Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Linia do charakteryzowania strukturalnych wad serca u płodu myszy

2.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64582

⸱

16 grudnia 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Developmental Biology, University of Pittsburgh, 2Department of Biological Sciences, University of Pittsburgh, 3Département de Biologie, École Normale Supérieure de Lyon, 4Department of Critical Care Medicine, University of Pittsburgh

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł szczegółowo opisuje metody diagnostyki mysiej wrodzonej wady serca (CHD) za pomocą echokardiografii płodu, sekcji zwłok i episkopowego przechwytywania obrazu fluorescencyjnego (EFIC) za pomocą episkopowej mikroskopii konfokalnej (ECM), a następnie trójwymiarowej (3D) rekonstrukcji.

Streszczenie

Wrodzone choroby serca (CHD) są głównymi przyczynami zgonów niemowląt w Stanach Zjednoczonych. W latach osiemdziesiątych XX wieku i wcześniej większość pacjentów z umiarkowaną lub ciężką chorobą niedokrwienną serca umierała przed osiągnięciem dorosłości, przy maksymalnej śmiertelności w pierwszym tygodniu życia. Niezwykły postęp w technikach chirurgicznych, podejściach diagnostycznych i postępowaniu medycznym doprowadził do znacznej poprawy wyników. Aby sprostać krytycznym potrzebom badawczym w zakresie zrozumienia wrodzonych wad serca, modele mysie stanowią idealną platformę badawczą, ponieważ mają bardzo podobną anatomię serca do ludzi i krótki wskaźnik ciąży. Połączenie inżynierii genetycznej z wysokowydajnymi narzędziami do fenotypowania pozwoliło na replikację i diagnostykę strukturalnych wad serca w celu dalszego wyjaśnienia szlaków molekularnych stojących za chorobą wieńcową. Zastosowanie nieinwazyjnej echokardiografii płodu do badań przesiewowych fenotypów serca w modelach mysich w połączeniu z wysoką wiernością episkopowego przechwytywania obrazu fluorescencyjnego (EFIC) przy użyciu histopatologii episkopowej mikroskopii konfokalnej (ECM) z trójwymiarowymi rekonstrukcjami (3D) umożliwia szczegółowy wgląd w anatomię różnych wrodzonych wad serca. Protokół ten przedstawia kompletny przebieg pracy tych metod w celu uzyskania dokładnej diagnozy mysich wrodzonych wad serca. Zastosowanie tego protokołu fenotypowania do organizmów modelowych pozwoli na dokładną diagnozę choroby niedokrwiennej serca, dostarczając informacji na temat mechanizmów choroby wieńcowej. Identyfikacja mechanizmów leżących u podstaw choroby niedokrwiennej serca stwarza możliwości potencjalnych terapii i interwencji.

Wprowadzenie

Wrodzone choroby serca (CHD) są najczęstszą wadą wrodzoną noworodków1,2, dotykające około 0,8%-1,7% noworodków i powodujące znaczną śmiertelność i zachorowalność noworodków3. Etiologia genetyczna jest silnie wskazywana w przypadku CHDs4,5. Genetycznie zmodyfikowane modele myszy były szeroko stosowane w celu zrozumienia złożoności choroby wieńcowej i mechanizmów, które je powodują, ponieważ myszy mają czterokomorowe serca i porównywalne sekwencje DNA rozwoju serca u płodów myszy i ludzi6. Identyfikacja fenotypu mutantów myszy jest podstawowym pierwszym krokiem w scharakteryzowaniu funkcji docelowego genu. Mysie modele wyrażające efekty dawkowania genów, w których pojedyncza mutacja genetyczna może powodować spektrum wad serca, które naśladują ludzkie choroby niedokrwienne serca, są ważne dla zrozumienia złożoności choroby wieńcowej i mechanizmów, które je powodują.

