Artykuł metodologiczny

Solidna produkcja tkanek do długoterminowej hodowli organoidów mózgowych pochodzących z iPSC do badań nad starzeniem się

5.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64586

⸱

12 maja 2023

 ,  , 
1Department of Applied Stem Cell Technologies, TechMed Centre Enschede, University of Twente, 2Centro de Biotecnología-FEMSA, Tecnologico de Monterrey, 3Department of Genetics, Harvard Medical School

W tym artykule

Podsumowanie

Obecny protokół krok po kroku przedstawia procedurę odtwarzalnego wytwarzania, utrzymywania i starzenia organoidów mózgowych pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC). Metoda ta umożliwia hodowlę i dojrzewanie organoidów mózgowych przez dłuższy czas, co ułatwia modelowanie procesów związanych ze starzeniem się mózgu i patogenezą związaną z wiekiem.

Streszczenie

Obecnie dostępne modele zwierzęce i komórkowe nie oddają w pełni złożoności zmian, które zachodzą w starzejącym się ludzkim mózgu. Niedawny rozwój procedur opisujących generowanie ludzkich organoidów mózgowych, pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC), może zasadniczo zmienić zdolność modelowania i zrozumienia starzenia się ludzkiego mózgu i związanych z nim procesów patogennych. W tym miejscu przedstawiono zoptymalizowany protokół generowania, utrzymywania, starzenia i charakteryzowania ludzkich organoidów mózgowych pochodzących z iPSC. Protokół ten można wdrożyć w celu generowania organoidów mózgowych w powtarzalny sposób i służy jako przewodnik krok po kroku, obejmujący najnowsze techniki, które skutkują lepszym dojrzewaniem organoidów i starzeniem się w kulturze. Poruszane są konkretne kwestie związane z dojrzewaniem organoidów, nekrozą, zmiennością i efektami wsadowymi. Podsumowując, te postępy technologiczne umożliwią modelowanie starzenia się mózgu w organoidach pochodzących od różnych młodych i starszych dawców, a także osób cierpiących na zaburzenia mózgu związane z wiekiem, umożliwiając identyfikację fizjologicznych i patogennych mechanizmów starzenia się ludzkiego mózgu.

Wprowadzenie

Modele chorób związanych ze starzeniem się stają się coraz bardziej istotne, ponieważ oczekiwana długość życia ludzi stale rośnie. Zakrojone na szeroką skalę badania genomiczne ujawniły starzejące się populacje z rozregulowaniem procesów molekularnych i zmianami genetycznymi wpływającymi na jakość życia1. Proces starzenia charakteryzuje się ogólną utratą funkcjonalności organizmu, w tym utratą funkcji poznawczych, zwiększonym ryzykiem zaburzeń neurodegeneracyjnych i wieloma chorobami przewlekłymi2.

Obecne techniki hodowli komórkowych nie reprezentują odpowiednio wieloczynnikowej natury starzenia, ponieważ te dysfunkcje nie mogą być poprawnie odtworzone za pomocą mutacji, toksyn lub infekcji3. Modele zwierzęce, które badają proces starzenia, często wiążą się z długim czasem eksperymentów i wysokimi kosztami, ale niosą ze sobą również względy etyczne. Wykorzystanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) od pacjentów może wyjaśnić mechanizmy molekularne, które leżą u podstaw postępu choroby, ponieważ iPSC pozwalają na naturalny rozwój komórek w dojrzałe tkanki3. iPSC stały się koniem roboczym wielu laboratoriów badających zaburzenia neurodegeneracyjne, ponieważ przeprogramowanie komórkowe pobranych komórek nie wydaje się usuwać śladów choroby lub starzenia się dawców4. Odciski te podsumowują fenotypy komórkowe, które zostały zademonstrowane w modelach ludzkich i zwierzęcych, dzięki czemu iPSC nadają się do badania indywidualnego pogorszenia stanu komórkowego bardzo gęstej tkanki mózgowej5,6. Organoidy pochodzące z IPSC stały się czołowym modelem trójwymiarowej hodowli tkanek, umożliwiając bardziej złożone interakcje międzykomórkowe i lepszą rekapitulację rozwoju. Chociaż organoidy są używane głównie do danych rozwojowych, są coraz częściej stosowane do modelowania chorób, w szczególności modeli stanów zapalnych, neurodegeneracji i starzenia się7. Opierając się na wcześniejszych badaniach iPSC, organoidy zachowują fenotypy choroby i fenotypy komórkowe w fizjologicznym kontekście połączeń sieci podobnych do tkanki8,9. Jednak hodowla trójwymiarowych tkanek o określonych wymiarach może być wyzwaniem, zwłaszcza przez dłuższy czas.

Ta praca przedstawia szczegółową metodę powtarzalnego generowania organoidów mózgowych, która pozwala tkance na znaczne dojrzewanie w dłuższych okresach. Tworzenie organoidów mózgowych pozostało stosunkowo ustandaryzowane, przyjmując metody z kilku znanych protokołów10,11. Zasugerowano jednak kilka modyfikacji w celu poprawy różnicowania i konserwacji. Te alternatywne metody obejmują wykorzystanie czynników neurogennych w celu zwiększenia różnicowania neuronów12, dodatkowe rusztowania dla lepszej wymiany składników odżywczych promujące długowieczność komórek13, oraz pobudzenie stresu o niskim stopniu przeziębienia dla przedłużonej hodowli i wzrostu14. Ulepszenia te zostały włączone do tej metody w celu opracowania dojrzałych organoidów zdolnych do ekspresji fenotypów neurodegeneracyjnych i starzeniowych.

Protokół

Badania nad pacjentami zostały zatwierdzone przez Institutional Review Board. Wszyscy uczestnicy podpisali pisemną świadomą zgodę i zgodę repozytorium, aby umożliwić ponowne wykorzystanie ich danych i próbek biologicznych. Linie iPSC zostały wygenerowane zgodnie z wytycznymi IRB i instytucjonalnymi. Rysunek 1 ilustruje schematyczny przegląd przepływu pracy tego protokołu.

