Artykuł metodologiczny

Analiza populacyjna i jednokomórkowa trwałości antybiotyków w Escherichia coli

4.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64550

⸱

24 marca 2023

 ,  ,  , 
1Bacterial Genetics and Physiology, Département de Biologie Moléculaire, Faculté des Sciences, Université Libre de Bruxelles (ULB)

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Trwałość antybiotyku opisuje zdolność małych subpopulacji we wrażliwej populacji izogenicznej do przejściowego tolerowania wysokich dawek antybiotyków bakteriobójczych. Niniejszy protokół łączy podejścia do scharakteryzowania fenotypu trwałości antybiotyku na poziomie molekularnym i komórkowym po wystawieniu Escherichia coli na działanie śmiertelnych dawek ofloksacyny.

Streszczenie

Trwałość antybiotyku odnosi się do zdolności małych subpopulacji bakteryjnych do przejściowego tolerowania wysokich dawek antybiotyków bakteriobójczych. Po zastosowaniu antybiotykobójczej antybiotykobójczej większości populacji bakterii dochodzi do szybkiego zabicia. Po tej pierwszej szybkiej fazie zabijania następuje znaczny spadek tempa zabijania, ponieważ trwałe komórki pozostają żywotne. Klasycznie trwałość określa się na poziomie populacji za pomocą testów czasu/uśmiercenia przeprowadzonych przy użyciu wysokich dawek antybiotyków i dla określonych czasów ekspozycji. Chociaż metoda ta dostarcza informacji na temat poziomu komórek trwałych i kinetyki zabijania, nie odzwierciedla wewnętrznej heterogeniczności między komórkami leżącej u podstaw zjawiska trwałości. Opisany tutaj protokół łączy klasyczne testy czasu/zabicia z analizą pojedynczych komórek przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej w czasie rzeczywistym. Dzięki zastosowaniu odpowiednich reporterów fluorescencyjnych, obrazowanie mikroskopowe żywych komórek może dostarczyć informacji na temat wpływu antybiotyku na procesy komórkowe, takie jak replikacja i segregacja chromosomów, wydłużanie komórek i podział komórek. Połączenie analizy populacyjnej i pojedynczej komórki pozwala na molekularną i komórkową charakterystykę fenotypu trwałości.

Wprowadzenie

Ten protokół ma na celu analizę fenotypu trwałości bakterii w odpowiedzi na specyficzne leczenie antybiotykami na poziomie pojedynczej komórki i populacji. Trwałość opisuje zdolność małych subpopulacji w populacji izogenicznej do znoszenia wysokich dawek antybiotyków bakteriobójczych (fluorochinolonów, aminoglikozydów, β-laktamów itp.), przy czym minimalne stężenie hamujące (MIC) tak zwanych komórek trwałych jest identyczne z stężeniem większości populacji. Dwufazowa dynamika zabijania, mierząca przeżywalność bakterii w czasie w obecności antybiotyku, ujawnia obecność komórek przejściowo tolerujących leki, z początkową szybką eliminacją komórek nietrwałych, po której następuje znacznie wolniejsze tempo zabijania komórek trwałych. Po usunięciu antybiotyku komórki te dają początek genetycznie identycznej populacji, która wykazuje podobną dynamikę zabijania, gdy jest traktowana tym samym antybiotykiem1,2. W przeciwieństwie do trwałości, oporność na antybiotyki jest definiowana na poziomie populacji i jest na ogół konsekwencją mutacji de novo lub horyzontalnego transferu genów plazmidu nadającego oporność3. Podczas gdy mutacje odpowiedzialne za oporność są w większości zlokalizowane w miejscu docelowym leku lub w regionach promotora pomp wypływu leku, geny zmieniające częstotliwość trwałości zidentyfikowane za pomocą metod analizy całego genomu i ukierunkowanej analizy mutantów okazały się liczne i różnorodne2,3,4,5,6,7,8. W związku z tym jest prawdopodobne, że komórki bakteryjne mogą wejść w stan trwałości przez wiele ścieżek9,10,11, a podejścia do badania zjawiska trwałości na poziomie pojedynczej komórki są potrzebne do scharakteryzowania fizjologii tych trwałych komórek.

Niedawny rozwój narzędzi mikroprzepływowych używanych w połączeniu z mikroskopią fluorescencyjną utorował drogę do charakterystyki fenotypu trwałości i podkreślił rolę kluczowych procesów komórkowych, takich jak replikacja chromosomów12, naprawa DNA13, oraz podział komórek14, w tworzeniu komórek trwałych. W tym artykule opisujemy zintegrowane podejście łączące klasyczne testy mikrobiologiczne z obrazowaniem żywych komórek pojedynczych komórek w celu scharakteryzowania trwałych komórek generowanych w wykładniczo rosnących kulturach Escherichia coli traktowanych wysoką dawką ofloksacyny. Opisany tutaj protokół może być zastosowany do badania zjawiska trwałości antybiotyków u innych gatunków bakterii, takich jak Bacillus subtilis15, lub warunków (np. utrzymywanie się antybiotyków po leczeniu β-laktamami16) i może być łatwo zmodyfikowany w celu zbadania wielu zjawisk związanych z heterogenicznością fenotypową17,18,19. Co więcej, konfiguracja opisana w tym artykule może być łączona z innymi fluorescencyjnymi reporterami w celu zbadania różnych parametrów komórkowych będących przedmiotem zainteresowania, takich jak wewnątrzkomórkowe poziomy pH20 lub ATP21 na poziomie pojedynczej komórki, co może potencjalnie dostarczyć nowych informacji na temat zjawiska trwałości antybiotyków.

Protokół

UWAGA: Użyj sterylnego szkła hodowlanego, końcówek pipet i podłoża wzrostowego. W tym przypadku komórki E. coli hodowano w chemicznie zdefiniowanym pożywce o niskiej autofluorescencji (patrz tabela materiałów). Szczepienia przeprowadzono w obecności palnika Bunsena, aby zminimalizować ryzyko skażenia.

1. Hodowla komórkowa i krzywa wzrostu

  1. Szczep będący przedmiotem zainteresowania należy rozprowadzić z zamrożonego wywaru glicerolowego na płytce agarowej Luria-Bertaini (LB) (uzupełnionej selektywnym antybiotykiem, jeśli jest to wymagane) i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc (między 15 godzinami a 19 godzinami) w celu uzyskania pojedynczych kolonii.
    UWAGA: W przedstawionym tutaj eksperymencie wykorzystano dwa szczepy, E. coli K-12 MG1655 odpowiadający szczepowi wt oraz izogeniczny MG1655 hupA-mCherry strain22. Ten ostatni szczep ulega ekspresji znakowanej fluorescencyjnie podjednostki α białka związanego z nukleoidem HU. Detektor hupA-mCherry jest zintegrowany w natywnym locus hupA. HU-mCherry służy jako proxy do śledzenia dynamiki nukleoidów w żywych komórkach, gdy wiąże się z DNA w niespecyficzny sposób.
  2. Zaszczepić 5 ml pożywki (w tym przypadku pożywki na bazie kwasu 3-[N-morfolino] propanesulfonowego [MOPS]; Tabela 1, Tabela 2 i Tabela 3) uzupełnione glukozą 0,4% i selektywnym antybiotykiem (jeśli jest to wymagane) z izolowaną kolonią w szklanej probówce (≥25 ml) i umieścić probówkę w inkubatorze wytrząsającym ustawionym na 37 °C i 180 obrotów na minutę (obr./min) przez noc (między 15 godziną a 19 godziną). Alternatywnie zamiast szklanych probówek można użyć plastikowych probówek, szklanych lub plastikowych kolb (≥ 25 ml).
    UWAGA: W eksperymentach opisanych w tej pracy stosowano pożywkę MOPS uzupełnioną glicerolem w końcowym stężeniu 0,4%, z wyjątkiem kultur nocnych, które przeprowadzono w MOPS glukozy 0,4%. Czas wytwarzania E. coli w MOPS uzupełnionym glukozą jest krótszy niż w glicerolu MOPS. Użycie MOPS glukozy 0,4% zamiast glicerolu MOPS 0,4% na tym etapie zapewnia, że komórki osiągną fazę stacjonarną w ciągu 19 godzin. Można również stosować inne pożywki wzrostowe, takie jak M9 lub bogate pożywki zdefiniowane (RDM) uzupełnione różnymi źródłami węgla. Należy jednak zauważyć, że tempo wzrostu i częstotliwość trwałości różnią się w zależności od użytego podłoża i/lub węgla23.
  3. Następnego ranka odwirować 1 ml kultury o stężeniu 2 300 x g przez 3 minuty, wyrzucić supernatant i delikatnie zawiesić osad w tej samej objętości soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Zmierzyć gęstość optyczną przy 600 nm (OD600 nm) i obliczyć objętość potrzebną do początkowego OD600 nm 0,01 w końcowej objętości 2 ml.
  4. Umieść 2 ml pożywki MOPS glicerolu 0,4% w studzience na przezroczystej 24-dołkowej płytce i zaszczepij obliczoną objętością kultury przez noc. Umieścić 24-dołkową płytkę w automatycznym czytniku mikropłytek (patrz tabela materiałów) w celu monitorowania średnicy zewnętrznej600 nm przez 24 godziny. Ustawić czytnik mikropłytek tak, aby mierzył średnicę zewnętrzną600 nm co 15 minut w temperaturze 37 °C i przy dużej rotacji orbitalnej (140 obr./min).
    UWAGA: Jeśli szczep użyty w eksperymencie koduje fluorescencyjny reporter, upewnij się, że jego tempo wzrostu jest porównywalne z szybkością wt, aby uniknąć artefaktów w kolejnych eksperymentach, ponieważ szybkość wzrostu wpływa na częstotliwość utrzymywania się antybiotyku23. Ze względu na ograniczenia wykrywania przy bardzo niskiej gęstości komórek i potencjalny wpływ specyficzny dla szczepu na zależność OD600 nm / jednostki tworzące kolonię (CFU), zaleca się ocenę kinetyki wzrostu poprzez monitorowanie CFU·mL-1 podczas pracy z niescharakteryzowanymi szczepami.