Ten artykuł przedstawia proces charakteryzowania fenotypów serca w modelach mysich. Zastosowane metody wykorzystują echokardiogram płodu7, a następnie sekcję zwłok i histopatologię ECM7,8, które mogą wyświetlać szczegółową anatomię rozwijających się fenotypów serca myszy. Echokardiogram płodu jest nieinwazyjną metodą, która umożliwia bezpośrednią wizualizację wielu zarodków z rozsądną rozdzielczością obrazowania. Ponadto echokardiogram płodu umożliwia szybkie określenie całkowitej liczby zarodków w miocie, ich etapów rozwoju oraz względnej orientacji i lokalizacji w rogu macicy. Za pomocą spektralnego przepływu Dopplera/koloru można zidentyfikować nieprawidłowe zarodki na podstawie struktury, zaburzenia hemodynamicznego, ograniczenia wzrostu lub rozwoju wodniaka. Ponieważ badanie echokardiogramu płodu jest techniką nieinwazyjną, może być używane do skanowania przez wiele dni i obserwowania zmian w hemodynamice lub morfologii serca. Uzyskanie wysokiej jakości obrazowania echokardiogramu płodu wymaga praktyki i umiejętności, ponieważ określone wady serca mogą zostać pominięte z powodu braku doświadczenia i wiedzy. Z tego powodu bardziej szczegółową analizę morfologii serca można uzyskać poprzez połączenie sekcji zwłok i histopatologii ECM. Sekcja zwłok zapewnia bezpośrednią wizualizację struktury łuku, względnych relacji aorty i tętnicy płucnej, wielkości komór i przedsionków, położenia serca względem klatki piersiowej oraz struktur oskrzelowo-płucnych. Jednak cechy wewnętrzne, takie jak zastawki serca i grubość ścianki, mogą być trudne do oceny za pomocą samej sekcji zwłok. W związku z tym histopatologia ECM jest zalecana w celu uzyskania jednoznacznej diagnozy. Histopatologia ECM to technika wizualizacji o wysokiej rozdzielczości, która pozwala na rekonstrukcję obrazu zarówno 2D, jak i 3D stosu9. Obrazy te uzyskuje się poprzez seryjne episkopowe obrazowanie fluorescencyjne próbki zanurzonej w parafinie, która jest cienko cięta w stałych odstępach czasu przez automatyczny mikrotom. W przeciwieństwie do klasycznej histologii, obrazy są rejestrowane jako przekrój przed wycięciem z bloku, tak aby wszystkie obrazy były rejestrowane w tym samym układzie odniesienia. Z tego powodu stos obrazów 2D wytworzony za pomocą histopatologii ECM może być łatwo i niezawodnie zrekonstruowany w trzech wymiarach. Odbywa się to za pomocą przeglądarki DICOM, która umożliwia wizualizację 3D obrazów w trzech płaszczyznach anatomicznych: czołowej, strzałkowej i poprzecznej. Na podstawie tych rekonstrukcji 3D w wysokiej rozdzielczości można postawić ostateczną diagnozę kardiologiczną. Zastosowanie tych trzech różnych modalności wizualizacji, zarówno indywidualnie, jak i w połączeniu, może zapewnić dokładną charakterystykę strukturalnych wad serca w zarodkach myszy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Użycie myszy do tych badań jest konieczne, ponieważ myszy mają czterokomorowe serca, które mogą naśladować ludzkie choroby wieńcowe. Myszom zapewniono opiekę weterynaryjną i umieszczono w akredytowanym przez instytucję Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC)-akredytowanym ośrodku opieki nad zwierzętami. Przestrzegano ścisłych protokołów, aby zminimalizować dyskomfort, stres, ból i obrażenia myszy. Myszy zostały poddane eutanazji przy użyciu gazu CO2, który jest dopuszczalny dla małych gryzoni zgodnie z wytycznymi Amerykańskiego Towarzystwa Lekarzy Weterynaryjnych dotyczącymi eutanazji. Badania na myszach w tym manuskrypcie zostały przeprowadzone przy użyciu zatwierdzonego protokołu IACUC na Uniwersytecie w Pittsburghu.

