Artykuł metodologiczny

Zastosowanie mikroskopii poklatkowej i specyficznego dla etapu zubożenia komórek białek do badania mejozy u S. cerevisiae

DOI:

10.3791/64580

⸱

11 października 2022

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Indiana University, 2Stowers Institute for Biomedical Research

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroskopia poklatkowa jest cennym narzędziem do badania mejozy u pączkujących drożdży. Protokół ten opisuje metodę, która łączy synchronizację cyklu komórkowego, mikroskopię poklatkową i warunkowe wyczerpanie białka docelowego, aby zademonstrować, jak badać funkcję określonego białka podczas segregacji chromosomów mejotycznych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Poklatkowa mikroskopia fluorescencyjna zrewolucjonizowała zrozumienie mejotycznych zdarzeń cyklu komórkowego, dostarczając danych czasowych i przestrzennych, które często nie są widoczne podczas obrazowania stałych komórek. Pączkujące drożdże okazały się ważnym organizmem modelowym do badania mejotycznej segregacji chromosomów, ponieważ wiele genów mejotycznych jest wysoce konserwatywnych. Mikroskopia poklatkowa mejozy u pączkujących drożdży pozwala na monitorowanie różnych mutantów mejotycznych w celu pokazania, w jaki sposób mutacja zakłóca procesy mejotyczne. Jednak wiele białek funkcjonuje w wielu punktach mejozy. Użycie mutantów utraconych funkcji lub mejotycznych mutantów zerowych może zatem zakłócić wczesny proces, blokując lub zakłócając późniejszy proces i utrudniając określenie fenotypów związanych z każdą pojedynczą rolą. Aby obejść to wyzwanie, protokół ten opisuje, w jaki sposób białka mogą być warunkowo wyczerpane z jądra na określonych etapach mejozy, jednocześnie monitorując zdarzenia mejotyczne za pomocą mikroskopii poklatkowej. W szczególności protokół ten opisuje, w jaki sposób komórki są synchronizowane w profazie I, w jaki sposób technika kotwiczenia jest wykorzystywana do zubożenia białek z jądra na określonych etapach mejotycznych oraz jak obrazowanie poklatkowe jest wykorzystywane do monitorowania segregacji chromosomów mejotycznych. Jako przykład użyteczności tej techniki, białko kinetochoru Ctf19 zostało zubożone z jądra w różnych punktach czasowych podczas mejozy, a liczbę mas chromatyny analizowano pod koniec mejozy II. Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten można dostosować do zubożenia różnych białek jądrowych z jądra przy jednoczesnym monitorowaniu podziałów mejotycznych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Poklatkowa mikroskopia fluorescencyjna jest cennym narzędziem do badania dynamiki segregacji chromosomów mejotycznych u pączkujących drożdży1,2. Pączkujące komórki drożdży mogą zostać nakłonione do poddania się mejozie poprzez głód kluczowych składników odżywczych3. Podczas mejozy komórki przechodzą jedną rundę segregacji chromosomów, po której następują dwa podziały, aby utworzyć cztery produkty mejotyczne, które są pakowane w zarodniki (Rysunek 1). Poszczególne komórki mogą być wizualizowane na każdym etapie mejozy, co generuje dane przestrzenne i czasowe, które można łatwo przeoczyć za pomocą obrazowania komórek stałych. Protokół ten pokazuje, w jaki sposób połączenie poklatkowej mikroskopii fluorescencyjnej z dwiema wcześniej ustalonymi metodami, indukowalnym systemem NDT80 (NDT80-in) i techniką zakotwiczenia, może być wykorzystane do badania funkcji określonych białek w różnych stadiach mejotycznych.

System NDT80-in to potężne narzędzie do synchronizacji mejotycznego cyklu komórkowego, które opiera się na indukowalnej ekspresji środkowego czynnika transkrypcyjnego mejozy NDT804,5. Wyrażenie NDT80 jest wymagane dla prophase I exit6,7. Dzięki systemowi NDT80-in, NDT80 jest pod kontrolą promotora GAL1-10 w komórkach eksprymujących czynnik transkrypcyjny Gal4 połączony z receptorem estrogenowym (Gal4-ER)4,5. Ponieważ Gal4-ER dostaje się do jądra tylko wtedy, gdy jest związany z β-estradiolem, komórki NDT80-in zatrzymują się w profazie I pod nieobecność β-estradiolu, co umożliwia synchronizację komórek w profazie I (Figura 1). Dodatek β-estradiolu sprzyja translokacji czynnika transkrypcyjnego Gal4-ER do jądra, gdzie wiąże GAL1-10, aby napędzać ekspresję NDT80, prowadząc do synchronicznego wejścia do podziałów mejotycznych. Chociaż mikroskopia poklatkowa może być wykonywana bez synchronizacji, zaletą korzystania z synchronizacji jest możliwość dodania inhibitora lub leku, gdy komórki znajdują się na określonym etapie mejozy.