2. Określenie minimalnego stężenia hamującego antybiotyków

UWAGA: Minimalne stężenie hamujące (MIC) jest definiowane jako najniższa dawka antybiotyku, przy której nie obserwuje się wzrostu bakterii. Oznaczanie wartości MIC należy przeprowadzić dla każdego antybiotyku i szczepu. W opisanych tu eksperymentach zastosowano antybiotyk fluorochinolonowy ofloksacynę (OFX). Oznaczenie wartości MIC pozwala na potwierdzenie, że roztwór antybiotyku został prawidłowo przygotowany, antybiotyk jest aktywny, a szczepy są jednakowo wrażliwe na antybiotyk. W tym przypadku przeprowadzono opublikowaną metodę rozcieńczania agaru w celu określenia wartości MIC do OFX różnych użytych szczepów24. Wartość MIC danego antybiotyku dla danego szczepu bakteryjnego można również określić za pomocą metody rozcieńczania bulionu24.

  1. Przygotowanie płytek do oznaczania wartości MIC
    1. Przygotować główny roztwór podstawowy dla antybiotyku użytego w eksperymentach, rozpuszczając 5 mg OFX w 1 ml ultraczystej wody. Dodać 20 μl 37% HCl, aby zwiększyć rozpuszczalność OFX.
    2. Rozpuść 100 ml sterylnego agaru LB i utrzymuj go w temperaturze 55 °C, aby uniknąć zestalenia. Przygotować sześć małych szklanych kolb (25 ml) i odpipetować 5 ml płynnego podłoża agarowego LB do każdej kolby za pomocą sterylnej pipety.
    3. Rozcieńczyć 10 μl głównego roztworu podstawowego OFX o stężeniu 5 mg·mL-1 w 90 μl ultraczystej wody (rozcieńczenie wzorca w stosunku 1:10). Dodać 0 μl, 2 μl, 4 μl, 6 μL, 8 μL lub 10 μL 500 μg·mL-1 roztworu OFX do każdej z sześciu szklanych kolb zawierających 5 ml pożywki agarowej LB w celu wytworzenia pożywki agarowej LB o końcowym stężeniu 0 μg·mL−1, Odpowiednio 0,02 μg·mL−1, 0,04 μg·mL−1, 0,06 μg·mL−1, 0,08 μg·mL−1 i 0,1 μg·mL-1 OFX. Wymieszać roztwór, obracając kolby kilka razy.
      UWAGA: Jeśli znany jest poziom MIC antybiotyku będącego przedmiotem zainteresowania, zakres stężeń powinien sięgać od dołu do powyżej rzeczywistego MIC. Jeżeli wartość MIC jest nieznana, zaleca się stosowanie szerokiego zakresu stężeń z serią rozcieńczeń log2. Upewnij się, że podłoże agarowe LB ostygło przed dodaniem antybiotyku, ponieważ wysokie temperatury mogą go dezaktywować. Niemniej jednak ważne jest, aby nie dopuścić do zestalenia się podłoża agarowego LB przed dodaniem antybiotyku, ponieważ może to prowadzić do niejednorodnego rozprowadzania antybiotyku w pożywce agarowej LB.
    4. Wlać 5 ml każdej z sześciu pożywek agarowych LB przygotowanych w kroku 2.1.3 w sposób zwiększający dawkę do 6-dołkowej płytki hodowlanej za pomocą sterylnej pipety. Pozwól agarowi ostygnąć aż do zestalenia się i wysusz płytkę przed użyciem.
      UWAGA: Przygotuj roztwór antybiotyku i płytkę hodowlaną w dniu wykonania testu.
  2. Test oznaczania MIC
    1. Zaszczepić 5 ml pożywki LB izolowaną kolonią w szklanej probówce (≥25 ml) i umieścić szklaną probówkę w inkubatorze z wytrząsaniem ustawionym na 37 °C i 180 obr./min na noc (między 15 godzinami a 19 godzinami).
    2. Następnego ranka zmierzyć OD600 nm i rozcieńczyć kulturę w probówce do końcowej gęstości komórek 1 x 107 CFU·mL-1 w PBS. Dla badanych tutaj szczepów 1 x 107 CFU·mL−1 odpowiada OD600 nm 0,0125,
      UWAGA: Jeżeli korelacja między CFU·mL-1 a OD600 nm nie jest znana, należy ustalić krzywą wzrostu wyznaczoną za pomocą pomiarów CFU i OD600 nm w celu obliczenia współczynnika korelacji między CFU·mL-1 a OD600 nm.
    3. Umieścić 2 μl uprzednio rozcieńczonej kultury na każdym dołku wysuszonej 6-dołkowej płytki. Pozostawić plamy do wyschnięcia przed umieszczeniem płytki w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez noc (między 15 a 19 godzinami).
    4. Następnego dnia policz kolonie utworzone w każdej studzience. MIC odpowiada studzience o minimalnym stężeniu antybiotyku, w której nie wykrywa się wzrostu bakterii.

3. Test punktowy

UWAGA: Metoda punktowa jest podejściem jakościowym, które pozwala oszacować liczbę komórek zdolnych do życia (komórek zdolnych do tworzenia kolonii po stresie antybiotykowym). Test punktowy przeprowadza się przed testem zabijania w czasie, aby uzyskać wgląd w żywotność szczepu użytego w badanych warunkach oraz poinformować o rozcieńczeniach potrzebnych podczas testu zabijania w czasie (patrz sekcja 4).