1. Echokardiogram płodu

UWAGA: Echokardiogram jest potężnym narzędziem do identyfikacji wad rozwojowych układu krążenia i wad pozasercowych u myszy. Ze względu na mały rozmiar zarodków myszy (około 1-2 mm w połowie ciąży, 3,5 mm po urodzeniu) wymagany jest sprzęt echokardiograficzny ultrawysokiej częstotliwości z biomikroskopią ultradźwiękową (UBM). UBM dostarcza różne sondy o wysokiej częstotliwości (30-50 MHz) z małym okienkiem obrazowania (15 mm x 14 mm), które zapewnia rozdzielczość (30 μm osiowe x 68 μm boczne) do wizualizacji jednego płodu myszy na raz. Przetwornik o częstotliwości 40 MHz zapewnia obrazy o wysokiej rozdzielczości w celu identyfikacji fenotypów sercowo-naczyniowych7.

  1. Włączyć echokardiogram i wybrać program Cardiology.
    UWAGA: Poniższy protokół może być stosowany dla dowolnego tła myszy od dnia embrionalnego (E) 14.5 do 19.5.
  2. Znieczulij żądaną mysz w anestezjologicznej komorze indukcyjnej. Wywołaj znieczulenie za pomocą stężenia 4% izofluranu i tlenu medycznego o natężeniu przepływu 1 l/min i zmniejsz je do 2%-3% w celu konserwacji.
  3. Szybko umieść mysz na platformie obrazowania. Platforma obrazowania ma podgrzewaną stal, która utrzymuje mysz w cieple podczas zabiegu. Włóż usta i nos myszy do znieczulającego stożka nosowego. Zabezpiecz kończyny taśmą, aby uniknąć ruchu. Monitoruj tętno, aby upewnić się, że utrzymuje się w przedziale 400-450 uderzeń na minutę.
  4. Monitoruj temperaturę za pomocą sondy termometru doodbytniczego i upewnij się, że spoczywa na 37 °C ± 0,5 °C. Monitoruj oddech, aby uniknąć niedotlenienia. Utrzymuj delikatną siłę na sondzie, aby zapobiec uszkodzeniom.
    UWAGA: Nad myszą można ustawić lampę grzewczą, aby zapobiec hipotermii podczas znieczulenia i odzyskać siły po znieczuleniu. Maść okulistyczna Petrolatum może być stosowana jako lubrykant, aby uniknąć suchości oczu.
  5. Usuń sierść z klatki piersiowej i brzucha za pomocą kremu do depilacji. Nałóż krem i odczekaj 3 minuty przed usunięciem. Oczyść obszar 70% etanolem. Etanol działa lepiej niż woda jako smar do golenia.
  6. Rozgrzej żel do ultradźwięków do normalnej temperatury ciała. Nałóż obficie żel ultradźwiękowy i umieść głowicę na brzuchu, aby ustawić ją w płaszczyźnie poziomej i zidentyfikować pęcherz na ekranie. Po zidentyfikowaniu pęcherza przeskanuj czaszkę z pęcherza i poszukaj płodu. Zmierz długość od korony do zadu, aby określić wiek ciążowy10 (Rysunek 1 i Tabela 1).
    UWAGA: Zmień pozycje przetwornika, aby uwidocznić różne płaszczyzny, w tym poprzeczne czterokomorowe, strzałkowe i frontalne/koronalne płaszczyzny obrazowania7 (Rysunek 1).
  7. Użyj kolorowego Dopplera, aby przeanalizować przepływ krwi z serca.
  8. Umieść mysz z powrotem w klatce, jeśli zarodki nie osiągnęły zamierzonego etapu. W przeciwnym razie przygotuj mysz do zbioru.
    UWAGA: Upewnij się, że mysz jest już przytomna i dobrze dochodzi do siebie po znieczuleniu przed włożeniem jej z powrotem do klatki.
  9. Wyłącz izofluran i tlen, oczyść obszar roboczy i wyłącz maszynę.
    UWAGA: Ważne jest, aby usunąć żel z przetwornika.

2. Sekcja zwłok

UWAGA: Gdy podejrzewa się nieprawidłowe fenotypy serca za pomocą echokardiografii płodu, płody są zbierane i utrwalane poprzez zanurzenie całego ciała w roztworze utrwalającym: albo 10% buforowanego fosforanu formaliny, albo 4% paraformaldehydu (PFA). Sprawdź zewnętrzną i wewnętrzną morfologię próbki, szukając makroskopowych nieprawidłowości anatomicznych lub wad rozwojowych.