Technika kotwiczenia to indukowalny system, dzięki któremu białko może zostać usunięte z jądra przez dodanie rapamycyny8. Technika ta jest idealna do badania białek jądrowych podczas podziału komórek w pączkujących drożdżach, ponieważ komórki drożdży przechodzą zamkniętą mitozę i mejozę, w której otoczka jądrowa nie ulega rozpadowi. Co więcej, technika ta jest bardzo przydatna w przypadku białek, które pełnią wiele funkcji podczas mejozy. W przeciwieństwie do delecji, zmutowanych alleli lub mejotycznych alleli zerowych, usunięcie białka docelowego z jądra na określonym etapie nie wpływa negatywnie na aktywność białka docelowego na wcześniejszych etapach, co pozwala na dokładniejszą interpretację wyników. System zakotwiczenia wykorzystuje przenoszenie podjednostek rybosomalnych między jądrem a cytoplazmą, które następuje podczas dojrzewania rybosomów8. Aby zubożyć białko docelowe z jądra, białko docelowe jest znakowane domeną wiążącą FKBP12-rapamycynę (FRB) w szczepie, w którym podjednostka rybosomalna Rpl13A jest znakowana FKBP12. Bez rapamycyny FRB i FKBP12 nie wchodzą w interakcje, a białko znakowane FRB pozostaje w jądrze. Po dodaniu rapamycyny, rapamycyna tworzy stabilny kompleks z FKBP12 i FRB, a kompleks jest transportowany z jądra w wyniku interakcji z Rpl13A (Ryc. 1). Aby zapobiec śmierci komórki po dodaniu rapamycyny, komórki są nosicielami mutacji tor1-1 genu TOR1. Dodatkowo komórki te zawierają fpr1Δ, allel zerowy białka S. cerevisiae FKBP12, który zapobiega endogennemu Fpr1 konkurowaniu z Rpl13A-FKBP12 dla wiązania FRB i rapamycyny. Mutacje tła zakotwiczenia, tor1-1 i fpr1Δ, nie wpływają na czasy mejotyczne ani segregację chromosomów2.

Aby zademonstrować użyteczność tej techniki, białko kinetochorowe Ctf19 było wyczerpywane w różnych punktach czasowych podczas mejozy. Ctf19 jest składnikiem kinetochoru, który jest zbędny w mitozie, ale wymagany do prawidłowej segregacji chromosomów w mejozie9,10,11,12,13. W mejozie kinetochor jest zrzucany w profazie I, a Ctf19 jest ważny dla ponownego złożenia kinetochoru9,14. W tym protokole zsynchronizowano komórki z systemem NDT80-in, a technikę zakotwiczenia zastosowano w celu wyczerpania docelowego białka Ctf19 z jądra przed i po uwolnieniu z profazy I oraz po segregacji chromosomów mejozy I (Figura 1). Protokół ten można dostosować do zubożenia innych interesujących białek na dowolnym etapie mejozy i mitozy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie niezbędnych materiałów

