Method Article

Inżynieria onkogennych heterozygotycznych mutacji wzmocnienia funkcji w ludzkich hematopoetycznych komórkach macierzystych i progenitorowych

DOI:

10.3791/64558

⸱

March 10th, 2023

 ,  ,  ,  , 
1Division of Hematology, Department of Internal Medicine, Medical University of Graz, 2Division of Hematology, Stanford Cancer Institute, Stanford Institute for Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, Stanford University School of Medicine, 3Department of Blood Group Serology and Transfusion Medicine, Medical University of Graz

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nowatorskie strategie wiernego modelowania mutacji somatycznych w krwiotwórczych komórkach macierzystych i progenitorowych (HSPC) są niezbędne do lepszego badania biologii hematopoetycznych komórek macierzystych i nowotworów hematologicznych. W tym miejscu opisano protokół modelowania heterozygotycznych mutacji typu gain-of-function w HSPC poprzez połączenie użycia CRISPR/Cas9 i podwójnej transdukcji dawcy rAAV.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przez całe swoje życie, hematopoetyczne komórki macierzyste i progenitorowe (HSPC) nabywają mutacji somatycznych. Niektóre z tych mutacji zmieniają właściwości funkcjonalne HSPC, takie jak proliferacja i różnicowanie, sprzyjając w ten sposób rozwojowi nowotworów hematologicznych. Skuteczna i precyzyjna manipulacja genetyczna HSPC jest niezbędna do modelowania, charakteryzowania i lepszego zrozumienia funkcjonalnych konsekwencji nawracających mutacji somatycznych. Mutacje mogą mieć szkodliwy wpływ na gen i powodować utratę funkcji (LOF) lub, w przeciwieństwie do tego, mogą wzmacniać funkcję, a nawet prowadzić do nowych cech określonego genu, określanych jako wzmocnienie funkcji (GOF). W przeciwieństwie do mutacji LOF, mutacje GOF występują prawie wyłącznie w sposób heterozygotyczny. Obecne protokoły edycji genomu nie pozwalają na selektywne celowanie w poszczególne allele, co utrudnia modelowanie heterozygotycznych mutacji GOF. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół, w jaki sposób zaprojektować heterozygotyczne mutacje hotspot GOF w ludzkich HSPC poprzez połączenie naprawy ukierunkowanej na homologię za pośrednictwem CRISPR/Cas9 i technologii rekombinacji AAV6 w celu skutecznego transferu matrycy dawcy DNA. Co ważne, strategia ta wykorzystuje system podwójnej fluorescencji reporterowej, aby umożliwić śledzenie i oczyszczanie pomyślnie heterozygycznie edytowanych HSPC. Strategia ta może być wykorzystana do precyzyjnego zbadania, w jaki sposób mutacje GOF wpływają na funkcję HSPC i ich progresję w kierunku nowotworów hematologicznych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wraz z rozwojem technologii CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9, do zestawu narzędzi naukowców dodano nowy i niezwykle potężny instrument. Technologia ta pozwala na precyzyjną inżynierię genomu i okazała się niezwykle przydatna nie tylko do celów badawczych (recenzja w Hsu et al.1), ale ostatnio została również z powodzeniem przetłumaczona na warunki kliniczne2,3,4. Strategie edycji CRISPR/Cas9 opierają się na aktywności białka Cas9 i jednoprzewodnikowego RNA (sgRNA)5,6,7. W komórce gospodarza białko Cas9 jest kierowane do określonego miejsca w DNA, które jest komplementarne do sekwencji sgRNA i wprowadza pęknięcie podwójnej nici DNA (DSB). Po wygenerowaniu DSB mogą wystąpić dwa główne i konkurujące ze sobą mechanizmy naprawcze: niehomologiczne łączenie końców (NHEJ) i naprawa ukierunkowana na homologię (HDR). NHEJ jest podatnym na błędy, głównie używanym mechanizmem naprawczym prowadzącym do insercji i delecji (indel), podczas gdy HDR, wykorzystując chromatydę siostrzaną jako szablon naprawczy, jest bardzo precyzyjny, ale ograniczony do fazy S lub G2 cyklu komórkowego8. W inżynierii genomu HDR może być wykorzystany do ukierunkowanej modyfikacji DNA poprzez dostarczenie matrycy dawcy, która jest otoczona ramionami homologicznymi identycznymi z obydwoma końcami DNA indukowanego Cas9 DSB (Rysunek 1). Typ szablonu dawcy, który jest używany w HDR, może znacznie wpłynąć na wydajność edycji. Dla inżynierii genetycznej w ludzkich HSPC, serotyp 6 wirusa związanego z adenowirusem (AAV6) został niedawno opisany jako doskonały nośnik do dostarczania jednoniciowych matryc DNA9,10.

Inżynieria genomu CRISPR/Cas9 może być wykorzystana terapeutycznie do korygowania szkodliwych mutacji11, ale może być również wykorzystana do wprowadzenia patogennych mutacji do DNA w celu modelowania rozwoju raka12. Rak krwi, taki jak białaczka, rozwija się poprzez sekwencyjne nabywanie mutacji somatycznych u zdrowych HSPCs13,14. Wczesne zdarzenia genetyczne prowadzą do przewagi proliferacyjnej klonów, co skutkuje klonalną hematopoezą o nieokreślonym potencjale (CHIP)15,16. Dalsze nabywanie mutacji ostatecznie doprowadzi do transformacji białaczkowej i rozwoju choroby. Mutacje somatyczne można znaleźć w genach kontrolujących samoodnowę, przetrwanie, proliferację i różnicowanie17.

Wprowadzenie indywidualnych mutacji poprzez inżynierię genomu do zdrowych HSPC pozwala na precyzyjne modelowanie tego etapowego procesu białaczkowego. Ograniczona liczba nawracających mutacji występujących w nowotworach szpiku, takich jak ostra białaczka szpikowa (AML)18,19 sprawia, że choroba ta jest szczególnie podatna na rekapitulację przy użyciu narzędzi inżynierii genomu.

Mutacje somatyczne mogą pojawić się tylko na jednym allelu (mutacje monoalleliczne/heterozygotyczne) lub na obu allelach (mutacje dwualleliczne/homozygotyczne) i mogą mieć głęboki wpływ na funkcję genu, co może spowodować utratę funkcji (LOF) lub wzmocnienie funkcji (GOF). Mutacje LOF prowadzą do zmniejszonego (jeśli dotyczy jednego allelu) lub całkowitego (jeśli oba allele są dotknięte) LOF genu, podczas gdy mutacje GOF prowadzą do zwiększonej aktywacji lub nowej funkcji genu. Mutacje GOF są zazwyczaj heterozygotyczne20.

Ważne, zygotyczność (hetero- vs. homozygotyczna) ma poważne implikacje dla próby wiernego modelowania mutacji; dlatego też celowa manipulacja tylko jednym allelem genu jest niezbędna do inżynierii heterozygotycznych mutacji GOF. Podatny na błędy NHEJ prowadzi do powstawania indeli o różnej długości21, które mogą prowadzić do różnych, nieprzewidywalnych konsekwencji biologicznych. Ponieważ jednak NHEJ jest dominującym programem naprawczym stosowanym przez komórki po wprowadzeniu DSB, większość platform CRISPR/Cas9 używanych obecnie do manipulowania HSPC nie pozwala na precyzyjne przewidywanie wyniku genetycznego22,23. W przeciwieństwie do tego, wprowadzenie dwuniciowego pęknięcia (DSB) za pośrednictwem CRISPR/Cas9, w połączeniu z wykorzystaniem szablonów dawcy DNA opartych na wektorze rekombinowanego wirusa związanego z adenowirusem (rAAV) do inżynierii genomu za pomocą HDR, pozwala na specyficzną dla alleli insercję mutacji w ludzkich HSPCs11,24. Jednoczesna integracja sekwencji mutanta i typu dzikiego (WT) w połączeniu z odrębnymi reporterami fluorescencyjnymi na poszczególnych allelach może być przeprowadzona w celu selekcji genotypu heterozygotycznego (Figura 2). Strategia ta może być wykorzystana jako potężne narzędzie do precyzyjnego scharakteryzowania wpływu nawracających, białaczkowych, heterozygotycznych mutacji hotspot GOF na funkcję HSPC, inicjację i progresję choroby.

W tym artykule przedstawiono szczegółowy protokół efektywnej inżynierii rekurencyjnie zmutowanych heterozygotycznych mutacji GOF w pierwotnych ludzkich HSPC. Strategia ta łączy w sobie wykorzystanie CRISPR/Cas9 i podwójnej transdukcji AAV6 w celu zapewnienia WT i zmutowanych matryc dawcy DNA do przyszłego generowania heterozygotycznej mutacji GOF. Jako przykład pokazana zostanie inżynieria nawracających mutacji typu 1 (delecja 52 pz) w genie kalretykuliny (CALR)25. Heterozygotyczna mutacja GOF w eksonie 9 CALR jest regularnie stwierdzana w zaburzeniach mieloproliferacyjnych, takich jak nadpłytkowość samoistna (ET) i pierwotne zwłóknienie szpiku (PMF)26. CALR jest białkiem rezydującym w retikulum endoplazmatycznym, które pełni przede wszystkim funkcję kontroli jakości w procesie fałdowania nowo zsyntetyzowanych białek. Jego strukturę można podzielić na trzy główne domeny: domenę aminową (N)-końcową i domenę P bogatą w prolinę, które biorą udział w funkcji białka opiekuńczego, oraz domenę C, która bierze udział w magazynowaniu i regulacji wapnia27,28. Mutacje CALR powodują przesunięcie ramki ramki odczytu o +1, co prowadzi do transkrypcji nowego wydłużonego końca C-końcowego i utraty sygnału retencji retikulum endoplazmatycznego (ER) (KDEL). Wykazano, że zmutowany CALR wiąże receptor trombopoetyny (TPO), prowadząc w ten sposób do sygnalizacji niezależnej od TPO ze zwiększoną proliferacją29.

figure-introduction-1
Rysunek 1: Naprawa NHEJ i HDR. Uproszczone schematyczne przedstawienie mechanizmów naprawczych NHEJ i HDR po wprowadzeniu dwuniciowego pęknięcia w DNA. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-introduction-2
Rysunek 2: Schematyczny przegląd strategii edycji biallelicznego HDR. Schematyczne przedstawienie przedstawiające integrację matryc dawcy z docelowymi allelami, a następnie ich translację na działające mRNA. Pomarańczowe kropkowane pola wskazują regiony odpowiadające lewemu ramieniu homologii (LHA) i prawemu ramieniu homologii (RHA). Idealna wielkość HA to 400 bp każdy. Zielone kropkowane pole reprezentuje region odpowiadający sekwencji SA. Rozmiar SA wynosi 150 pz. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół wymaga użycia zdrowych HSPC CD34+ pochodzących od darczyńców i wymaga etycznego zatwierdzenia przez lokalne instytucjonalne komisje rewizyjne (IRB) oraz podpisanej świadomej zgody. HSPC CD34+ użyte w tym protokole wyizolowano z krwi pępowinowej (UCB) porodu donoszonego (>34 tydzień ciąży). Przed porodem uzyskano świadomą zgodę matek oraz uzyskano zgodę etyczną na pobranie UCB (zgoda IRB: 31-322 ex 18/19) z Uniwersytetu Medycznego w Grazu. Pełna lista materiałów wykorzystanych w tym protokole znajduje się w Tabeli Materiałów.