  1. Przygotuj mysz.
    1. Jeśli mysz jest dorosła, poddaj ją eutanazji przy użyciu standardowego protokołu CO2 . Za pomocą kleszczy lub nożyczek preparacyjnych należy wykonać nacięcia (około 3 cm) w bocznej części klatki piersiowej i brzucha, aby umożliwić penetrację utrwalacza do narządów wewnętrznych.
      UWAGA: Próbka powinna być utrwalona przez co najmniej 24 godziny przed sekcją zwłok, jeśli zarodek jest starszy niż E14.5.
  2. Przeanalizuj zewnętrzną część ciała.
    1. Skonfiguruj oprogramowanie, aby zapisywać zdjęcia z nazwą, w tym identyfikacją próbki, powiększeniem mikroskopu i zawartością obrazu.
      UWAGA: Powiększenie od 1,0x do 3,2x powinno być wystarczające do obrazowania większości struktur u myszy E14,5 lub starszych.
    2. Umieść mysz na płytce pod soczewką mikroskopu stereoskopowego. Napełnij płytkę solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), aby całkowicie pokryć próbkę, aby zapobiec odwodnieniu i odbiciom na zdjęciach. Dostosuj powiększenie tak, aby ekran obejmował cały zarodek, a następnie zrób zdjęcie zarówno lewej, jak i prawej strony zarodka.
      UWAGA: Spód płytki powinien być pokryty parafiną, silikonem lub innym tego typu podłożem, aby ułatwić przypinanie.
    3. Przypnij próbkę przez gardło, skierowaną do góry, i zrób kolejne zdjęcie.
      UWAGA: Ustaw szpilkę lekko do góry, aby upewnić się, że żadne ważne struktury jamy klatki piersiowej nie zostały przebite.
  3. Przeanalizuj klatkę piersiową.
    1. Unosząc skórę na środku szyi za pomocą kleszczy, przetnij skórę w kierunku obu pach nożyczkami, a następnie przetnij skórę wzdłuż osi środkowej w kierunku ogona. Następnie odetnij skórę od pępka do nóg. Przypnij próbkę przez nadgarstki i kostki.
      UWAGA: Uważaj, aby przeciąć tylko skórę. Zaleca się trzymanie ostrzy nożyczek poziomo lub pod kątem do góry.
    2. Aby oderwać tkankę łączną, podnieś skórę jedną parą kleszczy, jednocześnie przytrzymując leżącą poniżej tkankę na miejscu drugą parą. Przypnij próbkę przez skórę, aby odsłonić klatkę piersiową i brzuch (Rysunek 2).
      UWAGA: Zbyt duże rozciąganie podczas przypinania, cięcia lub skrobania może spowodować uszkodzenie tkanki.
    3. Zrób zdjęcie odsłoniętych mięśni, a następnie delikatnie zeskrob mięśnie, aby odsłonić żebra.
    4. Zrób zdjęcie odsłoniętych żeber. Oddziel żebra od membrany i odetnij żebra po obu stronach tak daleko, jak to możliwe, na osi bocznej w kierunku szyi.
    5. Odsłoń serce, usuwając przecięte żebra. Zrób zdjęcie serca.
    6. Usuń grasicę, obierając ją jedną parą kleszczy. Użyj drugiej pary kleszczy, aby ustabilizować podstawę grasicy, aby uniknąć rozerwania naczyń znajdujących się pod spodem. Zrób zdjęcia serca i wielkich naczyń.
      UWAGA: Użycie kołków do rozciągnięcia niektórych sąsiednich struktur może pomóc w uzyskaniu lepszych widoków obrazowania. Dodatkowo zrób osobne zdjęcia skupiające się na wielkich tętnicach, sercu i innych interesujących strukturach, ponieważ mogą one nie być razem ostre.
  4. Przeanalizuj brzuch.
    1. Pociągnij membranę, aby ją wyjąć i odsłonić wątrobę. Zrób zdjęcie.
    2. Przypnij wątrobę, aby odsłonić żołądek i trzustkę. Zrób zdjęcie.
    3. Przetnij przełyk. Usuń okrężnicę i jelita, wyciągając je kleszczami. Przeciąć tuż nad wątrobą i usunąć ją, aby odsłonić nerki i nadnercza. Zrób zdjęcie.
      UWAGA: Usunięte narządy należy przechowywać w roztworze utrwalającym.
  5. Odizolować klatkę piersiową do analizy ECM.
    1. Przetnij dolną część klatki piersiowej wzdłuż linii prostej między wątrobą a płucami. Odetnij głowę na tyle wysoko, aby nie przecinać rozgałęzień tętnic szyjnych.
    2. Delikatnie usuń boczne żebra, zachowując żebra grzbietowe i kręgosłup. Obierz i zeskrob tłuszcz grzbietowy.
    3. Odłącz klatkę piersiową od reszty ciała i umieść ją w 10% buforowanym roztworze fosforanu formaliny.