  1. Aby przygotować płytki agarowe LB do testów punktowych, wlej 50 ml agaru LB do kwadratowej szalki Petriego (144 cm2). Przygotuj jedną kwadratową szalkę Petriego na punkt czasowy. Pozwól agarowi LB zestalić się i wysusz płytki przed użyciem.
  2. Zaszczepić 5 ml pożywki (MOPS glukozy 0,4%) izolowaną kolonią w szklanej probówce (≥25 ml) i umieścić probówkę w inkubatorze z wytrząsaniem ustawionym na 37 °C i 180 obr./min przez noc (między 15 godzinami a 19 godzinami).
  3. Następnego dnia zmierzyć OD600 nm i rozcieńczyć kulturę na świeżej pożywce o dostosowanej temperaturze (37 °C, MOPS glicerol 0,4%) w szklanej probówce (≥25 ml) do końcowego OD600 nm ~0,001. Pozostawić kulturę do wzrostu przez noc w inkubatorze w temperaturze 37 °C przy 180 obr./min (między 15 a 19 godzinami).
  4. Następnego dnia zmierzyć OD600 nm i inkubować kulturę do końcowego OD600 nm 0,3.
  5. Podczas inkubacji należy przygotować płytki 96-dołkowe, umieszczając 90 μl roztworu 0,01 MMgSO4 we wszystkich studzienkach z wyjątkiem studzienek w pierwszym rzędzie (rząd A). Płytki 96-dołkowe zostaną użyte do 10-krotnego rozcieńczenia seryjnego w kroku 3.7.
    UWAGA: W tym eksperymencie dwa szczepy (wt i szczep hupA-mCherry) zostały przetestowane w trzech egzemplarzach w siedmiu różnych punktach czasowych. Ponieważ jedna tablica składa się z 12 kolumn, jedna tabliczka może być użyta do dwóch punktów czasowych, a zatem w sumie przygotowano cztery tablice.
  6. Przy średnicy zewnętrznej600 nm wynoszącej 0,3 pobrać 200 μl każdej kultury bakteryjnej. Próbki te odpowiadają punktowi czasowemu t0 (nieleczonemu) przed antybiotykoterapią i umożliwiają oznaczenie CFU·mL-1 przed antybiotykoterapią.
  7. Odwirować próbki o masie 2 300 x g przez 3 minuty. W czasie wirowania dodać pożądane stężenie OFX do płynnej kultury i kontynuować inkubację w temperaturze 37 °C, wytrząsając.
    UWAGA: W tym przypadku OFX zastosowano w stężeniu 5 μg·mL-1 (co odpowiada MIC pomnożonemu 83-krotnie). W poprzednim badaniu stężenie to wykorzystano do scharakteryzowania zjawiska trwałości w OFX exposure25. Stężenie antybiotyku stosowane w testach czasu/uśmiercenia może się różnić w zależności od antybiotyku, pożywki hodowlanej i stanu wzrostu bakterii.
  8. Po odwirowaniu ponownie zawiesić osad komórkowy w 200 μl 0,01 M roztworuMgSO4. Umieścić 100 μl w pustym dołku 96-dołkowej płytki przygotowanej w kroku 3.5. Przeprowadzić rozcieńczenie, przenosząc 10 μl studzienki z rzędu A do studzienki w rzędzie B zawierającej 90 μl 0,01 MMgSO4. Kontynuować seryjne rozcieńczenia, przenosząc 10 μl studzienki z rzędu B do studzienki w rzędzie C. Powtarzać aż do osiągnięcia rozcieńczenia 10-7 (przy czym każde przeniesienie jest 10-krotnym rozcieńczeniem).
    UWAGA: W tym eksperymencie przetestowano sześć kultur (trzy dla szczepu wt i trzy dla szczepu hupA-mCherry) dla każdego punktu czasowego. Zgodnie z protokołem, pipeta wielokanałowa służy do wykonywania seryjnych rozcieńczeń dla sześciu szczepów w tym samym czasie. Aby zminimalizować błąd techniczny, końcówki pipet są wymieniane między każdym transferem.
  9. Umieścić 10 μl każdego rozcieńczenia na płytkach agarowych LB przygotowanych w kroku 3.1.
    UWAGA: Pipeta wielokanałowa służy do jednoczesnego wykrywania tego samego rozcieńczenia (np. rozcieńczenia 10-4) dla sześciu kultur. Podczas plamienia należy użyć pierwszego ogranicznika pipety wielokanałowej bez naciskania drugiego ogranicznika, ponieważ może to spowodować dozowanie mikrokropel na płytkę.
  10. W odpowiednich punktach czasowych po dodaniu antybiotyku pobrać 200 μl kultury i przeprowadzić seryjne rozcieńczenia, jak opisano w kroku 3.8. Umieścić 10 μl każdego rozcieńczenia, jak opisano w kroku 3.9.
    UWAGA: Do opisanego tutaj eksperymentu zebrano siedem punktów czasowych (t0, t1h, t2h, t3h, t4h, t5h, t6h). W przypadku szczepów wykazujących zwiększoną wrażliwość na antybiotyki w porównaniu z wt można przeprowadzić wielokrotne płukanie w MgSO4 0,01 M w celu usunięcia pozostałości antybiotyków.
  11. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez noc (między 15 h a 19 h). Następnego dnia policz liczbę kolonii w dwóch najwyższych rozcieńczeniach, dla których można wykryć kolonie. Idealnie, miejsca na płytkach agarowych dla tych rozcieńczeń zawierają od 3 do 30 kolonii, co pozwala na dokładne oznaczenie CFU·mL-1 dla każdej próbki.
  12. Obliczyć współczynnik przeżycia, dzieląc obliczoną CFU·mL-1 każdego punktu czasowego przez CFU·mL-1 populacji początkowej w t0.

4. Testy zabijania czasu

UWAGA: Podczas gdy testy punktowe są łatwą w użyciu metodą szacowania wskaźnika przeżycia danego szczepu dla danego antybiotyku, testy zabijające czas dają wyższą rozdzielczość przeżywalności i są wykonywane w celu dokładnego ilościowego określenia żywotności bakterii. Profil krzywej zabijania może być wykorzystany do określenia, czy dany szczep bakteryjny jest wrażliwy, tolerancyjny lub oporny na antybiotyk w danym stanie. Co więcej, testy zabijania w czasie pozwalają określić czas ekspozycji na antybiotyk potrzebny do wykrycia zjawiska trwałości (początek drugiego nachylenia dwufazowej krzywej zabijania), a także częstości utrzymywania się.

  1. Przygotować płytki agarowe LB do testu posiewu zabijającego w czasie. Wlać 25 ml agaru LB na szalkę Petriego (±57cm2). Przygotuj co najmniej dwie szalki Petriego na punkt czasowy (na płytkę nakłada się dwa rozcieńczenia na punkt czasowy na szczep).
  2. Pozwól agarowi LB zestalić się i wysusz płytki przed dodaniem pięciu do ośmiu sterylnych szklanych kulek do każdej płytki. Odwróć i oznacz płytki zgodnie z szczepem/warunkiem/punktem czasowym.
    UWAGA: Szklane kulki umożliwiają rozprzestrzenianie się bakterii na płytkach agarowych w kroku 4.7 i kroku 4.9. Alternatywnie, komórki można rozproszyć na płytce agarowej za pomocą rozsiewacza.
  3. Dla każdej próbki należy przygotować 10-krotne szklane probówki do seryjnego rozcieńczania zawierające 900 μl 0,01 M roztworuMgSO4. Liczba szklanych probówek do rozcieńczania na próbkę, którą należy przygotować, odpowiada rozcieńczeniom potrzebnym do wykrycia kolonii w teście punktowym.
  4. Zaszczepić 5 ml pożywki (MOPS glukozy 0,4%) izolowaną kolonią w szklanej probówce (≥25 ml) i umieścić probówkę w inkubatorze z wytrząsaniem ustawionym na 37 °C i 180 obr./min przez noc (między 15 godzinami a 19 godzinami).
  5. Po 16 godzinach wzrostu zmierzyć OD600 nm i rozcieńczyć kulturę do świeżej pożywki o dostosowanej temperaturze (37 °C, MOPS glicerol 0,4%) w szklanej probówce do końcowego OD600 nm ~0,001. Pozostawić kulturę do wzrostu przez noc w inkubatorze w temperaturze 37 °C przy 180 obr./min (między 15 a 19 godzinami).
  6. Następnego dnia zmierzyć OD600 nm i inkubować kulturę do końcowego OD600 nm 0,3.
  7. Przy OD600 nm 0,3 pobrać 100 μl hodowli, rozcieńczyć zgodnie z danymi uzyskanymi w teście punktowym (przy OD600 nm 0,3 i bez antybiotyku, rozcieńczenie 10-5 zwykle daje 200-300 kolonii) i rozlać 100 μl na płytki agarowe LB przygotowane w krokach 4.1-4.2. Delikatnie potrząśnij talerzami, aby kulki nie stykały się z krawędziami naczynia, ponieważ może to prowadzić do niejednorodnego rozprzestrzeniania się komórek bakteryjnych na podłożu agarowym LB. Ta pierwsza próbka przed antybiotykoterapią odpowiada punktowi czasowemu t0 (CFU·mL-1 przed antybiotykoterapią).
  8. Dodać żądane stężenie OFX i kontynuować inkubację w temperaturze 37 °C, wytrząsając.
    UWAGA: W tym przypadku OFX zastosowano w stężeniu 5 μg·mL-1 (co odpowiada MIC pomnożonemu 83-krotnie).
  9. W odpowiednich punktach czasowych po dodaniu antybiotyku pobrać 100 μl kultury, rozcieńczyć zgodnie z danymi uzyskanymi w teście punktowym i umieścić 100 μl na płytkach agarowych LB przygotowanych w krokach 4.1-4.2. Umieść komórki na płytkach zgodnie z opisem w kroku 4.7.
    UWAGA: Do opisanego tutaj eksperymentu zebrano siedem punktów czasowych (t0, t1h, t2h, t3h, t4h, t5h, t6h). W przypadku szczepów wykazujących zwiększoną wrażliwość na antybiotyki w porównaniu z wt można przeprowadzić wielokrotne płukanie w MgSO4 0,01 M w celu usunięcia pozostałości antybiotyków.
  10. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez noc (między 15 h a 19 h). Następnego dnia policz liczbę kolonii w dwóch najwyższych rozcieńczeniach, dla których można wykryć kolonie. Idealnie, płytki powinny zawierać 30-300 kolonii, aby umożliwić dokładne określenie CFU·mL-1 w każdej próbce.
  11. Oblicz współczynnik przeżycia, normalizując CFU·mL-1 w każdym punkcie czasowym przez CFU·mL-1 w t0. Wykreślić log10 znormalizowanego CFU·mL-1 w funkcji czasu.

5. Obrazowanie mikroskopem poklatkowym mikroprzepływowym

UWAGA: Poniższa sekcja opisuje przygotowanie płytki mikroprzepływowej, jak również procedurę akwizycji i analizy obrazu poklatkowego. Celem tego eksperymentu jest obserwacja i analiza fenotypu trwałości po leczeniu antybiotykami na poziomie pojedynczej komórki. Dane zebrane podczas tego eksperymentu mogą być wykorzystane do wygenerowania szerokiego zakresu wyników w zależności od zadanego pytania i/lub reporterów fluorescencyjnych użytych podczas eksperymentu. W opisanym tutaj eksperymencie przeprowadzono analizę ilościową długości komórki i fluorescencji HU-mCherry class<="xref">22, odzwierciedlającą organizację nukleoidów w komórkach trwałych i nietrwałych.