1. Przeprogramowanie i konserwacja iPSC

  1. Zbierz 8 ml krwi pacjenta (w podeszłym wieku lub chorego; w wieku 65 lat i starszego) do probówek do przygotowania komórek (CPT) z cytrynianem sodu lub do probówek EDTA lub heparynizowanych.
  2. Wirować przy 1,800 x g przez 30 minut w temperaturze pokojowej (RT) w celu zebrania osadu zawierającego tylko krew obwodową i bez surowicy15.
  3. Użyj specjalistycznych wektorów przeprogramowania zgodnie z protokołem producenta (patrz Tabela materiałów), aby uzyskać iPSCs16.
  4. Hodowla iPSC na wolnych od dehydrogenazy laktozowej, wolnych od dehydrogenazy laktozy wirusie udźwigu (LDEV), pokrytych matrycą błony podstawnej o obniżonym współczynniku wzrostu, na 6-dołkowych płytkach hodowlanych w pożywce Essential 8 (E8) (patrz tabela materiałów) w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze z 5% CO2 .
  5. Utrzymuj iPSC w pożywce E8 przez 3-4 dni, aby uniknąć przepełnienia lub spontanicznego różnicowania.
  6. Zwaliduj pluripotencję linii iPSC za pomocą markerów immunofluorescencyjnych (krok 2) i przetestuj na obecność mykoplazmy (krok 3).

2. Barwienie pluripotencji

  1. Aby zachować roztwory i przeciwciała, należy wysiać komórki na powlekanych (krok 1.4) 24-dołkowych płytkach hodowlanych 3-4 dni przed analizą. Odessać pożywkę pipetą i utrwalić komórki 4% formaldehydem w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (1x PBS) przez 15-20 minut w temperaturze pokojowej.
  2. Przemyć komórki 3x 1x PBS i przepuścić 0,1% Triton-X 100 w 1% albuminie surowicy bydlęcej (BSA) w PBS przez co najmniej 15 minut, ale nie dłużej niż 1 godzinę w RT.
  3. Umyć 3x 1x PBS i blokować 5% BSA w PBS przez 30 min w RT.
  4. Przemyć ponownie 3x 1x PBS i dodać przeciwciała Sox2 i Oct3/4 (rozcieńczenie 1:100; patrz Tabela Materiałów) oraz barwienie nukleinowe DAPI w 1% BSA (rozcieńczenie 1:4,000) przez noc w temperaturze 4 °C. Zawiń w folię aluminiową, aby chronić przed światłem.
  5. Umyj 3x 1x PBS i pozostaw komórki w PBS. Obraz pod mikroskopem fluorescencyjnym w powiększeniu 10-20x. Upewnij się, że markery pluripotencji Sox2 i Oct3/4 są zlokalizowane w jądrach komórek17,18.

3. Badanie na obecność mykoplazmy

UWAGA: Zapoznaj się z protokołem zestawu do wykrywania (zobacz Tabelę Materiałów), aby uzyskać szczegółowe informacje na temat wykonania testu i etapów analizy. Zestaw do wykrywania zapewnia odczynnik, substrat i bufor testowy do testowania mykoplazmy.

  1. Przed pasażowaniem komórek lub odświeżaniem należy zebrać 2-3 ml pożywki do hodowli komórkowych w probówce wirówkowej i granulować wszelkie komórki lub zanieczyszczenia w temperaturze 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej stężenia. Przechowywać supernatant w temperaturze 4 °C przez ≤5 dni. Inkubować komórki z pożywką przez co najmniej 24 godziny, aby zapewnić wykrywalny sygnał.
  2. Dodać 100 μl supernatantu komórkowego do świeżej probówki lub dołka 96-dołkowej płytki o białych ściankach (zalecane nieprzezroczyste dno, patrz Tabela materiałów). Odczynnik i substrat należy rozpuścić w buforze do oznaczania i równoważyć przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Dodać 100 μl odczynnika do próbki i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Zmierzyć luminescencję za pomocą luminometru (pomiar #1).
  4. Dodać 100 μl substratu do próbki i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Zmierzyć luminescencję (pomiar #2).
  5. Określ zanieczyszczenie mykoplazmą przez stosunek pomiaru #2 do #1. Zapoznaj się z instrukcją zestawu w celu interpretacji wyników.

4. Przygotowanie mikrofilamentu

  1. Przygotowanie mikrowłókien poli(kwas mlekowo-ko-glikolowy) (PLGA, patrz Tabela materiałów) należy rozpocząć od postrzępienia pasma szwu końcem skalpela. Lekko spryskaj postrzępione włókno 70% etanolem.
  2. Pod mikroskopem i za pomocą linijki zacznij ciąć włókno PLGA na fragmenty pasm o długości od 500 μm do 1 mm. Wytnij w sumie około 25 mm włókna. Przechowuj filamenty w probówce o pojemności 15 ml z 1 ml roztworu antybiotykowo-przeciwgrzybiczego.
    1. W kapturze rozcieńczyć roztwór błonnika 10 ml DMEM/F-12 (Tabela 1). Dobrze wymieszaj roztwór.
      UWAGA: Pracuj w okapie przepływowym do hodowli komórkowych w sterylnym środowisku.
  3. Dodać 20 μl roztworu błonnika do trzech dołków tworzących ciało zarodka (EB) na 96-dołkowej płytce. Pod mikroskopią jasnego pola policz i uśrednij włókna na studzienkę. Rozcieńczyć lub skoncentrować średnio 5-10 mikrofilamentów PLGA na dołek. Przygotuj każdą studzienkę w ten sposób.
  4. Studnie są teraz gotowe do zasiania komórkami. Przechowywać płytkę w temperaturze pokojowej do czasu jej użycia lub w temperaturze 4 °C przez następny dzień.