3. Osadzanie

  1. Przelać utrwalacz do odpowiedniej butelki na odpady niebezpieczne. Przemyć próbki trzykrotnie 1x PBS przez 15 minut.
  2. Do odwodnienia próbek należy stosować zwiększające się stężenia etanolu i ksylenu. Czas trwania wszystkich kolejnych etapów zależy od stadium zarodków. Szczegółowe informacje można znaleźć w Tabeli 2.
    UWAGA: Należy zachować ostrożność podczas wymiany roztworów, aby uniknąć uszkodzenia próbek. Optymalne parametry przetwarzania próbki można dostosować empirycznie. Ksylen rozpuści niektóre tworzywa sztuczne; Należy używać szklanych narzędzi i pojemników.
  3. Zastąp ksylen parafiną na żądany czas. Pozostawić butelki w inkubatorze w temperaturze 65 °C na odpowiedni czas (tabela 2).
  4. Użyj świeżej parafiny, aby osadzić próbki w żądanej pozycji.
    UWAGA: Zaleca się zorientowanie próbki w środku bloku parafinowego, tak aby jej grzbietowa strona była skierowana do góry, a tylna strona skierowana do przodu bloku. Podczas orientowania próbki należy pamiętać, że próbka jest osadzona z blokiem skierowanym do góry nogami.

4. Episkopowa mikroskopia konfokalna (ECM)

UWAGA: Po odpowiednim osadzeniu, zarodki są poddawane seryjnemu zbieraniu obrazów za pomocą ECM do analizy histopatologicznej. Poszczególne preparaty można pobrać z mikrotomu w celu przeprowadzenia dalszych badań.

  1. Wyjmij blok parafiny z zamrażarki -20 °C i wyjmij metalowe formy.
  2. Użyj żyletki, aby przyciąć wosk na krawędziach i z tyłu kasety. Przetnij wosk otaczający próbkę, aż zostanie zamknięty w małym kwadracie wosku przymocowanym do kasety.
    UWAGA: Zachowaj szczególną ostrożność podczas obchodzenia się z ostrzami.
  3. Użyj metalowej dźwigni, aby zacisnąć blok parafiny na etapie krojenia mikrotomu. Wybierz funkcję MAN (ręczną) w trybie pracy, podnieś powierzchnię parafiny blisko ostrza i uruchom kilka suwaków, aby upewnić się, że ostrze styka się z blokiem parafiny.
  4. Otwórz aplikację LAS AF i wybierz opcję MatrixScreener. Wybierz opcję Pojedyncza regularna macierz i załaduj odpowiedni, wcześniej zapisany szablon. Kliknij przycisk Szybki LUT, aby przełączyć się na białe i pomarańczowe ombre.
  5. Wybierz opcję Set Up Jobs (Konfiguruj zadania) i przeciągnij widoczny laser o długości fali 405 nm do maksimum. Dopasuj lewą krawędź bloku widma do linii 405 nm i przeciągnij prawą krawędź do linii 800 nm. Zaznacz opcję Otworek i uruchom podgląd na żywo.
  6. Dostosuj położenie projekcji laserowej, aby wyśrodkować próbkę na ekranie i ustaw pokrętło Zoom na ~20x. Aby zoptymalizować rozdzielczość, ustaw wzmocnienie na 1,250 V i zmaksymalizuj niebieski obszar za pomocą pokrętła ostrości; następnie zresetuj wzmocnienie do około 750 V dla obrazowania.
    UWAGA: Konkretne wartości mogą się różnić w zależności od stanu zarodka.
  7. Przełącz metodę cięcia na Auto, ustaw grubość na około 50 μm i uruchom suwaki. Przerwij cięcie, gdy płuca i drogi oddechowe są w zasięgu wzroku.
  8. Wybierz grubość cięcia w zakresie 8-10 μm i zatrzymaj podgląd na żywo. Otwórz program Microtome Communicator, aby rozpocząć obrazowanie. Upewnij się, że folder pamięci tymczasowej jest pusty przed pobraniem obrazów.
  9. Przerwij cięcie, gdy nie zostanie uwidoczniona żadna dodatkowa struktura serca. Zamknij aplikację Microtome Communicator i wyeksportuj plik tymczasowy do jednej serii obrazów .tiff za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazu w celu późniejszej rekonstrukcji 3D.