  1. Hodowla komórek bakteryjnych w mikroprzepływowej mikroskopii poklatkowej
    1. Zaszczepić 5 ml pożywki (glicerol MOPS 0,4%, w razie potrzeby uzupełniony selektywnym antybiotykiem) izolowaną kolonią w szklanej probówce (≥25 ml) i umieścić probówkę w inkubatorze z wytrząsaniem ustawionym na 37 °C i 180 obr./min przez noc (między 15 godzinami a 19 godzinami).
    2. Następnego dnia zmierzyć OD600 nm i rozcieńczyć kulturę w świeżej pożywce o dostosowanej temperaturze (37 °C, MOPS glicerol 0,4%) w szklanej probówce do końcowego OD600 nm ~0,001. Pozostawić kulturę do wzrostu przez noc (między 15 godziną a 19 godziną) w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C i 180 obr./min, aby następnego dnia uzyskać wczesną kulturę w fazie wykładniczej.
  2. Przygotowanie płytki mikroprzepływowej i mikroskopia poklatkowa obrazowanie
    UWAGA: Eksperymenty mikroprzepływowe można przeprowadzać w dostępnych na rynku urządzeniach mikroprzepływowych (zgodnie z opisem tutaj) lub w systemach mikroprzepływowych produkowanych we własnym zakresie.
    1. Usuń roztwór konserwujący (jeśli jest) z każdej studzienki płytki mikroprzepływowej i zastąp go świeżą pożywką hodowlaną.
      UWAGA: Jeśli płyta mikroprzepływowa zawiera studzienkę odpływową, roztwór konserwujący ze studzienki wylotowej należy usunąć, ale nie zastępować go medium.
    2. Uszczelnij płytkę mikroprzepływową za pomocą systemu kolektora, klikając przycisk Seal lub za pomocą oprogramowania mikroprzepływowego (najpierw wybierz Narzędzie, a następnie Płytka uszczelniająca).
      UWAGA: Aby uszczelnić płytę, należy przyłożyć równomierny nacisk na płytę i kolektor, ręcznie dociskając płytkę do kolektora. Jeśli zostanie to wykonane poprawnie, na interfejsie ONIX2 powinna pojawić się notatka "zapieczętowana". Ważne jest, aby nie wywierać żadnego nacisku na szkiełko, aby uniknąć potencjalnego ryzyka pęknięcia kolektora.
    3. Po uszczelnieniu wykonaj pierwszą sekwencję zalewania (kliknij na Uruchom sekwencję zalewania cieczą w interfejsie oprogramowania mikroprzepływowego).
      UWAGA: Uruchom sekwencję zalewania cieczą odpowiada 5 minutom perfuzji przy 6,9 kPa dla studzienek 1-5, następnie 5 minutom perfuzji przy 6,9 kPa dla studzienki 8 i końcowej rundzie perfuzji dla studni 6 przez 5 minut przy 6,9 kPa. Sekwencja zalewania Run Liquid umożliwia usunięcie roztworu konserwującego, który może być nadal obecny w kanałach łączących różne studnie.
    4. Inkubować płytkę w termostatycznie sterowanej komorze mikroskopu w żądanej temperaturze (w tym przypadku 37 °C) przez co najmniej 2 godziny przed rozpoczęciem obrazowania mikroskopowego.
    5. Rozpocznij drugą sekwencję zalewania cieczą przed rozpoczęciem eksperymentu.
    6. Uszczelnij płytkę mikroprzepływową, klikając przycisk Seal off w interfejsie oprogramowania mikroprzepływowego. Zastąpić pożywkę w studzience 1 i studzience 2 200 μl świeżej pożywki, w studzience 3 200 μl świeżej pożywki zawierającej antybiotyk (tutaj OFX w stężeniu 5 μg·mL−1), w studzience 4 i studzience 5 200 μl świeżej pożywki, w studzience 6 200 μl świeżej pożywki, oraz w studzience 8 z 200 μl próbki hodowli (z etapu 5.1.2) rozcieńczonej do OD600 nm 0,01 w świeżej pożywce.
    7. Uszczelnij płytkę mikroprzepływową zgodnie z opisem w kroku 5.2.2 i umieść płytkę na obiektywie mikroskopu wewnątrz szafki mikroskopu.
      UWAGA: Upewnij się, że umieściłeś kroplę olejku immersyjnego na obiektywie mikroskopu przed umieszczeniem płytki mikroprzepływowej.
    8. W oprogramowaniu mikroprzepływowym kliknij Ładowanie komórek, aby umożliwić załadowanie komórki do płytki mikroprzepływowej.
      UWAGA: Etap ładowania komórki obejmuje 15 s perfuzji przy 13,8 kPa dla dołka 8, następnie 15 s perfuzji przy 27,6 kPa dla dołka 6 i dołka 8 oraz końcową rundę perfuzji dla studzienki 6 przez 30 s przy 6,9 kPa. Gęstość komórek w płytce mikroprzepływowej ma kluczowe znaczenie dla eksperymentu. Pierwsza część tego protokołu mikroprzepływowego polega na hodowaniu bakterii przez 6 godzin w świeżej pożywce przed antybiotykoterapią. Po 6 godzinach wzrostu gęstość komórek musi być wystarczająca do wykrycia rzadkich komórek trwałych (w warunkach zastosowanych w tym badaniu, komórki trwałe generują się z częstotliwością 10−4). Jeśli zagęszczenie komórek jest zbyt duże, trudno jest rozróżnić poszczególne komórki, co uniemożliwia precyzyjną analizę pojedynczych komórek. Ponieważ szybkość wzrostu jest bezpośrednio zależna od pożywki, gęstość komórek w polach mikroskopowych powinna być oceniona przed rozpoczęciem eksperymentu.
    9. Ustaw optymalną ostrość w trybie światła przechodzącego i wybierz kilka obszarów zainteresowania (ROI), w których obserwuje się odpowiednią liczbę komórek (do 300 komórek na pole).
      UWAGA: Wybierz co najmniej 40 ROI, aby upewnić się, że rzadkie komórki trwałe są obrazowane.
    10. W oprogramowaniu mikroprzepływowym kliknij Utwórz protokół. Zaprogramować wstrzyknięcie świeżej pożywki w temperaturze 6,9 kPa przez 6 godzin (studzienka 1-2), następnie wstrzyknięcie pożywki zawierającej antybiotyk w temperaturze 6,9 kPa przez 6 godzin (studzienka 3), a na końcu wstrzyknięcie świeżej pożywki w temperaturze 6,9 kPa przez 20 godzin (studzienki 4-5).
      UWAGA: Kultura bakteryjna rozcieńczona do OD600 nm 0,01 pozwala bakteriom rosnąć w komorze mikroprzepływowej przez 6 godzin, zapewniając, że komórki znajdują się w fazie wzrostu wykładniczego. W zależności od liczby komórek wprowadzonych do urządzenia mikroprzepływowego podczas etapu ładowania (patrz krok 5.2.8), czas trwania fazy wzrostu można dostosować tak, aby uzyskać do 300 komórek na zwrot z inwestycji. Ponieważ trwałość jest rzadkim zjawiskiem, zwiększenie liczby komórek na ROI poprawia możliwość obserwacji komórek trwałych. Liczba komórek nie powinna jednak przekraczać 300 komórek na ROI, ponieważ sprawia to, że analiza pojedynczych komórek jest żmudna.
    11. Wykonuj obrazowanie mikroskopowe w trybie poklatkowym z jedną klatką co 15 minut przy użyciu światła przechodzącego i źródła światła wzbudzającego dla reportera fluorescencyjnego. W tym przypadku zastosowano źródło światła wzbudzającego 560 nm dla sygnału mCherry (dioda LED 580 nm o mocy 10% z filtrem 00 [530-585 ex, 615LP em, Zeiss] i ekspozycją 100 ms dla mCherry). Do obrazowania komórek wykorzystano oprogramowanie Zen3.2 kompatybilne z firmą Zeiss.
  3. Analiza obrazu
    UWAGA: Otwieranie i wizualizacja obrazów mikroskopowych odbywa się za pomocą oprogramowania ImageJ/Fiji o otwartym kodzie źródłowym (https://fiji.sc/)26. Ilościowa analiza obrazu jest wykonywana przy użyciu oprogramowania ImageJ/Fiji o otwartym kodzie źródłowym i bezpłatnej wtyczki MicrobeJ (https://microbej.com)27. W tym protokole użyto wersji MicrobeJ 5.13I(14).
    1. Otwórz oprogramowanie ImageJ/Fiji na komputerze i przeciągnij obrazy z mikroskopii poklatkowej hyperstack na pasek ładowania Fidżi. Użyj opcji Image > Color > Create Composite, aby połączyć różne kanały hyperstack. Jeśli kanały w eksperymencie poklatkowym nie odpowiadają pożądanemu kolorowi (np. kontrast fazowy jest pokazany na czerwono zamiast na szaro), użyj opcji Obraz > Kolor > Rozmieść kanały, aby zastosować odpowiedni kolor do kanałów.
    2. Otwórz wtyczkę MicrobeJ i wykryj komórki bakteryjne za pomocą interfejsu edycji ręcznej. Usuń automatycznie wykryte komórki i ręcznie obrysuj interesujące komórki trwałe klatka po klatce.
      UWAGA: Do automatycznego wykrywania pojedynczych komórek można użyć różnych ustawień. Zastosowano tutaj detekcję ręczną, ponieważ analizowane komórki trwałe tworzą długie włókna, które rzadko są wykrywane poprawnie za pomocą automatycznej detekcji.
    3. Po wykryciu użyj ikony Wynik w interfejsie ręcznej edycji MicrobeJ, aby wygenerować tabelę ResultJ. Zapisz plik ResultJ i użyj tabeli ResultJ, aby uzyskać wgląd w różne parametry będące przedmiotem analizy pojedynczej komórki. W przypadku tego protokołu wyeksportowano średnią fluorescencję intensywności HU-mCherry, długość komórki oraz powierzchnię komórek poszczególnych komórek.