5. Formowanie się ciała zarodkowego (EB)

UWAGA: Wszystkie media i roztwory muszą być podgrzane do RT.

  1. Gdy iPSC osiągną zbieżność 70%-80% (Rysunek 2A), są gotowe do przejścia i wykorzystania do tworzenia EB. Sprawdź komórki pod mikroskopem w powiększeniu 10x-20x. Upewnij się, że kolonie wykazują minimalne (<10%) obszary spontanicznego różnicowania.
  2. Odessać pożywkę pipetą i raz umyć komórki DPBS. Oddzielić kolonie przez dodanie 500 μl roztworu do odrywania komórek (patrz tabela materiałów) lub 0,5 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) i inkubować przez 3-5 minut w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Pracuj w okapie przepływowym do hodowli komórkowych w sterylnym środowisku.
  3. Zebrać uwolnione komórki, dodając 1 ml świeżej pożywki E8 do każdego dołka i delikatnie pipetować, aż wszystkie komórki zostaną odłączone.
  4. Przenieś 1,5 ml zawiesiny komórek do probówki o pojemności 15 ml i dodaj kolejny 1 ml świeżej pożywki E8, aby uzyskać całkowitą objętość 2,5 ml.
  5. Wirować przy 290 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
  6. Odessać supernatant za pomocą pipety, ponownie zawiesić osad komórek w 1 ml pożywki Essential 6 (E6, patrz tabela materiałów) uzupełnionej inhibitorem 50 μM ROCK i policzyć komórki za pomocą hemocytometru19.
  7. Przygotować zawiesinę komórkową 60 000-90 000 komórek/ml, w zależności od pożądanej gęstości wysiewu, w pożywce E6 uzupełnionej 50 μM inhibitora ROCK (patrz tabela materiałów).
  8. Dodać 150 μl zawiesiny komórkowej do każdego dołka 96-dołkowej płytki ULA (lub przygotowanej płytki wklęsłej20). Wysiewaj 9 000-11 000 komórek na dołek.
  9. Odwirować płytkę w celu wymuszonej agregacji komórek przy 290 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej. Umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze o stężeniu 5%CO2.

6. Indukcja neuroepitelialna

  1. Po 24 godzinach ostrożnie odessać pipetą 120 μl pożywki. Upewnij się, że nie zasysasz EB, opuszczając końcówkę pipety zbyt głęboko do studzienki.
  2. Dodać 150 μL pożywki E6 (w temperaturze pokojowej) uzupełnionej 2 μM XAV939 i inhibitorami SMAD: 10 μM SB431542 i 500 nM LDN 193189 na studzienkę (patrz tabela materiałów).
  3. Codziennie zmieniaj pożywkę na świeżo przygotowane pożywki E6 uzupełnione 2 μM XAV939, 10 μM SB431542 i 500 nM LDN 193189,
    UWAGA: Do 6 dnia (DIV6) EB powinny mieć średnicę 550-600 μm i być gotowe do dalszego różnicowania.

7. Różnicowanie i dojrzewanie organoidów

UWAGA: Wszystkie media muszą być podgrzane do RT.

  1. Około DIV7 sprawdź, czy wszystkie EB osiągnęły średnicę 550-600 μm i wykazują gładką i wyraźną krawędź (Rysunek 2B); na tym etapie są gotowe do osadzenia w macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM).
    UWAGA: Pracuj w sterylnym środowisku.
  2. Przygotuj wgłębienia w arkusze do zatapiania z termoplastycznej folii uszczelniającej (patrz Tabela materiałów), umieszczając arkusz folii (o długości około 4 cali) na pustym pudełku P200. Używając stożkowej probówki o pojemności 15 ml lub probówki mikrowirówkowej o pojemności 500 μl, delikatnie dociśnij arkusz folii do otworów, aby wykonać 12 wgłębień. Spryskaj arkusz folii 70% etanolem i pozostaw do wyschnięcia w okapie przepływowym przy włączonym świetle UV na co najmniej 30 minut.
  3. Rozmrozić wystarczającą ilość matrycy membrany podstawnej (Matrigel, patrz Tabela Materiałów) na lodzie i umieścić ją w okapie przepływowym.
    UWAGA: Na EB potrzeba około 30 μl nierozcieńczonej matrycy membranowej. Matrycę membrany należy zawsze utrzymywać w temperaturze poniżej 4 °C, aby zapobiec jej zżelowaniu. Zalecane są również wstępnie schłodzone końcówki do pipet, ponieważ spowalniają one polimeryzację matrycy w końcówce podczas pipetowania, zmniejszając w ten sposób straty materiału.
  4. Używając końcówki P200 o szerokim otworze, przenieś jeden EB do każdego wgłębienia i usuń jak najwięcej pożywki za pomocą zwykłej końcówki do pipety. Należy pamiętać, aby nie dopuścić do wyschnięcia EB. Używając zwykłej końcówki P200, dodaj ~30 μl nierozcieńczonej matrycy membranowej do każdego organoidu, upewniając się, że EB znajduje się w środku kropli.
  5. Gdy wszystkie EB zostaną osadzone w matrycy, umieść arkusz filmu zawierający EB na sterylnej szalce Petriego.
    UWAGA: Opcjonalnie małą szalkę Petriego wypełnioną sterylną wodą można umieścić na większej szalce Petriego obok arkusza folii, aby zapobiec parowaniu.
    1. Przenieść naczynie do inkubatora i inkubować w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze z 5% CO2 przez około 10 minut, aby umożliwić zestalenie się matrycy membranowej.
  6. Dla każdego zestawu 12 osadzonych organoidów należy przygotować 5 ml pożywki różnicującej z witaminą B27 bez witaminy A (Tabela 1) w jednym dołku 6-dołkowej płytki ULA. Podgrzej płytkę do temperatury 37 °C w inkubatorze.
  7. Po zakończeniu czasu inkubacji przenieś osadzone EB na 6-dołkową płytkę ULA, biorąc arkusz folii i wypychając wgłębienia z tyłu arkusza. W razie potrzeby weź 1 ml z dołka i odpipetuj go na arkusz, aby kropelki oderwały się od folii.
    UWAGA: Ważne zmiany morfologiczne można zauważyć 1 dzień po osadzeniu; EB przechodzą od gładkich krawędzi do wybrzuszonych wypukłości tworzących pąki (Rysunek 2C).
  8. Po 2 dniach (DIV9) wykonaj wymianę pożywki o połowę. Należy uważać, aby nie zassać ani nie uszkodzić kropelek matrycy membrany w tym procesie.
  9. Po kolejnych 2 dniach (DIV11) należy przeprowadzić pełną wymianę pożywki, uzupełniając pożywkę o 3 μM CHIR99021 (patrz Tabela Materiałów).
  10. W DIV14 zmień pożywkę na pożywkę różnicującą z witaminą B27 z witaminą A (Tabela 1) w celu stopniowego zwiększania wielkości organoidów.
  11. Przy DIV16 umieść płytkę studzienkową na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 90 obr./min wewnątrz inkubatora. Zmieniaj nośnik co 2 dni.
  12. Co 40 działek rozcieńczyć 500 μl matrycy membranowej na każde 50 ml pożywki, aby uzyskać dodatkowe składniki odżywcze w pożywce.