1. Projektowanie sgRNA i ocena efektywności cięcia

  1. Wyszukaj lokalizację pożądanej mutacji i poprawnego transkryptu w internetowej bazie danych (np. COSMIC, https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic).
  2. Wybierz sgRNA sąsiadujące z mutacją (celowanie egzoniczne) lub z poprzedniego intronu (celowanie introniczne) za pomocą narzędzia do projektowania sgRNA. W tym protokole wykorzystywane jest narzędzie online firmy Benchling. Zobacz tabelę materiałów, aby zapoznać się z listą możliwych narzędzi online do projektowania sgRNA.
  3. Wybierz opcję + (utwórz) > Sekwencja DNA > Importuj sekwencje DNA > Importuj z baz danych. Wprowadź żądany gen, np. CALR i wybierz człowieka jako gatunek > Wyszukaj > Wybierz odpowiedni transkrypt (np. CALR-201 -ENST00000316448) > Importuj. Wybierz obszar zainteresowania, w którym chcesz wprowadzić przerwę DS (np. intron 7).
  4. Wybierz opcję CRISPR po prawej stronie ekranu i wybierz opcję Projektuj i analizuj przewodniki. Wybierz pojedynczą prowadnicę, utrzymuj długość prowadnicy na poziomie 20 bp i sekwencję PAM do edycji za pomocą SpCas9 (NGG).
  5. Wybierz przewodnik z wysokim wynikiem on-target (duża szansa na edycję w pożądanym locus) i wysokim wynikiem off-target (mała szansa na edycję w niechcianych loci). Wybierz co najmniej trzy przewodniki do przetestowania, aby znaleźć najlepiej działające sgRNA. Zamów sgRNA jako chemicznie zmodyfikowane syntetyczne sgRNA od komercyjnego dostawcy.
    UWAGA: Na tym etapie wskazane jest zamówienie niewielkiej ilości syntetycznych sgRNA do wstępnego badania przesiewowego. Po zidentyfikowaniu dobrze działającego sgRNA przejdź do większej kolejności wybranego sgRNA.
  6. Rozmrozić 2 x 105-5 x 105 CD34+ HSPC. Przenieś komórki do 10 ml wstępnie podgrzanego RPMI1640 uzupełnionego 1% antybiotykami (np. penicyliną/streptomycyną).
    UWAGA: Aby osiągnąć najlepsze i najbardziej powtarzalne wyniki, należy stosować HSPC CD34+ o czystości >90%.
  7. Wirować przy 350 x g w temperaturze pokojowej (RT) przez 10 minut. Policzyć komórki za pomocą hemocytometru i zawiesić komórki w pożywce SFEM II uzupełnionej 0,2% penicyliną/streptomycyną (P/S), 100 ng/ml trombopoetyny (TPO), czynnikiem komórek macierzystych 100 ng/ml (SCF), 100 ng/ml ligandem kinazy tyrozynowej 3 podobnym do FMS (FLT3L), 100 ng/ml interleukiny-6 (IL-6), 35 nM UM171 i 0,75 μM StemRegenin1 (SR1) do stężenia 2,5 x 105 komórek/ml . Inkubować w temperaturze 37 °C/5% CO2 przez 48 h - 72 h.
    UWAGA: Całe podłoże będzie od teraz określane jako nośnik retencyjny HSPC.
  8. Zbierz komórki do probówki o pojemności 15 ml i policz komórki. Sprawdź żywotność komórek przez wykluczenie błękitu trypanowego.
    1. Przed rozpoczęciem włącz system transfekcji i wybierz opcję dla kuwet. Wybierz odpowiedni program i rozwiązanie nukleofekcji dla HSPC (patrz Tabela materiałów). W jednej kuwecie o pojemności 100 μlmożna zanukleekować od 2 x 105 do 5 x 10 6 komórek. Odłożyć niewielką liczbę komórek (np. 1 x 105-2 x 105) w celu utrzymania w kulturze przez 48 godzin, aby można je było wykorzystać jako kontrolę WT.
  9. Przygotuj kompleks RNP. Do probówki o pojemności 1,5 ml dodać 15 μg Cas9 i 8 μg sgRNA (stosunek molowy 1:2,5) i inkubować w temperaturze 25 °C przez 10 minut w bloku grzewczym.
  10. Podczas inkubacji kompleksu RNP odwirować komórki przy 350 x g w temperaturze pokojowej przez 5 minut i odrzucić supernatant za pomocą pipety. Zawiesić komórki w 100 μl roztworu nukleofekcji.
  11. Wymieszaj komórki z kompleksem RNP i przenieś do kuwety. Delikatnie postukaj w kuwetę, aby usunąć ewentualne pęcherzyki powietrza, które mogły powstać podczas przenoszenia.
  12. Włóż kuwetę do uchwytu systemu transfekcji i elektroporuj ogniwa za pomocą programu DZ-100.
  13. Bezpośrednio po elektroporacji dodać 400 μl wstępnie podgrzanego podłoża retencyjnego HSPC bez P/S.
  14. Przenieść komórki za pomocą pipety do drobnego transferu na płytkę hodowlaną zawierającą wstępnie podgrzaną pożywkę retencyjną HSPC bez P/S. W zależności od liczby komórek należy użyć odpowiedniej płytki hodowlanej (płytki 24-, 12- lub 6-dołkowej) w celu osiągnięcia gęstości między 0,25 x 106 a 1 x 106 komórek/ml.
  15. Przenieść płytkę do inkubatora w temperaturze 37 °C/5% CO2 . Inkubować komórki nukleofektyczne przez 6-8 godzin.
  16. Po 6-8 godzinach usuń starą pożywkę i zastąp ją świeżą, wstępnie podgrzaną pożywką retencyjną HSPC uzupełnioną P/S. Zawiesić komórki w stężeniu od 2,5 x 105 do 5 x 105 i przenieść na płytkę do hodowli komórkowej (płytka 24-, 12- lub 6-dołkowa). Inkubować komórki przez 48 godzin w temperaturze 37°C/5% CO2 .
  17. Zebrać 2 x 10 5 komórek i odwirować przy 350 x g przy temperaturze pokojowej przez 5 minut. Przed rozpoczęciem należy ustawić bloki grzewcze na 65 °C i 98 °C.
  18. Odrzucić supernatant i zawiesić komórki w 1 ml 1x DPBS w probówce o pojemności 1,5 ml. Wirować przy 350 x g przy temperaturze pokojowej przez 5 min.
  19. Odrzucić supernatant i zawiesić komórki w 50 μl roztworu do ekstrakcji DNA. Wir przez 15 s.
  20. Inkubować przez 6 minut w temperaturze 65 °C. Wirować przez 15 s i inkubować przez 2 minuty w temperaturze 98 °C.
  21. Amplifikuj obszar DSB za pomocą PCR przy użyciu starterów, które generują amplikon około 400-600 pz z DSB w środku. Do reakcji PCR należy użyć 0,5-1 μl wyekstrahowanego DNA.
    UWAGA: Ze względu na skład roztworu do ekstrakcji DNA, stężenia DNA nie mogą być dokładnie określone ilościowo za pomocą spektrofotometrii.
  22. Uruchom produkt PCR z drabinką DNA na 1,5% żelu agarozowym pod napięciem 100 V przez 45-60 minut. Umieść żel na transiluminatorze światła niebieskiego lub UV.
  23. Wyodrębnij z żelu pasmo DNA o odpowiednim rozmiarze za pomocą dostępnego w handlu zestawu zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela materiałów).
  24. Sekwencjonować próbki przez sekwencjonowanie Sangera przy użyciu startera do przodu lub startera wstecznego z PCR. W przypadku produktów PCR o długości 400-600 pz do sekwencjonowania wymagane jest 75 ng DNA o stężeniu 5 ng/ml w całkowitej objętości 15 μl.
  25. Przeanalizuj wydajność edycji sgRNA, przesyłając pliki sekwencjonowania do programu zaprojektowanego do obliczania wydajności edycji poprzez identyfikację insercji i delecji wytwarzanych przez sgRNA. Wybierz najlepiej działające sgRNA, z którym chcesz kontynuować.
    UWAGA: Dedykowane narzędzia online są wymienione w Tabeli Materiałów. Ta analiza wymaga plików .ab1 transfekowanych i WT HSPC, sekwencji sgRNA i sekwencji PAM.