Wyniki

Jak opisano powyżej, szczepy wykorzystane do analizy fenotypowej pojedynczych komórek persystujących zostały scharakteryzowane w podłożu MOPS z 0,4% glicerolem. Monitorowanie OD600nm w czasie nie wykazało różnic między szczepem wt a szczepem hupA-mCherry (Rysunek 1). Wskazuje to, że ekspresja białka fuzyjnego HU-mCherry nie wpłynęła na wzrost w tych warunkach. Komórki bakteryjne obu szczepów, początkowo zaszczepione przy OD600 nm wynoszącym 0,01, osiągnęły fazę wykładniczą około 8 h po inokulacji.

MIC dla OFX określono za pomocą ustandaryzowanych metod (w tym przypadku seryjnych rozcieńczeń w agarze)24. MIC definiuje się jako minimalne stężenie, przy którym nie stwierdzono widocznego wzrostu. MIC dla OFX dla obu szczepów wyniosło 0,06 µg·mL−1, co wskazuje, że fuzja hupA-mCherry nie miała wpływu na wrażliwość na OFX w porównaniu ze szczepem izogenicznym wt (Rycina 2).

Następnie określono wpływ letalnej dawki OFX (83-krotność MIC) na żywotność obu szczepów wykorzystanych w niniejszym badaniu. Ponieważ liczba żywych komórek maleje w czasie ekspozycji na OFX, rozcieńczenia kultur bakteryjnych muszą być odpowiednio dostosowane, aby uzyskać od 30 do 300 kolonii na płytce. W celu wyznaczenia odpowiednich rozcieńczeń w czasie przeprowadzono test kropelkowy (spot assay), w którym 10 µL szeregu 10-krotnych rozcieńczeń od 0 do 10−7 naniesiono na kwadratowe szalki Petriego za pomocą pipety wielokanałowej. Odpowiednie rozcieńczenia były tymi, w których widoczne były odizolowane klony (np. w t0 = 10−5, t1h = 10−4/10−3, t4h = 10−2/10−1) (Rycina 3).

Choć test kropelkowy (spot assay) jest łatwą metodą pozwalającą uzyskać wgląd w kinetykę zabijania pośredniczonego przez OFX, nie pozwala on na dokładne określenie dynamiki tego procesu. Podczas monitorowania żywotności komórek w fazie wzrostu wykładniczego traktowanych OFX za pomocą testu czasu zabijania (time-kill assay), zaobserwowano typową krzywą dwufazową (Rysunek 4). Pierwsze nachylenie krzywej odzwierciedla szybkie zabijanie populacji niebędącej persisterami (czerwona przerywana linia). W warunkach przetestowanych w tym badaniu, do 99,9% komórek nie było w stanie utworzyć kolonii po 3 h w obecności OFX. Po tej pierwszej fazie zabijania następuje druga faza, wykazująca wolniejszy tempo zabijania (niebieska przerywana linia), co ujawnia obecność lekoopornych komórek typu persister. W badanych warunkach faza persisterów rozpoczęła się około 3 h po dodaniu OFX, co podkreśla konieczność eksponowania komórek na OFX przez czas dłuższy niż 3 h w celu zbadania fenotypów persisterów. Co ważne, krzywa czasu zabijania pokazuje, że białko fuzyjne hupA-mCherry nie miało wpływu na kinetykę zabijania. Zatem szczep kodujący translacyjną fuzję fluorescencyjną może być wykorzystywany do monitorowania komórek typu persister za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Następnie zbadaliśmy zjawisko persistencji na poziomie pojedynczych komórek. W tym celu szczep hupA-mCherry wprowadzono do płytki mikrofluidycznej, co umożliwiło zmianę warunków hodowlanych (w tym przypadku: wzrost, traktowanie i regenerację) podczas wykonywania mikroskopii time-lapse w określonym obszarze zainteresowania (ROI). W pierwszym etapie eksperymentu mikrofluidycznego komórki wprowadzone do urządzenia mikrofluidycznego perfumowano pożywką wzrostową (MOPS glicerol 0,4%), a ich czas generacji wynosił ~2 h (Rycina 5 oraz Rycina 6). Ta pierwsza faza wzrostu wskazuje, że komórki były żywotne i aktywnie się działy przed traktowaniem OFX.

Po tej pierwszej fazie wzrostu komórki poddano perfuzji pożywką wzrostową uzupełnioną o 5 µg·mL−1 OFX przez 6 h. W momencie, gdy antybiotyk dotarł do komórek, podział komórkowy został zablokowany (Rysunek 5 i Rysunek 6). Po 6 h traktowania OFX komórki poddano perfuzji świeżą pożywką. Podczas gdy zdecydowana większość komórek nie była w stanie wznowić wzrostu (Rysunek 5 i Rysunek 6), niewielka subpopulacja bakterii była zdolna do wydłużania się i tworzenia komórek nitkowatych25. Komórki te, które po traktowaniu OFX były zdolne do podziału i wytworzenia żywotnych komórek potomnych, można zdefiniować jako komórki persystujące.

Ponieważ układ ten umożliwia wizualizację komórek persystujących przed, w trakcie i po leczeniu, dostarcza on informacji nie tylko o fenotypie persystującym w fazie regeneracji, ale także o stanie fizjologicznym komórek persystujących przed leczeniem (Rycina 6). W badanych warunkach komórki persystujące dzieliły się przed leczeniem OFX w sposób podobny do komórek niepersystujących, co wskazuje, że obserwowane komórki persystujące nie pochodziły z uśpionej subpopulacji (Rycina 6)25.

Analiza długości komórek persisterów w fazie regeneracji wykazała, że każdy filament charakteryzował się określoną prędkością wydłużania. Długość komórki osiągnięta przez poszczególne persistery przed pierwszym podziałem różniła się między sobą. Podobnie, czas wystąpienia pierwszego podziału był wysoce heterogeniczny (Rysunek 6). Dzielący się filament persistera generował wiele komórek potomnych, które w większości zaczęły rosnąć i dzielić się podobnie jak komórki nieleczone (Rysunek 7). Kolejne podziały filamentu prowadziły następnie do stopniowego zmniejszania się długości komórek, co ostatecznie doprowadziło do powstania komórek potomnych o długości zbliżonej do tej sprzed zastosowania OFX (Rysunek 6 oraz Rysunek 7B). Zdecydowana większość komórek nie była w stanie zaindukować filamentacji po usunięciu OFX. Ta liczna populacja komórek odpowiada komórkom martwym (Rysunek 5 oraz Rysunek 6).

Fluorescencyjna fuzja białka HU związanego z nukleoidem umożliwia wizualizację dynamiki nukleoidu22. Analiza całkowitej intensywności fluorescencji HU-mCherry wewnątrz komórki może służyć jako wskaźnik zawartości DNA22,25. W fazie wzrostu (przed traktowaniem OFX) całkowita intensywność fluorescencji mCherry ulegała zmianom, odzwierciedlając dynamikę replikacji i segregacji chromosomów podczas cyklu komórkowego (Rycina 8). Po dodaniu OFX fluorescencja mCherry wzrosła w środkowej części komórki, co wskazuje na kondensację nukleoidu, która – jak wykazano – jest indukowana przez powstawanie pęknięć obu nici DNA28 (Rycina 5). Pęknięcia obu nici DNA są konsekwencją mechanizmu działania OFX, który zaburza funkcjonowanie topoizomeraz typu II: gyrazy DNA i topoizomerazy IV29,30. W E. coli głównym celem OFX jest gyraza DNA29,30. Poprzez wiązanie się z celem w krytycznym etapie mechanizmu przejścia obu nici, OFX hamuje ponowne ligowanie przeciętych nici DNA, co ostatecznie prowadzi do powstania pęknięć obu nici DNA30. Jak opisano powyżej, komórki persystujące w odpowiedzi na traktowanie OFX zaczęły tworzyć filamenty podczas regeneracji25 (Rycina 6). Wzrost długości komórek korelował ze wzrostem całkowitej intensywności fluorescencji mCherry, co odzwierciedla restart replikacji i zwiększenie zawartości nukleoidu w filamencie25 (Rycina 7a oraz Rycina 8). W przypadku komórek martwych całkowita intensywność fluorescencji mCherry pozostawała stabilna podczas traktowania oraz w fazie regeneracji, co wskazuje, że komórki te nie były w stanie replikować swoich chromosomów po usunięciu OFX (Rycina 8). Przedstawiono również film z układu mikroprzepływowego (Wideo 1) komórek E. coli HU-mCherry przed, w trakcie i po traktowaniu ofloksacyną.