  1. Przygotować odczynniki do wzrostu i zarodnikowania komórek drożdży.
    UWAGA: Jeśli pączkujące szczepy drożdży są ade2- i trp1-, uzupełnij wszystkie pożywki w krokach 1.1.1-1.1.3 końcowym stężeniem 0,01% adeniny i 0,01% tryptofanu z 1% zapasów. W przypadku sterylizacji mediów w autoklawie, dodaj te aminokwasy dopiero po autoklawowaniu odczynników i pozostawieniu ich do ostygnięcia do temperatury pokojowej.
    1. Do wzrostu wegetatywnego przygotuj 2x syntetyczne kompletne + dekstroza pożywka (2XSC), rozpuszczając 6,7 g drożdżowej zasady azotowej bez aminokwasów, 2 g kompletnej mieszanki aminokwasów i 20 g dekstrozy w 500 ml wody. Mieszaninę sterylizować w autoklawie przez 20 minut w temperaturze 121 °C lub filtrować przez filtr 0,2 μm.
    2. Do pierwszego etapu zarodnikowania przygotuj 2x syntetyczne kompletne + octanowe podłoże (2XSCA), rozpuszczając 6,7 g drożdżowej zasady azotowej bez aminokwasów, 2 g kompletnej mieszanki aminokwasów i 20 g octanu potasu w 500 ml wody. Mieszaninę sterylizować w autoklawie przez 20 minut w temperaturze 121 °C lub filtrować przez filtr 0,2 μm.
    3. Do ostatniego etapu zarodnikowania należy przygotować 1% octan potasu (1% KAc), rozpuszczając 5 g KAc w 500 ml wody. Mieszaninę sterylizować w autoklawie przez 20 minut w temperaturze 121 °C lub filtrować przez filtr 0,2 μm.
  2. Przygotuj leki i odczynniki do mikroskopii, synchronizacji i zakotwiczenia.
    1. W celu przylegania komórek do szkiełka nakrywkowego podczas obrazowania poklatkowego, należy wykonać 1 mg/ml konkanawaliny A (ConA) w 1x PBS. Filtruj sterylizuj za pomocą filtra 0,2 μm i przechowuj małe (~10 μL) podwielokrotności w temperaturze -20 °C.
    2. Aby użyć systemu NDT80-in, należy przygotować 2 ml 1 mM β-estradiolu rozpuszczonego w etanolu. Filtruj sterylizuj za pomocą filtra 0,2 μm i przechowuj porcje (~500 μL) w temperaturze -20 °C.
    3. W przypadku systemu kotwiczenia należy przygotować 1 mg/ml rapamycyny rozpuszczonej w DMSO. Filtr sterylizować za pomocą filtra 0,2 μm i przechowywać małe (~10 μL) porcje w temperaturze -20 °C.
      UWAGA: Przygotuj małe porcje rapamycyny, aby uniknąć wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania leku.
  3. Wytwarzanie szczepów drożdży zawierających układ NDT80-in (PGAL1,10-NDT80/PGAL1,10-NDT80; GAL4-ER/ GAL4-ER) i docelowe białko znakowane FRB w tle genetycznym zakotwiczonym (tor1-1/tor1-1; fpr1Δ/ fpr1Δ; Rpl13A-FKBP12/Rpl13A-FKBP12)4,8. W tym badaniu wykorzystano Ctf19-FRB. Dodatkowo jedna kopia białka histonowego Htb2 została oznaczona mCherry, aby umożliwić monitorowanie progresji mejotycznej i segregacji chromatyny.
  4. Przygotowanie komory do obrazowania poklatkowego
    1. Rozpocznij przygotowanie komory 6 h-24 h przed obrazowaniem (Rysunek 2). Wytnij komorę o wymiarach 18 mm x 18 mm z wkładu pudełka z końcówkami do pipet za pomocą rozgrzanego skalpela lub innego ostrego ostrza.
    2. Użyj plastikowej końcówki pipety, aby rozprowadzić cienką warstwę szczeliwa silikonowego wokół dolnych krawędzi komory, która będzie przylegać do szkiełka nakrywkowego. Dodaj tyle szczeliwa, aby krawędzie komory były całkowicie pokryte (patrz Rysunek 2).
    3. Przyklej komorę do szkiełka nakrywkowego o wymiarach 24 mm x 50 mm, delikatnie umieszczając komorę stroną uszczelniającą do dołu na szkiełku nakrywkowym. Upewnij się, że w szczeliwie nie ma szczelin, aby komora nie przeciekała.
    4. Rozprowadzić 8-10 μl ConA na szkiełku nakrywkowym. Dozuj ConA na środek szkiełka nakrywkowego i za pomocą końcówki pipety rozprowadź ConA na cienką warstwę, tak aby pokryła większość szkiełka nakrywkowego, które jest otoczone komorą.
      UWAGA: Komory plastikowe mogą być używane ponownie w nieskończoność. Po zakończeniu obrazowania poklatkowego wyjmij komorę z szkiełka nakrywkowego za pomocą maszynki do golenia, wyczyść uszczelniacz silikonowy z komory i utrzymuj komory zanurzone w 95% etanolu do wykorzystania w przyszłości.

2. Zarodnikowanie komórek drożdży

  1. Wykonaj następujące kroki, aby zagłodzić komórki drożdży, aby indukować program mejotyczny.
    UWAGA: Te etapy dotyczą zarodnikowania szczepu drożdży W303. Inne szczepy mogą wymagać różnych protokołów15. Wydajność zarodnikowania jest bardzo zmienna między szczepami laboratoryjnymi, przy czym W303 wykazuje wydajność zarodnikowania na poziomie ~60%16,17,18.
    1. Pobrać pojedynczą kolonię odpowiedniego diploidalnego szczepu drożdży z płytki i zaszczepić 2 ml 2XSC i pozostawić do wzrostu w temperaturze 30 °C na bębnie rolkowym przez 12-24 godziny do nasycenia.
    2. Rozcieńczyć nasyconą kulturę do 2XSCA, dodając 80 μl kultury z etapu 2.1.1 do 2 ml 2XSCA. Pozwól mu rosnąć w temperaturze 30 °C na bębnie rolkowym przez 12-16 godzin. Nie pozostawiaj w 2XSCA na dłużej niż 16 godzin, ponieważ komórki mogą zachorować lub ulegnąć autofluorescencji.
    3. Wykonaj dwa płukania, wirując kulturę przy 800 x g w temperaturze pokojowej (25 °C) przez 1 minutę, wyrzucając płyn i ponownie zawieszając osad w 2 ml sterylnej wody destylowanej.
    4. Po drugim przemyciu usunąć płyn i ponownie zawiesić granulat w 2 ml 1% KAc i pozostawić do wzrostu w temperaturze 25 °C na bębnie rolkowym przez 8-12 godzin. Komórki, które weszły w mejozę, zostaną zatrzymane w pachytenie profazy I.
  2. System zwalniania Prophase I
    1. Dodać β-estradiol bezpośrednio do kultury zarodnikowej do końcowego stężenia 1 μM i szybko wymieszać probówkę hodowlaną. β-estradiol uwolni komórki z profazy I.