2. Konstrukcja wektora naprawy ukierunkowanej na homologię (HDR)

  1. Projekt szablonu HDR
    UWAGA: Należy zaprojektować dwa szablony HDR: szablon dla sekwencji WT i szablon dla sekwencji zmutowanej.
    1. Zaimportuj sekwencję genomową i sekwencję kodującą (CDS) pożądanego genu do odpowiedniego oprogramowania do klonowania molekularnego (dedykowane narzędzia znajdują się w Tabeli Materiałów). Z pliku sekwencji genomowej zaprojektuj lewe ramię homologii (HA), wybierając idealnie 400 pz na końcu 5' DSB. Wklej tę sekwencję do nowego pliku.
    2. Jeśli intron jest ukierunkowany na sgRNA, należy dołączyć sekwencję akceptora splicingu (SA). Wybierz ostatnie 150 pz docelowego intronu i wklej je po lewej HA. Jeśli ekson jest bezpośrednio skierowany, ta sekwencja nie jest konieczna (Rysunek 3).
    3. Z pliku CDS wybierz interesujące Cię cDNA. W przypadku, gdy celem jest sekwencja egzoniczna, upewnij się, że cDNA zaczyna się natychmiast za miejscem DSB i zawiera wszystkie następujące eksony genu będącego przedmiotem zainteresowania, a także kodon stop. W przypadku, gdy intron jest celem, upewnij się, że cDNA zaczyna się od pierwszego kodonu następnego eksonu. Kodon optymalizuje cDNA i wstawia go po sekwencji SA. Skorzystaj w tym celu z dedykowanych narzędzi online (Spis Materiałów).
    4. Wstaw sygnał poliadenylacji 3' (PolyA) po interesującym cDNA (np. SV40 lub bGH) (Tabela 1). Po PolyA należy wprowadzić sekwencję promotora (np. wirusa tworzącego ognisko śledziony [SFFV] lub poliubikwityny C [UBC], Tabela 1) dla białka fluorescencyjnego.
    5. Wstaw sekwencję białka fluorescencyjnego (tj. GFP, BFP lub mCherry). Wstaw drugi, ale inny sygnał PolyA.
      UWAGA: Wstawienie innej sekwencji PolyA pozwoli uniknąć problemów, takich jak bakteryjna rekombinacja plazmidu lub problemy z wyrównaniem sekwencji z powodu dwóch identycznych sekwencji w szablonie.
    6. Z pliku sekwencji genomowej zaprojektuj odpowiedni HA, wybierając idealnie 400 pz na końcu 3' DSB. Wstaw tę sekwencję po drugim PolyA.
    7. Utwórz kopię całego szablonu i zmodyfikuj interesujące nas cDNA tak, aby zawierało sekwencję pożądanej mutacji.
    8. Zamień białko fluorescencyjne na inne białko fluorescencyjne. Na przykład, jeśli GFP został użyty dla szablonu WT, zamień go na BFP lub mCherry dla szablonu mutanta. Skonstruuj i sklonuj szablony HDR do plazmidu pAAV-MCS (lub innego odpowiedniego szkieletu).
      UWAGA: Fragmenty wymagane do montażu mogą być wyprodukowane metodą PCR lub zamówione komercyjnie i muszą zawierać nakładające się sekwencje z sąsiednimi fragmentami. Jeśli mutacja, która jest przedmiotem zainteresowania, jest mutacją punktową, małą insercją lub małą delecją, zmutowane cDNA można wytworzyć metodą PCR, przeprowadzając mutagenezę ukierunkowaną na miejsce na matrycy HDR zawierającej cDNA WT.
    9. Przekształć kompetentną Escherichia coli w zmontowany produkt za pomocą metody szoku cieplnego. Przed rozpoczęciem umieść bakterie do rozmrożenia na lodzie na 10 minut.
    10. Dodaj 2 μl połączonych produktów do 50 μl bakterii. Wymieszaj zawartość, delikatnie trzepając.
    11. Umieścić próbki na lodzie na 30 minut. Przenieść próbki do termobloku ustawionego na 42 °C na 30 s.
    12. Przenieść próbki na lodzie przez 5 minut. Dodać 450 μl pożywki SOC o temperaturze pokojowej i inkubować próbki w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
    13. Rozprowadzić próbki na płytkach agarowych LB zawierających ampicylinę. Dla każdej próbki rozprowadzić 100 μl trzech różnych rozcieńczeń roztworu bakteryjnego (nierozcieńczonego, 1:5 i 1:10) w celu uzyskania płytek agarowych LB z pojedynczymi koloniami, które można zebrać. Inkubować płytki przez noc w temperaturze 37 °C.
    14. Następnego dnia wybierz trzy kolonie z próbki. Przenieść kolonie do probówek o pojemności 15 ml z nakrętkami zawierającymi 4 ml pożywki LB uzupełnionej ampicyliną i inkubować przez noc w wytrząsarce w temperaturze 37 °C.
    15. Porcję 500 μl roztworu bakteryjnego z każdej kolonii i przechowywać w lodówce do późniejszego wykorzystania. Wykonaj mini-przygotowanie, aby wyodrębnić plazmidowe DNA zgodnie z instrukcjami producenta.
    16. Wyślij próbki do sekwencjonowania Sangera, aby potwierdzić prawidłowe złożenie plazmidów. Użyj wystarczającej ilości starterów rozmieszczonych w plazmidzie, aby zapewnić nieprzerwane potwierdzenie sekwencji, najlepiej pokrywając każdy region dwukrotnie z odczytami do przodu i do tyłu.
    17. Dodać 200 μl roztworu bakteryjnego zawierającego prawidłowo złożony plazmid do 200 ml pożywki LB uzupełnionej ampicyliną i inkubować w wytrząsarce przez noc w temperaturze 37 °C.
    18. Wykonaj przygotowanie midi lub maxi, aby wyekstrahować plazmidowe DNA zgodnie z instrukcjami producenta. Przechowywać plazmidowe DNA w temperaturze -20 °C.
  2. Rekombinowany preparat AAV6
    UWAGA: Konieczne będzie wykonanie dwóch oddzielnych preparatów AAV6: jednego dla rAAV6 z szablonem WT HDR i jednego dla rAAV6 ze zmutowanym szablonem HDR. W tej sekcji opisano kroki potrzebne do przygotowania tylko jednego wirusa.
    1. Rozmrozić HEK293T komórki, przenieść komórki do 10 ml wstępnie podgrzanego DMEM uzupełnionego 10% FBS, 1% P/S i 25 mM HEPES i odwirować przy 350 x g w temperaturze RT przez 5 minut.
    2. Zawiesić komórki w stężeniu 1 x 105 komórek/ml i przenieść do odpowiedniej kolby (np. kolby o średnicy 175cm2). Przenieść kolbę do inkubatora w temperaturze 37 °C/5% CO2,
      UWAGA: HEK293T komórki należy wcześniej rozmrozić, aby umożliwić komórkom pełną regenerację i uzyskanie wystarczającej liczby komórek (11 x 107 komórek jest niezbędnych do produkcji jednego wirusa). Zaleca się stosowanie komórek po co najmniej trzech przejściach i utrzymywanie komórek poniżej 20 pasaży. HEK293T komórki należy dzielić trzy razy w tygodniu. Przy zachowaniu komórek nie powinny one przekraczać 70%-80% konfluencji. DMEM zastosowany w preparacie AAV powinien być już również uzupełniony o L-glutaminę i pirogronian sodu.
    3. Zebrać komórki do probówki o pojemności 50 ml i odwirować przy 350 x g w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
    4. Zawieś komórki w 20 ml DMEM uzupełnionym 10% FBS, 1% P / S i 25 mM HEPES i policz za pomocą hemocytometru. Użyj trypana niebieskiego, aby wykluczyć martwe komórki.
    5. Wysiew 3 x 106 komórek w 20 ml DMEM uzupełniony 10% FBS, 1% P / S i 25 mM HEPES w kolbie o średnicy 175 cm2. Do produkcji jednego wirusa należy przygotować co najmniej cztery kolbyo długości 175 cm2. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C/5% CO2 przez 3 dni.
      UWAGA: Ten krok najlepiej wykonać w piątek, ponieważ pozwala komórkom rozszerzać się w weekend.
    6. Zbierz i policz HEK293T komórek.
    7. W celu przygotowania jednego z wirusów przygotuj dziesięć szalek o średnicy 150 mm, z których każda zawiera 11 x 106 HEK293T w 20 ml DMEM uzupełnionego 10% FBS, 1% P / S i 25 mM HEPES.
    8. Umieścić szalki w inkubatorze w temperaturze 37 °C/5% CO2 przez 24 godziny. Ostrożnie wyrzuć starą pożywkę i zastąp ją 20 ml wolnego od antybiotyków DMEM uzupełnionego 10% FBS, 25 mM HEPES i 1 mM maślanu sodu. Zanim przejdziesz dalej, sprawdź, czy zbieg komórek nie przekracza 80%.
    9. Przygotuj dwie probówki o pojemności 15 ml, które będą zawierały mieszanki do transfekcji. Do probówki 1 dodać 5 ml zredukowanej pożywki surowicy, 60 μg zmutowanego plazmidu HDR rAAV6 i 220 μg pDGM6 (plazmid pomocniczy). Do probówki 2 dodać 5 ml zredukowanej pożywki surowicy i 1120 μl 1 mg/ml roztworu polietylenininy (PEI, odczynnik do transfekcji).
    10. Dodaj zawartość probówki 2 do probówki 1 i wiruj przez 30 s. Inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej, aby zapewnić prawidłowe enkapsulację DNA w micelach PEI.
      UWAGA: Nie przechowywać roztworu dłużej niż 20 minut.
    11. Ostrożnie dodaj kroplami 1,1 ml roztworu do każdego naczynia i rozprowadź, delikatnie mieszając. Umieścić naczynia w inkubatorze w temperaturze 37 °C/5% CO2 na 48 godzin.
    12. Po 48 godzinach dodać 250 μl 0,5 M EDTA do każdej potrawy i umieścić szalki w inkubatorze na 10 minut. Zebrać komórki, zmywając je z naczynia i przenieść do probówki wirówkowej o pojemności 500 ml lub wielu probówek o pojemności 50 ml.
    13. Odwirować przy 2 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant. Aby zapewnić całkowite usunięcie sklarowanego osadu, należy ponownie odwirować przy 2 000 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C.
    14. Odrzucić pozostały supernatant. Wszelkie pozostałości supernatantu mogą zaburzać oczyszczanie wirusa.
    15. Poluzuj osad przez wirowanie i wyekstrahuj wirusa za pomocą zestawu do oczyszczania AAV (patrz Tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta. Alternatywnie, przeprowadzić ekstrakcję za pomocą ultrawirowania w gradionym jodiksanolu30,31.
    16. Podwielokrotnić oczyszczony wirus i przechowywać w temperaturze -80 °C. Miareczkować funkcjonalnie AAV lub określić ilościowo miano AAV za pomocą cyfrowego kropelkowego PCR (ddPCR)32 w celu określenia optymalnych warunków transdukcji.
    17. Powtórz ten proces w celu przygotowania plazmidu rAAV6 WT HDR.
  3. Miareczkowanie AAV metodą ddPCR
    1. Przed rozpoczęciem należy ustawić bloki grzewcze na 65 °C i 98 °C.
    2. Ekstrahować DNA wirusa, dodając 15 μl roztworu do ekstrakcji DNA do 5 μl wirusa. Wir przez 15 s.
    3. Inkubować przez 6 minut w temperaturze 65 °C. Wirować przez 15 s. Inkubować przez 2 minuty w temperaturze 98 °C.
    4. Użyć wyekstrahowanego DNA (który jest rozcieńczeniem DNA wirusa w stosunku 1:4) do przygotowania seryjnych rozcieńczeń (1:400, 1:40 000, 1:160 000, 1:640 000) z wolnymi od nukleaz (nf)H2Odla ddPCR.
      UWAGA: Rozcieńczenia można przechowywać w temperaturze -20 °C, jeśli ddPCR nie zostanie natychmiast przeprowadzony.
    5. Wybierz trzy rozcieńczenia do ddPCR. Wybór rozcieńczenia, które należy zastosować, zależy od stężenia wirusa. Najlepiej użyć trzech różnych rozcieńczeń (np. 1:40 000, 1:160 000 i 1:640 000), aby znaleźć najlepsze rozcieńczenie, które mieści się w granicy wykrywalności maszyny.
    6. Podczas pracy odczynniki należy przechowywać na lodzie. Przygotować mieszankę wzorcową (wszystkie próbki zostaną zmierzone w dwóch egzemplarzach). Dla każdej reakcji przygotuj następujące elementy: 12,5 μl ddPCR Supermix for Probes, bez dUTP, 1,25 μl testu PrimeTime Std qPCR Astest, AAV-ITR (patrz tabela materiałów) i 6,25 μL nf-H2O.
    7. Zmieszać 5 μl DNA z 20 μl mieszanki wzorcowej. Wykonaj tę czynność dla rozcieńczeń 1:40 000, 1:160 000 i 1:640 000.
    8. Umieść nabój w uchwycie wkładu. Dodaj 70 μl oleju wytwarzającego kropelki do sond w rzędzie oznaczonym jako Olej. Uważaj, aby nie generować żadnych bąbelków.
    9. Dodać 20 μl objętości próbki w wierszu przeznaczonym jako Próbka. Uważaj, aby nie generować żadnych bąbelków.
    10. Uszczelnij wkład uszczelką i umieść go w generatorze kropel. Wygeneruj kropelki, naciskając przycisk start na maszynie, usuń uszczelkę i ostrożnie przenieś, za pomocą pipety wielokanałowej, 40 μl wytworzonych kropelek do płytki 96-dołkowej. Pracuj powoli, aby uniknąć zniszczenia kropelek i pęcherzyków powietrza.
    11. Uszczelnić 96-dołkową płytkę folią przebijającą (czerwony pasek skierowany do góry) za pomocą zgrzewarki do płytek PCR. Umieść płytkę w termocyklerze.
    12. Ustaw objętość na 40 μl, temperaturę pokrywki na 105 °C, a szybkość narastania na 2 °C/s. Uruchom program PCR zgodnie z opisem w Tabeli 2.
    13. Włącz czytnik kropel na 30 minut przed użyciem. Otwórz oprogramowanie na pulpicie.
    14. Wejdź w układ płytki i wybierz ABS w zakładce eksperyment oraz ddPCR Supermix w zakładce Supermix. Następnie najpierw naciśnij PRIME, a następnie kliknij FLUSH SYSTEM w oprogramowaniu, aby zainicjować system.
    15. Wprowadź tabliczkę do czytnika. Rozpocznij uruchamianie, a po jego zakończeniu wyeksportuj dane jako plik CSV do późniejszej analizy jako arkusz kalkulacyjny.
      UWAGA: Liczby generowane przez oprogramowanie to kopie genomu (GC) na μl. Należy je pomnożyć przez współczynniki rozcieńczenia: GC/μL x 5 (rozcieńczenie DNA w mieszance wzorcowej) x początkowe rozcieńczenie (tj. 40 000 lub 160 000).