Krzywa wzrostu bakterii, OD600 w funkcji czasu, wykres liniowy; porównanie wt i hupA-mCherry; analiza danych.
Rysunek 1: Monitorowanie wzrostu szczepów wt oraz hupA-mCherry E. coli. Monitorowanie gęstości optycznej (OD600 nm) dla wt (kolor czarny) i hupA-mCherry (kolor czerwony). Cieniowanie i linie przerywane wskazują odchylenia standardowe dla trzech powtórzeń biologicznych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Test hamowania wzrostu bakterii na szalkach Petriego, przedstawiający różne stężenia w układzie eksperymentalnym.
Rysunek 2: Wyznaczenie MIC OFX dla szczepów wt oraz hupA-mCherry E. coli. Szczepy wt (♦) i hupA-mCherry (●) hodowano w pożywce LB, a następnie 2 µL naniesiono punktowo na seryjne rozcieńczenia agaru LB zawierającego OFX (stężenie podano w każdym panelu w µg·mL−1). Hamowanie wzrostu jest widoczne przy minimum 0,06 µg·mL−1. Rysunek przedstawia reprezentatywny eksperyment wykonany w trzech powtórzeniach biologicznych. Pasek skali = 1 cm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Test hamowania wzrostu bakterii, seria rozcieńczeń, czas ekspozycji na OFX w szczepie typu dzikiego vs hupA-mCherry.
Rycina 3: Spot assay szczepów wt oraz hupA-mCherry E. coli po ekspozycji na OFX. Szczepy (A) wt oraz (B) hupA-mCherry hodowano w pożywce MOPS z 0,4% glicerolu, zgodnie z opisem w protokole (sekcja 3), a komórki w fazie wzrostu wykładniczego (OD600 nm = 0,3) poddano działaniu 5 µg·mL−1 OFX. T0 odpowiada punktowi czasowemu przed dodaniem OFX. T1, T2, T3, T4, T5 i T6 odpowiadają okresom od 1 do 6 h po dodaniu OFX. Rycina przedstawia reprezentatywny eksperyment z powtórzeń biologicznych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres analizy przeżywalności; hupA-mCherry vs. wt po ekspozycji na OFX; porównanie danych czasu i log CFU/mL.
Rysunek 4: Analiza czasu zabijania (time-kill assay) szczepów wt oraz hupA-mCherry E. coli po ekspozycji na OFX. Szczepy wt (♦) i hupA-mCherry (●) hodowano w pożywce MOPS glycerol 0,4% zgodnie z opisem w protokole (sekcja 4), a komórki w fazie wzrostu wykładniczego (OD600 nm = 0,3) poddano działaniu 5 µg·mL−1 OFX. Linie przerywane wskazują pierwszą „szybką” (czerwoną) fazę zabijania oraz drugą „wolną” (niebieską) fazę zabijania, odpowiadające odpowiednio subpopulacjom wrażliwym i persystującym (uzyskane za pomocą regresji liniowej między T0 a T2 oraz między T3 a T6). Słupki błędów wskazują odchylenia standardowe dla trzech powtórzeń biologicznych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dynamika wzrostu bakterii pod wpływem leczenia OFX; mikroskopia poklatkowa; oś czasu eksperymentu; analiza regeneracji.
Rycina 5: Reprezentatywne obrazy komórek persystujących i martwych pod wpływem OFX z wykorzystaniem narzędzi mikroprzepływowych. Reprezentatywne obrazy mikroskopowe przedstawiające odpowiednie punkty czasowe eksperymentu mikroprzepływowego przeprowadzonego z wykorzystaniem szczepu hupA-mCherry (kontrast fazowy w kolorze szarym, sygnał HU-mCherry w kolorze czerwonym). Komórki wykazujące ekspresję znakowanego hupA-mCherry były hodowane na płytce mikroprzepływowej (tutaj przez 4 h), po czym poddano je działaniu OFX (5 µg·mL−1). Po 6 h w obecności OFX komórki przepłukano świeżą pożywką, co umożliwiło regenerację komórek persystujących. Komórka persystująca oraz jej komórki potomne podczas leczenia OFX i po usunięciu OFX są wyróżnione odpowiednio na zielono i na niebiesko. Odpowiadające im punkty czasowe są zaznaczone na każdym panelu. Pasek skali = 5 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres dynamiki wzrostu komórek; długość komórek w funkcji czasu, pokazujący zmienność danych w ciągu 24 godzin.
Rycina 6: Analiza time-lapse mikroskopowa długości komórek persystujących i martwych. Analiza długości komórek martwych (na czerwono, n = 109) oraz komórek persystujących (na szaro, n = 13). Początek traktowania OFX (5 µg·mL−1) oznaczono czerwoną linią przerywaną (5 h), a usunięcie OFX niebieską linią przerywaną. Wstawka odpowiada fazie wzrostu przed dodaniem OFX. Eksperymenty przeprowadzono w trzech powtórzeniach. Cieniowanie i linie przerywane wskazują odchylenia standardowe dla populacji komórek martwych (n = 109). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Odzyskiwanie komórek w czasie; analiza time-lapse, skumulowane wykresy, diagram klastrowania hierarchicznego.
Rycina 7: Analiza mikroskopowa time-lapse reprezentatywnej komórki persystującej w obecności OFX. (A) Kymograf reprezentatywnej komórki persystującej wobec OFX i jej komórek potomnych powstałych w wyniku podziałów filamentów w ciągu 8,5 h po usunięciu OFX (18,5 h po rozpoczęciu eksperymentu mikrofluidycznego, obejmującego 4 h wzrostu, 6 h traktowania OFX w stężeniu 5 µg·mL−1 oraz 8,5 h regeneracji po usunięciu OFX). Jedna klatka odpowiada 15 min. Pasek skali = 5 µm. (B) Maska wygenerowana z kymografu komórki persystującej z panelu A. Monitorowana komórka persystująca jest zaznaczona niebieskim obrysem, a komórki potomne są wyróżnione różnymi kolorami. (C) Schematyczne przedstawienie linii komórkowej komórki persystującej wygenerowane na podstawie panelu B. Kodowanie kolorami jest identyczne jak w panelu B. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Kinetyka wzrostu komórek i dane fluorescencyjne; wykres dwuosiowy; długość komórek względem czasu; fluorescencja (A.U.).
Rysunek 8: Analiza długości komórek i fluorescencji mCherry dla reprezentatywnych komórek persystujących oraz martwych. Analiza długości komórek (oś lewa) oraz całkowitej intensywności fluorescencji HU-mCherry (oś prawa, przedstawiona w jednostkach arbitralnych) reprezentatywnej komórki persystującej (ciągłe linie czarna i czerwona) oraz reprezentatywnej komórki martwej (przerywane linie czarna i czerwona) podczas mikrofluidycznego eksperymentu time-lapse. Początek traktowania OFX (5 µg·mL−1) zaznaczono czerwoną przerywaną linią, a usunięcie OFX niebieską przerywaną linią. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wideo 1: Mikrofluidyczne nagranie komórek E. coli HU-mCherry przed, w trakcie i po zastosowaniu ofloksacyny. Obrazowanie mikrofluidyczne w trybie time-lapse przedstawiające komórki HU-mCherry. Komórki hodowano przez 4 h w MOPS z 0,4% glicerolem. Po 6 h traktowania OFX (5 µg·mL−1), do płytki mikrofluidycznej wprowadzono medium bez antybiotyku, aby umożliwić regenerację komórek persisterów. Pasek skali = 5 µm. Czas (w min) jest wskazany. Fazy wzrostu i regeneracji są oznaczone jako „MOPS- Gly. 0.4%”, a traktowanie OFX jako „OFX 5 µg/mL”. Kliknij tutaj, aby pobrać to wideo.

10x MOPS
Roztwór stokowyObjętość roztworu zapasu dla 1 l 10x MOPSStężenie końcowe w 10-krotnym buforze MOPS
kwas MOPS 1 M (pH dostosowane do 7,4 przy użyciu KOH)400 mL0,4 M
Trycyna 1 M (pH dostosowane do 7,4 przy użyciu KOH)40 ml0,04 M
FeSO4.7H2O2O 0,01 M10 mL0,0001 M
NH4Cl 1,9 M50 ml0,095 M
K2SO4 0,276 M10 mL0,00276 M
CaCl₂2.2H2O 0,0005 M10 mL0,000005 M
MgCl22·6H2O 0,528 M10 ml0,00528 M
NaCldodać bezpośrednio 29,2 g 0,5 M
Woda destylowana460 mL
Mikroskładniki 1000x (patrz Tabela 2)10 mL

Tabela 1: Skład 10x MOPS.