3. Zubożenie docelowego białka z jądra za pomocą techniki kotwiczenia

  1. Dodaj rapamycynę do komórek, aby na określonym etapie usunąć białko znakowane FRB z jądra.
    1. Aby zubożyć białka z jądra przy wyjściu profazy I, należy dodać rapamycynę do końcowego stężenia 1 μg/ml do probówki hodowli zarodników w tym samym czasie, co dodawanie β-estradiolu.
    2. Aby usunąć białka z jądra na określonym etapie mejozy, należy monitorować etap cyklu komórkowego, począwszy od 60 minut po dodaniu β-estradiolu. Co 20 minut odpipetować 5 μl kultury na szkiełko nakrywkowe o wymiarach 24 mm x 40 mm i przykryć komórki szkiełkiem nakrywkowym o wymiarach 18 mm x 18 mm. Utrzymuj kultury w ruchu wirującym na bębnie rolkowym w temperaturze 25 °C między punktami czasowymi.
    3. Zobrazuj komórki za pomocą filtra A594/mCherry i obiektywu 60x mikroskopu fluorescencyjnego. Ustaw procentową przepuszczalność na 2%, a czas ekspozycji na 250 ms. Obecność jednej, dwóch lub czterech mas DNA wskaże etap mejotyczny, na którym komórki się rozwinęły. Dodać rapamycynę do końcowego stężenia 1 μg/ml na interesującym nas etapie mejozy.
  2. Utrzymuj komórki wirujące na bębnie rolkowym w temperaturze 25 °C, aż będą gotowe do obrazowania. Wyczerpanie jądrowe białka docelowego następuje 30-45 minut po addycji rapamycyny2,8.