5. Rekonstrukcja trójwymiarowa (3D)

UWAGA: Celem rekonstrukcji 3D jest przetworzenie stosu obrazów 2D z obrazowania ECM na filmy 3D w orientacji czołowej, strzałkowej i poprzecznej oraz wykorzystanie filmów 3D do diagnozy nieprawidłowości strukturalnych i anatomicznych w próbkach.

  1. Otwórz stos obrazów ECM w oprogramowaniu do przetwarzania obrazu.
    1. Przeciągnij i upuść obraz files do oprogramowania do przetwarzania obrazu. Odwróć obrazy ECM w poziomie, wybierając opcje Image > Transform > Flip Horizontal (Odwróć w poziomie) na pasku menu.
    2. Zapisz odwrócony obraz i zamknij oprogramowanie do przetwarzania obrazu.
  2. Zaimportuj stos obrazów ECM w oprogramowaniu do przeglądania DICOM.
    1. Przeciągnij i upuść odwrócone w poziomie obrazy ECM do oprogramowania do przeglądania DICOM. Upewnij się, że wokół listy próbek znajduje się jasnoniebieska ramka lub obrazy mogą zostać dodane do istniejącego folderu przykładów.
    2. Wybierz łącza lub pliki, które chcesz skopiować do bazy danych, gdy pojawi się wyskakujące okienko. Na liście próbek pojawi się nowy przykład o tej samej nazwie, co plik skopiowany do oprogramowania do przeglądania DICOM.
    3. Kliknij nowo dodany plik, aby go otworzyć.
  3. Wykonaj rekonstrukcję 3D.
    1. Po otwarciu pliku kliknij menu Narzędzia do rekonstrukcji 2D/3D na pasku narzędzi i wybierz 3D MPR.
    2. W przypadku rozdzielczości Pixel X i Pixel Y Resolution (Rozdzielczość piksela X) wprowadź rozdzielczość obrazu, podając powiększenie używane podczas obrazowania ECM. W polu Interwał przekroju wprowadź grubość przekroju używaną do cięcia podczas obrazowania ECM.
      UWAGA: Rozdzielczość aparatu zmienia się w zależności od zoomu aparatu i może się różnić w zależności od aparatu.
  4. Użyj różnych narzędzi z karty Narzędzia po lewej stronie, aby dostosować stosy obrazów zgodnie z potrzebami.
    1. Użyj narzędzia WW/WL, aby dostosować szerokość okna i poziom okna. Kliknij i przeciągnij narzędzie na obrazie w górę, aby zmniejszyć jasność obrazu, lub w dół, aby ją zwiększyć. Kliknij i przeciągnij narzędzie na obrazie w prawo, aby zmniejszyć kontrast obrazu, lub w lewo, aby go zwiększyć.
      UWAGA: Optymalne ustawienia WW/WL dla jednej konstrukcji mogą być nieoptymalne dla innej. Z tego powodu zaleca się tworzenie oddzielnych filmów w celu oglądania różnych struktur.
    2. Użyj narzędzia Przesuń, aby przeciągnąć obrazy w żądane pozycje. Użyj narzędzia Lupka, aby powiększyć lub pomniejszyć obraz zgodnie z potrzebami, a narzędzia Obróć, aby obrócić obraz zgodnie z potrzebami.
      UWAGA: Powiększanie obrazów może spowodować obniżenie jakości obrazu. Zachowaj ostrożność podczas obracania obrazów, ponieważ może to spowodować odwrócenie osi.
  5. Kliknij i przeciągnij kolorową oś pierwszego panelu. Zwróć uwagę, jak obracanie tej osi zmienia orientację pozostałych dwóch paneli. Obracaj osie trzech paneli, aż trzy panele będą reprezentować widoki koronalne, strzałkowe i poprzeczne próbki.
    UWAGA: Podczas zmiany orientacji próbek należy zachować prawidłową orientację przednią/tylną.
  6. Generuj filmy.
    1. Gdy wszystkie trzy panele zostaną prawidłowo ustawione, zorientowane i rozjaśnione, kliknij panel reprezentujący widok koronalny.
    2. Kliknij Eksport filmu po prawej stronie paska menu. Kliknij opcję Partia i przeciągnij suwaki Od i Do, aby objąć cały obszar zainteresowania. W polu Interwał wybierz opcję Taka sama jak grubość. Zapisz wideo wskazujące orientację widoku.
    3. Obejrzyj film, aby sprawdzić, czy można odpowiednio zidentyfikować interesujące Cię struktury. Jeśli nie, użyj narzędzi (krok 5.4), aby ponownie dostosować filmy zgodnie z potrzebami i ponownie zapisać wideo.
  7. Powtórz krok 5.6 dla widoków poprzecznych i strzałkowych. Zdiagnozuj próbki za pomocą zrekonstruowanych filmów.
    UWAGA: Uważnie obejrzyj filmy w każdej orientacji, aby dokonać pełnej oceny, czy próbka wykazuje jakiekolwiek nieprawidłowości anatomiczne lub fenotypy choroby (Rysunek 3).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Zauważono, że zarodki myszy z istotnymi wadami hemodynamicznymi wykazują letalność embrionalną. Szeroką gamę wad wrodzonych serca (CHD) można zidentyfikować za pomocą wysokowydajnego, nieinwazyjnego echokardiograficznego badania płodów, wykorzystując różne projekcje (Rysunek 1).