Mikroskładniki odżywcze 1000x
Stężenie w 1000-krotnym roztworze stokowym mikroelementówStężenie końcowe w 10x bazie MOPS
(NH4)6Mo7O24.4H2O2O0,000003 M0,00000003 M
H3BO3 0,0004 M0,000004 M
CoCl22.6H2O0,00003 M0,0000003 M
CuSO₄4.5H2O0,00001 M0,0000001 M
MnCl₂2.4H2O0,00008 M 0,0000008 M
ZnSO₄·7H₂O2O0,00001 M0,0000001 M

Tabela 2: Skład 1000x roztworu mikroelementów.

glukoza w MOPS 0,4% lub glicerol w MOPS 0,4%
Roztwór stokowyObjętość dla 1 l MOPS z glukozą 0,4% lub MOPS z glicerolem 0,4%Stężenie końcowe w buforze MOPS z glukozą 0,4% lub MOPS z glicerolem 0,4%
10x MOPSpatrz Tabela 1100 mL
K2HPO40,132 M10 mL0,00132 M
Glukoza (do buforu MOPS z glukozą 0,4%)20% (20 g w 100 ml wody destylowanej)20 mL0.40%
Glicerol (do roztworu MOPS z glicerolem 0,4%)≤99%4 ml0.40%
Woda destylowana870 ml dla MOPS z glukozą 0,4% lub 886 ml dla MOPS z glicerolem 0,4%

Tabela 3: Skład MOPS glukoza 0,4% oraz MOPS glicerol 0,4%.

Dyskusja

Przedstawiony w niniejszej pracy protokół pozwala na analizę fenotypu trwałości obserwowanego w odpowiedzi na antybiotykoterapię na poziomie populacji i pojedynczych komórek. Eksperymenty przeprowadzono na szczepie E. coli MG1655, który był hodowany w chemicznie zdefiniowanym podłożu (MOPS glicerol 0,4%). Testy zabijające czas i eksperymenty mikroskopowe przeprowadzono na kulturach o fazie wykładniczej. Użyliśmy OFX, fluorochinolonu, w stężeniu 5 μg·mL−1, aby ujawnić trwałe komórki. Opisane tutaj podejścia można zastosować do innych antybiotyków bakteriobójczych, takich jak β-laktamy, aminoglikozydy lub związki przeciwdrobnoustrojowe31. W związku z tym można zastosować inne szczepy bakterii, pożywki lub warunki wzrostu. Monitorowanie różnych fuzji fluorescencyjnych w konfiguracji podobnej do opisanej tutaj może być przydatne do śledzenia procesów komórkowych, takich jak replikacja DNA32, naprawa DNA25,33 i podział komórki34 przed, w trakcie i po antybiotykoterapii. Podobnie, reportery fluorescencyjne mogą być wykorzystywane do badania różnych aspektów fizjologii komórki, takich jak wewnątrzkomórkowe poziomy pH35, ATP36 lub ROS37. Alternatywnie do fuzji fluorescencyjnych można również zastosować barwniki chemiczne. Na przykład fuzję hupA-mCherry można zastąpić 4',6-diamidyno-2-fenyloindolem (DAPI), barwnikiem fluorescencyjnym, który barwi DNA38. Należy jednak unikać wykonywania mikroskopii poklatkowej w połączeniu z takimi barwnikami fluorescencyjnymi, ponieważ te techniki barwienia mogą zaburzać dynamikę cyklu komórkowego podczas eksperymentów poklatkowych. Alternatywnie, takie eksperymenty można zastąpić analizami przebiegu czasowego obrazowania z migawki w odpowiednich punktach czasowych.

Chociaż takie fluorescencyjne reportery są pomocne, nie należy zaniedbywać ilości informacji, które można uzyskać dzięki analizie obrazów z kontrastem fazowym. W tym przypadku monitorowaliśmy ewolucję długości komórek na wszystkich etapach wzrostu, leczenia OFX i rekonwalescencji. Inne parametry oparte na obrazach z kontrastem fazowym, takie jak szerokość komórki, intensywność kontrastu fazowego i krzywizny komórek bakteryjnych, można również łatwo wyodrębnić za pomocą odpowiedniego oprogramowania, takiego jak MicrobeJ27.

Podsumowując, opisana tutaj procedura może być zastosowana do innych schorzeń i gatunków bakterii w celu monitorowania odpowiedzi komórkowych na zmieniające się środowisko lub stresory18,19. Dzięki zastosowaniu innych reporterów fluorescencyjnych (reporterów transkrypcyjnych i translacyjnych, barwnika chemicznego) w połączeniu z analizą populacji, taką jak cytometria przepływowa/FACS, można odpowiedzieć na interesujące pytania w wieloskalowych ramach.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Podziękowania

Praca w laboratorium Van Melderen jest wspierana przez działania ARC 2018-2023, Fonds National de la Recherche Scientifique (FNRS CDR J.0182.21F). T.O. jest wspierany przez stypendium ULB. T.S. jest wspierany przez stypendium FRIA (FNRS). J.C. jest wspierany przez stypendium podoktorskie "chargé de recherches" (FNRS).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Axio ObserverZeissOdwrócony mikroskop fluorescencyjny
CaCl2.2H2O Merck1.02382.0250Dla MOPS glukozy 0,4% i glicerolu MOPS 0,4% podłoża wzrostowego
CellASIC ONIX Microfluidic System MerckCAX2-S0000 Układ mikroprzepływowy
CellASIC ONIX2 FGMerckONIX2 1.0.1 Oprogramowanie mikroprzepływowe
Rozdzielacz CellASIC ONIX2 Podstawowy MerckCAX2-MBC20System kolektorów
CoCl2.6H2OMerck1.02539.0100Dla MOPS glukozy 0.4% i glicerolu MOPS 0.4% podłoża wzrostu
CuSO4.5H2OMerck1.02790.0250Dla MOPS glukozy 0.4% i glicerolu MOPS 0.4% podłoża wzrostowego
D-(+)-glukozaSigma AldrichG7021-1KGŹródło węgla dla glukozy MOPS 0,4% podłoża wzrostowego
E. coli K-12 MG1655 CF1648 (fnr+)SzczepBE10wt, szczep laboratoryjny
E. coli K-12 MG1655 CF1648 (fnr+) hupA-mCherry::FRT-kan-FRTBE16HU-mFuzja wiśni zintegrowana poprzez transdukcję P1 w natywnym locus, szczep laboratoryjny
FeSO4.7H2O VWR Chemicals24244.232Do MOPS glukozy 0,4% i glicerolu MOPS 0,4%
podłoża wzrostowegoFidżiImageJ https://fiji.sc/ Oprogramowanie do tworzenia obrazów; Schindelin i wsp., jeśli są używane w publikacji
GlycerolMerck56815Źródło węgla dla MOPS glicerol 0,4% pożywki wzrostowej
Greiner CELLSTAR® wielodołkowa płytka hodowlanaMerckM8812-100EA24-dołkowa przezroczysta płaska płytka hodowlana o pojemności 2 ml do automatycznego czytnika płytek
H3BO3  Sigma-AldrichB6768-1KGDo MOPS glukozy 0,4% i glicerolu MOPS 0,4% podłoża wzrostowego
Hamamatsu ORCA Flash 4.0 HamamatsuC13440-20CUCyfrowe pozyskiwanie obrazu
K2HPO4Merck1.05099.1000Dla MOPS glukozy 0,4% i glicerolu MOPS 0,4% podłoża
wzrostu KOHMerck1.05029.1000Dla MOPS glukozy 0,4% i glicerolu MOPS 0,4% podłoże
wzrostowe K2SO4 Merck1.05153.0500Dla MOPS glukozy 0,4% i glicerolu MOPS 0,4% pożywki wzrostowej
Pożywka agarowa Luria-BrothInvitrogen22700041Pożywka wzrostowa do testu galwanicznego
Pożywka Luria-Broth Pożywka12780029InvitrogenPożywka wzrostowa do oznaczania MIC
MgCl2,6H2O Merck1.05832.1000Dla MOPS glukozy 0,4% i glicerolu MOPS 0,4% pożywki wzrostowej
MgSO4Merck7487-88-9Roztwór rozcieńczający do testu przeżycia bakterii stosowany przy 10mM
MicrobeJ Wtyczka Imagej/Fijihttps://www.microbej.com/Wtyczka do analizy obrazu mikroskopowego. Ducret i wsp. w publikacji; Ustawienia wykrywania: Dla bakterii : Obszar (μ m2): 0,1-max; Długość (μ m): 0,5-max; Szerokość (μ m): 0,6-max; Zakres (μ m): 0,5-max; Kątowość (rad): 0-0,3; 0-max dla wszystkich innych parametrów. 
Płytki mikroprzepływowe CellASIC ONIXMerckB04A-03-5PK Płytka do układu mikroprzepływowego
MnCl2.4H2OMerck1.05927.0100Dla MOPS glukozy 0,4% i glicerolu MOPS 0,4% pożywki wzrostowej
MOPS, wolny kwas ULTROL® KlasaMerck475898-500GMDla MOPS glukozy 0,4% i glicerolu MOPS 0,4% podłoża wzrostowego
NaClSIgma-AldrichS5886-1KGDla MOPS glukozy 0,4% i glicerolu MOPS 0,4% podłoża wzrostu
(NH4)6Mo7O24,4H2OMerck1.01180.0250Dla MOPS glukozy 0,4% i glicerolu MOPS 0,4% podłoża wzrostowego
NH4Cl Merck1.01145.0500Dla MOPS glukozy 0,4% i glicerolu MOPS 0,4% podłoża wzrostowego
OfloksacynaMerck82419-36-1Antybiotyk fluorochinolonowy stosowany w leczeniu komórek bakteryjnych
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) pH 7,4, 1xMerckP3813Bufor rozcieńczający
GENESYS 10S Spektrofotometr UV-VisibleThermofisher Scientific  840-208200Spektrofotometr UV-widzialny, uchwyt pojedynczy/sześciokomórkowy z drukarkąPomiar gęstości optycznej OD600nm
SoftMax ProMolecular DevicesOprogramowanie do czytnika mikropłytek
SpectraMax i3xMolecular DevicesCzytnik mikropłytek
N-[Tris(hydroxé thyl)-mé thyl]-glycineMerck1.08602.0250Do MOPS glukozy 0,4% i glicerolu MOPS 0,4% podłoża wzrostowego
Zeiss® Olejek immersyjny 518FOlejek immersyjny Zeisszwiększający rozdzielczość mikroskopu
Zen3.2 ProZeissMikroskopowe oprogramowanie do akwizycji i przetwarzania obrazów
ZnSO4.7H2O Merck1.08883.0500Dla MOPS glukozy 0,4% i glicerolu MOPS 0,4% podłoża wzrostowego
referencyjny

