl₂, 0,1% NP40, 10% [w/w] glicerolu i 5 mM DTT.
7. Wykonać dwa długie płukania: dodać 1 ml lodowatego buforu do płukania, inkubować przez 10-30 minut ze stałą prędkością 15 obr./min, odwirować przy 2 000 x g przez 30 s i wyrzucić supernatant.
8. Dodać 1 ml lodowatego buforu do przemywania wodą, inkubować przez 1 minutę, odwirowywać przy 2 000 x g przez 30 s i odrzucić supernatant.
9. Eluować związane białka za pomocą 50 μl buforu elucyjnego w wytrząsarce z prędkością 1 200 obr./min przez 10 minut. Typowe receptury elucyjnych to:
   1. 6xHis-pulldown: Wymieszaj 30 mM HEPES (pH 7,5), 400 mM NaCl, 300 mM Imidazolu i 5 mM beta-merkaptoetanolu.
   2. GST-pulldown: 20 mM Tris (pH 7,5 przy 25 °C), 150 mM NaCl, 50 mM Glutation (dostosowany do pH 7,5 z zasadowym Tris) i 5 mM DTT.
   3. MBP-pulldown: Wymieszaj 20 mM Tris (pH 7,5 przy 25 °C), 150 mM NaCl, 40 mM maltozy i 5 mM DTT.
10. Analizuj eluowane białka za pomocą SDS-PAGE.
    UWAGA: Procentowa zawartość akrylamidu powinna być dostosowana do wielkości białek. W przykładach podanych w tym badaniu użyto 12% żeli akrylowych, pracujących w buforze tris-glicyna-SDS (2 mM Tris, 250 mM glicyny, 0,1% SDS) przy stałym napięciu 180 V. Żele barwiono przez gotowanie w 0,2% Coomassie blue R250, 10% kwasu octowego i 30% izopropanolu, a odbarwiono przez gotowanie w 10% kwasie octowym. Ilość załadowanego białka nie powinna być równa, ponieważ różne ilości oddziałujących białek mogą być ściągane w dół w różnych eksperymentach.

Opisana metoda była rutynowo stosowana z wieloma różnymi celami. Poniżej przedstawiono kilka reprezentatywnych wyników, których prawdopodobnie nie można uzyskać przy użyciu konwencjonalnych technik pulldown. Pierwszym z nich jest badanie specyficznej dimeryzacji ZAD (domena związana z palcem cynkowym)11. ZAD-y tworzą stabilne i specyficzne dimery, przy czym heterodimery są możliwe tylko między blisko spokrewnionymi domenami w grupach paralogicznych. Dimery utworzone przez te domeny są stabilne i nie dysocjują przez co najmniej kilka dni; w związku z tym mieszanie oczyszczonych ZADs nie powoduje żadnego wykrywalnego wiązania. W tym samym czasie koekspresja MBP i ZAD-skondensowanych tioredoksyny-6xHhis wykazuje dobrą i powtarzalną aktywność homo-dimeryzacji (Figura 2A), pojawiając się jako dodatkowe pasmo w wynikach SDS-PAGE testu MBP-pulldown. Niewielką część heterodimerów można zaobserwować z M1BP ulegającym koekspresji z inną domeną; interakcja ta nie została potwierdzona z Y2A i najprawdopodobniej jest wynikiem niespecyficznego związku spowodowanego wysokim stężeniem białka, ponieważ domeny te są bogate w cysteinę i wyjątkowo podatne na agregację. Warto zauważyć, że w tym przypadku 6xHis-pulldown jest nieodpowiednie, ponieważ ZAD-y są domenami koordynującymi metale, które niespecyficznie wiążą się z żywicą chelatującą metal. Taka aktywność powinna być dokładnie zbadana w równoległym eksperymencie.