figure-protocol-1
Rysunek 3: Schematyczny przegląd celowania w intronicznych i egzonicznych podczas CRISPR/Cas9 HDR. Schematyczne porównanie strategii celowania intronicznego i egzonicznego dla CRISPR/Cas9 HDR. (A) Podczas celowania intronicznego, w intronie DNA wprowadza się dwuniciowe pęknięcie. Matryca HDR składa się z LHA, sekwencji cDNA i RHA. Celowanie introniczne wymaga dodatkowo obecności akceptora warstwy zawierającego miejsce splicingu 3', punkt rozgałęzienia i trakt polipirymidynowy. Pozwala to na prawidłowe łączenie. Zielone kropkowane pole reprezentuje region odpowiadający sekwencji SA. Wielkość SA wynosi 150 pz. (B) Celowanie egzoniczne opiera się na wytwarzaniu dwuniciowego pęknięcia bezpośrednio w eksonie. Matryca HDR składa się z LHA, sekwencji cDNA i RHA. Pomarańczowe kropkowane pola wskazują regiony odpowiadające LHA i RHA. Idealna wielkość HA to 400 bp każdy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Promotorzy
nazwadługośćOpis
Napęd SFFV492 pzPromotor wirusa tworzącego ognisko śledziony. Silny promotor ssaków. Wyrażony konstytutywnie
Ubc400 punktów bazowychPromotor pochodzący z ludzkiego genu ubikwityny C. Konstytutywnie wyrażone.
Wirus CMV508 pkt. bazowychPromotor pochodzi od wirusa cytomegalii. Może zawierać region wzmacniający. Konstytutywnie wyrażone. Silny promotor ssaków. Może zostać wyciszony.
EF-1a1182 pzLudzki promotor wydłużenia translacji eukariotycznej 1 alfa. Konstytutywnie wyrażone. Silny promotor ssaków.
System zarządzania finansami (EFS)200-300 pzEF-1 alfa beztronowa krótka forma
Cag584 punkty bazoweHybrydowy promotor ssaków zawierający wczesny wzmacniacz CMV (C), promotor beta aktyny kurczaka (A) i akceptor splicingu dla genu beta-globiny królika (G). Konstytutywnie wyrażone.
Sygnały poliadenylacji (PolyA)
skrótdługośćOpis
SV40 PolyA82-122 pzSygnał poliadenylacji wirusa małpiego 40
bGH PolyA224 pzSygnał poliadenylacji bydlęcego hormonu wzrostu
rbGlob PolyA56 pzSygnał poliadenylacji beta globiny królika

Tabela 1: Promotory i sygnały poliadenylacji.

kroktemperaturaGodzinaCykli
Aktywacja enzymatyczna95°C10 minut1x
denaturacja94°C30 sekund42x
Wyżarzanie60°C1 minuta
rozszerzenie72°C30 sekund
Dezaktywacja enzymów98°C10 minut1x
trzymać4°C∞

Tabela 2: Cyfrowy program PCR kropelkowy.

3. Edycja HSPC

  1. Transfekcja i transdukcja HSPC
    1. Rozmrozić HSPC CD34+ i przenieść komórki do 10 ml wstępnie podgrzanego RPMI uzupełnionego 1% P/S. Wirować przy 350 x g w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
    2. Zawiesić komórki w pożywce retencyjnej HSPC do stężenia 2,5 x 105 komórek/ml i inkubować w temperaturze 37 °C/5% CO2 przez 48 godzin - 72 godziny.
    3. Zbierz komórki do probówki o pojemności 15 ml. Policz komórki i sprawdź żywotność komórek przez wykluczenie błękitu trypanowego. W jednej kuwecie można nukleofektować od 2 x 105 do 5 x 106 komórek. Przygotuj odpowiednią liczbę kuwet w zależności od obliczonej liczby komórek.
    4. Przygotuj kompleks RNP. Do probówki o pojemności 1,5 ml dodać 15 μg Cas9 i 8 μg sgRNA (stosunek molowy 1:2,5) i inkubować w temperaturze 25 °C przez 10 minut w bloku grzewczym.
    5. Podczas inkubacji kompleksu RNP odwirować komórki przy 350 x g przez 5 minut i odrzucić supernatant.
    6. Zawiesić komórki w 100 μl roztworu nukleofekcji. Wymieszaj komórki z kompleksem RNP i przenieś do kuwety.
    7. Delikatnie postukaj w kuwetę, aby usunąć wszelkie resztki pęcherzyków powietrza, które mogły powstać podczas przenoszenia.
    8. Włóż kuwetę do uchwytu systemu transfekcji i elektroporuj ogniwa, jak opisano wcześniej w sekcji projektowania sgRNA.
    9. Natychmiast po elektroporacji dodać 400 μl wstępnie podgrzanej pożywki retencyjnej HSPC bez P/S i przenieść komórki za pomocą pipety do cienkiego transferu na płytkę do hodowli tkankowej zawierającą 500 μl wstępnie podgrzanej pożywki retencyjnej HSPC bez P/S. W zależności od liczby komórek należy użyć odpowiedniej płytki hodowlanej (płytki 24-, 12- lub 6-dołkowej) w celu uzyskania gęstości między 0,25 x 106 a 1 x 106 komórek/ ml. Przenieść płytkę do inkubatora w temperaturze 37 °C/5% CO2 .
    10. Rozmrozić fiolki zawierające zamrożone rAAV na lodzie. Transdukuj komórki, pipetując optymalną ilość każdego rAAV6 do zawiesiny komórek. Wykonaj transdukcję w ciągu 20-30 minut po elektroporacji, aby uzyskać wysoką wydajność transdukcji.
      UWAGA: Optymalne stężenie każdego wirusa (jeden wirus dla matrycy WT HDR i inny oddzielny wirus dla zmutowanej matrycy HDR) powinno być określone eksperymentalnie. Zwykle 5 000-10 000 GC / komórkę (np. 5 x 109 GC dla 1 x 106 komórek) powoduje wysoką transdukcję.
    11. Delikatnie wymieszać zawiesinę komórek za pomocą pipety. Inkubować transdukowane komórki przez 6-8 godzin w temperaturze 37 °C/5% CO2 . Po 6-8 godzinach zebrać komórki do probówki i odwirować przy 350 x g w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
    12. Wyrzuć starą pożywkę i zastąp ją świeżą, wstępnie podgrzaną pożywką retencyjną HSPC uzupełnioną P/S.
    13. Zawiesić komórki w stężeniu 2,5 x 105-5 x 105 komórek/ml i przenieść na płytkę do hodowli komórkowej poddanej działaniu tkanki (płytka 24-, 12- lub 6-dołkowa). Inkubować komórki przez 48 godzin w temperaturze 37 °C/5% CO2 przed przystąpieniem do sortowania.
  2. Sortowanie przepływowe zmodyfikowanych HSPC z heterozygotyczną mutacją GOF
    1. Zebrać komórki do probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 350 x g w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Usunąć supernatant, zawiesić komórki w 1 ml DPBS zawierającym 0,1% BSA i ponownie odwirować przy 350 x g w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
    2. Odrzucić supernatant i zawiesić komórki w odpowiedniej objętości DPBS + 0,1% BSA w zależności od liczby komórek.
      UWAGA: Zaleca się zawieszenie komórek na minimalną objętość 200 μL i nie przekraczanie 1 x 107 komórek/ml w celu zmniejszenia ryzyka zatkania sortera.
    3. Przenieść komórki do sterylnej probówki FACS wyposażonej w nakrętkę. Dodaj 7-AAD lub inny barwnik żywotności (w zależności od ich kompatybilności z białkami fluorescencyjnymi) do zawiesiny komórek w celu wykluczenia żywych/martwych komórek.
    4. Sortować żywe komórki, które są podwójnie dodatnie dla fluorescencyjnych białek reporterowych, do probówki zbiorczej zawierającej 200 μl pożywki retencyjnej HSPC.
      UWAGA: Należy dodać odpowiednie kontrole składające się z komórek transdukowanych wyłącznie za pomocą AAV, aby zapewnić prawidłowe bramkowanie podczas procedury sortowania.
    5. Odwirować posortowane komórki przy 350 x g w temperaturze pokojowej przez 5 minut i zawiesić komórki w pożywce retencyjnej HSPC o stężeniu 2,5 x 105 komórek/ml w celu dalszej ekspansji w hodowli lub użyć komórek bezpośrednio do testów funkcjonalnych.