Wady przegrody: Najczęstszymi wrodzonymi wadami serca (CHD) są wady przegrody, takie jak ubytek w przegrodzie międzykomorowej (VSD), ubytek w przegrodzie przedsionkowo-kom...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Genetycznie zmodyfikowane myszy zostały wykorzystane do zrozumienia patomechanizmów wrodzonych wad serca. Protokoły, które przedstawiamy w tym badaniu, mają na celu usprawnienie i standaryzację procesu oceny wad serca u myszy płodu. Istnieją jednak krytyczne kroki, na które należy zwrócić uwagę podczas protokołu. Zarodki myszy rosną znacznie w każdym dniu ciąży, a właściwy czas na pobranie myszy można określić, wykonując dokładnie echokardiogram płodu. Echokardiogram płodu może być wykorzystany do badań przesiewowych pat...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów w związku z niniejszym manuskryptem.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1x buforowany fosforanem roztwór soli fizjologicznej (PBS), PH7.4Sigma AldrichP3813
1,5 ml probówki Eppendorfa (lub preferowana fiolka do przechowywania tkanek)SealRite1615-5599
10% buforowany roztwór fosforanu formalinyFisher ChemicalSF100-4
100% etanolDecon Laboratories2701
16% paraformaldehyd (PFA) utrwalacz ThermoScientific289084% stężenie robocze świeżo przygotowane w 1x PBS w 4 & stopniach; C
50 ml probówkiFalcon352070
6– Płytka 12-dołkowa lub fiolka 20 ml  do przechowywania zarodkówFalcon353046
Mikroskop preparacyjny LeicaMDG36
(klasa A1 lub A2)FST26002-15
Płytka preparacyjna FSTFB0875713szalka Petriego z bazą parafinową
Formy do zatapianiaSakura4133
Bardzo wąskie nożyczki (10,5 cm)FST14088-101– 2 pary 
Aplikacja Fidżi/Zdjęcie JNIHFiji.sc
Drobna końcówka (0,05 mm x 0,01 mm) Kleszcze preparacyjne (11 cm)FST11252-002 pary
gorących kleszczy FST11252-00Do orientacji zarodków
Przemysłowy marker do bloków woskowych Sharpie2003898Sformatowany do użytku laboratoryjnego
Kamera mikroskopowa Jenoptik ProgRes C14plus Jenoptik017953-650-26
Oprogramowanie akwizycyjne Jenoptik ProgRess CaptureProJenoptikjenoptik.com
Duża szklana zlewka Fisher ScientificS111053Do topienia parafiny
Mikroskop lornetkowy Leica M165 FC (optyka 16.5:1)LeicaM165 FC
OsiriX MD wersja 12.0OsiriXosirix-viewer.com 
Wosk parafinowy do zatapiania ParaplastMillipore Sigma1003230215
Mała szklana zlewkaFisher ScientificS111045
Mała, perforowana łyżka (14,5 cm)FST10370-17
Nożyczki proste Vannas (4– 8 mm)FST15018-10Para
biomikroskopów ultradźwiękowych Vevo2100 o ultrawysokiej częstotliwościFUJIFILM VisualSonics Inc.Vevo2100
KsylenFisher ChemicznyUN1307
Szpilki preparacyjne