Wyniki

Integracja włókien PLGA, osadzanie w dołkach oraz mieszanie prowadzą do stabilnego generowania organoidów mózgowych, co umożliwia utrzymanie kultur pochodzących z iPSC przez dłuższy czas (Rysunek 1).

Schemat powstawania organoidów, różnicowanie iPSC, E6+SMAD, wymiana pożywki, zatapianie w błonie podstawnej.
Rysunek 1: Schematyczna ilustracja przebiegu i harmonogramu tej metody. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wstępny okres indukcji neuronalnej jest porównywalny z wcześniej opisanymi procedurami11. Ciała embrionalne (EB) zaczynają jako okrągłe agregaty (Rysunek 2B) z białymi lub przezroczystymi krawędziami. Po zmianie pożywki z indukcyjnej na podtrzymującą w dniu DIV7, w ciągu 24 h z okrągłej tkanki wyłaniają się wypustki i pączki (Rysunek 2C). Ponadto, w miarę dalszego wzrostu organoidu, powierzchnia włókna PLGA sprzyja jego wydłużaniu się (Rysunek 2D). Podczas dojrzewania krawędzie organoidu muszą pozostać nienaruszone, co jest dobrym sygnałem zdrowia komórek i prawidłowego rozwoju; w przeciwnym razie należy dostarczyć dodatkowych składników odżywczych13 (Rysunek 2E). Wzrost organoidów jest dodatkowo wspomagany przez mieszanie hodowli, co poprawia perfuzję składników odżywczych.

Proces różnicowania komórek, hodowle komórek macierzystych, obrazy mikroskopowe, analiza badań biologicznych.
Rysunek 2: Różnicowanie i dojrzewanie organoidów mózgowych. (A) Reprezentacyjny obraz hodowli iPSC przy 70%-80% konfluencji. (B) Wygenerowano ciała embrionalne (EBs) i indukowano tworzenie neuroepitelium do DIV7. Następnie EBs osadzono w macierzy membranowej i dalej różnicowano w kierunku organoidów mózgowych. (C) Organoidy w DIV10 wykazujące wyraźne formacje pączkowate. Organoidy mogą być dalej dojrzewane w macierzy membranowej, stosując albo (D) osadzanie w wgłębieniu (dimple), albo (E) osadzanie metodą kanapkową (sandwich), pokazane tutaj w DIV30. (F) Długoterminowa hodowla wykazuje organoidy mózgowe osiągające znaczne rozmiary (DIV70). Pasek skali = 500 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wymiary i morfologia zewnętrzna organoidu są uzupełnione przez złożoną architekturę wewnętrzną organoidu. Po utrwaleniu tkanki w 7. dniu in vitro (DIV7) po pierwszym etapie różnicowania, komórki ciał ucieczek (EB) wykazują ekspresję SOX2, czynnika transkrypcyjnego z domeną HMG, który służy jako marker multipotentnych neuralnych komórek macierzystych21, a także białka z domeną parną Pax-6, co wskazuje na obecność komórek progenitorowych układu nerwowego (Rysunek 3). Niedojrzałe neurony znakowane TuJ1 (β-tubulina klasy III)22 są już widoczne, rozproszone w całej tkance.

Na tym etapie staje się widoczny przykład samoorganizacji, której podlegają te organoidy. Organizacja struktur radialnych, nazywanych rozetami, jest analogiczna do cewy nerwowej, z komórkami SOX2+ w centrum rozety21 oraz PAX6 w kierunku jej peryferii. Z rozet tych powstają neurony w miarę ich migracji na zewnątrz. Te migrujące radialnie komórki są początkowo dwukrotnie dodatnie pod kątem markerów komórek macierzystych/progenitorowych neuronów: nestyny23 oraz kwaśnego białka włókienstwa glialnego (GFAP), co przypomina glej radialny występujący w obszarach neurogennych mózgu in vivo. W miarę dojrzewania migrujących neuronów markery cytoszkieletowe odzwierciedlają tę zmianę22. Marker wczesnego etapu różnicowania neuronalnego TuJ122 jest widoczny w wewnętrznym kręgu rozety i przechodzi w białko MAP2 (mikrotubule-associated protein 2)24, specyficzny marker dojrzewania neuronów, znajdujący się na peryferiach.