4. Potwierdzenie udanej edycji genów

  1. Ekstrakcja genomowego DNA
    1. Przed rozpoczęciem należy ustawić bloki grzewcze na 65 °C i 98 °C. Zebrać 2 x 105 komórek oczyszczonych z edytowanym genomem i sortować i wirować przy 350 x g przez 5 minut.
    2. Wyodrębnij gDNA zgodnie z wcześniejszym opisem. Roztwór DNA należy stosować bezpośrednio do PCR lub przechowywać w temperaturze -20 °C.
  2. In-Out PCR (In-Out PCR)
    1. Zaprojektuj dwa startery do amplifikacji miejsca insercji 5' (Rysunek 4A): starter forward 1 celuje w locus genomowy poza lewym ramieniem homologii; starter reverse 2 jest ukierunkowany na zintegrowaną sekwencję.
    2. W przypadku PCR in-out należy przygotować następującą mieszaninę PCR na reakcję:
      10 μL PCR Master Mix (2x; patrz Tabela Materiałów)
      1 μl startera forward 1 (zapas 10 μM)
      1 μl podkładu na odwrót 2 (zapas 10 μM)
      0,5-1,0 μL wyekstrahowanego DNA
      Wolne od nukleazH2Odo końcowej objętości 20 μl
      UWAGA: W przypadku więcej niż jednej reakcji zaleca się przygotowanie mieszanki wzorcowej, która zawiera jedną dodatkową reakcję w celu uwzględnienia błędów pipetowania. Ważne jest, aby dołączyć kontrolę bez matrycy i matrycę DNA z próbki poddanej próbie.
    3. Uruchom reakcje PCR z odpowiednim programem cykli termicznych (patrz instrukcje producenta).
      UWAGA: Zaleca się najpierw przetestowanie pary podkładów pod kątem optymalnej temperatury wyżarzania. Można to zrobić, obliczając Tm, a następnie uruchamiając PCR za pomocą termocyklera, który może wykonać gradient temperatury.
    4. Uruchom produkty PCR z drabinką DNA na 1,5% żelu agarozowym pod napięciem 100 V przez 45-60 minut (Rysunek 4B). Umieść żel na niebieskim świetle lub transiluminatorze UV. Wyciąć pasma z żelu.
    5. Wyekstrahuj DNA z prążków za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu DNA. Wyślij wyekstrahowane próbki PCR z odpowiednimi starterami do sekwencjonowania Sangera, aby potwierdzić prawidłową i bezproblemową integrację pożądanego cDNA w endogennym locus genu.

figure-protocol-2
Rysunek 4: Walidacja integracji genomowej metodą in-out PCR. (A) Schematyczne przedstawienie strategii in-out PCR. W przedstawionej strategii zaprojektowano dwa elementarze. Starter forward 1 jest ukierunkowany na locus genomowy poza LHA, a starter reverse 2 jest ukierunkowany na sekwencję zoptymalizowaną pod kątem kodonów. (B) Schematyczne przedstawienie elektroforezy w żelu agarozowym. Tylko pomyślnie edytowane komórki (RNP + AAV) wygenerują produkt PCR podczas in-out PCR, podczas gdy nieedytowane próbki (tylko AAV) nie wygenerują produktu PCR. Skrót: NTC = kontrola bez szablonu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stosując wyżej opisany protokół, heterozygotyczne mutacje CALR typu 1 zostały ponownie wprowadzone w HSPC pochodzących z krwi pępowinowej. Mutacja ta składa się z delecji 52 pz w eksonie 9 (ostatnim eksonie CALR), co skutkuje przesunięciem ramki o +1, co prowadzi do translacji nowej dodatnio naładowanej domeny C-końcowej26,33. Aby wprowadzić mutację CALR w endogennym locus genu, przyjęto strategię celowania intronicznego przed eksonem 9, ponieważ pozwoliłoby to uniknąć wszelkich niepożądanych zmian w sekwencji kodującej w przypadkach, gdy DSB indukowany przez Cas9 nie został naprawiony przez mechanizm HDR. W tym konkretnym przypadku sgRNA dla intronu 7 został zaprojektowany ze względu na dostępność wysokich sekwencji docelowych i niskich poza celem w połączeniu z korzystnymi ramionami homologii (brak powtórzeń sekwencji; Rysunek 5A).

Następnie zaprojektowano dwa szablony dawców i spakowano je w wektory AAV6. Aby umożliwić prawidłowy splicing z endogennych eksonów do zintegrowanego cDNA, matryce dawcy zawierają (i) sekwencję SA obejmującą miejsce splicingu 3', punkt rozgałęzienia i szlak polipirymidynowy, (ii) zoptymalizowaną pod kątem kodonów sekwencję cDNA eksonów 8-9, zawierającą WT (CALRWT) lub zmutowaną sekwencję (CALRDEL), w tym kodon stop, (iii) sygnał poliA wirusa małpiego 40 (SV40), (iv) sekwencję kodującą białko fluorescencyjne pod kontrolą oddzielnego promotora wewnętrznego, promotora wirusa tworzącego ognisko śledziony (SFFV), po którym następuje (v) sygnał poliA bydlęcego hormonu wzrostu (bGH). Matryca dawcy zawierająca cDNA CALRWT została zaprojektowana tak, aby zawierała kasetę GFP, podczas gdy matryca dawcy zawierająca sekwencję cDNA CALRDEL została zaprojektowana tak, aby zawierała kasetę BFP. Cała konstrukcja była otoczona lewym i prawym HA (Rysunek 5A).

Dwa dni po transfekcji kompleksem RNP i transdukcji wirusami rAAV6, komórki zostały przeanalizowane za pomocą cytometrii przepływowej. Można wykryć cztery główne populacje: (i) komórki nie wykazujące ekspresji ani GFP, ani BFP, reprezentujące komórki bez edycji genomu opartej na HDR, (ii) komórki dodatnie tylko dla GFP, reprezentujące te, które zintegrowały tylko konstrukt WT, (iii) komórki dodatnie tylko dla BFP, reprezentujące te, które zintegrowały tylko zmutowany konstrukt, oraz (iv) komórki podwójnie dodatnie GFP i BFP, reprezentujące komórki, które zintegrowały zarówno sekwencje WT, jak i zmutowane (Rysunek 5B). W celu uzyskania czystych populacji HSPC z heterozygotyczną mutacją CALR typu 1, podwójnie dodatnie komórki posortowano za pomocą cytometrii przepływowej. HSPC, w których wbito dwie sekwencje WT, użyto jako komórek kontrolnych (GFP+, mCherry+; Rysunek 5B). Ważną alternatywą do wykorzystania jako komórki kontrolne byłyby HSPC z bialleliczną integracją białek fluorescencyjnych w locus "bezpiecznej przystani" (tj. AAVS1; nie pokazano). Liczenie komórek przez wykluczenie błękitu trypanowego przeprowadzone na posortowanych HSPC wykazało, że ponad 90% komórek było zdolnych do życia.

Bezproblemowa integracja konstruktów w miejscu docelowym została potwierdzona poprzez zastosowanie strategii PCR in-out (Rysunek 6A). W tym konkretnym przypadku przeprowadziliśmy dwa oddzielne PCR in-out, jeden dla wbitej sekwencji CALRWT (pas 1 elektroforezy żelowej w Figura 6A) i jeden dla wbitej sekwencji CALR DEL (pas 2 elektroforezy żelowej Figura 6A). Sekwencjonowanie Sangera przeprowadzone na DNA wyekstrahowanym z prążków żelowych potwierdziło prawidłową insercję WT i zmutowanych sekwencji w CALRDEL/WT HSPC (Figura 6B).

figure-results-1
Rysunek 5: Generacja HSPC z heterozygotyczną mutacją CARP. (A) Reprezentatywny schemat przedstawiający strategię edycji dla insercji heterozygotycznej mutacji CALR. Kompleks RNP jest ukierunkowany na intron między eksonem 7 a eksonem 8 genu CALR. Dwa AAV, jeden zawierający zmutowane egzony 8-9 i BFP, a drugi zawierający eksony WT 8-9 i GFP, będą służyć jako szablony naprawy dawcy i będą promować integrację zmutowanej sekwencji w jednym allelu i integrację sekwencji WT w pozostałym allelu. (B) Reprezentatywne wykresy cytometrii przepływowej przedstawiające ekspresję GFP i BFP lub GFP i mCherry 48 godzin po transfekcji i transdukcji HSPC. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 6: Walidacja udanej heterozygotycznej mutacji CALR w HSPCs. (A) Elektroforeza żelowa z produktów PCR in-out przeprowadzona na genomowym DNA wyekstrahowanym z kontroli AAV, CALRWT/WT iCALR DEL/WT. Zastosowano drabinę DNA o sile 100 pz. Skrót: NTC = kontrola bez szablonu. (B) Wyniki sekwencjonowania Sangera uzyskane z PCR in-out przeprowadzonych na CALRDEL/WT, potwierdzające udaną integrację WT i zmutowanych sekwencji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Skuteczna i precyzyjna manipulacja genetyczna ludzkich pierwotnych HSPC stanowi doskonałą okazję do zbadania i zrozumienia procesów wpływających na prawidłową hematopoezę, a co najważniejsze, na białaczkową transformację komórek krwiotwórczych.

W protokole tym opisano skuteczną strategię inżynierii ludzkich HSPC w celu ekspresji nawracających heterozygotycznych mutacji GOF. W procedurze tej wykorzystano technologię CRISPR/Cas9 i wektory rAAV6 jako dawców matryc DNA w celu precyzyjnego wprowadzenia WT i zmutowanych sekwencji DNA do ich endogennych loci genów. Sprzężenie zmodyfikowanych cDNA (WT i mutanta) z oddzielonymi fluorescencyjnymi białkami reporterowymi pozwala na wzbogacenie i śledzenie komórek o określonym stanie heterozygotycznym.

Strategia ta ma kilka zalet w porównaniu z często stosowanymi metodami opartymi na lentiwirusach (LV). Jedną z głównych zalet jest to, że system oparty na CRISPR/Cas9 pozwala na precyzyjną edycję w endogennych loci, co skutkuje zachowaniem endogennych promotorów i elementów regulatorowych. Prowadzi to do jednorodności ekspresji edytowanego genu w komórkach, co jest celem trudno osiągalnym, gdy stosuje się metodę opartą na LV. Transfer genów z wektorami LV prowadzi do półlosowej integracji genu z preferencją dla miejsc aktywnych transkrypcyjnie34. Może to przekładać się na nadekspresję przenoszonego genu i niejednorodność między edytowanymi komórkami, co ostatecznie skutkuje trudnościami w badaniu i analizowaniu roli mutacji i interakcji genów. Drugą zaletą jest to, że opisywany system, będąc systemem edycji specyficznym dla danego miejsca, eliminuje ryzyko mutagenezy insercyjnej35.