4. Poklatkowa mikroskopia fluorescencyjna

  1. Wykonaj podkładkę agarową, która zostanie użyta do stworzenia monowarstwy komórek do obrazowania (patrz krok 4.2).
    1. Odetnij i wyrzuć nakrętkę i dolną 1/3 probówki do mikrofugi o pojemności 1,5 ml, aby utworzyć cylinder. Cylinder posłuży jako forma do podkładki agarowej. Zrób dwa cylindry, aby mieć dodatkowy na wypadek, gdyby agar nie polimeryzował prawidłowo w pierwszym.
    2. Umieść wycięty cylinder rurki do mikrofuge na czystym szklanym szkiełku, tak aby górna część rurki była odwrócona do góry nogami na szkiełku.
    3. Przygotować 6 ml 5% roztworu agaru (użyć 1% KAc jako rozpuszczalnika) w zlewce o pojemności 50 ml i podgrzewać w kuchence mikrofalowej, aż agar całkowicie się rozpuści.
      UWAGA: Agar łatwo wykipi w kuchence mikrofalowej; Obserwuj agar i uruchamiaj i zatrzymuj kuchenkę mikrofalową, gdy agar zacznie wrzeć i obracać zlewką. Uruchom i zatrzymaj kuchenkę mikrofalową kilka razy, aby całkowicie rozpuścić agar. Roztwór agaru sporządza się w ilości przekraczającej ilość potrzebną do całkowitego rozpuszczenia agaru.
    4. Odetnij końcówkę pipety, aby zrobić większy otwór i odpipetuj ~500 μl stopionego agaru do każdego cylindra z rurką do mikrofuge. Pozostaw w temperaturze pokojowej, aż agar zastygnie (~10-12 min).
  2. Przygotowanie komórek drożdży do obrazowania
    1. Odwirować 200 μl kultury zarodnikowej z kroku 3.2 przy 800 x g przez 2 minuty w probówkach do mikrowirówek o pojemności 1 ml. Usunąć i wyrzucić 180 μl supernatantu. Zawiesić osad w pozostałym supernatancie, obracając i przesuwając probówkę.
    2. Odmierzyć pipetą 6 μl zagęszczonych komórek na szkiełko nakrywkowe w środku komory wykonanej w kroku 1.4.
    3. Chwyć cylinder z podkładką agarową wykonaną w kroku 4.1 i ostrożnie zsuń go ze szklanego szkiełka. Upewnij się, że agar jest całkowicie płaski na dole i używając dna końcówki pipety, lekko dociśnij formę do mikrofuge, tak aby podkładka agarowa została wypchnięta nieco powyżej granicy probówki.
    4. Odwróć formę tak, aby podkładka agarowa była skierowana w dół w kierunku komory.
    5. Za pomocą kleszczy delikatnie umieść wacik agarowy (nadal w formie do probówek do mikrofugów) na wierzchu komórek. Za pomocą końcówki pipety delikatnie przesuń wablocinę agarową po komorze 10-20 razy, aby utworzyć monowarstwę komórek na szkiełku nakrywkowym.
    6. Pozostaw wacik agarowy w komorze na 12-15 minut. Ten krok pozwoli komórkom przylgnąć do ConA na szkiełku nakrywkowym.
    7. Przenieść 2 ml kultury zarodnikowej z etapu 3.2 do dwóch probówek mikrowirówek i wirować z prędkością 15 700 x g przez 2 minuty. Przenieść supernatant do czystych probówek do mikrofermentacji i ponownie wirować z prędkością 15 700 x g przez 2 minuty. Przenieść supernatant do czystych probówek do mikrowirówek, które zostaną użyte w następnym kroku.
      UWAGA: Ważne jest, aby stosować wstępnie kondycjonowany supernatant KAc z β-estradiolem i rapamycyną, aby zapewnić skuteczne zarodnikowanie i ciągłe zubożenie białka będącego przedmiotem zainteresowania.
    8. Po umieszczeniu podkładki agarowej w komorze przez 12-15 minut, unieś się i wyjmij podkładkę agarową przed obrazowaniem. W tym celu dodać kroplami 2 ml supernatantu z kroku 4.2.7 do komory. Gdy ciecz dotrze do górnej części komory, podkładka agarowa najprawdopodobniej będzie unosić się na wodzie.
      UWAGA: Jeśli podkładka agarowa nie unosi się automatycznie, odczekaj 1-2 minuty. Jeśli podkładka agarowa nadal nie unosi się na wodzie, usuń ją delikatnie kleszczami. Idealnie byłoby, gdyby podkładka agarowa unosiła się sama, ponieważ usunięcie jej przed uniesieniem na wodzie może prowadzić do usunięcia komórek.
    9. Po wypłynięciu podkładki agarowej usuń ją delikatnie kleszczami i wyrzuć. Umieść szkiełko nakrywkowe o wymiarach 24 mm x 50 mm na górze komory, aby zapobiec parowaniu podczas obrazowania.
  3. Ustawianie filmu na mikroskopie
    UWAGA: Poniższe instrukcje dotyczą mikroskopu odwróconego wyposażonego w uchwyt na szkiełko, który mieści szkiełko nakrywkowe o wymiarach 24 mm x 50 mm (szczegółowe informacje można znaleźć w tabeli materiałów). Do akwizycji obrazu używany jest obiektyw z 60-krotnym zanurzeniem w olejku. Protokół ten może wymagać zmiany w przypadku korzystania z innych mikroskopów lub innych uchwytów na szkiełka. Dokładne kroki wykonywania kroków od 4.3.2 do 4.3.16 będą się różnić w zależności od używanego mikroskopu i oprogramowania do obrazowania. Patrz punkt 4.4 w celu uzyskania instrukcji dotyczących innego mikroskopu.
    1. Zamontuj szkiełko nakrywkowe w uchwycie szkiełka. Przyklej glinę formierską do boku szkiełka nakrywkowego, aby utrzymać ją bezpiecznie w uchwycie szkiełka.
    2. Otwórz oprogramowanie do akwizycji obrazów. Użyj pokręteł kursu i precyzyjnej regulacji, aby ustawić ostrość komórek za pomocą DIC lub jasnego pola.
    3. W menu głównym oprogramowania do akwizycji obrazów kliknij Plik > Pobierz (Rozwiąż 3D). Pojawią się trzy okna.
    4. W oknie o nazwie Resolve 3D kliknij ikonę kolby Erlenmeyera. Spowoduje to otwarcie okna zatytułowanego Projektowanie/uruchamianie eksperymentu, które zawiera elementy sterujące służące do konfigurowania eksperymentu w celu skonfigurowania filmu poklatkowego.