Złożony obraz kultur komórkowych barwionych immunofluorescencyjnie; markery: SOX2, TUJ1, PAX6, DAPI.
Rycina 3: Ciała embrionalne w 7. dniu in vitro (DIV7) wykazują organizację strukturalną i cechy niedojrzałości. Obraz immunohistochemiczny całego preparatu ciała embrionalnego (EB) w DIV7. (A) Złożony obraz EB przedstawiający (B) rozetki neuralne SOX2+, (C) niedojrzałe neurony (TUJ1) rozproszone w obrębie EB, (D) komórki progenitorowe neuronów (PAX6) oraz (E) jądra komórkowe zwiualizowane za pomocą DAPI. Pasek skali = 100 µm. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wraz z wiekiem organoidów organizacja i markery rozwijających się neuronów zaczynają odzwierciedlać warunki fizjologiczne. W 30. dniu in vitro (DIV30) można zaobserwować liczne rozetki tworzące regiony neurogenne odpowiadające rozwijającemu się mózgowi25. Do 60. dnia in vitro (DIV60) te neurogenne regiony SOX2+ zanikają i zostają zastąpione przez dojrzałe białka MAP2 i NeuN26, będące markerami różnicowania neuronów, oraz przez neurony dodatnie (Rycina 4 oraz Rycina 5).

Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej; obraz złożony, barwienie MAP2, NeuN, DAPI; analiza struktury komórkowej.
Rycina 4: Organoidy w 120. dniu in vitro (DIV120) wykazują dojrzałą charakterystykę neuronalną. Obraz immunohistochemiczny przekroju organoidu w DIV 120. (A) Obraz złożony przekroju wykazujący dojrzałe markery neuronalne (B) MAP2 (fioletowy) oraz (C) NeuN (zielony). (D) Jądra komórkowe zwizualizowano za pomocą DAPI. Pasek skali = 20 µm. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wyniki cyfrowego PCR kropelkowego, amplituda względem liczby zdarzeń, ilościowe oznaczanie DNA, analiza wykresu.
Rysunek 5: Cyfrowy PCR kropelkowy organoidów DIV120. Wykresy cyfrowego PCR kropelkowego przedstawiające bezwzględną wartość ekspresji dla (A) MAP2 (góra, kolor niebieski) oraz (B) NeuN (dół, kolor zielony). Żółte linie ukośne oddzielają różne linie iPSC (A, B, C itd.), a organoidy zostały zgrupowane. N = 5. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Te markery cytoszkieletowe można stosować w połączeniu z innymi markerami postmitotycznymi (takimi jak doublecortin27 i synapsin28) do badania plastyczności synaptycznej i innych zmian związanych z wiekiem (Rysunek 6), a także dodatkowych tkanek mózgu, takich jak astrocyty i glej (Rysunek 7).

Schemat mikroskopii immunofluorescencyjnej pokazujący ekspresję białek MAP2, DCX, SYN i DAPI.
Rycina 6: Przykład analizy zakończeń synaptycznych. Obraz immunohistochemiczny przekroju organoidu w 120. dniu in vitro (DIV 120). (A) Obraz kompozytowy przekroju barwionego na (B) MAP2, (C) doublecortin (DCX) oraz (D) synapsynę I (SYN). (E) Jądra komórkowe wizualizowano za pomocą DAPI. Pasek skali = 200 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Mikroskopia fluorescencyjna tkanki mózgu; barwienia Iba1, NeuN, DAPI; identyfikacja komórek; nałożenie obrazów.
Rysunek 7: Dowody na rozwój gleju. Obraz immunohistochemiczny przekroju organoidu w 120. dniu in vitro (DIV 120). (A) Obraz kompozytowy przekroju barwionego na (B) cząsteczkę Iba1 (ionized calcium-binding adaptor molecule 1) oraz (C) NeuN. (D) Jądra komórkowe zwizualizowano za pomocą DAPI. Pasek skali = 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

OdczynnikStężenie końcoweObjętość (łącznie 50 mL)
DMEM-F1250%25 mL
Neurobasal Medium50%25 mL
N2 Supplement (100x)1x0.25 mL
B27 Supplement -/+ Vitamin A (50x)0.5x0.5 mL 
Insulin0.25%12.5 µL
GlutaMAX (100x)1x0.5 mL 
MEM-NEAA (100x)0.5x0.25 mL
HEPES (1 M)10 mM0.5 mL 
Antibiotic/Antimycotic (100x)1x0.5 mL 
2-β-mercaptoethanol50 µM17.5 µL
*UWAGA: niektóre pożywki DMEM-F12 zawierają już GlutaMAX, w takim przypadku nie należy go dodawać. 

Tabela 1: Skład pożywek różnicujących wykorzystanych w niniejszym badaniu.

Dyskusja

Standaryzowane tworzenie EB jest kluczowym krokiem w odtwarzalnej konwersji pluripotencjalnych komórek macierzystych w organoidy mózgowe. Agregacja sił komórek macierzystych w pojedynczych tkankach może się różnić w zależności od geometrii wklęsłych studzienek, gęstości wysiewu i obróbki studni. Chociaż obecna metoda podaje zakres średnic 500-600 μm po 6 dniach, średnice te nie wykluczają innych średnic prawidłowego tworzenia organoidów, ponieważ wiele innych średnic okazało się skutecznych. Wykazano jednak, że różne średnice wpływają na tempo różnicowania i sukces29. Ze względu na odtwarzalność zdecydowanie zaleca się odchylenia średnicy poniżej 50 μm20. Dodatkowo, liczba dni indukcji neuronalnej może zostać wydłużona z 6 do 10 dni, aby umożliwić wzrost średnicy EB, ponieważ wykazano, że stosowanie inhibitorów SMAD skutecznie wytwarza i utrzymuje tworzenie neuroepitelii już po 5 dniach ekspozycji30. W przypadku braku inhibitorów SMAD, indukcja neuronalna może dawać niespójne wyniki, wymagając dłuższych okresów indukcji. Inhibitory SMAD cytowane w tej pracy są najskuteczniejsze, ale inne małe cząsteczki dorsomorfiny i TGF-β mogą być stosowane w ich efektywnym stężeniu.