Strategia podwójnego fluorescencyjnego reportera pozwala na precyzyjne wzbogacanie i śledzenie komórek, które zostały pomyślnie edytowane na obu allelach, przy czym jeden allel integruje cDNA WT, a drugi allel integruje zmutowane sekwencje cDNA. Komórki wyrażające tylko pojedynczy reporter reprezentują albo tylko integrację monoalleliczną, albo całkowanie bialleliczne matryc HDR z tym samym reporterem fluorescencyjnym. Oba scenariusze można precyzyjnie rozróżnić tylko wtedy, gdy klony pochodzące z pojedynczych komórek są produkowane i indywidualnie analizowane. Jednak HSPC mają tylko ograniczoną zdolność proliferacyjną in vitro, a gdy są trzymane w hodowli przez dłuższy czas, HSPC zaczynają różnicować się w bardziej dojrzałe potomstwo i tracą zdolność do samoodnawiania się i wszczepiania. To sprawia, że selekcja i namnażanie klonów pojedynczych komórek, które zawierają pożądaną mutację heterozygotyczną, jest niewykonalne. Zastosowanie strategii podwójnej fluorescencji białek i wzbogacenie za pomocą cytometrii przepływowej dla komórek z mutacją heterozygotyczną pozwala na ominięcie problemów wywołanych rozszerzoną hodowlą in vitro .

W tym konkretnym przykładzie udało się wykazać, że HSPC mogą być skutecznie modyfikowane i sortowane w celu uzyskania czystych populacji HSPC z heterozygotyczną mutacją CALRDEL/WT.

Jednak system ten nie ogranicza się do inżynierii heterozygotycznych mutacji przesunięcia ramki odczytu, ale może być również łatwo zaadoptowany do tworzenia innych typów mutacji, w tym mutacji missense i nonsensownych. Stosując różne kombinacje AAV zawierających WT lub zmutowane sekwencje z różnymi fluorescencyjnymi białkami reporterowymi, system ten może być również wykorzystany do wprowadzenia mutacji homozygotycznych (jednoczesna transdukcja z dwoma rAAV, z których oba zawierają zmutowane cDNA, ale różne reportery fluorescencyjne), a nawet korektę mutacji (jednoczesna transdukcja z dwoma AAV, z których oba zawierają cDNA WT, ale różne reportery fluorescencyjne). Dodatkowo należy wspomnieć, że strategia ta nie ogranicza się do wprowadzania onkogennych mutacji GOF. W rzeczywistości opisany protokół może być wykorzystany do wielu alternatywnych strategii, w tym do nokautu genów, wymiany genów36,37, ukierunkowanego knock-inu transgenów (tj. chimerycznych receptorów antygenowych)38, a nawet do korekcji mutacji powodujących chorobę11,39.

Wykazano również, że strategia łączenia CRISPR/Cas9 i AAV6 z wieloma reporterami fluorescencyjnymi ma zastosowanie w wielu innych typach komórek, w tym limfocytach T, plazmocytoidalnych komórkach dendrytycznych, indukowanych pluripotencjalnych komórkach macierzystych, neuronalnych komórkach macierzystych i komórkach macierzystych dróg oddechowych 24,38,40,41,42,43,44. Strategia ta może być stosowana do produkcji limfocytów T o doskonałym chimerycznym receptorze antygenowym (CAR). Na przykład niedawno opublikowano, że nokaut genu TGFBR2 za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w komórkach CAR T znacznie zwiększa ich funkcję w supresyjnym mikrośrodowisku guza bogatym w TGF-β45. Takie podejście może zapewnić jednoetapowy protokół zarówno do inżynierii limfocytów T w celu ekspresji CAR, jak i do wyeliminowania genu TGFBR2 poprzez specyficzne wprowadzenie CAR do obu alleli genu TGFBR2. Co więcej, podejście to może być również przydatne do generowania uniwersalnych limfocytów CAR T poprzez integrację CAR z genem stałej alfa receptora limfocytów T (TRAC)46,47.

Aby zwiększyć odtwarzalność i zagwarantować wydajną edycję komórek, należy wziąć pod uwagę kilka ważnych kwestii. Główne punkty krytyczne dla zapewnienia pomyślnej edycji komórek znajdują się w (i) wyborze sgRNA, (ii) projekcie szablonu HDR oraz (iii) produkcji rAAV6.

Wybór dobrze działającego sgRNA jest kluczowy, ponieważ określi maksymalną liczbę alleli, w których można zintegrować matrycę HDR. Dzięki licznemu oprogramowaniu, które jest obecnie dostępne, wyszukiwanie potencjalnych sgRNA zostało uproszczone. Wybierając obszar zainteresowania, oprogramowanie może zaproponować serię sgRNA z wynikiem on-target i off-target, które wskazują szanse na edycję odpowiednio w pożądanym locus i niechcianych loci. Wyniki te są obliczane na podstawie wcześniej opublikowanych modeli punktacji48,49. Chociaż jest to dobry punkt wyjścia do wyboru dobrze działającego sgRNA, wydajność sgRNA musi zostać potwierdzona, ponieważ jego przewidywana wydajność in silico nie zawsze odpowiada skutecznemu sgRNA in vitro. Dlatego zdecydowanie zaleca się zaprojektowanie i przetestowanie co najmniej trzech sgRNA, aby zwiększyć szanse na znalezienie najlepszego sgRNA. Po zidentyfikowaniu naprawdę dobrze działającego sgRNA sugeruje się przystąpienie do projektowania szablonu HDR.

Podczas projektowania szablonu HDR należy wziąć pod uwagę środki ostrożności. Lewe i prawe ramię homologiczne (odpowiednio LHA i RHA) powinno obejmować odpowiednio 400 pz w górę i w dół od miejsca przecięcia sgRNA, ponieważ krótsze HA mogą skutkować zmniejszeniem częstotliwości HDR. Wielkość cDNA, która może zostać wprowadzona za pomocą HDR, zależy od możliwości pakowania AAV, które wynoszą około 4,7 kb. Ze względu na liczne elementy obowiązkowe w matrycy HDR (LHA, RHA, SA, PolyA, promotor i fluorescencyjna sekwencja reporterowa), pozostała przestrzeń dla zmutowanego lub WT cDNA jest ograniczona. Nie jest to problematyczne, jeśli pożądana mutacja znajduje się w pobliżu końca 3' genu lub w genach z ogólnie krótkim CDS. Jednak w przypadkach, gdy mutacja znajduje się w pobliżu początkowej strony transkrypcji (TSS) genów z długim CDS (przekraczającym pozostałą przestrzeń pakowania AAV), to opisane podejście może być niewykonalne. Aby obejść ten problem, Bak i jego koledzy opracowali niedawno strategię, która opiera się na podziale szablonu HDR na dwa AAV. Strategia ta opiera się na dwóch oddzielnych integracjach za pośrednictwem HDR, aby uzyskać ostateczną bezproblemową integrację dużego genu50.

Jakość wirusa i jego miano są dodatkowymi czynnikami, które mogą zadecydować o sukcesie lub porażce inżynierii genomu komórek. Aby uzyskać optymalny plon, ważne jest, aby nie dopuścić do osiągnięcia pełnej zbieżności HEK293T podczas utrzymywania w kulturze. Idealnie, komórki HEK293T powinny zostać podzielone po osiągnięciu zbiegu 70%-80%. Ponadto HEK293T nie powinny być hodowane przez długi czas, ponieważ może to zmniejszyć ich zdolność do wytwarzania wirusa. Nowe HEK293T komórki należy rozmrozić po 20 przejściach. Uzyskanie wysokich mian wirusów jest ważne dla zwiększenia wydajności i odtwarzalności eksperymentów. Niskie miana wirusa przekładają się na duże ilości roztworu rAAV wymaganego do transdukcji HSPC. Zgodnie z ogólną zasadą, roztwór rAAV dodany do komórek nukleofektycznych nie powinien przekraczać 20% całkowitej objętości pożywki retencyjnej HSPC. Większe objętości roztworu AAV mogą prowadzić do zwiększonej śmierci komórek, mniejszej proliferacji i upośledzenia wydajności transdukcji. W przypadku niskich mian wirusa zaleca się zatem dalszą koncentrację wirusa.