Innym przykładem jest test konkurencji między białkiem ENY2 i jego partnerami wiążącymi Sgf11 (1-83aa) a domeną palca cynkowego (460-631 aa) białka CTCF26. W przypadku samodzielnej ekspresji białko ENY2 tworzy dimery, które uniemożliwiają mu interakcję z natywnymi partnerami wiążącymi. Przypuszczalnie zarówno białka Sgf11, jak i CTCF wiążą się z tą samą powierzchnią molekularną ENY2, co sprawia, że ich oddziaływanie wzajemnie się wyklucza. W teście koekspresji ENY2 znakowany 6xHis oddziaływał zarówno z Sgf11 oznaczonym GST, jak i MBP-CTCF, ale GST-Sgf11 nie był obecny w MBP-pulldownach i odwrotnie (Rysunek 2B). Wyniki te sugerują, że nie może powstać żaden potrójny kompleks, a interakcje wzajemnie się wykluczają. Dane te zostały niezależnie potwierdzone innymi testami i potwierdzają różne funkcjonalne role ENY2 w tych kompleksach. Należy zwrócić uwagę na fakt, że duże znaczniki powinowactwa mogą same w sobie nakładać przeszkody steryczne, zapobiegając złożonemu tworzeniu; W związku z tym wniosek nie powinien opierać się wyłącznie na danych dotyczących koekspresji.

Porównanie krok po kroku procesów konwencjonalnych i sprzężonych pulldownów z koekspresją jest pokazane w Rysunek 3A. Ściąganie sprzężone z koekspresją jest co najmniej dwa razy bardziej efektywne czasowo, nawet przy niewielkiej liczbie próbek, i umożliwia dobrą skalowalność. Wyniki wykorzystania obu technik do badania tej samej interakcji między domeną BTB białka CP190 (1-126aa) a domeną C-końcową znakowaną GST (610-818aa) białka Drosophila CTCF (dCTCF) przedstawiono w Rysunek 3B. Obie metody wykazują dobrą skuteczność i odtwarzalność (testy przeprowadzono w trzech powtórzeniach); w tym przypadku pulldown sprzężony z koekspresją wykazał mniejsze niespecyficzne wiązanie, co można zaobserwować w próbkach kontrolnych z samym białkiem GST.

Rysunek 1: Schematyczne przedstawienie protokołu. Schemat przedstawia przebieg pracy metody zastosowanej w tym badaniu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Reprezentatywne wyniki. (A) Badanie homodimeryzacji domeny związanej z palcem cynkowym (ZAD) w testach MBP i 6xHis-pulldown. ZADs połączone z MBP (40 kDa) lub z 6xHis-Thioredoxin (20 kDa) ulegały koekspresji w komórkach bakteryjnych i powinowactwa oczyszczane żywicą amylozową (wiąże białka znakowane MBP) lub żywicą Ni-NTA (wiąże białka znakowane 6xHis). Wspólnie oczyszczone białka wizualizowano za pomocą SDS-PAGE, a następnie barwienia Coomassie. Wyniki MBP-pulldown są pokazane w górnych panelach, wyniki 6xHis-pulldown są w dolnych panelach (używane tylko jako kontrola ekspresji białek, ponieważ wiele ZAD-ów wiąże się niespecyficznie z Ni-NTA). (B) Badanie wzajemnie wykluczających się oddziaływań między białkami ENY2 i Sgf11/CTCF. Znakowane GST Sgf11 (1-81aa), domena palca cynkowego CTCF znakowana MBP (460-631aa) i białka ENY2 znakowane 6xHhis ulegały koekspresji w różnych kombinacjach i powinowactwie oczyszczone żywicą amylozową, żywicą glutationową (wiąże białka znakowane GST) lub żywicą Ni-NTA. Wspólnie oczyszczone białka wizualizowano za pomocą SDS-PAGE, a następnie barwienia Coomassie. Rysunek w panelach A i B został zmodyfikowany za zgodą Bonchuk et al.11 oraz Bonchuk et al.26. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Porównanie procesów pracy konwencjonalnych i sprzężonych testów pulldown z koekspresją. (A) Porównanie krok po kroku wymaganych przedziałów czasowych w przebiegu pracy konwencjonalnego testu pulldown w porównaniu z pulldown sprzężonym z koekspresją. (B) Porównanie dwóch różnych technik pulldown w badaniu interakcji między domeną C-końcową dCTCF (610-818aa) a domeną BTB białka CP190 (1-126aa) w testach GST-pulldown. dCTCF (610-818aa) połączone z GST (25 kDa) lub samym GST ulegały koekspresji w komórkach bakteryjnych lub inkubowane in vitro z CP190 znakowanym tioredoksyną-6xHhis i powinowactwem oczyszczone żywicą glutationową. Pokazane są trzy niezależne powtórzenia każdego testu. Wspólnie oczyszczone białka wizualizowano za pomocą SDS-PAGE, a następnie barwienia Coomassie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.