Macierz błony podstawnej stanowi doskonałe podłoże do wzrostu i może być podawana w różny sposób. Wczesne zastosowania matrycy obejmowały błonę podstawną jako powłokę studni31. Jednak zastosowanie matrycy do osadzania tkanek wykazało poprawę różnicowania i dojrzewania w tych tkankach32. W przypadku organoidów wykazano, że zastosowanie matrycy poprawia różnicowanie EB w organoidy, wspomaga dojrzewanie i wydłuża okresy hodowli33. Podczas gdy organoidy mogą być nadal tworzone bez matrycy, ponieważ wiele grup dążyło do osiągnięcia kultury tkankowej wolnej od matrycy34,35, badania wykazały, że organoidy osadzone w matrycy mają większą szansę na wydłużenie czasu hodowli i wymagają mniej konserwacji36. Metoda osadzania wgłębień zapewnia równomierne pokrycie powierzchni organoidu, zapewniając podobną dyfuzję, dostęp do składników odżywczych i powtarzalne różnicowanie. Alternatywnie, osadzanie kopuły może być zastosowane w celu pełnej hermetyzacji organoidów37.

Przeniesienie EB do wgłębień w matrycy membranowej jest krytycznym krokiem. Chociaż końcówka do pipety o pojemności 1 ml ma wystarczająco szeroki otwór, aby przenieść EBs, preferowana jest końcówka o pojemności 200 μl ze względu na łatwość przenoszenia. Końcówki o pojemności 200 μl należy przyciąć, aby uzyskać wystarczająco duży otwór, zapewniając gładką krawędź w celu zmniejszenia naprężeń ścinających podczas pipetowania. Alternatywnie dostępne są końcówki o szerokim otworze 200 μl, które ułatwiają przenoszenie. Pipetowanie należy wykonywać powoli, ponieważ szybkie pipetowanie może zakłócić obrzeża organoidu i utrudnić prawidłowy wzrost. Szczególną uwagę należy zwrócić na to, aby zapewnić przeniesienie wystarczającej ilości podłoża w celu dostarczenia składników odżywczych. Zbyt mała ilość podłoża grozi wysuszeniem organoidu, powodując martwicę. Przenoszenie EB ze zbyt dużą ilością pożywki hodowlanej może spowodować, że matryca będzie zbyt rozcieńczona i nie będzie w stanie bezpiecznie zamknąć organoidu. Idealnie byłoby, gdyby matryca nie była rozcieńczana o więcej niż 50%, aby zapewnić jej polimeryzację i funkcjonować jako ECM dla EB. Jeśli osadzanie się nie powiedzie, EB można odzyskać i ponownie zakapsułkować. Ponowną enkapsulację w świeżej matrycy można przeprowadzić w dowolnym momencie, aby zapewnić organoidowi dodatkowe wsparcie.

Podobnie jak w przypadku osadzania matryc na rusztowaniach, włókna PLGA zapewniają dodatkowe wsparcie dla trójwymiarowego wzrostu. Pierwotnie włączone w celu wytworzenia wydłużonych organoidów i zwiększenia powierzchni38, włączenie włókien PLGA zostało stopniowo zidentyfikowane jako dodatkowe narzędzie poprawiające różnicowanie i dojrzewanie organoidów39. Ponieważ coraz więcej laboratoriów stara się ograniczyć użycie matrycy lub całkowicie ją znieść, samoorganizujące się właściwości organoidów wspierane przez wbudowane włókna zapewniają wystarczające rusztowanie do trójwymiarowego tworzenia iróżnicowania tkanek. W tym przypadku obie metody połączono w celu zwiększenia szans na długotrwałą hodowlę38,39. Włączenie włókien podczas początkowej agregacji ma kluczowe znaczenie, ponieważ mogą one nie zostać wprowadzone na późniejszym etapie. Po odwirowaniu sprawdzenie, czy wśród zagregowanych komórek znajduje się kilka włókien, zapewni, że włókno zostanie włączone do EB. Jeśli to się nie powiedzie, delikatne zasysanie studzienki i ponowne odwirowanie powinno zapewnić mieszanie.

Kolejnym krytycznym krokiem w utrzymaniu organoidów jest wprowadzenie wytrząsarki orbitalnej w celu lepszej perfuzji mediów. We wczesnych iteracjach protokołów organoidowych do wytworzenia mieszania używano wirującego bioreaktora11. Wytrząsarka orbitalna o prędkości 90 obr./min zapewnia wystarczające mieszanie bez niszczenia kropli matrycy lub uszkadzania morfologii organoidów. Niektóre grupy powstrzymują się od korzystania z rusztowania matrycowego, ale zachowują poruszenie wstrząsem, aby zapewnić odpowiednie środowisko34. Podobnie jak w przypadku wszystkich protokołów, prędkość obrotów należy dostosować w zależności od wytrząsarki, aby zmniejszyć naprężenia ścinające. Jeśli wybrano osadzenie kopuły, można zastosować wytrząsarkę pochyloną w celu zmniejszenia naprężeń ścinających 11,34.