Podsumowując, protokół ten oferuje powtarzalne podejście do precyzyjnego i wydajnego manipulowania ludzkimi HSPC poprzez jednoczesne wykorzystanie matryc dawców CRIPSR/Cas9 i rAAV6 z dodatkowymi podwójnymi reporterami fluorescencyjnymi. Podejście to okazało się doskonałym narzędziem w badaniu normalnej biologii krwiotwórczych komórek macierzystych i wkładu, jaki mutacje wnoszą w białaczkę.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca jest wspierana przez granty z Austriackiego Funduszu Naukowego (FWF; numer P32783 i I5021) dla A.R. Dodatkowe fundusze dla A.R. są również zapewnione przez Austriackie Towarzystwo Medycyny Wewnętrznej (Joseph Skoda Fellowship), Austriackie Towarzystwo Hematologii i Onkologii (OeGHO; Clinical Research Grant) oraz MEFOgraz. T.K. jest Specjalnym Członkiem Towarzystwa Białaczki i Chłoniaka.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
175 cm2 Kolba do hodowli komórkowych, nasadka odpowietrzająca, Corning431080
Szalki 150 mm x 25 mmCorning430599
293TDSMZACC 635https://www.dsmz.de/collection/catalogue/details/culture/ACC-635
4D Nucleofector Core UnitLonza-Donukleofekcji ludzkich HSPC użyj programu DZ-100.
Jednostka 4D Nucleofector XLonza-500
ml Probówka wirówkowaCorning431123
7-AADBD Biosciences559925
AAVproTakara6666
Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3Zintegrowane technologie DNA (IDT)1081058
Ultrawirówka Avanti JXN-30Beckman Narzędzie
Narzędzie online do projektowania sgRNA: http://www.benchling.com/crispr
Strona internetowa: https://www.synthego.com/products/crispr-kits/synthetic-sgrna Sekwencja dla sgRNA ukierunkowanego na intron 7 CALR: 5'-CGCCTGTAATCCTCGCCCAG-3'                 Rusztowanie SpCas9 składające się z 80 nukleotydów dodaje się do sekwencji 20 nukleotydowych RNA w celu uzupełnienia sgRNA. Modyfikacje chemiczne 2'-O-metylu są dodawane do pierwszych i ostatnich 3 zasad, a wiązania 3' fosforotanianu są dodawane do pierwszych 3 i ostatnich 2 zasad.       *Alternatywnie chemicznie modyfikowane syntetyczne sgRNA można pozyskać z
do projektowania sgRNANarzędzie online do projektowania sgRNA: http://chopchop.cbu.uib.no
Costar 24-well Clear TC-treated Multiple Well PlatesCorning3526
CRISPickNarzędzie online do projektowania sgRNA: https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public
projektowania sgRNA CRISPORNarzędzie online do projektowania sgRNA: http://crispor.tefor.net
96-dołkowe płytki ddPCRBio-Rad12001925
ddPCR Supermix do sond (bez dUTP)Wkłady Bio-Rad1863024
DG8 do generatora kropel QX200/QX100 Uszczelki Bio-Rad1864008
DG8 do generatora kropel QX200/QX100 Bio-Rad1863009
DreamTaq Green PCR Master Mix (2X)Thermo ScientificK1081
Olejek do generowania kropelek do sondBio-Rad1863005
Dulbecco" s Zmodyfikowane podłoże Eagle (DMEM) o wysokiej zawartości glukozySigma-AldrichD6429-6X500ML
Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (DPBS)Sigma-AldrichD8537-500ML
FACSAria FusionBD Biosciences-Falcon
5 ml Okrągłodennabydlęca Corning352054
(FBS) Good Forte (inaktywowana termicznie), 500 mlPan BiotechP40-47500
FlowJo 10.8.0BD Biosciences -
GenAgarose L.E.Inno-trainGX04090
GeneRuler 100 bp Plus Drabinka DNAThermo ScientificSM0321
Gibson Assembly Master MixNew England Biolabs Inc. (NEB)E2611L
HEK293T
roztwór HEPESSigma-AldrichH0887-100ML
ICESynthegohttps://ice.synthego.com
Narzędzie do optymalizacji kodonów IDT
IDTNarzędzie online do projektowania sgRNA: https://www.idtdna.com/site/order/designtool/index/CRISPR_CUSTOM
Pożywka mikrobiologicznaSigma-AldrichL7533-1KG
Midori Green AdvanceNippon GeneticsMG04
Zestaw miniprzygotowawczy do plazmidu Monarch NEBT1010L
Zestaw do ekstrakcji żelu DNA MonarchNEBT1020L
NEB 5-alfa Kompetentny E. coli (wysoka wydajność)NEBC2987U
Woda bez nukleaz, 5X100 mlAmbionAM9939
NucleoBond Xtra MidiMacherey-Nagel740410
Opti-MEM, Zredukowane podłoże surowicy, 500 mlGibco31985070
P3 Pierwotna komórka 4D-Nucleofetor  X Kit LLonzaV4XP-3024Roztwór Lonza Primary P3 jest dostarczany w postaci 2,25 ml roztworu nukleofektora pierwotnego P3 i 0,5 ml suplementu 1. Aby rozpuszczeć, dodać Suplement 1 do roztworu P3 Primary Cell Nucleofector i wymieszać.
pAAV-MCS2Addgene46954
Folia termozgrzewalna do PCR, przebijanaBio-Rad1814040
pDGM6Addgene110660
Penicylina-Streptomycyna (P / S)Gibco15140122
Polietylenina (PEI)Polysciences23966Dodaj 50 ml PBS 4,5 pH (wykonanego z HCl) do 50 mg PEI w probówce. Rozpuścić, umieszczając probówkę w 70° C łaźnia wodna i wirowanie co 10 minut, aż roztwór się rozpuści. Gdy roztwór osiągnie RT, przesterylizuj filtr przez 0,22 μ M filtr, marka 1120 μ L i przechowywać w temperaturze -80°C.
Probówka z polistyrenu, z podkładami zatrzaskowymi
 Eurofins-Primers zostały zamówione w Eurofins (eurofinsgenomics.eu) jako niemodyfikowane niestandardowe oligonukleotydy wolne od soli. Podkłady zostały zaprojektowane przy użyciu PRIMER-Blast (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)                                                                                                        Podkład 1 Pd:      AAGTGATCCGTTCGCCATGAC;                               Specyficzny dla podkładu 2 Rev CALR WT: ACGTCCTCTTCCTCGTCCTC;                                         Specyficzny dla Primer 2 Rev CALR DEL: CCAACCCTGGAGACACGCTTC
Test startera PrimeTime qPCRIDT-PrimeTimeqPCR Probe Test (1 sonda/2 startery)  które można zamówić w IDT (https://eu.idtdna.com/site/order/qpcr/assayentry). Skala: Std - qPCR Test 500 reakcji; Podkład 1 do przodu (5'-3') : GGAACCCCTAGTGATGGAGTT; Podkład 2 Odwrócony (5'-3'): CGGCCTCAGTGAGCGA; Sonda (5'-3'): CACTCCCTCTCTGCGCCCTG; 5' Barwnik / 3' Gaszenie: FAM/ZEN/IBFQ; Stosunek startera do sondy: 3,6
PX1 PCR Plate SealerBio-Rad1814000
QuantaSoft SoftwareBio-Rad
Quick Extract Roztwór do ekstrakcji DNALucigenQE0905T
QX200 Bio-Rad1864002
QX200Bio-Rad
Rekombinowany ludzki ligand Flt3Peprotech300-19
Rekombinowany ludzki IL-6Peprotech200-06
Rekombinowany ludzki SCFPeprotech300-07
Rekombinowany ludzki TPOPeprotech300-18
RPMI 1640Sigma-AldrichR8758-6X500ML
SnapGeneDotmaticsOprogramowanie do klonowania molekularnego https://www.snapgene.com *Alternatywnie można również użyć Benchling (https://www.benchling.com) i Geneious (https://www.geneious.com).
Pożywka do wzrostu SocNEBB9020S
Maślan soduSigma-AldrichB5887-1G
Stem Regenin 1 (SR1)Biogems1224999
StemSpan SFEM IISTEMCELL Technologies9655
TAE Buffer (Tris-acetate-EDTA) 50XThermo Scientific B49
TIDEhttp://shinyapps.datacurators.nl/tide/
Trypan blue 0,4%Sigma-AldrichT8154-100ML
TrypLE (z czerwienią fenolową), 500 mlThermo Scientific16605-028
UltraPure 0,5: EDTA, pH 8,0, 100 mlThermo Scientific15575-038
UM171STEMCELL Technologies72914
Narzędzie do optymalizacji kodonów Vector Builderhttps://en.vectorbuilder.com/tool/codon-optimization.html
Zestaw do oczyszczania do projektowania sgRNA Coulter-Benchling Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Sigma-Aldrich A7906-100G C1000 Touch Termocykler Bio-Rad-Chemicznie modyfikowany syntetyczny sgRNA Synthego narzędzia IDT (https://eu.idtdna.com/site/order/oligoentry/index/crispr) i Trilink (https://www.trilinkbiotech.com/custom-oligos)CHOPCHOP Narzędzie do projektowania sgRNA Narzędzie do surowica Narzędzie do projektowania sgRNA IDT https://www.idtdna.com/pages/tools/codon-optimization-toolLB Bulion (Lennox) EZMix w proszku pożywka do wzrostu mikrobiologicznego Sigma-Aldrich L7658-1KG LB Rosół z agarem (Lennox) EZMix w proszku Czytnik kropelek