    5. Na karcie Projektowanie przejdź do karty z etykietą Sekcje. Zaznacz pole obok opcji Przekrój Z. Ustaw stosy z w następujący sposób: Rozstaw sekcji optycznych = 1 μm, Liczba sekcji optycznych = 5, Grubość próbki = 5,0 μm.
    6. Na karcie Kanały kliknij ikonę +, aby pojawiła się opcja jednego kanału. Wybierz odpowiedni kanał. Do tego eksperymentu wybieramy A594, który jest używany do obrazowania mCherry. Zaznacz pole obok opcji Obraz referencyjny i ustaw pozycję Z na środku próbki z menu rozwijanego.
    7. Wybierz wartość z menu rozwijanego obok %T i Exp., aby ustawić odpowiednio procentową transmitancję i czas ekspozycji. W tym eksperymencie 2% transmitancji i czasu ekspozycji 250 ms są używane w kanale A594, a 10% transmitancji i czasu ekspozycji 500 ms są używane dla jasnego pola.
      UWAGA: Czas ekspozycji i procentowa przepuszczalność będą się różnić w zależności od mikroskopu. Aby uniknąć nadmiernej ekspozycji, należy stosować najniższą procentową przepuszczalność i najkrótszy możliwy czas ekspozycji, który pozwala na prawidłową wizualizację białka będącego przedmiotem zainteresowania.
    8. Na karcie Upływ czasu zaznacz pole obok opcji Upływ czasu. W wyświetlonej tabeli wprowadź wartość 10 pod kolumną min w wierszu poklatkowym i 10 w kolumnie godzin w wierszu czasu całkowitego. Spowoduje to uruchomienie kursu czasowego wykonującego zdjęcia co 10 minut przez 10 godzin.
    9. Zaznacz pole wyboru Utrzymuj ostrość przy ostatecznym ustawieniu ostrości, aby zapobiec przesuwaniu się sceny podczas filmu. Na karcie Punkty zaznacz pole obok opcji Lista punktów odwiedzin.
    10. W menu głównym kliknij Wyświetl > Listę punktów. Pojawi się okno o nazwie lista punktów. Przenieś stolik do obszaru komory, w którym znajduje się monowarstwa komórek. Kliknij Znacznik punktu w oknie listy punktów.
    11. Przesuń stół montażowy, aby zaznaczyć 25–30 punktów bez nakładania się, aby uniknąć prześwietlenia komórek. Każde pole będzie obrazowane podczas każdego kursu czasowego.
    12. W oknie listy punktów wybierz opcję Kalibruj wszystko, aby ustawić najwyższą ostrość dla każdego punktu. Na karcie Projektowanie w oknie Projekt/Uruchom eksperyment wprowadź zakres wartości punktów (uzyskanych z okna listy punktów) w polu obok opcji Odwiedź listę punktów. Na karcie Uruchom zapisz plik w odpowiednim miejscu docelowym na komputerze. W oknie Projektowanie/uruchamianie eksperymentu wybierz przycisk Odtwórz (ikona zielonego trójkąta), aby uruchomić film.
  4. Opcjonalna metoda: Ustawianie filmu pod mikroskopem
    UWAGA: Niniejsza instrukcja dotyczy mikroskopu odwróconego wyposażonego w uchwyt na szkiełko, który może pomieścić szkiełko nakrywkowe o wymiarach 24 mm x 50 mm. Patrz Spis materiałów, aby zapoznać się ze specyfikacjami używanego mikroskopu, kamery i oprogramowania do obrazowania. Do akwizycji obrazu używany jest obiektyw z 60-krotnym zanurzeniem w olejku.
    1. Zamontuj szkiełko nakrywkowe w uchwycie szkiełka. Otwórz oprogramowanie do akwizycji obrazów. Użyj pokręteł kursu i precyzyjnej regulacji, aby ustawić ostrość komórek za pomocą DIC lub jasnego pola. Kliknij prawym przyciskiem myszy w otwartym oknie oprogramowania. Pojawi się menu rozwijane.
    2. Kliknij Kontrola pozyskiwania > Pozyskiwanie. Kliknij pozycję Aplikacja> Zdefiniuj/Uruchom eksperyment. Spowoduje to otwarcie okna oznaczonego Pozyskiwanie ND.
    3. W oknie, które zostanie otwarte, zaznacz pole obok XY. Przenieś stół montażowy do żądanej lokalizacji i kliknij pole wyboru w obszarze Nazwa punktu, aby wybrać to położenie jako punkt. Powtarzaj to, aż zostanie wybranych 25-30 punktów bez nakładania się, aby uniknąć prześwietlenia komórek. Każde pole będzie obrazowane podczas każdego kursu czasowego.
    4. Ustaw procentową przepuszczalność dla każdego kanału fluorescencyjnego. Ponieważ szczepy wytwarzają Htb2-mCherry, stosuje się tutaj filtr mCherry. W oknie Akwizycja, które zostało otwarte w kroku 4.3.3, przejdź do przycisku 555 nm. Ustaw procentową przepuszczalność na 5%, regulując skalę przesuwania pod przyciskiem 555 nm, aż wskaże 5%.
    5. Ustaw czas ekspozycji dla każdego kanału fluorescencyjnego. W oknie Pozyskiwanie wybierz 200 ms z menu rozwijanego Ekspozycja.
      UWAGA: Czas ekspozycji i procentowa przepuszczalność będą się różnić w zależności od mikroskopu. Aby uniknąć nadmiernej ekspozycji, należy stosować najniższą procentową przepuszczalność i najkrótszy możliwy czas ekspozycji, który pozwala na prawidłową wizualizację białka będącego przedmiotem zainteresowania.
    6. Kliknij pole obok Z w oknie Akwizycja ND. Ustaw pięć stosów z komórek drożdży, które są oddalone od siebie o 1,2 μM.
    7. Kliknij pole obok λ. Wybierz odpowiednie kanały, które mają być używane w eksperymencie. W przypadku DIC upewnij się, że z menu rozwijanego w obszarze Z pos. wybrano opcję Strona główna. W przypadku mCherry upewnij się, że z menu rozwijanego w obszarze Z pos. Wybrano opcję Wszystkie. Gwarantuje to, że tylko jedna sekcja (w środku stosu z) jest pobierana dla DIC.
    8. Zaznacz pole obok opcji Czas w oknie Pobieranie ND. Zaznacz pole w obszarze Faza. Z menu rozwijanego w obszarze Interwał wybierz 10 min. W obszarze Czas trwania wybierz 10 godzin. Będzie to przebiegać w czasie tak, że zdjęcia będą wykonywane co 10 minut przez 10 godzin.