Bibliografia

  1. Wu, W., He, J., Shao, X. Incidence and mortality trend of congenital heart disease at the global, regional, and national level, 1990-2017. Medicine. 99 (23), Baltimore. e20593(2020).
  2. vander Linde, D., et al. Birth prevalence of congenital heart disease worldwide: a systematic review and meta-analysis). Journal of the American College of Cardiology. 58 (21), 2241-2247 (2011).
  3. Yang, Q., et al. Racial differences in infant mortality attributable to birth defects in the United States. Birth Defects Research. Part A, Clinical and Molecular Teratology. 76 (10), 706-713 (1989).
  4. Patel, A., et al. Prevalence of noncardiac and genetic abnormalities in neonates undergoing cardiac operations: Analysis of the society of thoracic surgeons congenital heart surgery database. The Annals of Thoracic Surgery. 102 (5), 1607-1614 (2016).
  5. Pierpont, M. E., et al. Genetic basis for congenital heart disease: Revisited: A scientific statement from the American Heart Association. Circulation. 138 (21), e653-e711 (2018).
  6. Krishnan, A., et al. A detailed comparison of mouse and human cardiac development. Pediatric Research. 76 (6), 500-507 (2014).
  7. Liu, X., et al. Interrogating congenital heart defects with noninvasive fetal echocardiography in a mouse forward genetic screen. Circulation. Cardiovascular Imaging. 7 (1), 31-42 (2014).
  8. Liu, X., Tobita, K., Francis, R. J., Lo, C. W. Imaging techniques for visualizing and phenotyping congenital heart defects in murine models. Birth Defects Research. Part C, Embryo Today: Review. 99 (2), 93-105 (2013).
  9. Tsuchiya, M., Yamada, S. High-resolution histological 3D-imaging: episcopic fluorescence image capture is widely applied for experimental animals. Congenital Anomalies (Kyoto. 54 (4), 250-251 (2014).
  10. Yu, Q., Tian Leatherbury,, Lo, X., W, C. Cardiovascular assessment of fetal mice by in utero echocardiography). Ultrasound in Medicine and Biology. 34, 741-752 (2008).
  11. Rosenthal, J., et al. Rapid high resolution three-dimensional reconstruction of embryos with episcopic fluorescence image capture. Birth Defects Research. Part C, Embryo Today: Review. 72 (3), 213-223 (2004).
  12. Weninger, W. J., Mohun, T. Phenotyping transgenic embryos: a rapid 3-D screening method based on episcopic fluorescence image capturing. Nature Genetics. 30 (1), 59-65 (2002).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Wady wrodzone sercap odowe modele mysieechokardiografia p odowaepiskopiczna mikroskopia konfokalna3D rekonstrukcja obrazufenotypowanie sercaubytek w przegrodzie komorowejgenetyczne modele mysieanatomia uk adu sercowo naczyniowego
Linia do charakteryzowania strukturalnych wad serca u płodu myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.