Podsumowując, połączenie kilku wybranych technik zapewnia solidną metodę tworzenia organoidów pochodzących z iPSC. Istnieje kilka sposobów tworzenia i utrzymywania organoidów, ale wiele z nich koncentruje się na wczesnych trajektoriach różnicowania. W tej pracy połączono wiele różnych technik hodowli organoidów przez dłuższy czas, po fazie różnicowania i w okresie dojrzewania, w którym mogą zacząć rozwijać się fenotypy starzenia. Włączenie tych technik pozwala na przedłużone dojrzewanie bez konieczności stosowania egzogennych czynników biologicznych w celu utrzymania kultur, zachowania samoorganizacji i naturalnego postępu starzenia.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Netherlands Organ-on-Chip Initiative, projekt NWO Gravitation (024.003.001) finansowany przez Ministerstwo Edukacji, Kultury i Nauki rządu Holandii. D.C.B. dziękuje za wsparcie finansowe Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) w formie stypendium doktoranckiego.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2-β-merkaptoetanolThermo Fisher Scientific31350010
4′,6-diamidyn-2-fenyloindolodichlorowodorek (DAPI)InvitrogenD13061:4000
6-dołkowa przezroczysta, płaska płytka do hodowli komórkowych CELLSTAR Cell Culture Greiner Bio-One657185
6-dołkowa przezroczysta płytka z płaskim dnem i ultraniskim nasadkąCorning3471
96-dołkowa przezroczysta mikropłytka z okrągłym dnem i ultraniskim nasadkąCorning7007
96-dołkowa, płaska płytka z płaskim dnem poddana działaniu nunclon Delta,Thermo Fisher Scientific136101
AccutaseSigma-Aldrich46964Rozwiązanie do odłączania komórek 
Antybiotyk-Antybiotyk (100x)Gibco15240062
B27 Suplement (z witaminą A) (50x)Gibco17504044
Suplement B27 (bez witaminy A) (50x)Gibco12587010
BD  Vacutainer & handel; Szklane probówki do przygotowania komórek jednojądrzastych (CPT)Thermo Fisher Scientific02-685-125
Albumina surowicy bydlęcej Sigma-AldrichA9418
WirówkaEppendorf5810 RZ uchwytami na płytki
CHIR99021Selleck ChemicalsS2924
CytoTune Sendai Reprogramming VectorThermo Fisher ScientificA1378001
startery ddPCR | człowiek | Startery ddPCR MAPTBio-RaddHsaCPE192234
| człowiek | RBFOX3 (NeuN) Bio-RaddHsaCPE5052108
DMEM/F12Thermo Fisher Scientific11320074
Doublecortin (DCX)Santa Cruz BiotechnologySC-80661:500
Dulbecco' s sól fizjologiczna buforowana fosforanami (DPBS)Thermo Fisher Scientific14190144bez wapnia, bez magnezu
Kubki Eppendorf, 1,5 ml Eppendorf0030 125.215
Essential 6GibcoA1516401
Essential 8GibcoA1517001
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) Invitrogen15575020
Falcon probówki, 15 mL, stożkoweGreiner Bio-One188271-N
Formaldehyde Sigma-Aldrich25254937% roztwór podstawowy, rozcieńczony do 4% w PBS
Geltrex LDEV-Free Zredukowany czynnik wzrostu Membrana podstawna MatrixThermo Fisher ScientificA1413202
GlutaMax (100x)Gibco35050038
Licznik komórek hemacytometruHausser scientific1490
Bufor HEPESThermo Fisher Scientific15-630-080
InsulinaSigma-AldrichI9278
LDN 193189StemCell Technologies72147
MAP2Abcamab324541:200
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Matrix Matryca błony podstawnej, wolna od LDEVCorning356230Macierz błony podstawnej
MEM-Nieistotny roztwór aminokwasów (MEM-NEAA; 100x)Thermo Fisher Scientific11140050
Multilabel Counter Victor 3 Czytnik płytPerkin Elmer 1420luminometr
MycoAlert Zestaw do wykrywania MycoplazmyLonzaLT07-318
Suplement N-2 (100x)Thermo Fisher Scientific17502-048
NeuNMilliporeMAB3771:500
Podłoże neurobazalneThermo Fisher Scientific21103049
Przeciwciało Oct-3/4 (C-10) Alexa Fluor 647Santa Cruz Biotechnologiasc-5279 AF6471:100
ParafilmBemisPM-996arkusz folii termoplastycznej
PAX6Thermo Fisher Scientific42-66001:200
Penicylina/StreptomycynaGibco15070063
Mikrofilamenty poli(kwas mlekowo-ko-glikolowy) (PLGA)EthiconJ463
QX200 Cyfrowy system PCRInhibitor ROCK 1864001
(Y27632)Selleck ChemicalsS1049
SB431542 R& D Systems1614/50
SOX2 Przeciwciało monoklonalne (Btjce), Alexa Fluor 488, eBioscienceInvitrogen53-9811-801:100
Synapsyna I (SYN)Calbiochem5747771:200
Triton-X 100 Sigma-AldrichT8787
TUJ1Santa Cruz Biotechnologysc-80005Beta-3-tubulina; 1:500
XAV939Tocris Bioscience3748
Bio-Rad