5. Analiza segregacji chromatyny

  1. Otwórz oprogramowanie Fiji. Otwórz jedno pole widzenia na raz: dla każdego pola otwórz kanały DIC i mCherry.
  2. Weź projekcję maksymalnej intensywności kanału mCherry, aby uzyskać pojedynczy obraz: kliknij Image > Stacks > Z Project, wybierz Max Intensity z menu rozwijanego.
  3. Połącz kanały DIC i mCherry na jednym obrazie: kliknij Obraz > Kolor > Scal kanały.
  4. Podążaj za pojedynczą komórką przez mejozę. Po zakończeniu mejozy II zapisz liczbę mas DNA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby monitorować segregację chromatyny, białko histonowe Htb2 zostało oznaczone mCherry. W profazie I chromatyna występuje jako pojedyncza masa Htb2. Po tym, jak chromosomy homologiczne zsegregują się w pierwszym podziale mejotycznym, chromatyna pojawia się jako dwie odrębne masy (Rysunek 3A). Po segregacji chromatyd siostrzanych chromatyna pojawia się jako cztery masy. Jeśli niektóre chromosomy nie przyłączają się do mikrotubul wrzeciona, po mejozie I lub mejozie II można zobaczyć dodatkowe masy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten łączy w sobie system NDT80-in do synchronizacji komórek, technikę kotwiczenia do zubożenia białek z jądra oraz fluorescencyjną mikroskopię poklatkową do obrazowania pączkujących komórek drożdży podczas mejozy. System NDT80-in to metoda synchronizacji mejotycznego cyklu komórkowego, która wykorzystuje zatrzymanie i uwolnienie profazy I 4,8. Chociaż poszczególne komórki będą się nieznacznie różnić pod względem ilości czasu spędzonego ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Centrum Obrazowania Mikroskopii Świetlnej na Uniwersytecie Indiana. Prace te zostały wsparte grantem z National Institutes of Health (GM105755).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
β-estradiolMillipore SigmaE8875Zrób 1mM zapasy w 95% EtOH
0,22 uM Gwintowany filtr butelkowyMillipore SigmaS2GPT02RE
100% EtOHFisher Scientific22-032-601
10X PBSFisher Scientific BP399500Rozcieńczony w stosunku 1:10 do stosowania jako rozpuszczalnik do
ConA 24 mm x 50 mm szkiełko nakrywkowe nr 1,5VWR Północnoamerykańskie48393241
Szkiełka mikroskopowe 25 mm x 75 mmVWR North American48300-026
Sól półsiarczanu adeninyMillipore SigmaA9126Do uzupełnienia SC, SCA i 1% Kac
Bacto AgarBD214030
Concanavialin AMllipore SigmaC2010Zrób jako 1 mg / ml w 1X
kamerze CCD PBS CoolSNAP HQ2Fotometriastosowana w sekcji 4.3
D-glukozaFisher ScientificD16-10
Difco Drożdże Azot Zasada bez aminokwasówBD291920
Dimetylosulfotlenek (DMSO)Milipore SigmaD5879
Eclipse Ti2 Mikroskop z odwróconym obiektywemNikonUżywany w sekcji 4.4
FidżiNIHPobierz z https://fiji.sc/
GE Osobisty mikroskop DeltaVisionStosowana precyzjastosowana w sekcji 4.3
L-tryptofan Millipore SigmaT0254Do suplementu SC, SCA i 1% Kac
Modeling ClayCrayola  2302880000Aby zabezpieczyć szkiełko nakrywkowe w uchwycie na szkiełko
NIS Elements AR 5.30.04 Oprogramowanie do obrazowaniaNikonużywane w sekcji 4.4
ORCA-Fustion BT CameraHamamatsuC15440-20UPUżywane w sekcji 4.4
Plastikowy uchwyt końcówki do pipetDot ScientificLTS1000-HRWytnij przekrój 4 kwadraty x 4 kwadraty części stojaka tego produktu. 
Octan potasuFisher ScientificBP264
RapamycinFisher ScientificBP29631Wytwarzaj zapasy 1 mg / ml w
uszczelniaczu silikonowymAqueon100165001Znany również jako klej akwariowy.
SoftWorx7.0.0  Oprogramowanie do obrazowaniaStosowana precyzjazastosowana w sekcji 4.3
Syntetyczna kompletna mieszanina (Kaiser) Olejek
Type N NikonMXA22166
firmy DMSO immersyjny Formedium DSCK2500