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).">Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
  2. CRISPR-Cas9 in vivo gene editing transthyretin amyloidosis. New England Journal of Medicine. 385 (6), 493-502 (2021).">Gillmore, J. D., et al. CRISPR-Cas9 in vivo gene editing transthyretin amyloidosis. New England Journal of Medicine. 385 (6), 493-502 (2021).
  3. CRISPR-Cas9 gene editing for sickle cell disease and β-thalassemia. New England Journal of Medicine. 384 (3), 252-260 (2021).">Frangoul, H., et al. CRISPR-Cas9 gene editing for sickle cell disease and β-thalassemia. New England Journal of Medicine. 384 (3), 252-260 (2021).
  4. CRISPR-engineered T cells in patients with refractory cancer. Science. 367 (6481), (2020).">Stadtmauer, E. A., et al. CRISPR-engineered T cells in patients with refractory cancer. Science. 367 (6481), (2020).
  5. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).">Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  6. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).">Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  7. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).">Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  8. Regulation of homologous recombination in eukaryotes. Annual Review of Genetics. 44, 113-139 (2010).">Heyer, W. D., Ehmsen, K. T., Liu, J. Regulation of homologous recombination in eukaryotes. Annual Review of Genetics. 44, 113-139 (2010).
  9. Pseudotyped recombinant adeno-associated viral vectors mediate efficient gene transfer into primary human CD34+ peripheral blood progenitor cells. Cytotherapy. 12 (1), 107-112 (2010).">Veldwijk, M. R., et al. Pseudotyped recombinant adeno-associated viral vectors mediate efficient gene transfer into primary human CD34+ peripheral blood progenitor cells. Cytotherapy. 12 (1), 107-112 (2010).
  10. High-efficiency transduction of primary human hematopoietic stem cells and erythroid lineage-restricted expression by optimized AAV6 serotype vectors in vitro and in a murine xenograft model in vivo. PLoS One. 8 (3), 58757(2013).">Song, L., et al. High-efficiency transduction of primary human hematopoietic stem cells and erythroid lineage-restricted expression by optimized AAV6 serotype vectors in vitro and in a murine xenograft model in vivo. PLoS One. 8 (3), 58757(2013).
  11. CRISPR/Cas9 β-globin gene targeting in human haematopoietic stem cells. Nature. 539 (7629), 384-389 (2016).">Dever, D. P., et al. CRISPR/Cas9 β-globin gene targeting in human haematopoietic stem cells. Nature. 539 (7629), 384-389 (2016).
  12. Sequential cancer mutations in cultured human intestinal stem cells. Nature. 521 (7550), 43-47 (2015).">Drost, J., et al. Sequential cancer mutations in cultured human intestinal stem cells. Nature. 521 (7550), 43-47 (2015).
  13. Clonal evolution of preleukemic hematopoietic stem cells precedes human acute myeloid leukemia. Science Translational Medicine. 4 (149), (2012).">Jan, M., et al. Clonal evolution of preleukemic hematopoietic stem cells precedes human acute myeloid leukemia. Science Translational Medicine. 4 (149), (2012).
  14. Preleukemic mutations in human acute myeloid leukemia affect epigenetic regulators and persist in remission. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (7), 2548-2553 (2014).">Corces-Zimmerman, M. R., Hong, W. J., Weissman, I. L., Medeiros, B. C., Majeti, R. Preleukemic mutations in human acute myeloid leukemia affect epigenetic regulators and persist in remission. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (7), 2548-2553 (2014).
  15. Clonal hematopoiesis and risk of atherosclerotic cardiovascular disease. New England Journal of Medicine. 377 (2), 111-121 (2017).">Jaiswal, S., et al. Clonal hematopoiesis and risk of atherosclerotic cardiovascular disease. New England Journal of Medicine. 377 (2), 111-121 (2017).
  16. Clonal hematopoiesis and blood-cancer risk inferred from blood DNA sequence. New England Journal of Medicine. 371 (26), 2477-2487 (2014).">Genovese, G., et al. Clonal hematopoiesis and blood-cancer risk inferred from blood DNA sequence. New England Journal of Medicine. 371 (26), 2477-2487 (2014).
  17. Genomic classification and prognosis in acute myeloid leukemia. New England Journal of Medicine. 374 (23), 2209-2221 (2016).">Papaemmanuil, E., et al. Genomic classification and prognosis in acute myeloid leukemia. New England Journal of Medicine. 374 (23), 2209-2221 (2016).
  18. Genomic and epigenomic landscapes of adult de novo acute myeloid leukemia. New England Journal of Medicine. 368 (22), 2059-2074 (2013).">Cancer Genone Atlas Research Network. Genomic and epigenomic landscapes of adult de novo acute myeloid leukemia. New England Journal of Medicine. 368 (22), 2059-2074 (2013).
  19. When clinical heterogeneity exceeds genetic heterogeneity: thinking outside the genomic box in chronic myelomonocytic leukemia. Blood. 128 (20), 2381-2387 (2016).">Ball, M., List, A. F., Padron, E. When clinical heterogeneity exceeds genetic heterogeneity: thinking outside the genomic box in chronic myelomonocytic leukemia. Blood. 128 (20), 2381-2387 (2016).
  20. The molecular genetics of cellular oncogenes. Annual Review of Genetics. 18, 553-612 (2003).">Varmus, H. E. The molecular genetics of cellular oncogenes. Annual Review of Genetics. 18, 553-612 (2003).
  21. Therapeutic genome editing: Prospects and challenges. Nature Medicine. 21 (2), 121-131 (2015).">Cox, D. B. T., Platt, R. J., Zhang, F. Therapeutic genome editing: Prospects and challenges. Nature Medicine. 21 (2), 121-131 (2015).
  22. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome editing in human hematopoietic stem cells models clonal hematopoiesis and myeloid neoplasia. Cell Stem Cell. 21 (4), 547-555 (2017).">Tothova, Z., et al. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome editing in human hematopoietic stem cells models clonal hematopoiesis and myeloid neoplasia. Cell Stem Cell. 21 (4), 547-555 (2017).
  23. Efficient ablation of genes in human hematopoietic stem and effector cells using CRISPR/Cas9. Cell Stem Cell. 15 (5), 643-652 (2014).">Mandal, P. K., et al. Efficient ablation of genes in human hematopoietic stem and effector cells using CRISPR/Cas9. Cell Stem Cell. 15 (5), 643-652 (2014).
  24. CRISPR/Cas9 genome editing in human hematopoietic stem cells. Nature Protocols. 13 (2), 358-376 (2018).">Bak, R. O., Dever, D. P., Porteus, M. H. CRISPR/Cas9 genome editing in human hematopoietic stem cells. Nature Protocols. 13 (2), 358-376 (2018).
  25. Human gene-engineered calreticulin mutant stem cells recapitulate MPN hallmarks and identify targetable vulnerabilities. Leukemia. , (2023).">Foßelteder, J., et al. Human gene-engineered calreticulin mutant stem cells recapitulate MPN hallmarks and identify targetable vulnerabilities. Leukemia. , (2023).
  26. Somatic CALR mutations in myeloproliferative neoplasms with nonmutated JAK2. New England Journal of Medicine. 369 (25), 2391-2405 (2013).">Nangalia, J., et al. Somatic CALR mutations in myeloproliferative neoplasms with nonmutated JAK2. New England Journal of Medicine. 369 (25), 2391-2405 (2013).
  27. Unfolding the role of calreticulin in myeloproliferative neoplasm pathogenesis. Clinical Cancer Research. 25 (10), 2956-2962 (2019).">Merlinsky, T. R., Levine, R. L., Pronier, E. Unfolding the role of calreticulin in myeloproliferative neoplasm pathogenesis. Clinical Cancer Research. 25 (10), 2956-2962 (2019).
  28. The contemporary approach to CALR-positive myeloproliferative neoplasms. International Journal of Molecular Sciences. 22 (7), 3371(2021).">Belčič Mikič, T., Pajič, T., Zver, S., Sever, M. The contemporary approach to CALR-positive myeloproliferative neoplasms. International Journal of Molecular Sciences. 22 (7), 3371(2021).
  29. Mutant calreticulin in myeloproliferative neoplasms. Blood. 134 (25), 2242-2248 (2019).">How, J., Hobbs, G. S., Mullally, A. Mutant calreticulin in myeloproliferative neoplasms. Blood. 134 (25), 2242-2248 (2019).
  30. Production and characterization of adeno-associated viral vectors. Nature Protocols. 1 (3), 1412-1428 (2006).">Grieger, J. C., Choi, V. W., Samulski, R. J. Production and characterization of adeno-associated viral vectors. Nature Protocols. 1 (3), 1412-1428 (2006).
  31. Recombinant adeno-associated virus purification using novel methods improves infectious titer and yield. Gene Therapy. 6 (6), 973-985 (1999).">Zolotukhin, S., et al. Recombinant adeno-associated virus purification using novel methods improves infectious titer and yield. Gene Therapy. 6 (6), 973-985 (1999).
  32. Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences. Human Gene Therapy Methods. 23 (1), 18-28 (2011).">Aurnhammer, C., et al. Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences. Human Gene Therapy Methods. 23 (1), 18-28 (2011).
  33. Somatic mutations of calreticulin in myeloproliferative neoplasms. New England Journal of Medicine. 369 (25), 2379-2390 (2013).">Klampfl, T., et al. Somatic mutations of calreticulin in myeloproliferative neoplasms. New England Journal of Medicine. 369 (25), 2379-2390 (2013).
  34. Viral vector platforms within the gene therapy landscape. Signal Transduction and Targeted Therapy. 6 (1), 1-24 (2021).">Bulcha, J. T., Wang, Y., Ma, H., Tai, P. W. L., Gao, G. Viral vector platforms within the gene therapy landscape. Signal Transduction and Targeted Therapy. 6 (1), 1-24 (2021).
  35. The genotoxic potential of retroviral vectors is strongly modulated by vector design and integration site selection in a mouse model of HSC gene therapy. The Journal of Clinical Investigation. 119 (4), 964-975 (2009).">Montini, E., et al. The genotoxic potential of retroviral vectors is strongly modulated by vector design and integration site selection in a mouse model of HSC gene therapy. The Journal of Clinical Investigation. 119 (4), 964-975 (2009).
  36. Targeted replacement of full-length CFTR in human airway stem cells by CRISPR-Cas9 for pan-mutation correction in the endogenous locus. Molecular Therapy. 30 (1), 223-237 (2022).">Vaidyanathan, S., et al. Targeted replacement of full-length CFTR in human airway stem cells by CRISPR-Cas9 for pan-mutation correction in the endogenous locus. Molecular Therapy. 30 (1), 223-237 (2022).
  37. Gene replacement of α-globin with β-globin restores hemoglobin balance in β-thalassemia-derived hematopoietic stem and progenitor cells. Nature Medicine. 27 (4), 677-687 (2021).">Cromer, M. K., et al. Gene replacement of α-globin with β-globin restores hemoglobin balance in β-thalassemia-derived hematopoietic stem and progenitor cells. Nature Medicine. 27 (4), 677-687 (2021).
  38. Genome editing of donor-derived T-cells to generate allogenic chimeric antigen receptor-modified T cells: Optimizing αβ T cell-depleted haploidentical hematopoietic stem cell transplantation. Haematologica. 106 (3), 847-858 (2021).">Wiebking, V., et al. Genome editing of donor-derived T-cells to generate allogenic chimeric antigen receptor-modified T cells: Optimizing αβ T cell-depleted haploidentical hematopoietic stem cell transplantation. Haematologica. 106 (3), 847-858 (2021).
  39. Cas9-AAV6 gene correction of beta-globin in autologous HSCs improves sickle cell disease erythropoiesis in mice. Nature Communications. 12 (1), 1-9 (2021).">Wilkinson, A. C., et al. Cas9-AAV6 gene correction of beta-globin in autologous HSCs improves sickle cell disease erythropoiesis in mice. Nature Communications. 12 (1), 1-9 (2021).
  40. CRISPR/Cas9 genome engineering in engraftable human brain-derived neural stem cells. iScience. 15, 524-535 (2019).">Dever, D. P., et al. CRISPR/Cas9 genome engineering in engraftable human brain-derived neural stem cells. iScience. 15, 524-535 (2019).
  41. Interferon priming is essential for human CD34+ cell-derived plasmacytoid dendritic cell maturation and function. Nature Communications. 9 (1), 1-14 (2018).">Laustsen, A., et al. Interferon priming is essential for human CD34+ cell-derived plasmacytoid dendritic cell maturation and function. Nature Communications. 9 (1), 1-14 (2018).
  42. Multiplexed genetic engineering of human hematopoietic stem and progenitor cells using CRISPR/Cas9 and AAV6. eLife. 6, 27873(2017).">Bak, R. O., et al. Multiplexed genetic engineering of human hematopoietic stem and progenitor cells using CRISPR/Cas9 and AAV6. eLife. 6, 27873(2017).
  43. The cell type-specific 5hmC landscape and dynamics of healthy human hematopoiesis and TET2-mutant preleukemia. Blood Cancer Discovery. 3 (4), 346-367 (2022).">Nakauchi, Y., et al. The cell type-specific 5hmC landscape and dynamics of healthy human hematopoiesis and TET2-mutant preleukemia. Blood Cancer Discovery. 3 (4), 346-367 (2022).
  44. selection-free gene repair in airway stem cells from cystic fibrosis patients rescues CFTR function in differentiated epithelia. Cell Stem Cell. 26 (2), 161-171 (2020).">Vaidyanathan, S., et al. selection-free gene repair in airway stem cells from cystic fibrosis patients rescues CFTR function in differentiated epithelia. Cell Stem Cell. 26 (2), 161-171 (2020).
  45. TGF-β inhibition via CRISPR promotes the long-term efficacy of CAR T cells against solid tumors. JCI Insight. 5 (4), 133977(2020).">Tang, N., et al. TGF-β inhibition via CRISPR promotes the long-term efficacy of CAR T cells against solid tumors. JCI Insight. 5 (4), 133977(2020).
  46. Long terminal repeat CRISPR-CAR-coupled "universal" T cells mediate potent anti-leukemic effects. Molecular Therapy. 26 (5), 1215-1227 (2018).">Georgiadis, C., et al. Long terminal repeat CRISPR-CAR-coupled "universal" T cells mediate potent anti-leukemic effects. Molecular Therapy. 26 (5), 1215-1227 (2018).
  47. Multiplex genome editing to generate universal CAR T cells resistant to PD1 inhibition. Clinical Cancer Research. 23 (9), 2255-2266 (2017).">Ren, J., et al. Multiplex genome editing to generate universal CAR T cells resistant to PD1 inhibition. Clinical Cancer Research. 23 (9), 2255-2266 (2017).
  48. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature Biotechnology. 31 (9), 827-832 (2013).">Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature Biotechnology. 31 (9), 827-832 (2013).
  49. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).">Doench, J. G., et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).
  50. CRISPR-mediated integration of large gene cassettes using AAV donor vectors. Cell Reports. 20 (3), 750-756 (2017).">Bak, R. O., Porteus, M. H. CRISPR-mediated integration of large gene cassettes using AAV donor vectors. Cell Reports. 20 (3), 750-756 (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Hematopoietic Stem CellsProgenitor CellsGain Of Function MutationsCRISPR Cas9 EditingHomology Directed RepairRecombinant AAV6Fluorescent Reporter SystemFlow CytometrySingle Guide RNAGenome Editing

Related Articles