Bibliografia

  1. Balaban, N. Q., et al. Definitions and guidelines for research on antibiotic persistence. Nature Reviews Microbiology. 17 (7), 441-448 (2019).
  2. Brauner, A., Fridman, O., Gefen, O., Balaban, N. Q. Distinguishing between resistance, tolerance and persistence to antibiotic treatment. Nature Reviews Microbiology. 14 (5), 320-330 (2016).
  3. Pribis, J. P., Zhai, Y., Hastings, P. J., Rosenberg, S. M. Stress-induced mutagenesis, gambler cells, and stealth targeting antibiotic-induced evolution. mBio. 13 (3), 01074(2022).
  4. Molina-Quiroz, R. C., Lazinski, D. W., Camilli, A., Levy, S. B. Transposon-sequencing analysis unveils novel genes involved in the generation of persister cells in uropathogenic Escherichia coli. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (11), 6907-6910 (2016).
  5. Cameron, D. R., Shan, Y., Zalis, E. A., Isabella, V., Lewis, K. A genetic determinant of persister cell formation in bacterial pathogens. Journal of Bacteriology. 200 (17), 00303-00318 (2018).
  6. Cui, P., et al. Identification of genes involved in bacteriostatic antibiotic-induced persister formation. Frontiers in Microbiology. 9, 413(2018).
  7. Li, T., et al. Identification of novel genes involved in Escherichia coli persistence to tosufloxacin. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 581986(2020).
  8. Verstraeten, N., et al. Obg and membrane depolarization are part of a microbial bet-hedging strategy that leads to antibiotic tolerance. Molecular Cell. 59 (1), 9-21 (2015).
  9. Hofsteenge, N., van Nimwegen, E., Silander, O. K. Quantitative analysis of persister fractions suggests different mechanisms of formation among environmental isolates of E. coli. BMC Microbiology. 13 (1), 25(2013).
  10. Huemer, M., Mairpady Shambat, S., Brugger, S. D., Zinkernagel, A. S. Antibiotic resistance and persistence-Implications for human health and treatment perspectives. EMBO Reports. 21 (12), 51034(2020).
  11. Wilmaerts, D., Windels, E. M., Verstraeten, N., Michiels, J. General mechanisms leading to persister formation and awakening. Trends in Genetics. 35 (6), 401-411 (2019).
  12. Murawski, A. M., Brynildsen, M. P. Ploidy is an important determinant of fluoroquinolone persister survival. Current Biology. 31 (10), 2039-2050 (2021).
  13. Lemma, A. S., Soto-Echevarria, N., Brynildsen, M. P. Fluoroquinolone persistence in Escherichia coli requires DNA repair despite differing between starving populations. Microorganisms. 10 (2), 286(2022).
  14. Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. Bacterial persistence as a phenotypic switch. Science. 305 (5690), 1622-1625 (2004).
  15. Morawska, L. P., Kuipers, O. P. Antibiotic tolerance in environmentally stressed Bacillus subtilis: Physical barriers and induction of a viable but nonculturable state. microLife. 3, (2022).
  16. Windels, E. M., et al. Enrichment of persisters enabled by a ß-lactam-induced filamentation method reveals their stochastic single-cell awakening. Communications Biology. 2 (1), 426(2019).
  17. Leygeber, M., et al. Analyzing microbial population heterogeneity-Expanding the toolbox of microfluidic single-cell cultivations. Journal of Molecular Biology. 431 (23), 4569-4588 (2019).
  18. Rojas, E., Theriot, J. A., Huang, K. C. Response of Escherichia coli growth rate to osmotic shock. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (21), 7807-7812 (2014).
  19. Shi, H., et al. Starvation induces shrinkage of the bacterial cytoplasm. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (24), 2104686118(2021).
  20. Goode, O., et al. Persister Escherichia coli cells have a lower intracellular pH than susceptible cells but maintain their pH in response to antibiotic treatment. mBio. 12 (4), 00909-00921 (2021).
  21. Manuse, S., et al. Bacterial persisters are a stochastically formed subpopulation of low-energy cells. PLoS Biology. 19 (4), 3001194(2021).
  22. Fisher, J. K., et al. Four-dimensional imaging of E. coli nucleoid organization and dynamics in living cells. Cell. 153 (4), 882-895 (2013).
  23. Cabral, D., Wurster, J., Belenky, P. Antibiotic persistence as a metabolic adaptation: Stress, metabolism, the host, and new directions. Pharmaceuticals. 11 (1), 14(2018).
  24. Wiegand, I., Hilpert, K., Hancock, R. E. W. Agar and broth dilution methods to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances. Nature Protocols. 3 (2), 163-175 (2008).
  25. Goormaghtigh, F., Van Melderen, L. Single-cell imaging and characterization of Escherichia coli persister cells to ofloxacin in exponential cultures. Science Advances. 5 (6), (2019).
  26. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  27. Ducret, A., Quardokus, E. M., Brun, Y. V. MicrobeJ, a tool for high throughput bacterial cell detection and quantitative analysis. Nature Microbiology. 1 (7), 16077(2016).
  28. Odsbu, I., Skarstad, K. DNA compaction in the early part of the SOS response is dependent on RecN and RecA. Microbiology. 160 (5), 872-882 (2014).
  29. Pham, T. D. M., Ziora, Z. M., Blaskovich, M. A. T. Quinolone antibiotics. MedChemComm. 10 (10), 1719-1739 (2019).
  30. Drlica, K., et al. Quinolones: Action and resistance updated. Current Topics in Medicinal Chemistry. 9 (11), 981-998 (2009).
  31. Kohanski, M. A., Dwyer, D. J., Collins, J. J. How antibiotics kill bacteria: From targets to networks. Nature Reviews Microbiology. 8 (6), 423-435 (2010).
  32. Reyes-Lamothe, R., Sherratt, D. J., Leake, M. C. Stoichiometry and architecture of active DNA replication machinery in Escherichia coli. Science. 328 (5977), 498-501 (2010).
  33. Lesterlin, C., Ball, G., Schermelleh, L., Sherratt, D. J. RecA bundles mediate homology pairing between distant sisters during DNA break repair. Nature. 506 (7487), 249-253 (2014).
  34. Alexeeva, S., Gadella, T. W. J., Verheul, J., Verhoeven, G. S., Den Blaauwen, T. Direct interactions of early and late assembling division proteins in Escherichia coli cells resolved by FRET: Bacterial division studied by spectral FRET. Molecular Microbiology. 77 (2), 384-398 (2010).
  35. Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
  36. Yaginuma, H., et al. Diversity in ATP concentrations in a single bacterial cell population revealed by quantitative single-cell imaging. Scientific Reports. 4, 6522(2014).
  37. Ermakova, Y. G., et al. Red fluorescent genetically encoded indicator for intracellular hydrogen peroxide. Nature Communications. 5, 5222(2014).
  38. Kapuscinski, J. DAPI: A DNA-specific fluorescent probe. Biotechnic & Histochemistry. 70 (5), 220-233 (1995).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Analiza populacjibadanie czasu u miercania time kill assaykom rki persystuj cemikroskopia fluorescencyjnap ytka mikroprzep ywowaleczenie ofloksacynprze ywalno bakterii
Analiza populacyjna i jednokomórkowa trwałości antybiotyków w Escherichia coli
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.