Bibliografia

  1. Liu, G. H., et al. Aging Atlas: a multi-omics database for aging biology. Nucleic Acids Research. 49, 825-830 (2021).
  2. Ferrucci, L., et al. Measuring biological aging in humans: A quest. Cell. 19 (2), 13080(2020).
  3. Mertens, J., Reid, D., Lau, S., Kim, Y., Gage, F. H. Aging in a dish: iPSC-derived and directly induced neurons for studying brain aging and age-related neurodegenerative diseases. Annu Rev Genet. 52, 271-293 (2018).
  4. Mertens, J., et al. Age-dependent instability of mature neuronal fate in induced neurons from Alzheimer's patients. Cell Stem Cell. 28 (9), 1533-1548 (2021).
  5. Lin, Y. T., et al. APOE4 causes widespread molecular and cellular alterations associated with Alzheimer's disease phenotypes in human iPSC-derived brain cell types. Neuron. 98 (6), 1141-1154 (2018).
  6. Fang, E. F., et al. Mitophagy inhibits amyloid-β and tau pathology and reverses cognitive deficits in models of Alzheimer's disease. Nature Neuroscience. 22 (3), 401-412 (2019).
  7. Hu, J. L., Todhunter, M. E., LaBarge, M. A., Gartner, Z. J. Opportunities for organoids as new models of aging. Journal of Cell Biology. 217 (1), 39-50 (2018).
  8. Choi, S. H., et al. A three-dimensional human neural cell culture model of Alzheimer's disease. Nature. 515 (7526), 274-278 (2014).
  9. Gonzalez, C., et al. Modeling amyloid beta and tau pathology in human cerebral organoids. Molecular Psychiatry. 23 (12), 2363-2374 (2018).
  10. Yoon, S. -J., et al. Reliability of human cortical organoid generation. Nature Methods. 16 (1), 75-78 (2019).
  11. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).
  12. Muratore, C. R., Srikanth, P., Callahan, D. G., Young-Pearse, T. L. Comparison and optimization of hiPSC forebrain cortical differentiation protocols. PLoS ONE. 9 (8), 105807(2014).
  13. Giandomenico, S. L., Sutcliffe, M., Lancaster, M. A. Generation and long-term culture of advanced cerebral organoids for studying later stages of neural development. Nature Protocols. 16 (2), 579-602 (2020).
  14. Goto-Silva, L., et al. Computational fluid dynamic analysis of physical forces playing a role in brain organoid cultures in two different multiplex platforms. BMC Developmental Biology. 19 (1), 1-10 (2019).
  15. Sommer, A. G., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using the STEMCCA lentiviral vector. Journal of Visualized Experiments. (68), e4327(2012).
  16. Beers, J., et al. A cost-effective and efficient reprogramming platform for large-scale production of integration-free human induced pluripotent stem cells in chemically defined culture. Scientific Reports. 5 (1), 1-9 (2015).
  17. Wakao, S., et al. Morphologic and gene expression criteria for identifying human induced pluripotent stem cells. PLoS ONE. 7 (12), e48677(2012).
  18. Schlaeger, T. M., et al. A comparison of non-integrating reprogramming methods. Nature Biotechnology. 33 (1), 58-63 (2015).
  19. JoVE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Using a Hemacytometer to Count Cells. JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. (2022).
  20. Choy Buentello, D., Koch, L. S., Trujillo-De Santiago, G., Alvarez, M. M., Broersen, K. Use of standard U-bottom and V-bottom well plates to generate neuroepithelial embryoid bodies. PLOS ONE. 17 (5), 0262062(2022).
  21. Ellis, P., et al. SOX2, a persistent marker for multipotential neural stem cells derived from embryonic stem cells, the embryo or the adult. Developmental Neuroscience. 26 (2-4), 148-165 (2004).
  22. Lee, S., et al. TuJ1 (class III β-tubulin) expression suggests dynamic redistribution of follicular dendritic cells in lymphoid tissue. European Journal of Cell Biology. 84 (2-3), 453-459 (2005).
  23. Suzuki, S., Namiki, J., Shibata, S., Mastuzaki, Y., Okano, H. The neural stem/progenitor cell marker nestin is expressed in proliferative endothelial cells, but not in mature vasculature. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 58 (8), 721-730 (2010).
  24. Soltani, M. H., et al. Microtubule-associated protein 2, a marker of neuronal differentiation, induces mitotic defects, inhibits growth of melanoma cells, and predicts metastatic potential of cutaneous melanoma. The American Journal of Pathology. 166 (6), 1841-1850 (2005).
  25. Wilson, P. G., Stice, S. S. Development and differentiation of neural rosettes derived from human embryonic stem cells. Stem Cell Reviews. 2 (1), 67-77 (2006).
  26. Gusel'nikova, V. V., Korzhevskiy, D. E. NeuN as a neuronal nuclear antigen and neuron differentiation marker. Acta Naturae. 7 (25), 42-47 (2015).
  27. Rao, M. S., Hattiangady, B., Shetty, A. K. The window and mechanisms of major age-related decline in the production of new neurons within the dentate gyrus of the hippocampus. Aging Cell. 5 (6), 545-558 (2006).
  28. Meng, L., et al. A synapsin I cleavage fragment contributes to synaptic dysfunction in Alzheimer's disease. Aging Cell. 21 (5), 13619(2022).
  29. Moon, S. H., et al. Optimizing human embryonic stem cells differentiation efficiency by screening size-tunable homogenous embryoid bodies. Biomaterials. 35 (23), 5987-5997 (2014).
  30. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
  31. Lee, S. -W., et al. Optimization of Matrigel-based culture for expansion of neural stem cells. Animal Cells and Systems. 19 (3), 175-180 (2015).
  32. Zhang, J., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: The matrix sandwich method. Circulation Research. 111 (9), 1125-1136 (2012).
  33. Hocevar, S. E., Liu, L., Duncan, R. K. Matrigel is required for efficient differentiation of isolated, stem cell-derived otic vesicles into inner ear organoids. Stem Cell Research. 53, 102295(2021).
  34. Birey, F., et al. Assembly of functionally integrated human forebrain spheroids. Nature. 545 (7652), 54-59 (2017).
  35. Kozlowski, M. T., Crook, C. J., Ku, H. T. Towards organoid culture without Matrigel. Communications Biology. 4 (1), 1-15 (2021).
  36. Kaiser, A., Kale, A., Novozhilova, E., Olivius, P. The effects of Matrigel® on the survival and differentiation of a human neural progenitor dissociated sphere culture. The Anatomical Record. 303 (3), 441-450 (2020).
  37. Kakni, P., et al. Intestinal organoid culture in polymer film-based microwell arrays. Advanced Biosystems. 4 (10), 2000126(2020).
  38. Lancaster, M. A., et al. Guided self-organization and cortical plate formation in human brain organoids. Nature Biotechnology. 35 (7), 659-666 (2017).
  39. Tejchman, A., Znój, A., Chlebanowska, P., Frączek-Szczypta, A., Majka, M. Carbon fibers as a new type of scaffold for midbrain organoid development. International Journal of Molecular Sciences. 21 (17), 5959(2020).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Organoidy pochodz ce z iPSCdojrzewanie organoid wkom rki progenitorowe neuron wtworzenie cia embrionalnychosadzanie w macierzy zewn trzkom rkowejmodelowanie chor b neurodegeneracyjnychplastyczno synaptyczna
Solidna produkcja tkanek do długoterminowej hodowli organoidów mózgowych pochodzących z iPSC do badań nad starzeniem się
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.