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tsuchiya, D., Gonzalez, C., Lacefield, S. The spindle checkpoint protein Mad2 regulates APC/C activity during prometaphase and metaphase of meiosis I in Saccharomyces cerevisiae. Molecular Biology of the Cell. 22 (16), 2848-2861 (2011).
  2. Cairo, G., MacKenzie, A. M., Lacefield, S. Differential requirement for Bub1 and Bub3 in regulation of meiotic versus mitotic chromosome segregation. Journal of Cell Biology. 219 (4), 201909136(2020).
  3. van Werven, F. J., Amon, A. Regulation of entry into gametogenesis. Philosophical Transactions of the Royal Society London B: Biological Sciences. 366 (1584), 3521-3531 (2011).
  4. Carlile, T. M., Amon, A. Meiosis I is established through division-specific translational control of a cyclin. Cell. 133 (2), 280-291 (2008).
  5. Benjamin, K. R., Zhang, C., Shokat, K. M., Herskowitz, I. Control of landmark events in meiosis by the CDK Cdc28 and the meiosis-specific kinase Ime2. Genes and Development. 17 (12), 1524-1539 (2003).
  6. Xu, L., Ajimura, M., Padmore, R., Klein, C., Kleckner, N. NDT80, a meiosis-specific gene required for exit from pachytene in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 15 (12), 6572-6581 (1995).
  7. Chu, S., Herskowitz, I. Gametogenesis in yeast is regulated by a transcriptional cascade dependent on Ndt80. Molecular Cell. 1 (5), 685-696 (1998).
  8. Haruki, H., Nishikawa, J., Laemmli, U. K. The anchor-away technique: rapid, conditional establishment of yeast mutant phenotypes. Molecular Cell. 31 (6), 925-932 (2008).
  9. Borek, W. E., et al. The proteomic landscape of centromeric chromatin reveals an essential role for the Ctf19(CCAN) complex in meiotic kinetochore assembly. Current Biology. 31 (2), 283-296 (2021).
  10. Mehta, G. D., Agarwal, M., Ghosh, S. K. Functional characterization of kinetochore protein, Ctf19 in meiosis I: an implication of differential impact of Ctf19 on the assembly of mitotic and meiotic kinetochores in Saccharomyces cerevisiae. Molecular Microbiology. 91 (6), 1179-1199 (2014).
  11. Ortiz, J., Stemmann, O., Rank, S., Lechner, J. A putative protein complex consisting of Ctf19, Mcm21, and Okp1 represents a missing link in the budding yeast kinetochore. Genes and Development. 13 (9), 1140-1155 (1999).
  12. Hyland, K. M., Kingsbury, J., Koshland, D., Hieter, P. Ctf19p: A novel kinetochore protein in Saccharomyces cerevisiae and a potential link between the kinetochore and mitotic spindle. Journal of Cell Biology. 145 (1), 15-28 (1999).
  13. Fernius, J., Marston, A. L. Establishment of cohesion at the pericentromere by the Ctf19 kinetochore subcomplex and the replication fork-associated factor, Csm3. PLoS Genetics. 5 (9), 1000629(2009).
  14. Meyer, R. E., et al. Ipl1/Aurora-B is necessary for kinetochore restructuring in meiosis I in Saccharomyces cerevisiae. Molecular Biology of the Cell. 26 (17), 2986-3000 (2015).
  15. Elrod, S. L., Chen, S. M., Schwartz, K., Shuster, E. O. Optimizing sporulation conditions for different Saccharomyces cerevisiae strain backgrounds. Methods in Molecular Biology. 557, 21-26 (2009).
  16. Deutschbauer, A. M., Davis, R. W. Quantitative trait loci mapped to single-nucleotide resolution in yeast. Nature Genetics. 37 (12), 1333-1340 (2005).
  17. Ben-Ari, G., et al. Four linked genes participate in controlling sporulation efficiency in budding yeast. PLoS Genetics. 2 (11), 195(2006).
  18. Primig, M., et al. The core meiotic transcriptome in budding yeasts. Nature Genetics. 26 (4), 415-423 (2000).
  19. Spencer, F., Gerring, S. L., Connelly, C., Hieter, P. Mitotic chromosome transmission fidelity mutants in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 124 (2), 237-249 (1990).
  20. Weinhandl, K., Winkler, M., Glieder, A., Camattari, A. Carbon source dependent promoters in yeasts. Microbial Cell Factories. 13, 5(2014).
  21. Byers, B., Goetsch, L. Reversible pachytene arrest of Saccharomyces cerevisiae at elevated temperature. Molecular and General Genetics. 187 (1), 47-53 (1982).
  22. Winter, E. The Sum1/Ndt80 transcriptional switch and commitment to meiosis in Saccharomyces cerevisiae. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 76 (1), 1-15 (2012).
  23. Neiman, A. M. Sporulation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 189 (3), 737-765 (2011).
  24. Robinett, C., et al. C. al. In vivo localization of DNA sequences and visualization of large-scale chromatin organization using lac operator/repressor recognition. Journal of Cell Biology. 135, 1685-1700 (1996).
  25. Straight, A. F., Belmont, A. S., Robinett, C. C., Murray, A. W. GFP tagging of budding yeast chromosomes reveals that protein-protein interactions can mediate sister chromatid cohesion. Current Biology. 6 (12), 1599-1608 (1996).
  26. Sym, M., Engebrecht, J. A., Roeder, G. S. ZIP1 is a synaptonemal complex protein required for meiotic chromosome synapsis. Cell. 72 (3), 365-378 (1993).
  27. Scherthan, H., et al. Chromosome mobility during meiotic prophase in Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (43), 16934-16939 (2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Deplecja bia ek j drowychsegregacja chromosom w meiotycznychmejoza dro d y p czkuj cychtechnika Anchor Awaymikroskopia fluorescencyjnaanaliza masy chromatynysynchronizacja cyklu kom rkowegobia ko kinetochorowe Ctf19lokalizacja bia ek

Powiązane artykuły